CN102159590A

CN102159590A - Cd28结合为单价的组合物及使用方法

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Publication number: CN102159590A
Application number: CN2009801358711A
Authority: CN
Inventors: 默里.麦金农; 史蒂文.G.纳德勒; 苏珊娜.J.苏查德; 布伦丹.克拉森; 史蒂夫.霍姆斯; 奥尔佳.伊格纳托维奇; 克里斯托弗.普卢默; 史蒂夫.格兰特
Original assignee: Domantis Ltd; Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Domantis Ltd; Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2009-07-17
Publication date: 2011-08-17
Also published as: CO6341641A2; RS54675B1; EP2700651A1; DK2700651T3; TW201336510A; EP2700651B1; US8168759B2; JP2011528551A; HK1155178A1; KR20160113322A; ES2730727T3; US9908937B2; CL2011000117A1; HRP20160329T1; DK2321352T3; AU2009270726A1; SMT201900367T1; JP2015120695A; IL251320A0; CY1121796T1

Abstract

公开了单价结合CD28的域抗体。对于结合CD28为单价的域抗体能抑制CD28活性。在一方面，一种域抗体由下述单一免疫球蛋白可变域组成或包含下述单一免疫球蛋白可变域，其特异性结合并拮抗CD28的活性，在一方面，基本上不激动CD28活性。在另一方面，所述域抗体是人域抗体。本公开还涵盖在个体中拮抗CD80和/或CD86与CD28的相互作用的方法以及治疗涉及CD80和/或CD86与CD28的相互作用的疾病或病症的方法，所述方法涉及将域抗体施药于所述个体。

Description

CD28结合为单价的组合物及使用方法

对相关申请的引用

本申请要求于2009年3月20日提交的美国临时申请61/162,121号和于2008年7月18日提交的美国临时申请61/082,078号的权益。

发明领域

提供了结合CD28并阻止CD28结合CD80和/或CD86的域抗体(dAb)，其中所述dAb并不与CTLA4交叉反应，并且提供了该dAb的使用方法。

序列表

下文所附的序列表以提述的方式并入本文。

发明背景

T淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC)之间的抗原非特异性的细胞间相互作用产生T细胞共刺激信号，该信号导致T细胞对抗原的应答(Jenkins和Johnson(1993)Curr.Opin.Immunol.5：361-367)。共刺激信号决定T细胞对抗原的应答的程度，以及该应答是激活还是灭活对抗原的后续应答(Mueller等(1989)Annu.Rev.Immunol.7：445-480)。当共刺激不存在时T细胞激活导致中断的(aborted)或无反应性的(anergic)T细胞应答(Schwartz，R.H.(1992)Cell71：1065-1068)。一种关键的共刺激信号是由T细胞表面受体CD28与抗原呈递细胞上B7相关分子(例如，B7-1和B7-2，或分别为CD80和CD86)的相互作用提供的(P.Linsley和J.Ledbetter(1993)Annu.Rev.Immunol.11：191-212)。CD28与B7-1(CD80)和B7-2(CD86)共刺激分子的相互作用提供了供提升及维持T细胞应答的主要信号途径(Freedman等(1987)J.Immunol.137：3260-3267；Freeman等(1989)J.Immunol.143：2714-2722；Freeman等(1991)J.Exp.Med.174：625-631；Freeman等(1993)Science 262：909-911；Azuma等(1993)Nature 366：76-79；Freeman等(1993)J.Exp.Med.178：2185-2192)。

CD28在T细胞的表面上组成型表达，所述T细胞为几乎所有的人CD4+T细胞，以及较低程度的人CD8+T细胞，一些自然杀伤细胞和所有的鼠类T细胞。CD28是一种I型跨膜糖蛋白，且因其具有单一的Ig可变样细胞外结构域而为免疫球蛋白家族的成员，所述域具有CD80和CD86结合所需要的MYPPPY(SEQ ID NO：639)基序(Peach等1994，J.Exp.Med.180：2049-2058)。CD28在Ig可变样结构域之后具有半胱氨酸残基，所述结构域参与其同二聚化。CD28的蛋白质序列和编码人CD28的核酸公开于，例如，Harper等J.Immunol.(1991)147：1037-44。编码CD28的人mRNA的序列还公开于，例如，最后于2009年4月19日更新的NCBI登录号NM_006139。人CD28的完整蛋白质序列还公开于，例如，最后于2009年4月19日更新的NCBI登录号NM_006130。

CD28传递的信号与T细胞受体(TCR)信号协同作用以促进幼稚T细胞的激活(Lanzavecchia等(1999)Cell 96：1-4)。CD28信号传导调节T细胞激活的阈值，并显著地减少有效T细胞激活所需要的TCR参与数(Viola等(1996)Science 273：104-6)。CD28共刺激导致T细胞增殖增强、多种细胞因子和细胞因子受体的产生和参与细胞周期进行的蛋白质的表达增加、持续的T细胞存活和CD40配体(CD40L)在T细胞上的表达持续(Sharpe等Fundamental Immunology，W.E.Paul Ed.Fifth Edition，Page 396)。

CD28信号在调节CD4和CD8T细胞分化中具有至关重要的作用。CD28还优化之前激活的T细胞的应答，促进IL-2产生和T细胞存活。幼稚T细胞的IL-4产生高度依赖B7-1/B7-2共刺激。在幼稚T细胞的激活过程中CD28/B7途径的中断减少T细胞增殖和分化，而在之前激活的T细胞中CD28/B7途径的中断减少T细胞扩增，但不减少效应物细胞因子产生(Sharpe等Fundamental Immunology，W.E.Paul Ed.Fifth Edition，pages 393-404)。

T辅助细胞依赖性抗体应答使用B7-CD28途径以提供对于关联T细胞/B细胞相互作用至关重要的共刺激信号，所述相互作用是免疫球蛋白类型转换和生发中心形成所需要的。在CD28敲除小鼠中，潜在反应性B细胞在抗原刺激之后聚集在淋巴样滤泡内，但无法增殖或进行体细胞突变(Ferguson等(1996)J.Immunol.156：4576-4581)。

B7-1和B7-2还是另一种具有更高亲和力的受体，CTLA4(CD152)的配体，所述受体位于激活的T细胞的表面。当B7-1/B7-2结合CTLA-4时，发生B7-1/B7-2对抑制性信号的共刺激(Brunet等(1987)Nature 328：267-270；Linsley等(1991)J.Exp.Med.174：561-569)。免疫应答的结果涉及CD28介导的T细胞激活和CTLA-4介导的T细胞抑制之间的平衡。

抑制CD28介导的T细胞激活能抑制在自身免疫、移植排斥或变态反应过程中发生的不想要的T细胞应答。例如，抑制CD28介导的T细胞激活能延迟移植物排斥，阻止急性同种异体移植物排斥，诱导供体特异性耐受并阻止慢性同种异体移植物排斥的发生并中断其行进，以及阻止移植物抗宿主病(GVH)，即，当移植的T细胞针对宿主组织同种异体抗原发动强力的免疫应答时(Salama等(2001)J.Clin.Invest.108：943-48)。抑制CD28介导的T细胞激活不仅通过抵消经CD28的激活信号传导来减弱免疫应答，而且其并不影响CD86和CD80对CTLA-4的相互作用，由此保留了CTLA-4介导的对T细胞应答的抑制。因此，对CD28介导的T细胞激活的抑制可用于阻止自身免疫的诱导，并缓和已发生的自身免疫性疾病的行进和/或严重性，所述自身免疫性疾病包括胶原诱导的关节炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性葡萄膜炎、重症肌无力和狼疮的模型(Saloman等(2001)Ann.Rev.Immunol.19：225-252)。

需要抑制CD28介导的T细胞激活，但不刺激CD28信号传导途径的方法。本文所述的公开着眼并满足了该需要

发明概述

本文提供了单价结合CD28的域抗体(dAb)。由于CD28在调节T细胞应答和抗体产生中的明显重要性，CD28/B7(CD80和CD86)相互作用和途径呈现了重要靶标，供开发用于治疗涉及不适当细胞应答的疾病和病症的治疗方法，所述疾病和病症如移植物排斥、自身免疫和/或过度抗体应答。对于CD28结合为单价的域抗体能抑制CD28活性，削弱免疫应答，但避免使用能够二价或多价结合CD28的抗体时会发生的潜在的不想要的作用。域抗体还可用于任意多种其中也使用了标准的二价抗体的用途中，例如，体内成像和诊断。

因此，本文中描述了结合CD28并阻止或抑制CD28结合CD80、CD86和/或其他配体，并在受体结合测定法中抑制由CD80和/或CD86引起的CD28信号传导的域抗体。本文中所述的域抗体也并不阻断CD80和CD86对于CTLA4的相互作用。在一个实施方案中，本文中所述的域抗体并不与CTLA4交叉反应，因此并不结合CTLA4和CD28上与CD80/86结合的共同基序。

在一个实施方案中，域抗体对CD28的结合基本上并不激动CD28活性。具体地，dAb与T细胞受体信号传导组合时并不激动CD28信号传导。在另一个实施方案中，所述域抗体抑制CD28对CD80的结合。在另一个实施方案中，所述域抗体抑制CD28对CD80的结合，且基本上并不激动由CD28引起的信号传导。还在另一个实施方案中，所述域抗体抑制CD28对CD86的结合。在另一个实施方案中，所述域抗体抑制CD28对CD86的结合，且基本上并不激动由CD28引起的信号传导。还包括干扰CD80和/或CD86对CD28的MYPPPY(SEQ ID NO：639)序列的结合的dAb。

在一方面，所述dAb与T细胞受体信号传导组合时基本上并不诱导T细胞增殖。在另一方面，所述dAb与T细胞受体信号传导组合时基本上并不诱导T细胞的细胞因子分泌。在一个实施方案中，细胞因子为至少一种选自下组的细胞因子：GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、IL-24、TGFβ、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。

在一方面，因为当将人抗体施药于人受试者以供治疗或预防疾病时会避免产生针对该抗体的免疫应答，所以所述域抗体为单价结合CD28的人域抗体，且在示例性实施方案中，基本上不激动CD28活性。

在一个实施方案中，所述域抗体与人CD28以通过表面等离振子共振测量为50nM至1pM(含)范围中的K_d相互作用。例如，对人CD28的K_d可为25nM至20pM、10nM至20pM、5nm至20pM、1nM至20pM、0.5nM至20pM、0.1nM至20pM、0.1nM至50pM、75pM至20pM或甚至50pM至20pM。在一个实施方案中，对人CD28的K_d为约50pM。

在一个实施方案中，所述域抗体以50nM或更小的IC₅₀抑制CD80与CD28的结合。在一个实施方案中，所述域抗体以50nM或更小的IC₅₀抑制CD86与CD28的结合。在另一个实施方案中，所述域抗体具有对CD28的结合特异性，通过表面等离振子共振测定的K_off速率常数为1x10^-3s^-1或更小、1x10^-4s^-1或更小、1x10^-5s^-1或更小、或1x10^-6s^-1或更小。在一个实施方案中，所述域抗体在标准测定法中以50nM或更小的IC₅₀中和CD28。

在另一个实施方案中，所述域抗体包含结合CD28的单一的免疫球蛋白可变域。在一个实施方案中，所述单一的免疫球蛋白可变域是V_H或V_L域。在另一个实施方案中，所述域抗体包含两个可变域，例如，V_H和V_L域的同多聚物或异多聚物，但一个可变域具有无需对应的V_L或V_H域即可结合CD28的能力。即，所述dAb独立于其他V_H或V_L域结合抗原。在这些实施方案中的可变域可包含三个互补决定区(CDR)。在另一个实施方案中，所述域抗体不含Fc域。对Fc域的限制见于Kabat等(1991，Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health & Human Services，Washington，D.C.；以提述的方式并入本文)。或者，Fc域由CH2-CH3区组成，任选地包含连接于CH2的铰链区。

在一方面，所述域抗体包含通用的框架。在此方面，域抗体可包含一个或多个框架区，其包含的氨基酸序列与由人种系抗体基因区段编码的相应框架(FW)区的氨基酸序列相同，或者一个或多个所述框架区的氨基酸序列总体而言相对于所述由人种系抗体基因区段编码的相应框架区的氨基酸序列包含多至5处(例如，1、2、3、4、或5处)氨基酸差异。

在一个实施方案中，所述dAb包含与人抗体(例如，人种系抗体)的FW1、FW2、FW3和FW4对应的FW1、FW2、FW3和FW4氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述域抗体的FW1、FW2、FW3和FW4氨基酸序列的一部或全部与由人种系抗体基因区段编码的相应框架区的氨基酸序列相同。例如，FW2可与人抗体的FW2相同。在另一个实施方案中，FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列总体而言相对于由所述人种系抗体基因区段编码的相应框架区的氨基酸序列包含多至10处氨基酸差异。在前述的另一个实施方案中，所述人种系抗体基因区段可选自下组：DP47、DP45、DP48和DPK9。在一个实施方案中，所述通用框架包含选自下组的V_H框架：DP47、DP45和DP38，和/或V_L框架为DPK9.

在一方面，域抗体经定型式(format)以延长其体内半衰期。具体而言，所述域抗体相对于未经定型式的同一域抗体具有延长的体内t-α或t-β半衰期。

在一个实施方案中，所述域抗体组合物的tα半衰期在除此之外相同的条件下测定时与未经修饰的蛋白质相比延长了10％或更多。在另一个实施方案中，所述域抗体组合物的tα半衰期延长了50％或更多。在另一个实施方案中，所述域抗体组合物的tα半衰期延长了2X或更多，在另一个实施方案中，所述域抗体组合物的tα半衰期延长了5X或更多，例如，10X、15X、20X、25X、30X、40X、50X或更多。在另一个实施方案中，所述域抗体组合物的tα半衰期延长了100X、200X、300X、400X、500X或更多。

在另一个实施方案中，所述域抗体具有0.25至6小时(含)的tα半衰期。在另一个实施方案中，tα半衰期是在30分钟至12小时(含)的范围内。在另一个实施方案中，所述域抗体的tα半衰期是在1至6小时的范围内。

在另一个实施方案中，所述域抗体的tβ半衰期在除此之外相同的条件下测定时与未经修饰的蛋白质相比延长了10％或更多。在另一个实施方案中，所述域抗体的tβ半衰期延长了50％或更多。在另一个实施方案中，所述域抗体的tβ半衰期延长了2X或更多，在另一个实施方案中，所述域抗体的tβ半衰期延长了5X或更多，例如，10X、15X、20X、25X、30X、40X或更多。在另一个实施方案中，所述域抗体的tβ半衰期延长了50X或更多。

在另一个实施方案中，所述域抗体具有1小时至744小时(含)的tβ半衰期。在另一个实施方案中，tβ半衰期是在12至48小时(含)的范围内。在另一个实施方案中，tβ半衰期是在12至26小时(含)的范围内。还在另一个实施方案中，tβ半衰期是约336小时。

作为上述标准的附加或替代，提供了含域抗体的组合物，其包含具有范围为1mg·min/ml或更高的AUC值(曲线下面积)的配体。在一个实施方案中，所述范围的下限为5、10、15、20、30、100、200、或300mg·min/ml。作为附加或替代，配体或组合物具有范围为高至600mg·min/ml的AUC。在一个实施方案中，所述范围的上限为500、400、300、200、150、100、75或50mg·min/ml。有利地，配体具有选自下组的范围中的AUC：15至150mg·min/ml、15至100mg·min/ml、15至75mg·min/ml和15至50mg·min/ml。

在一个定型式的实施方案中，本文中所述的域抗体可连接于人血清清蛋白(HSA)，其还具有延长所述分子体内半衰期的作用。人血清清蛋白编码序列可通过PCR使用下述引物获得，所述引物衍生自以GenBank登录号NM000477可获得的cDNA序列。上述编码序列可融合于本文中所述的域抗体的编码序列，且所述融合物可由本领域技术人员表达。在一个实施方案中，所述HSA连接的域抗体组合物的tα半衰期延长了10％或更多。在另一个实施方案中，所述HSA连接的域抗体组合物的tα半衰期是在0.25小时至6小时的范围内。在另一个实施方案中，所述HSA连接的域抗体组合物的tβ半衰期延长了10％或更多。在另一个实施方案中，所述HSA连接的域抗体组合物的tβ半衰期是在12至48小时的范围内。

在另一个实施方案中，所述定型式包含dAb的PEG化。在一个实施方案中，所述PEG是共价连接的。在另一个实施方案中，所述PEG是在半胱氨酸或赖氨酸残基处连接于所述域抗体的。还在另一个实施方案中，所述PEG连接的域抗体具有至少24kD的流体动力学大小(hydrodynamic size)。还在另一个实施方案中，总PEG大小为20至60kD(含)。还在另一个实施方案中，所述PEG连接的域抗体具有至少200kD的流体动力学大小。

在另一个实施方案中，所述PEG连接的域抗体相对于缺乏聚乙二醇连接的相同多肽组合物具有延长的体内半衰期。在另一个实施方案中，所述域抗体组合物的tα半衰期延长了10％或更多。在另一个实施方案中，所述域抗体组合物的tα半衰期延长了50％或更多。在另一个实施方案中，所述域抗体组合物的tα半衰期延长了2X或更多，在另一个实施方案中，所述域抗体组合物的tα半衰期延长了5X或更多，例如，10X、15X、20X、25X、30X、40X、50X或更多。在另一个实施方案中，所述域抗体组合物的tα半衰期增加至100X、200X、300X、400X、500X或更多。

在另一个实施方案中，PEG连接的域抗体具有0.25至6小时(含)的tα半衰期。在另一个实施方案中，tα半衰期是在30分钟至12小时(含)的范围内。在另一个实施方案中，所述域抗体的tα半衰期是在1至6小时的范围内。

在另一个实施方案中，所述PEG连接的域抗体的tβ半衰期延长了10％或更多。在另一个实施方案中，所述PEG连接的域抗体的tβ半衰期延长了50％或更多。在另一个实施方案中，所述PEG连接的域抗体的tβ半衰期延长了2X或更多，在另一个实施方案中，所述PEG连接的域抗体的tβ半衰期延长了5X或更多，例如，10X、15X、20X、25X、30X、40X或更多。在另一个实施方案中，所述PEG连接的域抗体的tβ半衰期延长了50X或更多。

在另一个实施方案中，所述PEG连接的域抗体具有1至170小时(含)的tβ半衰期。在另一个实施方案中，tβ半衰期是在12至48小时(含)的范围内。在另一个实施方案中，tβ半衰期是在12至26小时(含)的范围内。

在另一个实施方案中，所述PEG连接的域抗体具有范围为1mg·min/ml或更高的AUC值(曲线下面积)。在一个实施方案中，所述范围的下限为约5、10、15、20、30、100、200、或300mg·min/ml。作为附加或替代，配体或组合物具有范围为高至约600mg·min/ml的AUC。在一个实施方案中，所述范围的上限为约500、400、300、200、150、100、75或50mg·min/ml。有利地，配体具有选自下组的范围中的AUC：约15至150mg·min/ml、约15至100mg·min/ml、约15至75mg·min/ml和约15至50mg·min/ml。

在另一个实施方案中，提供了具有与由下述核酸分子编码的氨基酸序列至少85％相同，例如，至少90％相同，至少95％相同，和多至(含)96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列的域抗体，所述核酸分子具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1-57，所述域抗体特异地并单价地结合CD28。

在另一个实施方案中，所述域抗体包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：58-398和640，以及SEQ ID NO：532-635，且在示例性的实施方案中：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：534、SEQ IDNO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ IDNO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：545、SEQ IDNO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ IDNO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ IDNO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ IDNO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ IDNO：611、SEQ ID NO：617和SEQ ID NO：622。

还在另一方面，提供了下述的域抗体，其具有与选自下组的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ IDNO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ IDNO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ IDNO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ IDNO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ IDNO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ IDNO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ IDNO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ IDNO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617和SEQ ID NO：622，所述多肽特异地并单价地结合CD28。在另一个实施方案中，域抗体与所选氨基酸序列在不多于25个氨基酸位置上存在差异，并具有与所选序列至少80％相同的序列。在一个实施方案中，所述域抗体与所选的氨基酸序列在25个或更少的氨基酸位置、20个或更少的氨基酸位置、15个或更少的氨基酸位置、10个或更少的氨基酸位置、5个或更少的氨基酸位置、2个或更少的氨基酸位置或少至一个氨基酸位置存在差异。在另一个实施方案中，所述域抗体与所选序列至少80％相同，例如，至少70％相同，至少75％相同，至少80％相同，至少85％相同，至少90％相同，至少95％相同，和多至(含)96％、97％、98％或99％相同。

在一个实施方案中，CD28拮抗剂具有与选自下组的氨基酸序列的CDR1序列至少50％相同的CDR1序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ IDNO：276、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ IDNO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ IDNO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ IDNO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ IDNO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ IDNO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ IDNO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617和SEQ IDNO：622。

在一个实施方案中，CDR1与所选氨基酸序列在所有的CDR1氨基酸位置，5个或更少的氨基酸位置，4个或更少的氨基酸位置，3个或更少的氨基酸位置，2个或更少的氨基酸位置或少至一个氨基酸位置存在差异。在另一个实施方案中，CDR1与所选序列至少50％相同，例如，至少60％相同，至少70％相同，至少75％相同，至少80％相同，至少85％相同，至少90％相同，至少95％相同，和多至(含)96％、97％、98％或99％相同。

在一个实施方案中，CD28拮抗剂具有与选自下组的氨基酸序列的CDR2序列至少50％相同的CDR2序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ IDNO：276、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ IDNO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ IDNO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ IDNO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ IDNO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ IDNO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ IDNO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617和SEQ IDNO：622。

在一个实施方案中，CDR2与所选氨基酸序列在所有的CDR2氨基酸位置，5个或更少的氨基酸位置，4个或更少的氨基酸位置，3个或更少的氨基酸位置，2个或更少的氨基酸位置或少至一个氨基酸位置存在差异。在另一个实施方案中，CDR2与所选序列至少50％相同，例如，至少60％相同，至少70％相同，至少75％相同，至少80％相同，至少85％相同，至少90％相同，至少95％相同，和多至(含)96％、97％、98％或99％相同。

在一个实施方案中，CD28拮抗剂具有与选自下组的氨基酸序列的CDR3序列至少50％相同的CDR3序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ IDNO：276、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ IDNO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ IDNO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ IDNO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ IDNO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ IDNO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ IDNO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617和SEQ IDNO：622。

在一个实施方案中，CDR3与所选氨基酸序列在所有的CDR3氨基酸位置，5个或更少的氨基酸位置，4个或更少的氨基酸位置，3个或更少的氨基酸位置，2个或更少的氨基酸位置或少至一个氨基酸位置存在差异。在另一个实施方案中，CDR3与所选序列至少50％相同，例如，至少60％相同，至少70％相同，至少75％相同，至少80％相同，至少85％相同，至少90％相同，至少95％相同，和多至(含)96％、97％、98％或99％相同。

还包括下述dAb，其包含与选自下组的CDR1序列之一至少50％相同的CDR1序列：SEQ ID NO：484、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：490、SEQ IDNO：493、SEQ ID NO：496、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：502、SEQ IDNO：505、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：514、SEQ IDNO：517、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：526、SEQ IDNO：529和SEQ ID NO：636；与选自下组的CDR2序列之一至少50％相同的CDR2序列：SEQ ID NO：485、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：491、SEQ IDNO：494、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：503、SEQ IDNO：506、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：515、SEQ IDNO：518、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：527、SEQ IDNO：530和SEQ ID NO：637；和与选自下组的CDR3序列之一至少50％相同的CDR3序列：SEQ ID NO：486、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：492、SEQ IDNO：495、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：504、SEQ IDNO：507、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：516、SEQ IDNO：519、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：528、SEQ IDNO：531和SEQ ID NO：638。

在另一方面，包括下述dAb，其包含选自下组的CDR1序列：SEQ IDNO：484、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：490、SEQ ID NO：493、SEQ IDNO：496、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：505、SEQ IDNO：508、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：517、SEQ IDNO：520、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：529和SEQ IDNO：636；选自下组的CDR2序列：SEQ ID NO：485、SEQ ID NO：488、SEQ IDNO：491、SEQ ID NO：494、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：500、SEQ IDNO：503、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：512、SEQ IDNO：515、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：524、SEQ IDNO：527、SEQ ID NO：530和SEQ ID NO：637；和选自下组的CDR3序列：SEQID NO：486、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：492、SEQ ID NO：495、SEQ IDNO：498、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：507、SEQ IDNO：510、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：519、SEQ IDNO：522、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：531和SEQ IDNO：638。

还在另一方面，dAb包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：472、SEQ ID NO：473、SEQ IDNO：474、SEQ ID NO：475、SEQ ID NO：476、SEQ ID NO：477、SEQ IDNO：478、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：480、SEQ ID NO：481、SEQ IDNO：482、SEQ ID NO：483、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ IDNO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ IDNO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ IDNO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ IDNO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ IDNO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ IDNO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ IDNO：617和SEQ ID NO：622。在一个实施方案中，dAb包含与SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ IDNO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ IDNO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ IDNO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ IDNO：611、SEQ ID NO：617或SEQ ID NO：622的氨基酸序列相差不多于25个氨基酸的氨基酸序列。

所述dAb可以以约100nM、约50nM、约1nM、约500pM、约100pM、约50pM、约10pM、约5pM或约1pM的IC₅₀抑制CD28对CD80和/或CD86的结合。例如，所述域抗体可以以范围为1pM至1.5μM(含)的IC₅₀抑制CD28对CD80的结合；IC₅₀为CD28对CD80的结合的抑制。IC₅₀的范围可为1pM至1μM、1pM至900nM、1pM至800nM、1pM至700nM、1pM至600nM、1pM至500nM、1pM至400nM、1pM至300nM、1pM至200nM、1pM至100nM、1pM至50nM、1pM至10nM、1pM至1nM、1pM至500pM、1pM至100pM、1pM至50pM、1pM至10pM或1pM至5pM。可接受的范围还包括，例如，50pM至1μM、100pM至500nM、125pM至250nM、150pM至200nM、150pM至100nM和200pM至50nM。

在另一个实施方案中，所述域抗体以1pM至1.5μM(含)范围的IC₅₀抑制CD28对CD86的结合；IC₅₀为CD28对CD86的结合的抑制。IC₅₀的范围可为1pM至1μM、1pM至900nM、1pM至800nM、1pM至700nM、1pM至600nM、1pM至500nM、1pM至400nM、1pM至300nM、1pM至200nM、1pM至100nM、1pM至50nM、1pM至10nM、1pM至1nM、1pM至500pM、1pM至100pM、1pM至50pM、1pM至10pM或1pM至5pM。可接受的范围还包括，例如，50pM至1μM、100pM至500nM、125pM至250nM、150pM至200nM、150pM至100nM和200pM至50nM。

提供了在个体中拮抗CD80对CD28的结合的方法，所述方法包括将如本文中所述的域抗体施药于个体，其中所述域抗体在该个体中拮抗CD80对CD28的结合。在个体中拮抗CD86对CD28的结合的方法包括将如本文中所述的域抗体施药于个体，其中所述域抗体在该个体中拮抗CD86对CD28的结合。在个体中拮抗CD28活性的方法包括将如本文中所述的域抗体施药于该个体，其中所述域抗体拮抗CD28活性。在需要下述处理的个体中治疗或预防由CD28介导的疾病或病症的方法包括将治疗有效量的包含结合CD28的域抗体的组合物施药于该个体。在一个实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性疾病或病症。在另一个实施方案中，所述疾病或病症是移植物相关的。

还包括了双特异性配体，其包含对第一抗原具有结合特异性的域抗体和对第二抗原具有结合活性的单一可变域，其中所述第一抗原是CD28，且其中所述单一可变域对所述第二抗原的结合导致配体体内半衰期延长。

在一个实施方案中，所述双特异性配体是四链IgG免疫球蛋白。四链IgG可以包含两个双特异性配体，所述双特异性配体在它们的可变域方面是不同的。

在另一个实施方案中，所述域抗体是驼类(camelid)V_HH域。在所述双特异性配体的这个实施方案中，所述单一免疫球蛋白可变域可以是重链可变域。在所述双特异性配体的另一个实施方案中，所述单一免疫球蛋白可变域是轻链可变域。在所述双特异性配体的一个实施方案中，所述配体是作为包含四个重链单一可变域或四个轻链单一可变域的IgG免疫球蛋白提供的。所述重链可包含驼类V_HH域。在所述双特异性配体的另一个实施方案中，所述第一和第二域独立地结合，从而使得所述双特异性配体可同时结合第一和第二抗原二者。在所述双特异性配体的一个实施方案中，所述域抗体如表面等离振子共振所测定的对人CD28具有1x10^-8M或更小的解离常数(K_d)，以及1x10^-3s^-1或更小的K_off速率常数。

在所述双特异性配体的一个实施方案中，所述单一可变域对血清清蛋白(SA)具有特异性，并如表面等离振子共振所测定的对SA具有1nM至500μm的解离常数(K_d)。在另一个实施方案中，所述单一可变域在标准配体结合测定法中以1nM至500μM的IC₅₀结合SA。所述单一可变域可对SA具有特异性，并包含MSA-16的氨基酸序列或与其至少80％相同的序列。或者，所述单一可变域可对SA具有特异性，并包含MSA-26的氨基酸序列或与其至少80％相同的序列。

在另一个实施方案中，所述域抗体可包含针对类属配体(generic ligand)的结合位点。在一个实施方案中，所述类属配体结合位点选自下组：蛋白A、蛋白L和蛋白G结合位点。

在所述双特异性配体的一个实施方案中，所述域抗体包含通用的框架。所述域抗体还可包含选自下组的V_H框架：DP47、DP45和DP38；或为DPK9的V_L框架。所述域抗体可包含一个或多个包含下述氨基酸序列的框架区，所述氨基酸序列与由人种系抗体基因区段编码的相应框架区的氨基酸序列相同，或者一个或多个所述框架区的氨基酸序列总体而言相对于所述由人种系抗体基因区段编码的相应框架区的氨基酸序列包含多至5处氨基酸差异。

在一个实施方案中，所述域抗体的FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与由人种系抗体基因区段编码的相应框架区的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列总体而言相对于所述由人种系抗体基因区段编码的相应框架区的氨基酸序列包含多至10处氨基酸差异。

在一个实施方案中，所述域抗体FW1、FW2和FW3的氨基酸序列与由人种系抗体基因区段编码的相应框架区的氨基酸序列相同。所述人种系抗体基因区段可选自下组：DP47、DP45、DP48和DPK9。

还包括供产生如本文中所述的双特异性配体的方法，其包含具有针对CD28的结合特异性的域抗体和具有针对下述蛋白质的结合特异性的单一域抗体，所述蛋白质延长所述配体在体内的半衰期，所述方法包括下述步骤：就其结合CD28的能力选择第一可变域；就其结合所述在体内延长配体半衰期的能力选择第二可变域；将所述可变域组合；并就其结合CD28和所述蛋白质的能力选择所述双特异性配体。在一个实施方案中，所述域抗体是针对不存在互补可变域的情况下结合CD28而选择的。

还包括编码本文中所述的双特异性配体的核酸。所述核酸可包含MSA-16的核酸序列，或与其至少80％相同的序列，或者，可包含MSA-26的核酸序列，或与其至少70％相同的序列。所述核酸可掺入载体，其可掺入宿主细胞。

还包括包含如本文中所述的双特异性配体和药学可接受赋形剂、载体或稀释剂的药物组合物。

还包括包含第一和第二重链单一可变域的双特异性配体，或包含第一和第二轻链单一可变域的双特异性配体，其中所述第一可变域是域抗体。在一个实施方案中，所述第二可变域具有针对除了CD28之外的抗原的结合特异性。在一方面，所述第二可变域促使和/或增强域抗体的稳定性。举一个非限定性的实例，第二可变域具有针对血清清蛋白的结合特异性。

还包括包含下述第一和第二单一可变域的双特异性配体，所述第一单一可变域具有针对第一抗原的结合特异性，所述第二单一可变域具有针对第二抗原的结合活性，其中所述第一抗原是CD28，而所述第二抗原是抗原呈递细胞表面抗原或T细胞表面抗原。所述抗原呈递细胞表面抗原可选自下组：树突细胞表面抗原、激活的巨噬细胞表面抗原、激活的B细胞表面抗原、共刺激信号途径表面抗原和MHC抗原。在一个实施方案中，所述MHC抗原是II类MHC抗原，且所述II类抗原可为α和/或β链。

所述抗原呈递细胞表面抗原或T细胞表面抗原可选自下组：CD40、CD40L、诱导性共刺激分子(Inducible co-stimulatory molecule，ICOS)、CD27、CD30、OX40、CD45、CD69、CD3、CD70、诱导性共刺激分子配体(inducible co-stimulatory molecule ligand，ICOSL)、OX40L、CD80、CD86、HVEM(疱疹病毒进入介体，Herpes Virus Entry Mediator)和LIGHT，包括CD40L、诱导性共刺激分子(ICOS)、CD27、CD30、OX40、CD45、CD69或CD3之一。示例性的表面抗原是B7基因表面抗原，如CD86或CD80.

在另一个实施方案中，所述双特异性配体包含下述第一域抗体和第二单一可变域，所述第一域抗体具有针对第一抗原的结合特异性，而所述第二单一可变域具有针对第二抗原的结合活性，其中所述第一抗原是CD28而所述第二抗原是细胞因子。在具体的实施方案中，所述细胞因子可为GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-28、IL-33、LIF、TGFβ、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。

如本文中所述的域抗体还可与其他的免疫抑制剂/免疫调节剂和/或抗炎剂或疗法，如神经钙蛋白抑制剂(calcineuirin inhibitor)、环孢霉素(cyclosporine)、环磷酰胺(cytoxan)、泼尼松(prednisone)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、皮质类固醇(corticosteroids)、非甾类抗炎药(nonsteroidal antiinflammatory drugs)/Cox-2抑制剂、羟氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺吡啶(sulphasalazopryine)、金盐(gold salts)、依那西普(etanercept)、英夫利息单抗(infliximab)、阿那白滞素(anakinra)、咪唑立宾(mizoribine)、霉酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸吗乙酯(mycophenolatemofetil)、干扰素β-1a、干扰素β-lb、格拉默乙酸盐(glatiramer acetate)、盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)和/或其他生物制品如抗TNF组合施药。所述域抗体还可与一种或多种下述药剂组合施药以调节免疫应答：CTLA4、溶解性gp39(也称作CD40配体(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)、溶解性CD29、溶解性CD40、溶解性CD80、溶解性CD86、溶解性CD56、溶解性Thy-1、溶解性CD3、溶解性TCR、溶解性VLA-4、溶解性VCAM-1、溶解性LECAM-1、溶解性ELAM-1、溶解性CD44、与gp39具有反应性的抗体、与CD40具有反应性的抗体、与B7具有反应性的抗体、与CD28具有反应性的抗体、与LFA-1具有反应性的抗体、与LFA-2具有反应性的抗体、与IL-2具有反应性的抗体、与IL-12具有反应性的抗体、与IFN-γ具有反应性的抗体、与CD2具有反应性的抗体、与CD48具有反应性的抗体、与任何ICAM(例如ICAM-2)具有反应性的抗体、与CTLA4具有反应性的抗体、与Thy-1具有反应性的抗体、与CD56具有反应性的抗体、与CD3具有反应性的抗体、与CD29具有反应性的抗体、与TCR具有反应性的抗体、与VLA-4具有反应性的抗体、与VCAM-1具有反应性的抗体、与LECAM-1具有反应性的抗体、与ELAM-1具有反应性的抗体、与CD44具有反应性的抗体、针对白细胞受体(例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD 27、B7、CD40、CD45、CD58、CD 137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB)或其配体的单克隆抗体。确定最优的组合和剂量可使用本领域周知的方法来确定和优化。

当本发明的域抗体与另一种免疫抑制剂/免疫调节剂或抗炎剂或疗法(例如，如上所指明)“组合”施药时，该施药可伴随地(concomitantly)或按序地(in sequence)进行。当dAb伴随另一种药剂(如如上所指明的药剂)施药时，所述dAb和药剂可在相同的药物组合物中施药。

在一个实施方案中，提供了域抗体以供制备用于治疗患者的药物，其中所述患者需要结合CD28的域抗体。在一个实施方案中，所述患者受免疫性疾病折磨。

在一个方面，所述免疫性疾病是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病包括但不仅限于，阿狄森氏病(Addison’s disease)、变态反应(allergy)、变应性鼻炎(allergic rhinitis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、哮喘(asthma)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、耳部自身免疫性疾病(autoimmune diseases of the ear)、眼部自身免疫性疾病(autoimmune diseases of the eye)、自身免疫性萎缩性胃炎(autoimmune atrophic gastritis)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、自身免疫性溶血性(hymolytic)贫血(autoimmune hymolytic anemia)、自身免疫性腮腺炎(autoimmune parotitis)、自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis)、乳糜泻(celiac disease)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、良性淋巴细胞性aniitis(benign lymphocytic aniitis)、COPD、结肠炎(colitis)、冠心病(coronary heart disease)、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、糖尿病(diabetes)(I型)、抑郁症(depression)、糖尿病(包括I型和/或2型糖尿病)、附睾炎(epididymitis)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、古德帕斯丘氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、格雷夫斯氏病(Graves’disease)、格巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏病(Hashimoto’s disease)、溶血性贫血(hemolytic ahemia)、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura)、炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、针对重组药物产品(例如血友病中的因子VII)的免疫应答、幼年型特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、狼疮肾炎(lupus hephritis)、男性不育(male infertility)、混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease)、多发性硬化(multiple sclerosis)、重症肌无力(myasthenia gravis)、肿瘤(oncology)、骨关节炎(osteoarthritis)、疼痛(pain)、原发性粘液水肿(primary myxedema)、天疱疮(pemphigus)、恶性贫血(pernicious anemia)、多肌炎(polymyositis)、银屑病(psoriasis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)、反应性关节炎(reactive arthritis)、风湿热(rheumatic fever)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、结节病(sarcoidosis)、硬皮病(scleroderma)、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’s syndrome)、脊椎关节病(spondyloarthropathies)、交感性眼炎(sympathetic ophthalmia)、T细胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia)、睾丸抗中心T细胞淋巴瘤(testicular antiocentric T-cell lymphoma)、甲状腺炎(thyroiditis)、移植物排斥(transplant rejection)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis)和血管炎(vasculitis)。自身免疫性疾病包括但不仅限于，其中影响的组织是主要靶的病状，以及在一些情况下，影响的组织是次要靶的病状。上述病状包括但不仅限于：AIDS、特应性变态反应(atopic allergy)、支气管哮喘(brobchial asthma)、湿疹(eczema)、麻风病(1eprosy)、精神分裂症(schizophrenia)、遗传性抑郁症(inherited depression)、组织和器官的移植、慢性疲乏综合征(chronic fatigue syndrome)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、心肌梗死(myocardial infarction)、中风(stroke)、孤独症(autism)、癫痫(epilepsy)、阿蒂斯现象(Arthus’s phenomenon)、过敏反应(anaphylaxis)以及酒精和药物成瘾(alcohol and drug addiction)。

在另一方面，所述免疫性疾病是移植物相关疾病，如同种异体移植物排斥(allograft rejection)、异种移植物排斥(xenograft rejection)、移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)、急性移植排斥(acute transplantation rejection)和慢性移植排斥(chronic transplantation rejection)。

包括具有选自下组的至少三个特征的dAb：

a)阻止CD80和CD86结合CD28，

b)与T细胞受体信号传导组合时并不激动CD28信号传导，

c)对于结合CD28，具有约50nM至约1pM的K_d，

d)具有约15秒至约12小时的tα半衰期，

e)具有约12小时至约336小时的tβ半衰期，

f)结合MYPPPY序列，和

g)选自下组的CDR1序列：SEQ ID NO：484、SEQ ID NO：487、SEQID NO：490、SEQ ID NO：493、SEQ ID NO：496、SEQ ID NO：499、SEQ IDNO：502、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：511、SEQ IDNO：514、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：523、SEQ IDNO：526、SEQ ID NO：529和SEQ ID NO：636；选自下组的CDR2序列：SEQID NO：485、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：491、SEQ ID NO：494、SEQ IDNO：497、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：506、SEQ IDNO：509、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：518、SEQ IDNO：521、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：530和SEQ IDNO：637；以及选自下组的CDR3序列：SEQ ID NO：486、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：492、SEQ ID NO：495、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：501、SEQID NO：504、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：513、SEQ IDNO：516、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：525、SEQ IDNO：528、SEQ ID NO：531和SEQ ID NO：638。

还包括编码本文中公开的dAb的核酸。

包括拮抗CD28的方法，其包括将有效量的本文中公开的dAb施药于个体。还包括拮抗CD28结合的方法，其包括将有效量的本文中公开的dAb施药于个体，其中所述dAb在个体中拮抗CD28对CD80和/或CD86的结合。

还包括治疗、缓解或预防免疫性疾病(如自身免疫性疾病或移植物相关疾病)的症状的方法，其包括将有效量的本文中公开的dAb施药于罹患或有风险罹患免疫性疾病的个体。包括治疗、缓解或预防免疫性疾病的方法，其包括将有效量的本文中公开的dAb施药于罹患或有风险罹患免疫性疾病的个体。

本文中包括包含治疗有效量的本文中公开的dAb和药学可接受载体的药物组合物。

包括本文中公开的dAb在制备用于在有此需要的患者中治疗或预防免疫性疾病的药物中的用途。还包括本文中公开的dAb在制备用于在有此需要的患者中治疗或预防免疫性疾病的症状的药物中的用途。本文中还包括本文中公开的dAb在制备用于在有此需要的患者中缓解免疫性疾病的至少一种症状的药物中的用途。

附图简述

图1，包含图1A和1B，是一系列描述本文中所述的抗人CD28域抗体并不呈现激动剂活性的图像。图1A说明增加多种dAb的浓度并不激活CD28，而抗CD3抗体(OKT3)对照添加于PBMC时，显示CD28的激活。将域抗体(dAb)和抗体添加于用从正常供体的全血分离的PBMC接种的96孔板中。图1B说明dAb、抗CD28(9.3)、抗CD3(OKT3)或同种型对照固定于96孔圆底板时不在添加于孔中的PBMC中呈现激动剂活性。

图2是描述抗人CD28域抗体添加于用抗CD3(G19-4，在PBS中10μg/ml)包被的96孔平底板时并不呈现共激动剂活性的图像。将每种dAb以终浓度30μg/ml与纯化的T细胞一同添加至孔。作为阳性对照，以终浓度1μg/ml添加抗CD28(mAb 9.3)替代dAb。

图3是描述本文中所述的域抗体体内抑制T细胞增殖的图像。

图4，包含图4A和4B，是一系列描述9日受体占据研究的结果的图像，该研究使用dAb 1m-74-15-40L。图4A说明用腹膜内dAb给药的受体占据。图4B说明用皮下dAb给药的受体占据。

图5描述了dAb 1h-99-2P40-分支和1h-99-2P40-线性在猕猴研究中的历时血浆浓度。

图6显示了单克隆噬菌体展示域抗体克隆针对重组人CD28/Fc嵌合物和Fc对照包被的板的结合的ELISA。

图7显示溶解性单克隆域抗体结合重组人CD28/Fc嵌合物和Fc对照包被的板的ELISA。

图8显示dAb克隆结合用12500单位CD28-Fc包被的CM5芯片的BIAcore示踪。

图9A和图9B显示域抗体克隆在重复的基于细胞的“体外”测定法中抑制CD28活性的能力。在这些测定法中，用抗CD3加上经转染表达CD80或CD86之一的CHO细胞刺激人CD4阳性T细胞。

图10显示抗CD28域抗体缺乏激动剂活性。在图10A中，将PBMC暴露于抗CD28域抗体239-891-D70C或促有丝分裂的抗CD28抗体5.11A1。在第3日通过³[H]-胸苷掺入来测量细胞增殖，如示于图10A，并测量IL-2产生，如示于图10B的。

详述

本公开提供了拮抗CD28活性的域抗体。所述域抗体可连接于聚合物以改善药动学特性，如稳定性和半衰期。本文中包括用于将聚合物分子(例如，聚乙二醇；PEG)附于蛋白质以调节修饰的蛋白质的药动学特性的组合物和方法。例如，已显示蛋白质的PEG修饰改变该蛋白质的体内循环半衰期、抗原性、溶解性和对蛋白质水解的抗性(Abuchowski等(1977)J.Biol.Chem.，252：3578；Nucci等(1991)Adv.Drug Delivery Reviews 6：133；Francis等，Pharmaceutical Biotechnology Vol.3(Borchardt，R.T.ed.)；及Stability of Protein Pharmaceuticals：in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pp235-263，Plenum，NY)。

1.定义和缩写

1.1.定义

根据该详细说明书，适用下述缩写和定义。应注意如本文中所用的单数形式“一/一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”也指其复数，除非上下文明确地另有规定。因此，例如，提及“一个抗体”包括多个该抗体，而提及“所述剂量”包括提及一种或多种剂量及本领域技术人员已知的其等同形式，等等。

除非另有规定，本文中使用的所有的技术和科学术语具有与本领域一般技术人员通常所理解的相同的含意。除非另行指明，本文中所述的所有范围均包含特定的端点。以下给出了下述术语。

如本文所使用的术语“人”，当用于域抗体或用于免疫球蛋白可变域时，意指所述多肽具有衍生自人免疫球蛋白的序列。当序列是：a)从人个体或从来自人个体的细胞或细胞系分离的时；b)从克隆的人抗体基因序列文库(或人抗体V域序列文库)分离的时；或c)当克隆的人抗体基因序列(或克隆的人V区序列(包括，例如，种系V基因区段))用于生成一种或多种多样化序列，并然后用该序列选择针对所需靶抗原的结合时，则该序列“衍生自”人免疫球蛋白编码序列。

最低限度，人域抗体与天然出现的人免疫球蛋白可变域序列(例如，Kabat(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，US Department of Health and Human Services 1991)中公开的天然出现的人免疫球蛋白可变域序列)具有至少70％相同，至少75％相同，至少80％相同，至少具有85％氨基酸同一性(包括，例如87％、90％、93％、95％、97％、99％或更高的同一性)。

如本文所使用的术语“域”指下述折叠的蛋白质结构，其独立于所述蛋白的其余部分保留其三级结构。一般而言，域负责蛋白质的分立的功能性特征，且在多种情况下，可添加、去除或转移至其他蛋白质而不丧失所述蛋白质其他部分和/或该域的功能。

“域抗体”意指下述折叠的多肽域，其包含免疫球蛋白可变域特征性的序列，且其特异性结合抗原(例如，解离常数为500nM或更小)。因此，“域抗体”包括完整的抗体可变域以及修饰的可变域，例如，其中一个或多个环由并非抗体可变域特征性的序列替换的域，或经截短或包括N-或C-端延伸的抗体可变域，以及保留500nM或更小(例如，450nM或更小、400nM或更小、350nM或更小、300nM或更小、250nM或更小、200nM或更小、150nM或更小、100nM或更小)解离常数和全长域的靶抗原特异性的折叠可变域片段。当必要时，或有任何疑问时，由Kabat等(Kabat等(1991)Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health & Human Services，Washington，D.C.)所述的编号规则和边界适用于本文中提及的免疫球蛋白可变域和恒定域。

在本文中，“dAb”可与“域抗体”互换使用。

如本文中使用的域抗体指哺乳动物免疫球蛋白多肽，其包括人，但也包括啮齿类(例如，如公开于WO00/29004中的，其内容以提述的方式全文并入本文)或驼类V_HHdAb。驼类dAb是衍生自下述物种的抗体单一可变域多肽，所述物种包括骆驼、美洲驼羊(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和大羊驼(guanaco)，并包含天然缺乏轻链的重链抗体：V_HH。V_HH分子比IgG分子小大约10倍，并且作为单一多肽，其非常稳定，耐受极端pH和温度环境。

驼类抗体描述于例如美国专利5,759,808；5,800,988；5,840,526；5,874,541；6,005,079和6,015,695号，其每一个的内容均以提述的方式全文并入本文。在例如WO04/041862中，教导了人源化驼类V_HH多肽，其教导以提述的方式全文并入本文。本领域技术人员会理解，可对天然出现的驼类抗体单一可变域多肽根据WO04/041862的教导进行修饰(例如，在45和103位的氨基酸替代)以生成人源化驼类V_HH多肽。本文中还包括为铰口鲨(nurse shark)V_HH的抗体单一可变域多肽。铰口鲨V_HH dAb描述于例如Greenberg等(1995)Nature 374：168-173和美国公开20050043519号。

如本文中使用的短语“免疫球蛋白可变域特征性的序列”指在20或更多个、25或更多个、30或更多个、35或更多个、40或更多个、45或更多个、或甚至50或更多个连续氨基酸上与免疫球蛋白可变域序列包含的序列相同的氨基酸序列。

与本文中公开的序列相似或相同(例如，至少约70％序列同一性)的序列也包括在本文中。在一些实施方案中，序列同一性在氨基酸水平可为约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在核酸水平，序列同一性可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。或者，当核酸区段在选择性杂交条件下(例如，非常高的严格杂交条件)与所述链的互补链杂交，则存在实质性的同一性。所述核酸可存在于全细胞中，细胞裂解物中或以部分纯化或实质性纯的形式存在。

如本文中使用的术语“同一性”指两个核苷酸或氨基酸序列结构上彼此类似的程度。如本文中使用的序列“相似性”是氨基酸序列在序列比对中在相应位置共享类似的氨基酸残基的程度的量度。当氨基酸侧链相似时，其为彼此相似的。具体而言，“相似性”涵盖彼此为保守替代物的氨基酸。“保守”替代是任何在blosum62替代矩阵(Hentikoff和Hentikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)中具有正得分的替代。表述“序列A与序列Bn％类似”意指在序列A和B之间的最优全局比对的位置中的n％由相同的氨基酸或保守替代组成。如本文中使用的，当使用Needleman-Wunsch算法或由Tatusova & Madden(1999)FEMS Microbiol Lett.174：247-250描述的所谓“BLAST 2序列”算法进行比对时，两个序列彼此“类似”或共享“百分比同一性”。当使用“BLAST 2序列算法”比对氨基酸序列时，Blosum 62矩阵是缺省矩阵。最优全局比对可使用下述参数在Needleman-Wunsch比对算法中进行：

对于多肽：

替代矩阵：blosum62.

缺口评分函数：-A-B*LG，其中A＝11(缺口罚分)，B＝1(缺口长度罚分)，而LG是缺口长度。

对于核苷酸序列：

替代矩阵：10为匹配，0为错配。

缺口评分函数：-A-B*LG，其中A＝50(缺口罚分)，B＝3(缺口长度罚分)，而LG是缺口长度。

使用软件AlignX，Vector NTI Suite 8.0(InforMax，Inc.)的一个组件，使用Clustal W算法(1994)Nucleic Acid Research，22(22)：4673-4680创建比对。使用该方法时，计算所有序列对之间的粗略相似性，称为“对比对(parities alignment)”。然后使用这些得分计算“向导树(guide tree)”或树状图，其告知在多个比对阶段，比对序列以实现最终多重比对的次序。计算出树状图之后，将序列在越来越大的组中进行比对，直至全部序列并入最终的比对。

或者，氨基酸和核酸序列的同一性的计算在本文中是使用软件AlignX，用下述参数确定的：

使用FAST算法：关

K-元组(tuple)大小：1

最佳对角线的数目： 5

窗口大小： 5

缺口罚分： 3

缺口开放罚分： 10

缺口延伸罚分： 0.1

针对AlignX的多重比对设定如下所述设置：

缺口开放罚分： 10

缺口延伸罚分： 0.05

缺口分离罚分范围： 8

无末端缺口分离罚分未选择

比对延迟的％同一性： 40

残基特异性缺口排除：未选择

亲水残基缺口排除：未选择

过渡权重： 0

典型的保守替代为Met、Val、Leu和Ile之间的交换；Ser和Thr之间的交换；残基Asp、Glu和Asn之间的交换；残基Gln、Lys和Arg之间的交换；或芳香族残基Phe和Tyr之间的交换。

如本文中使用的术语“表位”指常规地由免疫球蛋白V_H/V_L对结合的结构单元。表位限定对于抗体最低限的结合位点，并因此代表抗体的特异性的靶。在域抗体的情况中，表位代表由域抗体孤立地结合的结构单元。即，其结合位点是由一个单一的免疫球蛋白可变域提供的。表位可为线性的或构象的，且可小至三个氨基酸。

如本文中使用的术语“延长释放”，或等同术语“控制释放”或“缓慢释放”指在施药于个体之后在一段时间内释放活性药物如多肽药物的药物配制剂。多肽药物的延长释放取决于药物配制剂可发生在所需时间范围(例如，数分钟，数小时，数日，数周或更长)内，这与标准配制剂形成对比，其中基本上整个剂量单位通过血流可供立即吸收或立即分配。延长释放配制剂可从一次施药导致持续的循环药物水平，例如，持续8小时或更久，12小时或更久，24小时或更久，36小时或更久，48小时或更久，60小时或更久，72小时或更久，84小时或更久，96小时或更久，或甚至，例如1周或2周或更久，例如1个月或更久。

如本文中使用的“CD28活性”是参与CD80、CD86和/或另一种配体结合CD28，或由该结合导致的活性，并包括但不仅限于，激活CD28介导的细胞信号传导。CD28活性还包括诱导T细胞增殖和诱导T细胞分泌细胞因子例如白介素2(IL-2)。

如本文中使用的术语“基本上不激动”意指给定药剂例如域抗体，基本上不激活一种或多种D28活性，其中术语“激活”如本文中定义。具体而言，“基本上不激动”的试剂意指所述试剂并不激活多于20％的由CD80和/或CD86结合CD28激活的活性，并且在一方面，所述试剂并不激活多于约10％、8％、5％、3％或2％或更少的由CD80和/或CD86结合CD28激活的活性，包括零激活。作为非限定性实例，本文中所述的基本上不刺激CD28活性的域抗体激动的CD28活性不多于由抗CD28mAb 9.3(Gibson，等(1996)JBC，271：7079-7083)在其它方面相同的测定条件下激动CD28活性获得的活性的5％。

如本文中使用的术语“抑制”指给定可测量的活性(例如，结合活性)相对参照减少至少10％。当需要抑制时，此类抑制为至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或更多，高至包括100％，即，给定活性的完全抑制或丧失。对CD28结合CD80或CD86的抑制可如本文中工作实施例中所述进行测量。如本文中使用的术语“实质性抑制”指给定可测量的活性(例如，CD28对CD80或CD86的结合)相对参照减少至少50％。例如，“实质性抑制”指给定可测量的活性相对于参照减少至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，并高至包括100％。如本文中使用的“抑制结合”，当提及域抗体结合CD28，或CD80结合CD28，或CD86结合CD28时，指结合相对于参照减少至少10％。“抑制结合”指结合减少至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，高至包括100％。

如本文中使用的术语“激活”和“活化”指给定可测量的活性相对于参照增加至少5％，例如至少10％、25％、50％、75％，或甚至100％或更多。

如本文中使用的术语“CD28拮抗剂”指通过抑制CD80和/或CD86对CD28的结合抑制至少一种由CD28介导的活性的试剂。如果CD28活性在拮抗剂存在时相对于不存在时减少至少10％，且在示例性实施方案中，至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％，或甚至100％(即，无活性)，则CD28活性“被拮抗”。在示例性实施方案中，如本文中使用的术语CD28拮抗剂包括单价结合CD28的域抗体。作为非限定性实施例，本文中所述的CD28拮抗剂是抑制部分或全部CD28活性的试剂，且同时该试剂与T细胞受体信号传导组合时并不实质性激动CD28活性。

如本文中使用的术语“优先抑制”如用于如“其中域抗体相对于CD80对CD28的结合优先抑制CD86对CD28的结合”的短语时，意指所述域抗体相对于如上所定义对CD80结合CD28抑制的量，实现更高的如上所定义对CD86结合CD28抑制的量。

如本文中使用的术语“CD28激动剂”指单独地或当与另一种共刺激组合时，相对于参照激活至少一种由CD28介导的活性的试剂。如果活性在激动剂存在时相对于其不存在时，增加至少约10％，例如50％，则该活性被“激动”。

如本文中使用的抑制“CTLA4活性”包括但不仅限于，抑制T细胞功能。上述功能包括T细胞受体介导的信号传导、T细胞增殖和细胞因子分泌的诱导等。

如本文中使用的“免疫性疾病”指任何与免疫反应包括细胞和/或体液免疫反应在个体中的形成相关的疾病。免疫性疾病的实例包括但不仅限于，炎症、变态反应、自身免疫性疾病和移植物相关疾病。

如本文中使用的“自身免疫性疾病”指其中个体免疫应答针对该个体自身的构成成分的疾病状况和状态，其导致不想要的且常常使人衰弱的状况。如本文中使用的“自身免疫性疾病”意图还包括自身免疫性病状，综合征等。自身免疫性疾病包括但不仅限于，阿狄森氏病、变态反应、变应性鼻炎、强直性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化、耳部自身免疫性疾病、眼部自身免疫性疾病、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性溶血性(hymolytic)贫血、自身免疫性腮腺炎、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜泻、原发性胆汁性肝硬化、良性淋巴细胞性aniitis、COPD、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病、糖尿病(I型)、抑郁症、糖尿病(包括I型和/或2型糖尿病)、附睾炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯氏病、格巴二氏综合征、桥本氏病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病(IBD)、针对重组药物产品(例如血友病中的因子VII)的免疫应答、幼年型特发性关节炎、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、男性不育、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、肿瘤、骨关节炎、疼痛、原发性粘液水肿、天疱疮、恶性贫血、多肌炎、银屑病、银屑病关节炎、反应性关节炎、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病、交感性眼炎、T细胞淋巴瘤、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、睾丸抗中心(antiocentric)T细胞淋巴瘤、甲状腺炎、移植物排斥、溃疡性结肠炎、自身免疫性葡萄膜炎和血管炎。自身免疫性疾病包括但不仅限于，其中影响的组织是主要靶的病状，以及在一些情况下，影响的组织是次要靶的病状。上述病状包括但不仅限于：AIDS、特应性变态反应、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织和器官的移植、慢性疲乏综合征、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、心肌梗死、中风、孤独症、癫痫、阿蒂斯现象、过敏反应以及酒精和药物成瘾。

如本文中使用的术语“抗体多肽”指其为修饰的或未修饰的抗体或抗体部分的多肽，其保留特异性结合抗原的能力。因此，术语抗体多肽包括结合抗原的重链、轻链、重链-轻链二聚物、Fab片段、F(ab’)₂片段、dAb或Fv片段，包括单链Fv(scFv)。短语“抗体多肽”意为涵盖下述重组融合多肽，其包含在融合背景中保留特异性结合抗原的能力的抗体多肽序列。

如本文中使用的术语“单价”意指给定的域抗体仅锰结合其靶的单一分子。天然出现的抗体通常是二价的，因为其具有两个功能性的抗原结合环，每个均包含VH和VL域。当位阻不成问题时，二价抗体能结合相同抗原的两个分开的分子。与之相对，“单价”抗体具有仅结合一个此类抗原分子的能力。如该术语在本文中使用的，“单价”抗体还可包含多于一个抗原结合位点，例如，两个抗原结合位点，但所述结合位点必需是针对不同抗原的，从而使得该抗体仅能一时结合一个分子的CD28。单价抗体的抗原结合域可包含V_H和V_L域，但在一方面，仅包含单一的免疫球蛋白可变域，即V_H或V_L域，其分别具有无需对应的V_L或V_H域而结合CD28的能力。单价抗体缺乏交联单一抗原的分子的能力。

如本文中使用的术语“标准血小板聚集测定法”意指描述于本文中下述标题为“血小板聚集测定法”一节的测定法。

如本文中使用的术语“V_H域”和“V_L域”指如Kabat等(Kabat等(1991)Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health & Human Services，Washington，D.C.，以提述的方式并入本文)定义的免疫球蛋白可变区。

如本文中使用的“连接的”指聚合物部分如PEG附于域抗体的氨基酸残基。PEG聚合物附于域抗体的氨基酸残基，例如域抗体，称作“PEG化”，且可使用几种包括但不仅限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯、丙酸琥珀酰亚胺酯(SPA)、马来酰亚胺(MAL)、乙烯基砜(VS)或硫醇的PEG附加部分来达成。PEG聚合物，或其他聚合物，可在预决位置连接于域抗体，或可随机连接于所述域抗体分子。PEG聚合物可在预决位置连接于域抗体。PEG聚合物可连接于域抗体中的任何残基，然而，优选所述聚合物连接于赖氨酸或半胱氨酸，其天然出现在所述域抗体中或经工程改造(例如，通过将所述域抗体中天然出现的残基诱变为半胱氨酸或赖氨酸)引入所述域抗体。PEG连接还可通过附于域抗体的肽接头来介导。即，所述PEG部分可附于融合于域抗体的肽接头，其中所述接头提供供PEG附着的位点，例如游离的半胱氨酸或赖氨酸。如本文中使用的“连接”还可指两个或更多个域抗体例如dAb单体的联合，以形成二聚物、三聚物、四聚物或其他多聚物。域抗体单体可通过本领域已知的几种方法连接以形成多聚物，其包括但不仅限于，将所述域抗体单体作为融合蛋白表达，将两个或更多个单体通过单体之间的肽接头连接，或在翻译之后通过化学方法将单体直接彼此连接，或通过二硫键经接头来连接，或通过连接于二、三或多价连接部分(例如，多臂PEG)来连接。当本文中具体考虑到dAb多聚物时，例如，在双重或多重特异性域抗体构建物的上下文中，须强调对于任何给定域抗体构建物，该构建物应仅能够结合一个分子的CD28，即，所述构建物应仅具有一个CD28结合元件，且不应交联CD28。

如本文中使用的“聚合物”指由重复单体单元构成的大分子，并可指合成的或天然出现的聚合物，如任选地取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物或支化或未支化的多糖。如本文中使用的“聚合物”具体指任选地取代的或支链的聚乙二醇、聚丙二醇或聚乙烯醇及其衍生物。

如本文中使用的“PEG”或“PEG聚合物”指聚乙二醇，且更具体而言可指PEG的衍生形式，包括但不仅限于PEG的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯如丙酸琥珀酰亚胺酯、苯并三唑活性酯、用马来酰亚胺、乙烯基砜或硫醇基团衍生化的PEG。例如，PEG制剂可包括PEG-O-CH₂CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-O-CH₂-NHS；PEG-O-CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-S-CH₂CH₂-CO-NHS；PEG-O₂CNH-CH(R)-CO₂-NHS；PEG-NHCO-CH₂CH₂-CO-NHS和PEG-O-CH₂-CO₂-NHS；其中R是(CH₂)₄)NHCO₂(mPEG)。本文中所述的PEG聚合物可为线性分子，或可为支化的，其中多个PEG部分存在于单一聚合物中。一些代表性PEG构造包括但不仅限于下列：

如本文中使用的“巯基选择性试剂”为可用于将PEG聚合物附于含有硫醇的氨基酸的试剂。氨基酸残基半胱氨酸上的硫醇基团特别有用于与巯基选择性试剂相互作用。可用于上述附着的巯基选择性试剂包括但不仅限于马来酰亚胺、乙烯基砜和硫醇。巯基选择性试剂用于偶联于半胱氨酸残基的用途在本领域是已知的，且可根据需要加以适应(参见，例如Zalipsky(1995)Bioconjug.Chem.6：150；Greenwald等(2000)Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17：101；Herman等(1994)Macromol.Chem.Phys.195：203)。

在示例性实施方案中，将PEG或另一种试剂例如HSA附于本文中所述域抗体并不会损害所述多肽特异性结合CD28的能力。即，所述PEG连接的域抗体相对于其非PEG连接的对应物，会保留其结合活性。如本文中使用的“保留活性”指PEG连接的域抗体的活性水平是非PEG连接的域抗体活性水平的至少10％，包括为包含相同抗原结合域的非PEG连接的域抗体的活性的至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％并高至90％，包括高至约95％，98％和高至100％。更具体而言，PEG连接的域抗体的活性，相比非PEG连接的域抗体而言，应由抗体多肽的摩尔数来确定；即，在每次试验中，应使用相同摩尔数的PEG连接的和非PEG连接的域抗体。为了确定具体的PEG连接的域抗体是否“保留活性”，PEG连接的域抗体的活性可与不具有PEG的相同域抗体的活性进行比较。

如本文中使用的术语“体内半衰期”指在体内配体(例如，域抗体)的血清浓度由于例如配体的降解和/或配体通过自然机理的清除或隔绝而减少约50％所需的时间。本文中所述的域抗体可在体内通过结合耐受降解和/或清除或隔绝的分子如PEG而稳定化和延长其半衰期。如果域抗体的功能性活性在体内比类似的未连接PEG聚合物的抗体多肽存留更长的时间，则域抗体的半衰期是延长的。通常而言，经PEG化的域抗体的半衰期相对于未PEG化的域抗体延长至少约10％、20％、30％、40％、50％或更多。在2X、3X、4X、5X、10X、20X、30X、40X、50X或更高范围内的半衰期延长是可能的。或者，或此外，高至30X、40X、50X、60X、70X、80X、90X、100X或150X范围内的半衰期延长是可能的。如本文中所述，PEG连接的域抗体具有0.25至170小时的半衰期，包括1至100小时，还包括30至100小时，且仍旧还包括50至100小时，以及高至170、180、190和200小时或更久。

如本文中使用的“对降解是耐受的”或“耐受降解”，当提及PEG或其他聚合物连接的域抗体单体或多聚物时，意指当在pH 2.0暴露于胃蛋白酶30分钟时，所述PEG或其他聚合物连接的域抗体单体或多聚物降解不多于约10％，且在一方面，完全未降解。

如本文中使用的“流体动力学大小”指基于分子通过水溶液的扩散而得的分子(例如，蛋白质分子)的表观大小。蛋白质通过溶液的扩散或运动可经处理以推导蛋白质的表观大小，其中大小由蛋白质颗粒的“Stokes半径”或“流体动力学半径”给出。蛋白质的“流体动力学大小”取决于质量和形状(构象)，从而使得两个具有相同分子量的蛋白质可基于蛋白质的总体构象而具有不同的流体动力学大小。流体动力学大小是通过，例如大小排阻层析测量的。PEG连接的抗体多肽(例如域抗体)的流体动力学大小可在约24kD至500kD；30至500kD；40至500kD；50至500kD；100至500kD；150至500kD；200至500kD；250至500kD；300至500kD；350至500kD；400至500kD以及450至500kD的范围内。在一方面，PEG化的域抗体的流体动力学大小为约30至40kD；70至80kD或200至300kD。当需要域抗体用于成像应用时，域抗体应具有约50至100kD的流体动力学大小。或者，当需要域抗体用于治疗应用时，域抗体制备物应具有大于约200kD的流体动力学大小。

如本文中使用的术语“IC₅₀”指抑制给定活性约50％所需的抑制剂浓度。IC₅₀是如下确定的，即在不同量的抑制剂(例如，域抗体)的存在下测定给定活性例如CD28对CD80或CD86的结合，并将抑制剂浓度针对靶向的活性作图。CD28对CD80或CD86的结合在本文中是通过描述于工作实施例中的方法测量的。或者，可使用表面等离振子共振(SPR)。

如本文中使用的术语“EC₅₀”指在受试者中引起反应的化合物或域抗体的浓度，其中所述反应是基线反应和最大反应之间的一半。受试者的基线反应和最大反应，当关于化合物或域抗体时，可通过本领域任何已知的技术确定。

如本文中使用的术语“融合于域抗体”一般而言意指多肽通过使用重组DNA技术融合于给定抗体，虽然融合可在蛋白质水平通过化学方法进行。因此，“融合于”另一多肽的抗体，例如，融合于具有不同结合特异性的另一抗体的抗体，并不天然存在，并为通过重组手段生成的。术语“融合于域抗体”还涵盖多肽通过例如二硫化物或其他化学连接而连接于给定域抗体，其中所述融合的多肽并未天然地发现融合于所述域抗体。将多肽融合于另一多肽(例如，抗体)的重组方法和化学方法在本领域是众所周知的。

如本文中使用的术语“Fc域”指包含如根据Kabat等(见上)限定的CH2和CH3恒定域的恒定域抗体序列。重链多肽的Fc部分具有自行联结的能力，该功能促进二价抗体的形成。术语“缺乏Fc域”意指给定的域抗体至少缺乏免疫球蛋白Fc域中(这些域如根据Kabat等，1991，Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health & Human Services，Washington，D.C.所定义)足以介导含有Fc的域抗体二聚化的部分。含有Fc的域抗体的二聚化是通过，例如层析方法或通过表面等离振子共振测量的。缺乏Fc域的域抗体避免了Fc-血小板相互作用，并因此避免对血小板聚集的诱导。

如本文中使用的“治疗”、“减弱”、“预防”或“减轻”等当涉及疾病症状时，指基于可临床测量的参数，症状降低至少10％，或基于临床上接受的疾病或症状严重性量表，降低至少一个点。如本文中使用的术语“系统性红斑狼疮的症状”指本领域技术人员已知的SLE的任何临床相关症状。非限定性的实例包括IgG自身抗体(例如，针对核抗原如染色质、snRNP(特别是U1、Sm、Ro/SSA和La/SSB)、磷脂和细胞表面分子)的积聚、溶血性贫血、血小板减少、白细胞减少、肾小球肾炎、血管炎、关节炎和浆膜炎。上述症状的降低是可临床测量的参数降低至少10％，或基于临床上接受的疾病严重性量表，降低至少一个点。

如本文中使用的短语“特异性结合”指域抗体以1μM或更小的解离常数(K_d)结合抗原，所述解离常数通过表面等离振子共振分析使用例如BIAcore^TM表面等离振子共振系统和BIAcore^TM动力学评估软件(例如2.1版本)所测得。对于特异性结合相互作用的亲和力或K_d，在一方面，是约500nM或更小，而在另一方面，约300nM或更小。

如本文中使用的“类属配体”是与给定的全集(repertoire)(例如，在噬菌体展示文库中)的实质性比例的功能性成员结合的配体。因此，相同的类属配体能结合所述全集中的许多成员，而无论其靶配体特异性。一般而言，功能性类属配体结合位点的存在表明所述全集成员的表达和折叠是正确的。因此，类属配体对其结合位点的结合提供了用于从多肽全集中预选择功能性多肽的方法。类属配体包括，例如，蛋白A，蛋白G和蛋白L。

如本文中使用的术语“通用框架”指与抗体中序列保守的区域(如Kabat(Kabat等(1991)Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health& Human Services，Washington，D.C.)所定义的)对应的单一抗体框架序列，或者指与如Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：910-917所定义的人种系免疫球蛋白全集或结构对应的单一抗体框架序列。本文中包括单一框架，或一组该框架的用途，已发现所述框架任选仅通过高变区中的变化即可得到事实上任何结合特异性。

本领域一般技术人员应理解术语“约”，且会根据其使用的上下文进行一定程度的变动。一般而言，“约”涵盖所述值加上/减去10％的值的范围。

如本文中使用的术语“对应”，当关于蛋白质或核酸序列和/或域时，指在不同蛋白质上的同源序列或结构。例如，小鼠肌球蛋白的钙结合域与人肌球蛋白的钙结合域“对应”。

1.2.缩写

下述为本文中使用的术语和相关缩写的列表，其适用于所述术语，除非用具体术语和缩写另行指明。

提供了单价结合CD28的域抗体。虽不愿拘于任何具体理论，但相信CD28结合的单价去除了现有技术抗体存在的交联细胞表面受体的可能性。因此，在一方面，本文中公开的域抗体不仅抑制或拮抗CD80或CD86对CD28的结合，而且其基本上不激动CD28活性。

在一方面，对CD28结合为单价的抗体是人域抗体。人域抗体可施药于人类患者，而很大程度上避免了常常由来自其他物种例如小鼠的抗体施药所引起的抗抗体免疫应答。尽管鼠类抗体可通过将人恒定域嫁接至鼠类抗原决定域而“人源化”，如本文中公开的人抗体的产生无需费力和耗时地对鼠类抗体序列进行遗传操作。

2.单价域抗体

抗体的重和轻多肽链包含直接参与抗原相互作用的可变(V)区，和提供结构支持和在与免疫效应物的非抗原特异性相互作用中发挥功能的恒定(C)区。常规抗体的抗原结合域由两个不同的域组成：重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L，其可为V_κ或V_λ)。抗原结合位点本身是由六个多肽环形成的：三个来自V_H域(H1、H2和H3)，而三个来自V_L域(L1、L2和L3)。在体内，编码V_H和V_L的V基因的多样性原始全集是通过基因区段的组合重排来产生的。C区包含轻链C区(称作C_L区)和重链C区(称作C_H1、C_H2和C_H3区)。天然出现的抗体通常包含两个抗原结合域，并因此是二价的。

在蛋白酶消化之后，鉴定了天然出现的抗体的多种较小抗原结合片段。其包括，例如，“Fab片段”(V_L-C_L/C_H1-V_H)、“Fab’片段”(具有重链铰链区的Fab)和“F(ab’)₂片段”(由重链铰链区连接的Fab’片段的二聚物)。已使用重组方法以生成上述片段，并生成甚至更小的抗原结合片段，例如那些称作“单链Fv”(可变片段)或“scFv”的，其由通过肽接头连接的V_L和V_H组成(V_L-接头-V_H)。Fab片段、Fab’片段和scFv片段对于抗原结合是单价的，因为其每一个均仅包含一个抗原结合域，该域包含一个V_H/V_L二聚物。

域抗体，或“dAb”独立于其他V域结合抗原；然而，域抗体可与其他V_H或V_L一起存在于同多聚物或异多聚物中，其中并不需要所述其他域来实现dAb的抗原结合，即，其中所述dAb独立于其他的V_H或V_L域结合抗原。在本文中域抗体的制备描述并示例如下。

抗体单一可变域，例如，V_HH，是已知的结合抗原的最小抗体单位。对于在治疗中的用途，人抗体是特别有利的，主要是因为当其施药于患者时，不太可能引发免疫应答。驼类V_HH与人抗体V_H域的比较揭示了与人V_H域的V_H/V_L界面对应的驼类V_HH域的框架区中的几个关键性差异。将人V_H3的这些残基突变为更加近似V_HH序列(特别是Gly44→Glu，Leu 45→Arg和Trp47→Gly)以产生“驼化的”人V_H域，其保留抗原结合活性(Davies & Riechmann(1994)FEBS Lett.339：285-290)，同时改善了表达和溶解性。(本文中使用的可变域氨基酸编号与Kabat编号规则(Kabat等(1991)Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health & Human Services，Washington，D.C.)一致。)WO 03/035694(Muyldermans)报道了Trp 103→Arg突变改善了非驼类V_H域的溶解性。Davies & Riechmann(1995)Biotechnology N.Y.13：475-479也报道了产生噬菌体展示的驼化人V_H域全集和选择以在100至400nM范围内的亲和力结合半抗原的克隆，但是所选的用于结合蛋白质抗原的克隆具有较弱的亲和力。

域抗体可以以几种不同方式生成。例如，编码已知结合CD28的抗体的重链和轻链的核酸序列可经操作以生成多种不同的对于CD28结合是单价的域抗体。因此，给予编码构成抗体的重链和轻链多肽的序列和标准的分子克隆方法，可生成单价的抗原结合多肽构建物如Fab片段、scFv、dAb或甚至双特异性抗体(即，包含两种不同的抗原结合部分的抗体，并因此能结合两种不同的抗原，且在一方面，为同时结合)，这些对于CD28结合是单价的。

2.1.设计域抗体的一般性策略和方法

生成对CD28有特异性的域抗体的一个手段是扩增并表达例如从表达域抗体的杂交瘤(例如，小鼠杂交瘤)分离的重链和轻链基因序列的V_H和V_L区。Kabat等展示了V_H和V_L域的边界(Kabat等(1991)Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health & Human Services，Washington，D.C.)。将关于重链和轻链基因V_H和V_L域的边界的信息用于设计PCR引物以从编码已知结合CD28的抗体的重链或轻链编码序列中扩增V域。将扩增的V域插入合适的表达载体，例如，pHEN-1(Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.19：4133-4137)，并且例如作为V_H和V_L的融合以scFv或其他合适的单价形式进行表达。然后对所得的多肽就其对CD28的高亲和力单价结合进行筛选。对结合的筛选是与本文中所述的方法一同如本领域已知的或如本文中下面所述的那样进行的。

或者，可使用文库筛选方法以鉴定单价CD28特异性结合蛋白。噬菌体展示技术(参见，例如Smith(1985)Science 228：1315；Scott & Smith(1990)Science 249：386；McCafferty等(1990)Nature 348：552)提供了从域抗体的大且多样的全集中选择结合需要的靶的域抗体的方法。可将这些噬菌体抗体文库分组为两类：使用从人B细胞收获的重排的V基因的天然文库(Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Vaughan等(1996)Nature Biotech.，14：309)或者其中种系V基因区段或其他域抗体编码序列在体外经“重排”(Hoogenboom &Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Nissim等(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths等(1994)EMBO J.，13：3245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，248：97)或其中将合成CDR掺入单一重排的V基因(Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457)的合成文库。涉及遗传展示包(genetic display package)(例如，噬菌体展示，多核糖体展示)的方法非常适于选择单价CD28特异性抗体构建物，这是因为在展示包上，一般仅表达单价片段，而非完整的二价抗体。用于制备展示多种抗体片段的噬菌体展示文库的方法描述于前述文献。上述方法还描述于，例如，美国专利6,696,245号，其以提述的方式并入本文。描述于该‘245专利中的方法一般地涉及将免疫球蛋白基因编码区，特别是V_H和V_L编码区的所选区域随机化，而留下其他区域未随机化(见下)。该‘245专利还描述了包含个别随机化的V_H和V_L域的scFv构建物的生成。

对抗体结构和序列的分析显示六个抗原结合环中的五个(H1、H2、L1、L2、L3)具有有限数目的主链构象或规范结构(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901；Chothia等(1989)Nature 342：877)。所述主链构象是由(i)所述抗原结合环的长度，和(ii)在所述抗原结合环和抗体框架中某些关键位置处具体的残基，或残基类型决定的。例如，对环长度和关键残基的分析使得能够预测由大多数人抗体序列编码的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.227：799；Tomlinson等(1995)EMBO J.14：4628；Williams等(1996)J.Mol.Biol.264：220)。尽管H3区在序列、长度和结构的角度而言多样性高得多(由于其使用D区段)，对于短的环长度其还是形成有限数目的主链构象，这取决于长度和在环和抗体框架中关键位置存在的具体残基或残基类型(Martin等(1996)J.Mol.Biol.263：800；Shirai等(1996)FEBS Letters 399：1。

虽然，在一种方法中，可在多种抗原结合环的CDR中的任何位点对合成全集增加多样性，但是该方法导致较大比例的V域无法适当地折叠，并因此导致较小比例的分子具有结合抗原的潜力。对促成抗原结合环之主链构象的残基的了解容许鉴定在V_H或V_L的合成全集中多样化的具体残基。即，最好在对于维持主链构象不是至关重要的残基中引入多样性。试举一例，对于环L2的多样化，常规方法会对在如Kabat等(Kabat等(1991)Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health & Human Services，Washington，D.C.)所定义的相应的CDR(CDR2)中所有的残基进行多样化，约七个残基。然而，对于L2，已知50和53位在天然出现的抗体中是多样的，并观察到其与抗原相接触。一种方法会是仅将该环中的这两个残基多样化。这代表了创建一系列抗原结合特异性所需要的功能多样性方面的显著改善。

可有利地将免疫球蛋白多肽文库设计为基于预决的可变域主链构象。上述文库可如国际专利申请WO 99/20749所述进行构建，其内容以提述的方式并入本文。因此，在一方面，域抗体包含给定人种系V区基因区段例如V_H种系基因区段DP-47或V_κ种系基因区段DPK9的氨基酸序列。上述可变区多肽可用于产生scFv或Fab，例如，包含下述的scFv或Fab：(i)抗体重链可变域(V_H)，或其抗原结合片段，其包含种系V_H区段DP-47的氨基酸序列和(ii)抗体轻链可变域(V_L)，或其抗原结合片段，其包含种系V_κ区段DPK9的氨基酸序列。在所选的重链和轻链种系基因区段(例如DP-47、DPK 9、DP45、DP38等)的背景内对序列的多样化可生成多样性免疫球蛋白编码序列的全集。一种多样化的方法如下在生成多样化的域抗体或scFv序列的文库的背景中进行描述。这些可变区多肽还可表达为域抗体并筛选对CD28的高亲和力结合。可将所述全集克隆入适于噬菌体展示的载体(例如，λ或丝状噬菌体展示载体)或在其中生成，并然后就其对于给定靶抗原(例如，CD28)的结合进行筛选。

3.域抗体的制备

域抗体是下述折叠的多肽域，其包含免疫球蛋白可变域特征性的序列，且其特异性结合抗原(例如，解离常数为500nM或更小)，且其作为单一可变域结合抗原；即，域抗体仅提供一个结合位点，而无任何互补的可变域。域抗体因此包括完整的抗体可变域以及修饰的可变域，例如其中一个或多个环被并非抗体可变域特征性的序列替换，或经截短或包含N-或C-端延伸的抗体可变域，以及保留约500nM或更低解离常数(例如，约450nM或更少，约400nM或更少，约350nM或更少，约300nM或更少，约250nM或更少，约200nM或更少，约150nM或更少，约100nM或更少)和全长域的靶抗原特异性的折叠可变域片段。在一个示例性实施方案中，可用于本文中所述的组合物和方法的抗体单一可变域选自下组：V_H和V_L，包括V_κ和V_λ。在一个示例性实施方案中，本文中使用的域抗体是如本文中定义的“人”的。

3.1.1.配体的结构

根据本文中公开的一个方面，将两个或更多个非互补性表位结合域连接从而使得其为本文中所定义的封闭构象。有利地，其还可附于骨架，所述骨架可作为本文中所述的接头的替代或附加，促进所述表位结合位点相对于彼此的封闭构象的形成和/或维持。或者，本文中公开的域抗体可使用本文中讨论的支架(scaffold)或骨架(skeleton)框架来构建。

配体骨架可基于免疫球蛋白分子，或可如本文中另外所述为非免疫球蛋白起源。如本文中定义的免疫球蛋白骨架可包括任何一种或多种那些选自下组的：至少包含(i)抗体的CL(κ或λ亚类)域或(ii)抗体重链的CH1域的免疫球蛋白分子；包含抗体重链的CH1和CH2域的免疫球蛋白分子；包含抗体重链的CH1、CH2和CH3域的免疫球蛋白分子；或任何与抗体CL(κ或λ亚类)域联合的子集(ii)。还可包含铰链区域。域的上述组合可，例如，模拟天然抗体，如IgG或IgM或其片段，如Fv、scFv、Fab或F(ab’)₂分子。本领域技术人员会明白该列表并不意欲为穷举的。

每个表位结合域包含蛋白质支架和一个或多个CDR，其涉及所述域与一种或多种表位的特异性相互作用。有利地，本文中公开的表位结合域包含三个CDR。合适的蛋白质支架，除了那些基于免疫球蛋白域的之外，还可基于除了免疫球蛋白域之外的蛋白质支架或骨架。例如，天然细菌受体如SpA已之外支架用于嫁接CDR以生成特异性结合一种或多种表位的配体。该方法的细节描述于US 5,831,012。其他合适的支架包括那些基于纤维连接蛋白和亲合体(affibody)(Affibody，Bromma，Sweden)的。合适的方法的细节描述于WO 98/58965。其他合适的支架包括lipocallin和CTLA4，如van den Beuken等，(2001)J.Mol.Biol.310：591-601所述，以及如那些描述于WO00/69907(Medical Research Council)的支架，其基于例如细菌GroEL或其他侣伴多肽的环结构。其他可用的基于非免疫球蛋白的支架包括那些基于LDL受体A类、EGF域单体和多聚物的，以及可从Biorexis(King of Prussia，PA)或Avidia(Mountain View，CA)获得的支架。其他可用的非免疫球蛋白支架描述于例如WO 05/040229、WO 04/044011和US 2005/0089932。

3.1.2.主链构象的选择

免疫球蛋白超家族的成员对于其多肽链均共享相似的折叠。例如，尽管抗体在其一级序列方面高度多样性，对序列和晶体结构的比较揭示了，与预想相悖，抗体六个抗原结合环中的五个(H1、H2、L1、L2、L3)采用有限数目的主链构象，或规范结构(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196：901；Chothia等(1989)Nature，342：877)。对环长度和关键残基的分析因此使得能够预测在大多数人抗体中找到的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227：799；Tomlinson等(1995)EMBO J.，14：4628；Williams等(1996)J.Mol.Biol.，264：220)。尽管H3区在序列、长度和结构方面多样性高得多(由于其使用D区段)，其对于短环长度还是形成有限数目的主链构象，其取决于长度和在环和抗体框架中关键位置处存在的具体残基或残基类型(Martin等(1996)J.Mol.Biol.，263：800；Shirai等(1996)FEBS Letters，399：1)。

本文中公开的配体可从域文库如V_H域文库和/或V_L域文库选取和/或装配。而且，本文中公开的配体其自身可以以文库的形式提供。在本文中公开的一个方面，将配体和/或域的文库设计为其中选择某些环长度和关键残基以保证其成员的主链构象是已知的。如上所讨论的，有利地，这些是天然发现的免疫球蛋白超家族分子的真实构象，使其为非功能性的机会降至最低。种系V基因区段充当一个示例性的基础框架以供构建抗体或T细胞受体文库；也可使用其他序列。变化可以以低频率出现，从而使得少数功能性成员可具有改变的主链构象，而其并不影响其功能。

规范结构理论可用于评价配体编码的不同主链构象的数目，以基于配体序列预测主链构象和选择可多样化而不影响规范结构的残基。已知在人V_κ域中，L1环可采用四种规范结构之一，L2环具有单一的规范结构，而90％的人V_κ域对于L3采用四种或五种规范结构之一(Tomlinson等(1995)见上)；因此，仅在V_κ域中，可将不同的规范结构组合以创建多种不同主链构象。鉴于V_λ域对于L1、L2和L3环编码不同范围的规范结构，且V_κ和V_λ域能与任何V_H域配对，其中所述V_H域对于H1和H2环能编码几种规范结构，因此对于这五个环观察到的规范结构组合的数目是非常庞大的。这暗示主链构象多样性的产生对于产生广泛范围的结合特异性可为至关重要的。然而，通过基于单一的已知主链构象构建抗体文库，发现与预想相悖，生成足够的多样性以靶向基本上所有抗原无需主链构象的多样性。甚至更令人惊讶的是，所述单一主链构象无需为共有结构。单一的天然出现的构象可用作整个文库的基础。因此，在一方面，本文中公开的配体具有单一的已知主链构象。

所选的单一主链构象在一方面，在所讨论的免疫球蛋白超家族类型的分子中是司空见惯的。当观察到显著数目的天然出现的分子采用一种构象时，则该构象是司空见惯的。因此，在本文中公开的一个方面，对于免疫球蛋白域的每个结合环天然出现的不同主链构象被分别考虑，然后选择对于不同环具有所需的主链构象组合的天然出现的可变域。如果这无法得到，可选取最接近的等同物。优选对于不同环所需的主链构象的组合是通过选择编码所需主链构象的种系基因区段来构建的。更优选所选择的种系基因区段在自然界是频繁表达的，且最优选其为所有天然种系基因区段中最频繁表达的。

为了设计配体或其文库，可分别考虑每一种抗原结合环的不同主链构象的发生率。对于H1、H2、L1、L2和L3，选择由20％至100％的天然出现的分子的抗原结合环采用的给定构象。通常，其观察到的发生率高于35％(即，35％至100％)，且理想地，高于50％或甚至高于65％。因为绝大多数H3环并不具有规范结构，优选选择在不展示规范结构的那些环中司空见惯的主链构象。因此对于每个环，选择在天然全集中最常观察到的构象。在人抗体中，对于每个环最流行的规范结构(CS)如下所述：H1-CS 1(表达的全集的79％)，H2-CS 3(46％)，L1-CS V_κ的2(39％)，L2-CS 1(100％)，L3-CS V_κ的1(36％)(该计算假定κ∶λ比例为70∶30，Hood等(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，48：133)。对于具有规范结构的H3环，长度为七个残基(Kabat等(1991)Sequences of proteins of immunological interest，U.S.Department of Health and Human Services)，具有从残基94至残基101的盐桥的CDR3似为最常见的。在EMBL数据库中有至少16种人抗体序列具有所需的H3长度和关键残基以形成该构象，且在蛋白质数据库中有至少两种晶体结构可用作抗体建模的基础(2cgr和ltet)。具有该规范结构组合的最频繁表达的种系基因区段是V_H区段3-23(DP-47)、J_H区段JH4b、V_κ区段O2/O12(DPK9)和J_κ区段J_κ1。V_H区段DP45和DP38也是合适的。因此，这些区段可组合使用作为基础以构建具有所需单一主链构象的文库。

或者，不是对于每个结合环分别基于不同主链构象的天然出现率选择单一主链构象，而是将主链构象组合的天然出现率用作选择单一主链构象的基础。在抗体的情况下，例如，可确定任何两个、三个、四个、五个或全部六个抗原结合环的规范结构组合的天然出现率。在此，优选所选的构象在天然出现的抗体中是司空见惯的，且最优选其在天然全集中是最频繁观察到的。因此，在人抗体中，例如，当考虑五个抗体结合环H1、H2、L1、L2和L3的天然组合时，确定最频繁的规范结构组合，然后将其与对于H3最流行的构象组合，作为选择单一主链构象的基础。

3.2.域抗体的制备

域抗体可以以多种方式制备。对于这些方法中的每一种，可应用众所周知的核酸序列制备(例如，扩增，突变等)和操作方法。

一种制备域抗体的手段是扩增并表达已知结合所需抗原的克隆抗体的重链或轻链基因的V_H或V_L区。即，已知域抗体编码区的V_H或V_L域可作为单一域(或单一域的融合)来扩增和表达，并就对CD28的结合进行评估。Kabat等(Kabat等(1991)Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health & Human Services，Washington，D.C.)展示了V_H和V_L域的边界。将关于重链和轻链基因V_H和V_L域的边界的信息用于设计PCR引物，其从编码已知结合CD28的抗体的克隆的重链或轻链编码序列扩增V域。将扩增的V域插入合适的表达载体，例如pHEN-1(Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.19：4133-4137)并单独表达，或作为与另一多肽序列的融合表达。

V_H基因是通过三个基因区段，V_H、D和J_H的重组来产生的。在人中，取决于单倍型，有大约51种功能性V_H区段(Cook和Tomlinson(1995)Immunol Today 16：237)、25种功能性D区段(Corbett等(1997)J.Mol.Biol.268：69)和6种功能性J_H区段(Ravetch等(1981)Cell 27：583)。V_H区段编码形成V_H域第一和第二抗原结合环(H1和H2)的多肽链区域，而V_H、D和J_H区段组合以形成V_H域的第三抗原结合环(H3)。

V_L基因是通过近两个基因区段，V_L和J_L的重组来产生的。在人中，取决于单倍型，有大约40种功能性V_κ区段(和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 374：1001)、31种功能性V_λ区段(Williams等(1996)J.Mol.Biol.264：220；Kawasaki等(1997)Genome Res.7：250)、5种功能性J_κ区段(Hieter等(1982)J.Biol.Chem.257：1516)和4种功能性J_λ区段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.172：609)。V_L区段编码形成V_L域第一和第二抗原结合环(L1和L2)的多肽链区域，而V_L和J_L区段组合以形成V_L域的第三抗原结合环(L3)。相信选自该原始全集的抗体的多样性足以以至少中等的亲和力结合几乎所有抗原。高亲和力抗体在体内是通过重排基因的“亲和力成熟”来产生的，其中生成点突变，并由免疫系统基于改善的结合来选择。

在一个方法中，通过例如噬菌体展示来筛选V_H或V_L域(在一方面，人V_H或V_L域)全集，将其针对所需抗原进行淘洗。构建噬菌体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法在本领域是众所周知的，并例如由McCafferty等(1990)Nature 348：552；Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson等(1991)Nature 352：624；Lowman等(1991)Biochemistry 30：10832；Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.88：10134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.19：4133；Chang等(1991)J.Immunol.147：3610；Breitling等(1991)Gene 104：147；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4457；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22：867；Marks等(1992)J.Biol.Chem.，267：16007；以及Lerner等(1992)Science，258：1313教导。Fab噬菌体展示文库由例如U.S.5,922,545教导。scFv噬菌体文库由例如Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.85：5879-5883；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.87：1066-1070；McCafferty等(1990)(见上)；Clackson等(1991)(见上)；Marks等(1991)(见上)；Chiswell等(1992)Trends Biotech.10：80；以及Marks等(1992)(见上)教导。已描述了展示于噬菌体外壳蛋白上的scFv文库的多种实施方案。亦已知噬菌体展示方法的精化，例如描述于WO96/06213及WO92/01047(Medical Research Council等)和WO97/08320(Morphosys，见上)。

V_H或V_L域的全集可为免疫球蛋白序列的天然出现全集或合成全集。天然出现全集是例如从自一个或多个个体收获的免疫球蛋白表达细胞制备的全集。上述全集可为“幼稚的

即，例如从人胎儿或新生儿免疫球蛋白表达细胞制备的，也可为重排的，即，例如从成人B细胞制备的。天然全集描述于，例如Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581和Vaughan等(1996)Nature Biotech.14：309。若需要，可然后对从天然全集(或在此情况下，任何全集)鉴定的结合靶抗原的克隆进行诱变和进一步筛选以产生并选择具有改善的结合特征的变体。

域抗体的合成全集是通过将多样性人工引入克隆的V域来制备的。合成全集描述于，例如，Hoogenboom & Winter(1992)J.Mol.Biol.227：381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4457；Nissim等(1994)EMBO J.13：692；Griffiths等(1994)EMBO J.13：3245；DeKriuf等(1995)J.Mol.Biol.248：97；以及WO 99/20749。

在一方面，合成的可变域全集是在V_H或Vκ背景中，基于人工多样化的种系V_H或Vκ序列制备的。例如，V_H域全集可为基于克隆的种系V_H基因区段V3-23/DP47(Tomlinson等(1992)J.Mol.Biol.227：776)和JH4b。V_κ域全集可为基于，例如，种系V_κ基因区段O2/O12/DPK9(Cox等(1994)Eur.J.Immunol.24：827)和J_κ1。将多样性通过例如PCR诱变引入这些或其他基因区段。可随机地例如通过易错PCR(Hawkins，等(1992)J.Mol.Biol.226：889)或化学诱变引入多样性。然而，如上所讨论，在一个实施方案中，多样性的引入是靶向特定残基的。在另一个实施方案中，所需的残基是通过使用诱变引物引入密码子NNK(使用IUPAC命名法，其中N＝G、A、T或C，而K＝G或T)来靶向的，其编码所有的氨基酸和TAG终止密码子。也可使用其他达成同样目的的密码子，包括NNN密码子(其导致附加的终止密码子TGA和TAA的产生)、DVT密码子((A/G/T)(A/G/C)T)、DVC密码子((A/G/T)(A/G/C)C)以及DVY密码子((A/G/T)(A/G/C)(C/T))。DVT密码子编码22％丝氨酸和11％酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸，其最接近地模拟天然人抗体抗原结合位点中氨基酸残基的分布。使用在待多样化的每个位点具有所选的简并密码子的PCR引物制备全集。PCR诱变在本领域是众所周知的。

在一方面，在位点H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97和H98处使用NNK密码子将多样性引入人种系V_H基因区段V3-23/DP47(Tomlinson等(1992)J.Mol.Biol.227：7768)和JH4b的序列，对应于CDR1、2和3中的多样性，而编号如用于美国专利6,696,245号中的。

在另一方面，例如，还在位点H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、H100、H100a和H100b处使用NNK密码子将多样性引入人种系V_H基因区段V3-23/DP47和JH4b的序列，对应于CDR1、2和3中的多样性，而编号如用于美国专利6,696,245号中的。

在另一方面，例如，在位点L30、L31、L32、L34、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96处使用NNK密码子将多样性引入人种系V_κ基因区段O2/O12/DPK9和J_κ1的序列，对应于CDR1、2和3中的多样性，而编号如用于美国专利6,696,245号中的。

如本领域已知并例如描述于WO 99/20749，将多样化的全集克隆入噬菌体展示载体。一般而言，本文中所述的组合物和方法所需要的核酸分子和载体构建物在本领域是可获得的，且为如标准的实验室手册如Sambrook等(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA及其后续版本所述进行构建和操作的。

如本文中所述的对核酸的操作通常是在重组载体中进行的。如本文中使用的“载体”指用于将异源DNA引入细胞以供其表达和/或复制的分立元件。选择或构建并随后使用上述载体的方法对于本领域技术人员是众所周知的。多种载体是公众可获得的，包括细菌质粒、噬菌体、人工染色体和附加型载体。上述载体可用于简单的克隆和诱变；或者，如常见于携带本文中的全集(或前全集)成员的载体，可使用基因表达载体。本文中所述的可用的载体经选择以容纳所需大小的多肽编码序列，通常长度为0.25千碱基(kb)至40kb。将合适的宿主细胞用所述载体在体外克隆操作之后进行转化。每个载体含有多种功能性组分，其通常包含克隆(或“多接头(polylinker)”)位点、复制起点和至少一种选择标记基因。如果给定的载体是表达载体，其还具有下述中的一种或多种：增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，每一个均位于克隆位点附近，从而使得其可操作地连接如本文中所述的编码多肽库成员的基因。

克隆和表达载体均通常含有使得该载体能够在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列是使得该载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列，并包括复制起点或自主复制序列。上述序列对于多种细菌、酵母和病毒而言是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌，2微米质粒起点适于酵母，而多种病毒起点(例如，SV40，腺病毒)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，复制起点对于哺乳动物表达载体不是必需的，除非其用于能够复制高水平DNA的哺乳动物细胞，如COS细胞。

有利地，克隆或表达载体还含有选择基因，也称作选择标记。该基因编码对在选择培养基中培养的转化的宿主细胞的存活或生长为必需的蛋白质。因此，未经含有所述选择基因的载体转化的宿主细胞会无法在该培养基中生存。通常的选择基因编码赋予针对抗生素和其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，弥补营养缺陷或供应生长培养基中无法获得的关键营养的蛋白质。

由于本文中载体的复制最方便地是在大肠杆菌中进行的，使用大肠杆菌选择标记，例如赋予针对抗生素氨苄青霉素的抗性的β-内酰胺酶基因。这些可从大肠杆菌质粒如pBR322或pUC质粒如pUC18或pUC19获得。然而，也可合理地替换为其他质粒微生物组合。

表达载体通常含有受到宿主生物识别并可操作地连接目标编码序列的启动子。上述启动子可为诱导型或组成型的。术语“可操作地连接”指并列，其中所述组分处于容许其以其预想的方式发挥功能的关系。控制序列“可操作地连接”编码序列是以下述方式连接，从而使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下达成。

适用于原核宿主的启动子包括，例如，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如tac启动子。用于细菌系统的启动子还通常会含有Shine-Dalgarno序列可操作地连接于编码序列。

在本文中所述的文库或全集中，载体可为使得与多肽文库成员对应的核苷酸序列能够表达的表达载体。因此，选择是通过将表达所述多肽文库成员的单一克隆分别扩增和表达，或通过使用任何选择展示系统来进行的。如上所述，一种个选择展示系统使用噬菌体展示。因此，可使用噬菌体或噬菌粒载体。载体可为噬菌粒载体，其具有大肠杆菌复制起点(用于双链复制)，并还具有噬菌体复制起点(用于产生单链DNA)。上述载体的操作和表达在本领域是众所周知的(Hoogenboom和Winter(1992)，见上；Nissim等(1994)，见上)。简言之，所述载体含有β-内酰胺酶或其他选择标记基因以将选择性赋予噬菌粒，并在表达盒上游含有lac启动子，该表达盒由(N至C端)pelB前导序列(其将表达的多肽引导至周质空间)，多克隆位点(用于克隆文库成员的核苷酸形式)，任选地，一个或多个肽标记(用于检测)，任选地，一个或多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白PIII。在一个实施方案中，所述载体编码真核GAS1前导序列而非pelB前导序列，所述GAS1前导序列用于将融合多肽的分泌引导至大肠杆菌中的周质空间或在真核细胞系统中，引导至培养基。使用多种大肠杆菌阻遏和非阻遏菌株，以及添加葡萄糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体如VCS M13，所述载体能够作为质粒无表达的复制，仅产生大量的多肽文库成员，或产生噬菌体，其中一些在其表面含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合。

载体的实例是pHEN1噬菌粒载体(Hoogenboom等(1991)Nucl.Acids Res.19：4133-4137；序列可得自，例如，WO 03/031611中的SEQ ID NO：7)，其中pIII融合蛋白的产生是置于LacZ启动子的控制之下的，所述启动子在葡萄糖存在下被抑制，而由IPTG诱导。当在大肠杆菌的阻遏菌株例如TG1中培养时，基因III融合蛋白产生并包装成噬菌体，而在非阻遏菌株例如HB2151中培养则容许溶解性融合蛋白分泌至细菌周质和培养基中。由于基因III的表达阻止了辅助噬菌体的之后的感染，携带所述噬菌粒载体的细菌在葡萄糖存在下繁殖，然后用VCSM13辅助噬菌体感染以供回收噬菌体(phage rescue)。

如本文中所述的载体的构建采用常规的连接技术。将分离的载体或DNA片段切割、裁剪(tailor)并重新连接为所需的形式以生成所需的载体。若需要，可使用标准方法进行序列分析以确证正确的序列存在于构建的载体中。构建表达载体，制备体外转录物，将DNA引入宿主细胞，以及进行分析以供评价表达和功能的合适方法对于本领域技术人员是已知的。基因序列在样品中的存在的检测，及其扩增和/或表达的定量是通过常规方法如Southern或Northern分析，Western印迹，DNA、RNA或蛋白质的点印迹，原位杂交，免疫细胞化学或核酸或蛋白质分子的序列分析来进行的。若需要，本领域技术人员会容易地想到如何修饰这些方法。

3.3.就抗原结合对域抗体的筛选

在噬菌体表面表达域抗体全集之后，通过将所述噬菌体全集与固定化的靶抗原接触，洗涤去除未结合的噬菌体，并扩增结合的噬菌体来进行选择，其整个过程常常称作“淘洗”。该方法适用于对域抗体以及其他可表达于展示文库的抗体片段(例如，scFv、Fab等)的筛选。或者，对噬菌体就正确折叠的成员变体的表达通过针对固定化的类属配体(例如，蛋白A或蛋白L)进行淘洗来进行预选择，其中所述类属配体仅由折叠的成员结合。这具有下述益处：减少了非功能性成员的比例，由此增加了有可能结合靶抗原的成员的比例。用类属配体的预选择由例如WO 99/20749所教导。噬菌体抗体文库的筛选一般性地描述于例如by Harrison等(1996)Meth.Enzymol.267：83-109。

筛选通常是使用在固体支持物例如塑料管或孔上，或者在层析基质例如Sepharose^TM(Pharmacia)上固定化的纯化抗原来进行的。还可针对复杂抗原如细胞表面进行筛选或选择(Marks等(1993)BioTechnology 11：1145；de Kruif等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：3938)。另一种替代方法涉及通过在溶液中结合生物素化的抗原，然后在链霉亲合素包被的珠上捕获来进行的选择。

在一方面，淘洗是通过将抗原(类属的或特异性的)于管上或板(例如Nunc MAXISORP^TM immunotube 8孔条)中的孔上固定化进行的。将孔用150μl抗原(PBS中100μg/m1)包被并温育过夜。然后用PBS洗涤孔3次，并用400μlPBS-2％脱脂乳(2％MPBS)在37℃封闭2小时。将孔用PBS漂洗3次，并将噬菌体在2％MPBS中添加。将混合物在室温温育90分钟，并去除含有未结合噬菌体的液体。将孔用PBS-0.1％Tween 20漂洗10次，然后用PBS漂洗10次以去除去污剂。将结合的噬菌体通过添加200μl新制备的100mM三乙胺，充分混合并在室温温育10分钟来洗脱。将洗脱的噬菌体转移至装有100μl 1M Tris-HCl，pH 7.4的管，并涡旋振荡以中和三乙胺。将指数生长的大肠杆菌宿主细胞(例如，TG1)用例如150ml洗脱的噬菌体通过在37℃温育30分钟来感染。将感染的细胞旋转沉淀，重悬于新鲜培养基，并铺板于顶层琼脂糖。将噬菌斑洗脱或挑取至宿主细胞的新鲜培养物中繁殖以供分析或更多轮次的选择。若需要，进行一个或多个轮次的噬菌斑纯化以确保所选噬菌体的纯种群。其他筛选方法描述于Harrison等(1996)，见上。

在鉴定了表达结合所需靶的域抗体的噬菌体之后，如果使用了噬菌粒载体如pHEN1，则可通过感染细菌的非阻遏菌株例如HB2151容易地以溶解性形式产生可变域融合蛋白，所述细菌容许溶解性基因III融合蛋白的分泌。如果载体编码了GAS1分泌信号肽，则所述融合多肽可由真核(例如，酵母或哺乳动物)或原核(例如，大肠杆菌)细胞所分泌。或者，可根据本领域已知的方法将V域序列亚克隆入合适的表达载体以产生溶解性蛋白。

3.4.域抗体的纯化和浓缩

根据已知方法收获并纯化分泌入细菌周质空间或培养基的域抗体(Harrison等(1996)见上)。Skerra & Pluckthun(1988)Science 240：1038和Breitling等(1991)Gene 104：147描述了从周质收获域抗体，而Better等(1988)Science 240：1041描述了从培养物上清液收获。对于一些域抗体，还可通过将其结合于类属配体如蛋白A或蛋白L来达成纯化。或者，所述可变域可与肽标签例如Myc、HA或6X-His标签(SEQ ID NO：644)一同表达，其便于通过亲和层析的纯化。

若需要，将域抗体通过本领域公知的任意几种方法来浓缩，包括例如超滤、渗滤和切向流过滤。超滤方法使用半渗透性膜和压力以基于大小和形状将分子物种分开。压力是通过气压或离心来提供的。商用超滤产品可广泛地从例如Millipore(Bedford，MA；实例包括Centricon^TM和Microcon^TM浓缩器)和Vivascience(Hannover，Germany；实例包括Vivaspin^TM浓缩器)获得。通过选择小于靶多肽的分子量截留(通常为靶多肽分子量的1/3至1/6，尽管可成功地利用少至10kD的差异)，当溶剂和较小的溶质穿过膜时，多肽得到保留。因此，约5kD的分子量截留可用于浓缩本文中所述的域抗体。

渗滤，其使用超滤膜与“洗涤”方法，是当需要在多肽制备物中去除或交换盐或缓冲剂时使用的。通过使溶剂和小溶质穿过膜来浓缩所述多肽，而所余的盐或缓冲剂是通过将保留的多肽视需要用新缓冲剂或盐溶液或水稀释，伴以连续超滤来去除的。在连续渗滤中，以滤液穿过膜的相同速率添加新缓冲液。渗滤体积为多肽溶液在渗滤开始之前的体积一使用连续渗滤，可通过用新缓冲液以六个渗滤体积的洗涤来去除超过99.5％的完全渗透性溶质。或者，该方法可以以不连续的方式进行，其中将所述样品反复稀释，并过滤恢复至其初始体积以去除或交换盐或缓冲剂，并最终浓缩所述多肽。渗滤用装置及其具体的使用方法可从例如Pall Life Sciences(Ann Arbor，MI)和Sartorius AG/Vivascience(Hannover，Germany)获得。

切向流过滤(TTF)，亦称作“错流(cross flow)过滤”，也使用超滤膜。将含有靶多肽的液体沿膜表面的切向泵送。压力导致部分液体穿过膜，而靶多肽保留在过滤器上。然而，与标准超滤相对，保留的分子并不在膜表面上蓄积，而是由切向流携带走。可将未穿过过滤器的溶液(含有靶多肽)反复循环穿过所述膜以取得所需的浓缩程度。TFF用装置及其具体使用方法可从例如Millipore (例如，ProFlux M12^TM台式TFF系统和Pellicon^TM系统)，Pall Life Sciences(例如，Minim^TM切向流过滤系统)获得。

蛋白质浓度是以多种本领域公知的方式测量的。这些包括例如氨基酸分析，280nm处的吸光度，“Bradford”和“Lowry”方法以及SDS-PAGE。最精确的方法是完全水解继以用HPLC的氨基酸分析，然后通过与域抗体的已知序列比较来确定浓度。虽然这种方法是最精确的，但是它昂贵且费时。通过在280nm处的UV吸光度测量的蛋白质测定与氨基酸分析相比，更快速并远不如其昂贵，相对较为精确，为其折衷的方法。使用280nm处的吸光度确定在本文中所述的实施例中报道的蛋白质浓度

“Bradford”和“Lowry”蛋白质测定法(Bradford(1976)Anal.Biochem.72：248-254；Lowry等(1951)J.Biol.Chem.193：265-275)是将样品蛋白质浓度与标准曲线(最经常为基于牛血清清蛋白(BSA)的标准曲线)相比较。这些方法较为不精确，趋于低估域抗体的浓度。然而，其精确性可通过使用V_H或V_κ单一域多肽作为标准来改善。

其他可使用的蛋白质测定方法为美国专利4,839,295号(以提述的方式并入本文)所述的二辛克宁酸(bicinchoninic acid)测定法，其由Pierce Biotechnology(Rockford，IL)作为“BCA蛋白质测定法”(例如，Piece产品目录23227号)销售。

SDS-PAGE方法使用凝胶电泳和考马斯蓝染色以与已知浓度的标样(例如，已知量的域抗体)相比较。定量可通过肉眼或密度测定进行。

本文中所述的域抗体在高浓度保留溶解性(例如，在水溶液(例如PBS)中至少4.8mg(～400μM)，且在一方面至少约5mg/ml(～417μM)、10mg/ml(～833μM)、20mg/ml(～1.7mM)、25mg/ml(～2.1mM)、30mg/ml(～2.5mM)、35mg/ml(～2.9mM)、40mg/ml(～3.3mM)、45mg/ml(～3.75mM)、50mg/ml(～4.2mM)、55mg/ml(～4.6mM)、60mg/ml(～5.0mM)、65mg/ml(～5.4mM)、70mg/ml(～5.8mM)、75mg/ml(～6.3mM)、100mg/ml(～8.33mM)、150mg/ml(～12.5mM)、200mg/ml(～16.7mM)、240mg/ml(～20mM)或更高)。一种促进高溶解性的结构特征是域抗体相对较小的大小。全长的常规四链抗体，例如IgG大小为约150kD。与之相对，具有包含4个框架(FW)区和3个CDR的一般结构的域抗体具有大约12kD的大小，即小于常规抗体大小的1/10。类似地，域抗体大约为scFv分子大小(～26kD)的一半，和Fab分子大小(～60kD)的五分之一。本文中公开的含有域抗体的结构的大小可为100kD或更小，包括例如约90kD或更小、80kD或更小、70kD或更小、60kD或更小、50kD或更小、40kD或更小、30kD或更小、20kD或更小，低至包括约12kD的结构，即分离的域抗体。

域抗体的溶解性主要决定于氨基酸侧链与周围溶剂的相互作用。疏水侧链趋于作为多肽折叠而位于内部，远离多肽的溶剂相互作用表面。相反，亲水残基趋于位于多肽的溶剂相互作用表面。一般而言，具有容许该分子折叠以将更多亲水残基暴露于水性环境的一级序列的多肽比折叠以将较少亲水残基暴露于表面的多肽更加易溶。因此，疏水和亲水残基的排列和数目是溶解性的重要决定因素。其他决定多肽溶解性的参数包括溶剂pH、温度和离子强度。在通常的实践中，多肽的溶解性可通过向溶液添加甘油(例如，～10％v/v)来维持或增强。

如上所讨论，在人V_H域的保守残基中鉴定出了在通常较人V_H域更加易溶的驼类物种V_H域中变化的特定氨基酸残基。这些包括例如Gly 44(在驼类中为Glu)、Leu 45(在驼类中为Arg)和Trp 47(在驼类中为Gly)。V_H的氨基酸残基103亦与溶解性相关，其从Trp突变为Arg趋于赋予增加的V_H溶解性。

在本文中所述的一些方面，域抗体是基于DP47种系V_H基因区段或DPK9种系V_κ基因区段的。因此，这些种系基因区段能够产生高度可溶的特异性结合域抗体，特别是在本文中所述的选定的结构位置进行多样化时。具体而言，四个框架区(在一方面，其未经多样化)可促成所得蛋白质的高溶解性。

预期与具有已知高溶解性的域抗体共享百分比序列同一性的域抗体也会趋于具有高溶解性。因此，作为一种预测或识别给定域抗体会具有本文中记载的高溶解性的手段，可将域抗体的序列与一种或多种具有已知溶解性的域抗体相比较。因此，当域抗体鉴定为具有高结合亲和力但未知溶解性时，将其氨基酸序列与一种或多种(在一方面，多种)已知具有高溶解性的域抗体(例如，本文中公开的dAb序列)的氨基酸序列相比较能容许预测溶解性。尽管这并非绝对的预测指标，当新鉴定的结合多肽与已知高度溶解的序列有高度相似性(例如，90-95％或更高的相似性)时，特别是当关于亲水氨基酸残基或有可能在溶剂界面暴露的残基有高度相似性时，其更有可能具有与所述已知高溶解性序列的溶解性相似的溶解性。

还可使用分子建模软件相对于溶解性已知的多肽的溶解性来预测多肽序列的溶解性。例如，相对于溶解性已知的分子，其在下述位置具有不太疏水或甚至亲水的残基，溶剂暴露表面处疏水性残基的替代或添加预期降低该多肽的相对溶解性。类似地，此类位置处更亲水的残基的替代或添加预期提高相对溶解性。即，在位于分子表面的亲水或疏水残基净数目(或表面暴露残基的总体疏水或亲水性质)相对于具有已知溶解性的域抗体结构的变化能预测域抗体的相对溶解性。

作为上述预测的替代或补充，可通过简单地浓缩域抗体来确定该多肽的溶解性的限度。

3.5.亲和力的确定

如本文中所述的分离的含有域抗体的多肽，在一方面，具有至少约500nM或更低，且在一方面，至少约400nM-50pM、300nM-50pM、200nM-50pM，且在另一方面，至少100nM-50pM、75nM-50pM、50nM-50pM、25nM-50pM、10nM-50pM、5nM-50pM、1nM-50pM、950pM-50pM、900pM-50pM、850pM-50pM、800pM-50pM、750pM-50pM、700pM-50pM、650pM-50pM、600pM-50pM、550pM-50pM、500pM-50pM、450pM-50pM、400pM-50pM、350pM-50pM、300pM-50pM、250pM-50pM、200pM-50pM、150pM-50pM、100pM-50pM、90pM-50pM、80pM-50pM、70pM-50pM、60pM-50pM，或甚至低至50pM的亲和力(解离常数，K_d＝K_off/K_on)。

在另一个实施方案中，所述域抗体以1pM至1.5μM(含)范围中的IC₅₀抑制CD28对CD80的结合，IC₅₀关于对CD28结合CD80的抑制。所述IC₅₀可为1pM至1μM、1pM至900nM、1pM至800nM、1pM至700nM、1pM至600nM、1pM至500nM、1pM至400nM、1pM至300nM、1pM至200nM、1pM至100nM、1pM至50nM、1pM至10nM、1pM至1nM、1pM至500pM、1pM至100pM、1pM至50pM、1pM至10pM或1pM至5pM的范围中的。其他可接受的范围包括例如50pM至1μM、100pM至500nM、125pM至250nM、150pM至200nM、150pM至100nM和200pM至50nM。

在另一个实施方案中，所述域抗体以1pM至1.5μM(含)范围中的IC₅₀抑制CD28对CD86的结合，IC₅₀关于对CD28结合CD86的抑制。所述IC₅₀可为1pM至1μM、1pM至900nM、1pM至800nM、1pM至700nM、1pM至600nM、1pM至500nM、1pM至400nM、1pM至300nM、1pM至200nM、1pM至100nM、1pM至50nM、1pM至10nM、1pM至1nM、1pM至500pM、1pM至100pM、1pM至50pM、1pM至10pM或1pM至5pM的范围中的。其他可接受的范围包括例如50pM至1μM、100pM至500nM、125pM至250nM、150pM至200nM、150pM至100nM和200pM至50nM。

域抗体的抗原结合亲和力可方便地通过表面等离振子共振(SPR)使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor，Piscataway，N.J.)来测量。在此方法中，将抗原以已知浓度偶联于BIAcore芯片，并引入可变域多肽。可变域多肽和固定化的抗原之间的特异性结合导致芯片基质上蛋白质浓度的增加和SPR信号的变化。将SPR信号的变化作为共振单位(RU)记录，并沿传感图的Y轴针对时间进行显示。以溶剂自身(例如，PBS)经过芯片取为基线信号。基线信号与域抗体注入完成之后的信号之间的净差异代表给定样品的结合值。为了确定解离速率(K_off)、结合速率(K_on)和解离速率(K_d)常数，使用BIAcore动力学评估软件(例如，版本2.1)。

因此，可使用SPR通过测量由单价抗体制备物引起的CD28对CD80或CD86结合的置换或抑制来监测域抗体制备物对CD28结合CD80或CD86的拮抗。还可将SPR用于监测在如本文中所述的抗体制备物中通过Fc区发生的二聚化，或在一方面，二聚化的缺乏。

高亲和力依赖于抗原的表面和抗体或抗体片段的CDR之间的互补性。互补性是由靶和CDR部分之间可能的分子相互作用的类型和强度来决定的，所述相互作用例如潜在的离子相互作用、范德华吸引、氢键键合或其他可发生的相互作用。CDR3与CDR1和2相比更趋于促进抗原结合相互作用，这可能是因为其通常大小较大，为有利的表面相互作用提供了更多的机会。(参见，例如，Padlan等(1994)Mol.Immunol.31：169-217；Chothia & Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：904-917；以及Chothia等(1985)J.Mol.Biol.186：651-663。)高亲和力表明域抗体/抗原配对具有高度的互补性，其直接涉及可变域和靶的结构。

在一方面，域抗体连接于另一个域抗体以形成异二聚物，其中每个单独的域抗体能够结合不同的关联抗原。将域抗体融合为异二聚物，其中每个单体结合不同的靶抗原，可产生双特异性配体，其能够例如桥联相应的靶抗原。上述双特异性配体可用于靶向细胞因子和其他在生物体内的治疗情况下协同配合的分子。因此，提供了一种使两种或更多种细胞因子的活性协同化的方法，包括施药能够结合两种或更多种细胞因子的双特异性抗体异二聚物。

本文中所述的域抗体包括结合CD28的域抗体克隆，以及与其具有实质性序列相似性或百分比同一性的克隆，其亦以高亲和力结合靶抗原。如本文中使用的“实质性”序列相似性或同一性为至少70％相似性或同一性。

同一性或相似性其他的量度为在高严格杂交条件下杂交的能力。因此，如果编码域抗体的第一序列与第二编码序列(或其互补序列)在高严格杂交条件(如Sambrook等，Molecular Cloning，Laboratory Manuel，Cold Spring，Harbor Laboratory press，New York中所述的)下杂交，则所述第一序列与所述第二序列实质性相似。“高严格杂交条件“指在6X SSC中在约45℃杂交，继以在65℃用0.2X SSC，0.1％SDS洗涤一次或多次。”非常高严格杂交条件“指在65℃在0.5M磷酸钠，7％SDS中杂交，继以在65℃用0.2X SSC，1％SDS洗涤一次或多次。

在一个实施方案中，域抗体包括

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在一个实施方案中，域抗体可包括一个或多个下述CDR：

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1h-239-891CDR2(SEQ ID NO：637)和

1h-239-891CDR3(SEQ ID NO：638)。

4.CD28活性的测定法

在一个示例性实施方案中，如本文中所述的域抗体结合CD28，但并不实质性激动CD28信号传导。对CD28途径的激活表现出多种不同的结果，可测量这些结果以评价给定域抗体对该途径活性的作用。然而，对于评价本文中所述的域抗体的拮抗剂或激动剂功能，可使用至少一种下述CD28测定法。

在一个实施方案中，测量了T细胞的激活。在该测定法中，用抗CD3加上表达CD80或CD86之一的转染的CHO细胞刺激人CD3阳性T细胞。这导致T细胞的增殖，且其为CD28依赖性的，因为域抗体阻断了该增殖应答。

在另一个实施方案中，测量了T细胞增殖的诱导和细胞因子分泌的诱导。该测定法包括用抗CD28mAb 9.3(Gibson，等(1996)J.Biol.Chem.，271：7079-7083)刺激人CD3阳性T细胞。这导致T细胞受体介导的信号传导和细胞因子的分泌的上调，且其为CD28依赖性的，因为mAb 9.3阻断了该增殖应答。可测量的分泌的细胞因子包括但不仅限于，GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、IL-24、TGFβ、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。一种或多种此类细胞因子可根据本文中所述的公开来进行检测和/或测量。

如本文中另行所述，CD28活性的测定法还可包括评价CTLA4活性。具体而言，依照本公开的域抗体并不抑制CTLA-4介导的对T细胞功能的抑制，包括对T细胞受体介导的信号传导的抑制，对T细胞增殖的抑制，以及对细胞因子分泌的抑制。

应理解的是，基于本文的公开，本文中所述的域抗体可具有多种功能和活性，并因此可通过多种不同的测定法来测定。如本文中另行详细描述，域抗体具有多个限定特征(例如，CD28结合亲和力、CDR域身份和氨基酸序列等)，因此每种不同的域抗体可以以多种方式和通过多个参数进行表征。因此，对于每种此类域抗体本身和/或与域抗体的活性和/或CD28结合特性一同进行的表征，可对于域抗体提供独特的鉴定特征。

5.域抗体的PEG化

本文中还提供了PEG化的域抗体，其相对于非PEG化的域抗体具有延长的半衰期，并在一方面，还对降解具有抗性而不会损失活性(例如结合活性)

对蛋白质分子的定点和随机PEG化均在本领域是已知的(参见，例如Zalipsky和Lee，Poly(ethylene glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications(1992)pp 347-370，Plenum，NY；Goodson和Katre(1990)Bio/Technology，8：343；Hershfield等(1991)PNAS 88：7185)。更具体而言，描述了在赖氨酸残基和硫醇化的衍生物处对抗体分子的随机PEG化(Ling和Mattiasson(1983)Immunol.Methods59：327；Wilkinson等(1987)Immunol.Letters，15：17；Kitamura等(1991)CancerRes.51：4310；Delgado等(1996)Br.J.Cancer，73：175；Pedley等(1994)Br.J.Cancer，70：1126)。

因此，根据该方面的域抗体可使用本领域已知方法偶联于聚合物分子(在一方面，PEG)，其对于达成本文中涵盖的延长的半衰期和降解抗性特性是有用的。可利用的聚合物部分可为合成的或天然出现的，且包括但不仅限于直链或支链的聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物，或者支化或未支化的多糖，如同多糖或杂多糖。可使用的合成聚合物的实例包括直链或支链聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚乙烯醇及其衍生物或取代形式。可用的取代聚合物包括取代的PEG，包括甲氧基(聚乙二醇)。可在本文中与PEG一同使用或替代PEG使用的天然出现的聚合物部分包括乳糖、直链淀粉、右旋糖酐或糖原，以及其本领域技术人员可识别的衍生物。如本文中所述的聚合物分子的衍生化形式包括例如其中存在其他部分或反应基团以容许与本文中所述的域抗体的氨基酸残基相互作用的衍生物。此类衍生物包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯、丙酸琥珀酰亚胺酯聚合物和巯基选择性反应性试剂如马来酰亚胺、乙烯基砜和硫醇。衍生化的聚合物包括但不仅限于具有下式的PEG聚合物：PEG-O-CH₂CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-O-CH₂-NHS；PEG-O-CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-S-CH₂CH₂-CO-NHS；PEG-O₂CNH-CH(R)-CO₂-NHS；PEG-NHCO-CH₂CH₂-CO-NHS和PEG-O-CH₂-CO₂-NHS；其中R是(CH₂)₄)NHCO₂(mPEG)。如本文中所述的可用的PEG聚合物可为线性分子，或可为支化的其中多个PEG部分存在于单一聚合物中。可用的PEG衍生物包括但不仅限于mPEG-MAL、mPEG2-MAL、mPEG-(MAL)²、多臂PEG、mPEG-SPA、mPEG2-NHS和mPEG2-(MAL)²，如下所示：

所述反应性基团(例如MAL、NHS、SPA、VS或硫醇)可直接附于PEG聚合物或可通过接头分子附于PEG。

如本文中所述可用的聚合物的大小可为约500Da至60kD的范围中，例如约1000Da至60kD、10kD至60kD、20kD至60kD、30kD至60kD、40kD至60kD和高至50kD至60kD的范围中。本文中使用的聚合物，特别是PEG，可为直链聚合物或可具有支化的构象。取决于分子量和构象的组合，如本文中所述可用的聚合物分子当附于域抗体时，会产生具有平均流体动力学大小在约24至500kD的分子。本文中使用的聚合物分子的流体动力学大小指基于分子穿过水溶液的扩散所得的分子(例如，蛋白质分子)的表观大小。可对蛋白质的扩散，或其穿过溶液的运动进行处理以推导蛋白质的表观大小，其中所述大小以该蛋白质颗粒的Stokes半径或流体动力学半径给出。蛋白质的“流体动力学大小”取决于其质量和形状(构象)，从而使得两种具有相同分子量的蛋白质可基于该蛋白质的总体构象而具有不同的流体动力学大小。PEG连接的域抗体，例如本文中所述的域抗体的流体动力学大小可为约24kD至500kD；30至500kD；40至500kD；50至500kD；100至500kD；150至500kD；200至500kD；250至500kD；300至500kD；350至500kD；400至500kD；以及450至500kD的范围中。在一个示例性实施方案中，如本文所述的PEG化的域抗体的流体动力学大小为约30至40kD；70至80kD或200至300kD。附于域抗体的聚合物分子的大小可因此根据所需的应用而变化。例如，当意欲使所述PEG化的域抗体脱离循环并进入外周组织时，需要保持所附的聚合物的大小较小以促进从血流的外渗。或者，当需要使得所述PEG化的域抗体留在循环中较长时间段时，可使用更高分子量的聚合物(例如，30至60kD聚合物)。

本文中所述可用的聚合物(PEG)分子可使用本领域众所周知的方法附于域抗体。将PEG或其他聚合物部分附于域抗体的第一个步骤是将PEG聚合物的羟基末端基团用含有亲电体的官能团取代。具体而言，将PEG聚合物附于域抗体中存在的半胱氨酸或赖氨酸残基。所述半胱氨酸和赖氨酸残基可为天然出现的，或可经工程改造引入所述域抗体分子。例如，半胱氨酸残基可在域抗体的C-端重组工程改造引入，或者在所述域抗体中特定的溶剂可及位置处的残基可用半胱氨酸或赖氨酸替代。在一个实施方案中，将PEG部分附于存在于域抗体C-端铰链区中的半胱氨酸残基。

在另一个实施方案中，将PEG部分或其他聚合物附于天然出现于或经工程改造引入如本文中所述的域抗体的N-端的半胱氨酸或赖氨酸残基。还在另一个实施方案中，将PEG部分或其他聚合物在半胱氨酸或赖氨酸残基(天然出现的或经工程改造的)处附于如本文中所述的域抗体，其中所述残基距所述域抗体的C-和/或N-端至少为2个残基(例如，在其内部)。

在一个实施方案中，将PEG聚合物附于存在于域抗体框架区(FW)和一个或多个异源CDR中的一个或多个半胱氨酸或赖氨酸残基。CDR和框架区(例如，CDR1-CDR3和FW1-FW4)为那些如Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest(Kabat等(1991)Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health & Human Services，Washington，D.C.)中所定义的域抗体区域。在一个实施方案中，将PEG聚合物连接于V_H框架区段DP47，或V_k框架区段DPK9中的半胱氨酸或赖氨酸残基。本文中公开的可连接于PEG的DP47的半胱氨酸和/或赖氨酸残基包括SEQ ID NO：641的22或96位的半胱氨酸和43、65、76或98位的赖氨酸。本文中公开的可连接于PEG的DPK9的半胱氨酸和/或赖氨酸残基包括SEQID NO：643的23或88位的半胱氨酸残基和39、42、45、103或107位的赖氨酸残基。(SEQ ID NO：643的DPK9序列长度为95个氨基酸；然而，在本领域中理解的是，当融合于DPK9序列时，残基103和107是由J基因区段编码的序列提供的。)此外，在V_H规范框架区DP38或DP45中特定的半胱氨酸或赖氨酸残基可连接于PEG。

此外，所述域抗体中并非天然出现的半胱氨酸或赖氨酸残基的特定溶剂可及的位点可突变为半胱氨酸或赖氨酸以供PEG聚合物的附加。在任何给定域抗体中的溶剂可及的残基可使用本领域已知方法如所述域抗体晶体结构的分析来确定。例如，使用已解析的V_H dAb HEL4(SEQ ID NO：399；一种结合鸡卵溶酶体的域抗体)的晶体结构，鉴定出残基Gln-13、Pro-14、Gly-15、Pro-41、Gly-42、Lys-43、Asp-62、Lys-65、Arg-87、Ala-88、Glu-89、Gln-112、Leu-115、Thr-117、Ser-119和Ser-120是溶剂可及的，且如本文中所公开，可为用于突变为半胱氨酸或赖氨酸残基以供PEG聚合物附加的有吸引力的候选。此外，使用已解析的V_k对照(dummy)域抗体(SEQ ID NO：400)的晶体结构，鉴定出残基Val-15、Pro-40、Gly-41、Ser-56、Gly-57、Ser-60、Pro-80、Glu-81、Gln-100、Lys-107和Arg-108是溶剂可及的，且如本文中所公开，可为用于突变为半胱氨酸或赖氨酸残基以供PEG聚合物附加的有吸引力的候选。在如本文中公开的一个实施方案中，将PEG聚合物连接于多个溶剂可及的半胱氨酸或赖氨酸残基，或连接于突变为半胱氨酸或赖氨酸残基的溶剂可及的残基。或者，当特定域抗体仅具有一个溶剂可及的半胱氨酸或赖氨酸(或修饰为半胱氨酸或赖氨酸的残基)或者自几个此类残基选择一个具体溶剂可及残基供PEG化时，仅将一个溶剂可及的残基连接于PEG。

HEL4的一级氨基酸序列(SEQ ID NO：399)：

1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFRIS DEDMGWVRQA PGKGLEWVSS

51 IYGPSGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASAL

101 EPLSEPLGFW GQGTLVTVSS

V_k对照物的一级氨基酸序列(SEQ ID NO：400)：

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA

51 ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPNTFGQ

101 GTKVEIKR

本文中公开的几种PEG附加方案是由Nektar公司(SanCarlos，CA)提供的。例如，当需要将PEG或其他聚合物附加于赖氨酸残基时，可使用用N-羟基琥珀酰亚胺衍生化的PEG聚合物的活性酯，如丙酸琥珀酰亚胺酯。当意欲附加于半胱氨酸残基时，可使用用巯基选择性试剂如马来酰亚胺、乙烯基砜或硫醇衍生化的PEG聚合物。其他可如本文中公开使用以生成PEG化的抗体的PEG衍生物的具体实施方案的实例可见于Netkar产品目录(可从万维网上netkar.com获得)。此外，PEG的几种衍生化形式可如本文中公开使用以促进PEG聚合物附于域抗体。本文中公开的PEG衍生物包括但不仅限于PEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、乌拉坦连接的PEG、PEG苯基碳酸酯、PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯、PEG-羟甲基叠氮化物、二乙基马来酸酐PEG、PEG二硫代碳酸酯衍生物、PEG-三氟乙磺酸酯(2，2，2-三氟乙磺酸酯)、mPEG亚氨酸酯和其他如Zalipsky和Lee，(1992)(“Use of functionalized poly(ethylene glyco1)s for modification of peptides”in Poly(Ethylene Glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，J.Milton Harris，Ed.，Plenum Press，NY)所述的。

在本文中公开的一个实施方案中，域抗体组合物包含域抗体和PEG聚合物，其中PEG聚合物对域抗体的比例是至少0.25∶1的摩尔比。在另一个实施方案中，PEG聚合物对域抗体的摩尔比是0.33∶1或更高。还在另一个实施方案中，PEG聚合物对域抗体的摩尔比是0.5∶1或更高。

6.域抗体的修饰

6.1.规范序列的多样化

已经选择了几种已知的主链构象，或在一方面，单一的已知主链构象，可将本文中公开的配体或本文中使用的文库通过变动分子的结合位点来构建以生成具有结构和/或功能多样性的全集。这意指产生下述变体，其在其结构和/或其功能中具有足够的多样性，从而使得其能够提供多种活性。

所需的多样性通常是通过在一个或多个位置变动所选的分子来生成的。待改变的位置可随机选取，或在一方面，可为选定的。所述变化随之可通过随机化来达成，其间原有的氨基酸由任何天然或合成的氨基酸或其类似物所替换，产生了很大量的变体，或者通过将原有的氨基酸用氨基酸的一种或多种限定子集所替换，产生更加有限数目的变体。

已报道了多种引入此类多样性的方法。可使用易错PCR(Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.，226：889)、化学诱变(Deng等(1994)J.Biol.Chem.，269：9533)或细菌增变株(Low等(1996)J.Mol.Biol.，260：359)来将随机突变引入编码该分子的基因。用于突变选定位置的方法在本领域中也是众所周知的，且包括使用错配的寡核苷酸或简并的寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通过将突变靶向抗原结合环，构建了几种合成抗体文库。已随机化了含有人破伤风类毒素的Fab的H3区以构建多种新结合特异性(Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457)。将随机或半随机的H3和L3区附于种系V基因区段以产生具有未突变的框架区的大文库(Hoogenboom & Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457；Nissim等(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths等(1994)EMBO J.，13：3245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，248：97)。扩展了上述多样化以包括其他抗原结合环的一些或全部(Crameri等(1996)Nature Med.，2：100；Riechmann等(1995)Bio/Technology，13：475；Morphosys，WO97/08320，见上)。

因为环随机化具有仅对于H3就创建大约超过10¹⁵个结构，且对于其他五个环创建类似巨大数目的变体的潜力，用现有的转化技术或甚至使用无细胞系统以产生代表所有可能组合的文库是不可行的。例如，在迄今构建的最大的文库之一中，生成了6x10¹⁰种不同的抗体，其仅为该设计的文库潜在多样性的一部分(Griffiths等(1994)见上)。

在一个实施方案中，仅那些直接涉及创建或修饰分子所需功能的残基被多样化。对于许多分子，所述功能会是结合靶，并因此多样性应集中于靶结合位点，而避免改变对于所述分子的总体组装(packing)或维持所选的主链构象为至关重要的残基。

6.1.1.适用于抗体域的规范序列的多样化。

在本文中公开的配体的情况下，对于靶的结合位点最常见为抗原结合位点。因此，在一方面，其中仅那些在抗原结合位点的残基有变动的抗体配体的文库或组装。这些残基在人抗体全集库中是极度多样的，并已知其在高解析度抗体/抗原复合物中发生接触。例如，在L2中，已知50和53位在天然出现的抗体中是多样的，并观察到其与抗原发生接触。与之相对，常规方法会多样化在相应的如Kabat等(Kabat等，1991，Sequences of Immunological Interest，5^th ed.U.S.Dept.Health & Human Services，Washington，D.C.)定义的互补决定区(CDR1)中所有的残基，为约七个残基，而与之相比在本文中公开使用的文库中仅多样化两个。这在创建大量抗原结合特异性所需的功能多样性方面代表了显著的进步。

在自然界中，抗体多样性是两个过程的结果：种系V、D和J基因区段的体细胞重组以创建天然的原始全集(所谓种系和连接多样性)以及所得的重排V基因的体细胞超突变。对于人抗体序列的分析显示在原始全集中的多样性集中在抗原结合位点的中央，而体细胞超突变使多样性蔓延至抗原结合位点的边缘，其在原始全集中是高度保守的(参见Tomlinson等(1996)J.Mol.Biol.，256：813)。这种互补性可能是作为有效的搜索序列空间的策略而进化的，并且尽管其显然仅见于抗体，但是其可容易地适用于其他多肽库。变动的残基为那些形成对于靶的结合位点残基的子集。若需要，对靶结合位点中不同的(包括重叠的)残基子集在选择过程中不同的阶段进行多样化。

在抗体全集的情况下，当将抗原结合位点中一些但非全部的残基多样化时，创建了初始的“幼稚的”全集。如本文中在该上下文中使用的术语“幼稚的”指无预决靶的抗体分子。这些分子类似于那些由未经免疫多样化的个体的免疫球蛋白基因编码的分子，如胎儿或新生儿个体的情况，其免疫系统还未受到广泛种类的抗原刺激的攻击(challenge)。然后将该全集针对多种抗原或表位进行选择。若需要，然后可将进一步的多样性引入在初始全集中多样化的区域以外之处。可就其修饰的功能、特异性或亲和力对该成熟的全集进行选择。

本文中公开了两种不同的幼稚的结合域的全集以供构建配体，或配体的幼稚文库，其中抗原结合位点中一些或全部残基有变化。“原始”文库模拟天然的原始全集，其中多样性限于抗原结合位点中央的残基，其在种系V基因区段中是多样的(种系多样性)或在重组过程中发生多样化(连接多样性)。那些被多样化的残基包括但不仅限于H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96。在“体细胞”文库中，多样性限于在重组过程中多样化的残基(连接多样性)或高度体细胞突变的。那些被多样化的残基包括但不仅限于H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34和L96。已知上述所有列出为适于在这些文库中进行多样化的残基均在一种或多种抗体-抗原复合物中发生接触。由于在两个文库中，并非抗原结合位点的所有残基均有变化，所以如果需要这么做，可通过变化剩余的残基来在选择过程中掺入附加的多样性。对于本领域技术人员应显而易见任何这些残基(或构成抗原结合位点的其他残基)的任何子集均可用于所述抗原结合位点的初始和/或后续多样化。

为了构建本文中公开使用的文库，选定位置的多样化通常是在核酸水平通过改变限定多肽的序列的编码序列达成的，从而使得可将多种可能的氨基酸(总共20种，或其子集)在该位置掺入。使用IUPAC命名法，最通用的密码子是NNK，其编码所有的氨基酸以及TAG终止密码子。在一方面，使用NNK密码子以引入所需的多样性。也可使用其他达成相同目的的密码子，包括NNN密码子，其导致其他终止密码子TGA和TAA的产生。

在人抗体的抗原结合位点中侧链多样性的一项特征是偏爱某些氨基酸残基显著的偏好。如果统计V_H、V_κ和V_λ区域每一个中十个最多样化的位置的氨基酸组成，则超过76％的侧链多样性来自仅仅七种不同的残基，其为丝氨酸(24％)、酪氨酸(14％)、天冬酰胺(11％)、甘氨酸(9％)、丙氨酸(7％)、天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这种朝向可提供主链柔性的亲水残基和小残基的偏好反映了倾向于结合广泛范围的抗原或表位的表面的进化，并可帮助解释在原始全集中所需的抗体混杂。

由于优选模拟氨基酸的该分布，所以氨基酸在待变化的位置处的分布，在一方面，模拟在抗体的抗原结合位点中看到的分布。上述容许针对多种靶抗原选择某些多肽(而非仅为域抗体)的氨基酸替代中的偏好可容易地适用于任何多肽全集。有多种方法以供使得待变化位置的氨基酸分布产生偏好(包括使用三核苷酸诱变，参见WO 97/08320)，其中一种由于合成容易而有利的方法，是使用常规的简并密码子。通过将由简并密码子的所有组合编码的氨基酸概况(在每个位置单一、双重、三重和四重简并性以相同比例存在)与天然所用的氨基酸相比较，可以计算出最具代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)为最接近于所需氨基酸概况的密码子：其编码22％的丝氨酸和11％的酪氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸，并在一方面，将这些密码子用于构建文库。

6.2.双特异性配体

本文中还提供了包含每一个均具有相应特异性的域抗体的双特异性配体；即，由所述双特异性配体结合的第一和第二表位在一方面，为不同的或为相同的表位的两个拷贝，所述表位由相应的可变域结合。在一个实施方案中，“双特异性配体”指包含如本文中定义的第一域抗体和第二域抗体的配体，其中可变域能够结合两个不同的抗原或相同抗原上的两个通常不由一个单特异性免疫球蛋白结合的表位。在另一个实施方案中，“双特异性配体”指包含如本文中定义的域抗体和免疫球蛋白可变域的配体，其中所述可变区能够结合两个不同的抗原或相同抗原上的两个通常不由一个单特异性免疫球蛋白结合的表位。例如，所述两个表位可为在同一个半抗原上，但并不是相同的表位，或并不足够接近从而可由一个单特异性配体结合。本文中公开的双特异性配体由具有不同特异性的可变域构成，且并不包含具有相同特异性的彼此互补的可变域对。双特异性配体可为多肽、蛋白质或核酸或其部分，其可为天然出现的或合成的。

有利地，所述双或多特异性配体可包含能够结合靶分子的第一域，和能够结合延长所述配体半衰期的分子或基团的第二域。例如，所述分子或基团可为庞大的(bulky)试剂，如HSA或细胞基质蛋白。如本文中使用的短语“延长配体半衰期的分子或基团”指当施药于动物时，当由如本文中所述的双特异性配体结合时，与不结合该分子或基团的配体相比，使得此类双特异性配体在体内的半衰期延长的分子或化学基团。延长配体半衰期的分子或基团的实例在本文中如下所述。在一个实施方案中，封闭构象的多特异性配体可能仅在置换了所述半衰期增强分子或基团之后能够结合靶分子。因此，例如，庞大的分子如HSA将封闭构象的多特异性配体维持循环于受试者的血液中。当遇到靶分子时，所述封闭构象的多特异性配体的结合域之间的竞争导致HSA的置换和靶的结合。在上文已更详细地讨论了延长半衰期的分子。

在本文中公开的第二构象的一个实施方案中，可变域衍生自针对第一和/或第二抗原或表位的抗体。在一个实施方案中，所述可变域衍生自单一可变抗体域的全集。在一个实例中，所述全集为并非在动物中创建的全集，或合成全集。在另一个实例中，所述单一可变域未经动物免疫接种所分离(至少部分分离)。因此，所述单一域可从幼稚的文库分离。

在另一方面，本文中公开了包含具有第一表位结合特异性的第一表位结合域和具有第二表位结合特异性的非互补性的第二表位结合域的多特异性配体。所述第一和第二结合特异性可为相同的或不同的。

在另一方面，本文中公开了含具有第一表位结合特异性的第一表位结合域和具有第二表位结合特异性的非互补性的第二表位结合域的封闭构象的多特异性配体，其中所述第一和第二结合特异性能够竞争表位结合，从而使得所述封闭构象的多特异性配体无法同时结合两个表位。

根据本文中公开的任何方面的配体，以及可用于构建上述配体的域抗体单体，可有利地从其关联靶以由表面等离振子共振确定为约300nM至1pM或5pM(即，3x10^-7至5x10^-12M)，在一方面，约50nM至20pM，或5nM至200pM，或1nM至100pM、1x10^-7M或更低、1x10^-8M或更低、1x10^-9M或更低、1x10^-10M或更低、1x10^-11M或更低的K_d；和/或约5x10^-1至1x10^-7S^-1，在一方面，约1x10^-2至1x10^-6S^-1、或5x 10^-3至1x10^-5S^-1、或5x10^-1S^-1或更低、或1x10^-2S^-1或更低、或1x10^-3S^-1或更低、或1x10^-4S^-1或更低、或1x10^-5S^-1或更低、或1x10^-6S^-1或更低的K_off速率常数解离。K_d速率常数定义为K_off/K_on。其他关于双特异性配体的细节可见于WO03/002609、WO 04/003019和WO 04/058821。

此外，提供了以1nM至500μM(即，1x10^-9M至5x10^-4M)(在一方面，100nM至10μM)的K_d结合血清清蛋白(SA)的域抗体单体(或包含上述域抗体的双特异性配体)。在一方面，对于包含第一抗SA域抗体和针对另一种靶的第二域抗体的双特异性配体，第二dAb对于其靶的亲和力(例如，如使用BiaCore通过表面等离振子共振测量的K_d和/或K_off)为第一域抗体针对SA的亲和力的1至100,000倍(在一方面，100至100,000，在另一方面，1000至100000或10000至100000倍)。例如，第一域抗体以大约10μM的亲和力结合SA，而第二域抗体以约100pM的亲和力结合其靶。在一个示例性实施方案中，所述血清清蛋白是人血清清蛋白(HSA)。

在一个实施方案中，第一域抗体(或域抗体单体)以大约为约50nM(在一方面，约70nM，而在另一方面，约100、150或200nM)的K_d结合SA(例如HSA)。

与前述方面一致，还提供了上述域抗体单体的二聚物、三聚物和多聚物。

可将本文中公开的配体，包括域抗体单体、二聚物和三聚物，连接于抗体Fc区，其包括C_H2和C_H3域中一个或两个，并任选地包括铰链区。例如，编码作为单一核苷酸序列连接于Fc区的配体的载体可用于制备上述多肽。或者，本文中公开的配体可不含Fc域。

在另一方面，提供了一种或多种编码至少一种本文中定义的双特异性或多特异性配体的核酸分子。在一个实施方案中，所述配体是封闭构象的配体。在另一个实施方案中，其为开放构象的配体。所述多特异性配体可编码于单一核酸分子上；或者，每个表位结合域可由不同的核酸分子所编码。当配体由单一核酸分子编码时，所述域可作为融合多肽表达，或可分别表达并随后连接在一起，例如使用化学连接剂。从不同核酸表达的配体可通过合适的手段连接在一起。

所述核酸可进一步编码用于将所述多肽在表达后从宿主细胞输出的信号序列，且可在表达后与丝状噬菌体颗粒的表面组分(或选择展示系统的其他组分)融合。前导序列，其可用于细菌表达和/或噬菌体或噬菌粒展示，包括pelB、stII、ompA、phoA、bla、ompT和pelA。

在另一方面，如本文中公开的第二构象包括包含核酸的载体。

还在另一方面，提供了用载体转染的宿主细胞。

来自上述载体的表达可配置为例如在噬菌体颗粒的表面产生表位结合域供选择。这容许使用如本文中公开的方法进行的展示的域的选择以及“多特异性配体”的选择。

6.2.1.‘双特异性配体’的结构

如上所述，在本文中，抗体定义为包含至少一个重链可变域和一个轻链可变域、至少两个重链可变域或至少两个轻链可变域的抗体或片段(Fab、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体)。其至少部分地衍生自任何天然产生抗体的物种，或通过重组DNA技术构建；无论其为从血清、B-细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌分离的。

在一个实施方案中，所述双特异性配体至少包含抗体的一个单一重链可变域和抗体的一个单一轻链可变域，或两个单一重链或轻链可变域。例如，所述配体可包含V_H/V_L对，一对V_H域或一对V_L域。

上述配体的第一和第二可变域可为在同一个多肽链上。或者其可为在不同的多肽链上。在其为在相同的多肽链上的情况下，其可由接头相连接，所述接头可为如上所述的肽序列。

所述第一和第二可变域可为共价或非共价联合的。在其为共价联合的情况下，所述共价键可为二硫键。

在所述可变域选自V-基因全集的情况下，例如使用如本文中所述的噬菌体展示技术选择，这些可变域包含通用的框架区，从而使得其可以由如本文中定义的特定类属配体所识别。通用框架、类属配体等的使用描述于WO99/20749。

当使用V-基因全集时，在一方面，多肽序列中的变异位于可变域的结构环之内。可变域任一的多肽序列可通过DNA改组或通过突变来改变以增强每个可变域与其互补对的相互作用。DNA改组在本领域是已知的，并例如，由Stemmer(1994)Nature 370：389-391和美国专利6,297,053号所教导，二者均以提述的方式并入本文。其他诱变方法对于本领域技术人员是众所周知的。

在一个实施方案中，所述“双特异性配体”是单链Fv片段。在另一个实施方案中，所述“双特异性配体”由Fab形式组成。

本文中公开的另一方面提供了至少编码本文中定义的“双特异性配体”的核酸。

本领域技术人员会理解，取决于其方面，抗原或表位可同时结合相同的抗体分子。或者，其可竞争对相同抗体分子的结合。例如，当两个表位均同时连接时，双特异性配体的两个可变域均能够独立地结合其靶表位。当所述域竞争时，一个可变域能够结合其靶，但并非与另一个可变域结合其关联靶同时的；或第一可变域能够结合其靶，但并非与第二可变域结合其关联靶同时的。

所述可变区可衍生自针对靶抗原或表位的抗体。或者，其可衍生自单一抗体域的全集，如那些在丝状噬菌体表面上表达的。可如下所述进行选择。

一般而言，如本文中公开的性能所需要的核酸分子和载体构建物可如标准实验室手册(如Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA)中所述进行构建和操作。

如本文中公开的可用的核酸的操作通常是在重组载体中实施的。

因此，本文中公开的另一方面提供了包含至少编码如本文中定义的“双特异性配体”的核酸的载体。

如本文中使用的载体指用于将异源DNA引入细胞以供其表达和/或复制的分立元件。用于选择或构建以及随后使用上述载体的方法对于本领域一般技术人员是众所周知的。多种载体可为公众所获得，包括细菌质粒、噬菌体、人工染色体和附加型载体。上述载体可用于简单的克隆和诱变；或者可使用基因表达载体。如本文中公开的可用的载体可选择为容纳所需大小的多肽编码序列，通常其长度为0.25千碱基(kb)至40kb或更大。将合适的宿主细胞用所述载体在体外克隆操作之后进行转化。每个载体包含多种功能性组分，其通常包括克隆(或“多接头”)位点，复制起点，以及至少一种选择标记基因。如果给定的载体是表达载体，其还具有下述中的一种或多种：增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，每一个均位于克隆位点附近，从而使得其可操作地连接于编码如本文中公开的配体的基因。

克隆和表达载体均通常含有使得所述载体能够在一种或多种所选的宿主细胞中复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列是使得所述载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列，并包含复制起点或自主复制序列。上述序列对于多种细菌、酵母和病毒而言是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点对于大多数革兰氏阴性细菌是合适的，2微米质粒起点适用于酵母，而多种病毒起点(例如SV40，腺病毒)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，对于哺乳动物表达载体并不需要复制起点，除非其用于能够复制高水平DNA的哺乳动物细胞，如COS细胞。

有利地，克隆或表达载体可包含选择基因，也称作选择标记。该基因编码在选择性培养基中培养的转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。因此，未用含有所述选择基因的载体转化的宿主细胞会无法在培养基中存活。通常的选择基因编码赋予针对抗生素和其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，弥补营养缺陷型缺陷或供应生长培养基中无法获得的关键营养的蛋白质。

6.2.2.组合单一可变域

一旦如本文中公开的可用的域经使用上文示例的方法选择，其可通过多种本领域已知的方法组合，包括共价和非共价方法。

方法包括所述的多肽接头的使用，例如，与scFv分子相连接(Bird等，(1988)Science 242：423-426)。关于合适接头的讨论由Bird等，Science 242：423-426；Hudson等，(1999)J.Immunol.Methods 231：177-189；Hudson等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85：5879-5883提供。在一方面，接头是柔性的，容许两个单一域相互作用。一个接头实例为(Gly₄Ser)_n接头，其中n＝1至8，例如2、3、4、5或7。还可使用用于双抗体的柔性较低的接头(Holliger等，(1993)PNAS(USA)90：6444-6448)。

在一个实施方案中，使用的接头并非免疫球蛋白铰链区。

可使用除了接头之外的方法来组合可变域。例如，可发掘使用通过天然出现的或经工程改造的半胱氨酸残基提供的二硫桥以稳定化V_H-V_H、V_L-V_L或V_H-V_L二聚物(Reiter等，(1994)Protein Eng.7：697-704)或通过重塑可变域之间的界面以改善“配合(fit)”并由此改善相互作用的稳定性(Ridgeway等，(1996)Protein Eng.7：617-621；Zhu等，(1997)Protein Science 6：781-788)。

可适当使用其他联结或稳定化免疫球蛋白可变域，尤其是抗体V_H域的技术。

如本文中公开的双特异性配体在溶液中可为“封闭”构象。“封闭”构象为其中两个域(例如V_H和V_L)以相联合的形式存在，如形成抗体结合位点的相联合的V_H-V_L对。例如，scFv可为封闭构象，取决于用于连接V_H和V_L域的接头的排列。如果其足够柔性，容许所述域相联合，或刚性地将其保持在相联合的位置，则有可能所述域会采用封闭构象。

类似地，V_H域对和V_L域对可以封闭构象存在。一般而言，其为所述域的紧密联合(如在配体分子中通过刚性接头)的结果。封闭构象的配体会无法结合延长所述配体半衰期的分子和第二靶分子二者。因此，所述配体通常仅在从延长所述配体半衰期的分子解离时结合第二靶分子。

而且，构建无接头的V_H/V_H、V_L/V_L和V_H/V_L二聚物提供了这些域之间的竞争。

如本文中公开的配体还可为开放构象。在上述构象中，配体会能够同时结合延长所述配体半衰期的分子和第二靶分子二者。通常，开放构象的可变域(在V_H-V_L对的情况下)保持足够距离使得所述域不相互作用和形成抗体结合位点，而且不竞争对其相应表位的结合。在V_H/V_H或V_L/V_L二聚物的情况下，所述域并不由刚性接头强制在一起。自然，上述域配对不会竞争抗原结合或形成抗体结合位点。

Fab片段和完整抗体主要会以封闭构象存在，尽管会理解的是在不同情况下，开放和封闭的双特异性配体有可能以多种均衡状态存在。配体与靶的结合有可能将所述均衡的平衡移向开放构象。因此，本文中公开的某些配体可在溶液中以两种构象存在，其中一种(开放形式)能独立地结合两个抗原或表位，而另一种构象(封闭形式)仅能结合一个抗原或表位；因此在该构象中抗原或表位竞争对配体的结合。

尽管双特异性配体的开放形式因此可在溶液中与封闭形式以均衡状态存在，可预见所述均衡会倾向于封闭形式；而且，开放形式可通过靶结合而隔绝成封闭形式(the open form can be sequestered by target binding into a closed conformation)。因此，在示例性实施方案中，本文中公开的某些双特异性配体以两种(开放和封闭)构象之间的均衡状态存在。

本文中公开的双特异性配体可经修饰以偏好开放或封闭构象。例如，用二硫键稳定化V_H-V_L相互作用稳定了封闭构象。而且，可构建用于联结域的接头，包括V_H域和V_L域对，使得其偏好开放形式；例如，所述接头可在空间上阻碍域的联系，如通过在合适的位置掺入大氨基酸残基，或通过设计会使得所述域物理上分隔开来的合适的刚性结构。

6.2.3.双特异性配体的表征

双特异性配体对其特定抗原或表位的结合可通过本领域技术人员熟悉的方法(包括ELISA)来进行测试。在一个实施方案中，结合是使用单克隆噬菌体ELISA来测试的。

噬菌体ELISA可根据任何合适的规程进行；下文描述了示例性的方案。

可对在每轮选择产生的噬菌体体群就其通过ELISA结合所选的抗原或表位来进行筛选以鉴定“多克隆”噬菌体抗体。然后可将来自这些群体的单一感染的细菌菌落的噬菌体通过ELISA进行筛选以鉴定“单克隆”噬菌体抗体。还想要就其对抗原或表位的结合来筛选可溶性抗体片段，且其也可通过ELISA使用例如针对C-或N-端标签(参见例如Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55及其中引用的文献)来进行。

所选的噬菌体单克隆抗体的多样性亦可通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等(1991)，见上；Nissim等(1994)，见上)、探查(Tomlinson等，(1992)J.Mol.Biol.227，776)或对载体DNA的测序来进行评价。

7.提高多肽稳定性

7.1.延长半衰期

在体内，如本文中所述的经PEG化的域抗体与未经PEG化的域抗体相比，提供了独特的益处，即经PEG化的抗体分子具有大为延长的体内半衰期。应理解的是，在本公开的上下文中，任何组合物的具体半衰期可由所述组合物向患者的施药途径而延长或缩短。

尽管如此，不愿拘于一种具体理论，相信本文中所述的分子延长的半衰期是由所述域抗体由于PEG聚合物的附加而增加的流体动力学大小所赋予的。更具体而言，相信两个参数在决定经PEG化的域抗体的血清半衰期中起重要作用。第一个标准是所述PEG附加的性质和大小，即使用的聚合物是单纯的线性链还是支化的/叉状的链，其中支化的/叉状的链导致较长的半衰期。第二个标准是PEG部分在域抗体最终形式中的位置，以及所述分子具有多少个“游离”的未经修饰的PEG臂。所得的经PEG化的域抗体的流体动力学大小，根据例如大小排阻层析的估计，反映了所述分子的血清半衰期。因此，经PEG化的分子的流体动力学大小愈大，其血清半衰期愈长。

延长的半衰期有助于免疫球蛋白，特别是抗体而特别是较小的抗体片段，以及域抗体的体内应用。上述片段(Fv、Fab、scFv)和域抗体遭受身体的快速清除；因此，尽管其能够迅速地抵达身体的大部分位置，且其快速产生并更容易操作，但是其体内应用受限于其在体内仅仅短暂的存在。

在一方面，在体内通过将其与部分如PEG融合来稳定化如本文中所述的域抗体，所述融合增加了所述域抗体的流体动力学大小。用于药动学分析和确定半衰期的方法对于本领域技术人员是熟悉的。其细节可见于Kenneth等，Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists及Peters等，Pharmacokinetc Analysis：A Practical Approach(1996)。还参考了“Pharmacokinetics”，M.Gibaldi & D.Perron，由Marcel Dekker出版，第2修正版(1982)，其描述了药动学参数如t-α和t-β半衰期以及曲线下面积(AUC)。

通常，如本文中所述的经PEG化的域抗体的半衰期相对于未经PEG化的dAb(其中经PEG化的域抗体和未经PEG化的域抗体的域抗体是相同的)增加了约0％、20％、30％、40％、50％或更多。2x、3x、4x、5x、7x、10x、20x、30x、40x以及高至50x或更多范围的半衰期延长是可能的。或者，或此外，高至30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x或150x范围的半衰期延长是可能的

半衰期(t1/2-α和t1/2-β)和AUC可从配体血清浓度针对时间的曲线来确定。例如，可使用WinNonlin分析包(可从Pharsight Corp.，Mountain View，CA94040，USA获得)对所述曲线建模。在第一阶段(α阶段)中，配体主要在患者中进行分布，部分被消除。第二阶段(β阶段)是配体已经分布而血清浓度随着配体从患者清除而降低的末期。“tα半衰期”是第一期的半衰期而“tβ半衰期”是第二阶段的半衰期。如本文中使用的“半衰期”，除非另行指明，指通过非隔室建模(non-compartment modeling)(与例如二相建模(biphasic modeling))确定的本文中公开的抗体单一可变域的总体半衰期。β半衰期是域抗体单体或多聚物从哺乳动物中清除至其量为其给药量所需的时间的量度(Beta half-life is a measurement of the time it takes for the amount of domain antibody monomer or multimer to be cleared from the mammal to which it is administered)。因此，有利地，考虑了含有域抗体的组合物，例如，域抗体-效应物组组合物具有约0.25小时至6小时或更长范围的tα半衰期。在一个实施方案中，所述范围的下限是约30分钟、45分钟、1小时、1.3小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。此外，或或者，含有域抗体的组合物会具有高至包括12小时范围的tα半衰期。在一个实施方案中，所述范围的上限为约11、10、9、8、7、6或5小时。合适范围的实例为约1.3至6小时，2至5小时或3至4小时。

有利地，包含配体的含有域抗体的组合物具有约1至170小时或更长范围的tβ半衰期。在一个实施方案中，所述范围的下限为约2.5小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时。此外，或或者，含有域抗体的组合物，例如dAb-效应物组组合物具有高至包括21日范围的tβ半衰期。在一个实施方案中，所述范围的上限是约12小时、24小时、2日、3日、5日、10日、15日或20日。有利地，如本文中公开的含有dAb的组合物具有约2至100小时、4至80小时和10至40小时范围的tβ半衰期。在另一个实施方案中，其为约12至48小时的范围。还在另一个实施方案中，其为约12至26小时的范围。本文中公开了包含配体的含有域抗体的组合物，其具有1至170小时或更长范围的半衰期。在一个实施方案中，所述范围的下限是约1.3小时、2.5小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时。此外，或或者，含有域抗体的组合物，例如dAb-效应物组组合物，具有高至包括21日范围的半衰期。在一个实施方案中，所述范围的上限是约12小时、24小时、2日、3日、5日、10日、15日或20日。

作为上述标准的附加或替代标准，包含配体的含有域抗体的组合物具有1mg·min/ml或更高范围的AUC值(曲线下面积)。在一个实施方案中，所述范围的下限是约5、10、15、20、30、100、200、或300mg·min/ml。此外或或者，本文中公开的配体或组合物具有高至约600mg·min/ml范围的AUC。在一个实施方案中，所述范围的上限为约500、400、300、200、150、100、75或50mg·min/ml。本文中公开的示例性的配体具有选自下组的范围中的AUC：约15至150mg·min/ml，15至100mg·min/ml，15至75mg·min/ml，以及15至50mg·.min/ml。

本文中公开的配体，包括单特异性、双特异性和多特异性配体，以其一种构象能够结合一种或多种能在体内延长所述配体半衰期的分子。通常，上述分子是在体内天然出现的多肽，且其对从生物去除不想要的物质的内源机理的降解或去除有抗性。

例如，在生物中延长半衰期的分子可选自下述：

■来自胞外基质的蛋白质；例如胶原蛋白、层粘连蛋白、整联蛋白和纤维连接蛋白。胶原蛋白是胞外基质的主要蛋白质。现在已知大约15种类型的胶原蛋白分子，其见于身体的不同部分，例如见于骨、皮肤、肌腱、韧带、角膜、内脏的I型胶原蛋白(代表体内90％的胶原蛋白)，或见于软骨、椎间盘、脊索、眼部的玻璃状液的II型胶原蛋白。

■见于血液的蛋白质，包括血浆蛋白质，如纤维蛋白、α-2巨球蛋白、血清清蛋白、纤维蛋白原A、纤维蛋白原B、血清淀粉样蛋白A、肝球蛋白(heptagolbin)、肌动蛋白抑制蛋白、泛素、子宫球蛋白和β-2微球蛋白。

■酶和抑制剂，如纤溶酶原(plasminogen)、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)、α-1-抗胰蛋白酶和胰的胰蛋白酶抑制剂。纤溶酶原是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶纤溶酶的无活性前体。通常发现其通过血流循环。当纤溶酶原变得激活并转化为纤溶酶时，其打开强力的酶活性域的折叠而溶解将血细胞纠缠于血块中的血纤蛋白原纤维。这称为血纤蛋白溶解。

■免疫系统蛋白质，如IgE、IgG和IgM。

■运输蛋白如视黄醇结合蛋白，α-1微球蛋白。

■防卫素如β-防卫素1，嗜中性防卫素1、2和3。

■在血脑屏障处或在神经组织中发现的蛋白质，如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸转运蛋白。

■运铁蛋白受体特异性配体-神经药剂(neuropharmaceutical agent)融合蛋白(参见美国专利5,977,307号)；脑毛细血管内皮细胞受体、运铁蛋白、运铁蛋白受体、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGFl)受体、胰岛素样生长因子2(IGF2)受体，胰岛素受体。

■位于肾脏的蛋白质，如多囊蛋白(polycystin)、IV型胶原蛋白、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann氏抗原。

■位于肝脏的蛋白质，例如醇类脱氢酶，G250。

■凝血因子X

■α1抗胰蛋白酶

■HNF 1α

■位于肺脏的蛋白质，如分泌成分(结合IgA)。

■位于心脏的蛋白质，例如HSP27。其与扩张型心肌病相关。

■位于皮肤的蛋白质，例如角蛋白。

■骨特异性蛋白质，例如骨形态发生蛋白(BMP)，其为转化生长因子β超家族的子集，表现出成骨活性。其实例包括BMP-2、-4、-5、-6、-7(也称作成骨蛋白(OP-1))和-8(OP-2)。

■肿瘤特异性蛋白质，包括人滋养层抗原、赫赛汀(herceptin)受体、雌激素受体、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B)(见于肝和脾)。

■疾病特异性蛋白质，如仅在激活的T细胞上表达的抗原：包括LAG-3(淋巴细胞激活基因)、骨保护素配体(OPGL)(参见Nature 402，304-309；1999)；OX40(TNF受体家族的一个成员，在激活的T细胞上表达，且为唯一已知的在人T细胞白血病病毒类型-I(HTLV-I)产生细胞中特异性上调的共刺激T细胞分子。)(参见J.Immunol.165(1)：263-70，2000)；金属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)，包括CG6512果蝇、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠类ftsH；血管发生性生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)，碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透性因子(VEGF/VPF)，转化生长因子-a(TGF a)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管生成素、白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长抑制(PIGF)、中期因子(midkine)血小板衍生生长因子-BB(PDGF)、fractalkine(CXXXC趋化因子)。

■应激蛋白(热休克蛋白)。HSP通常见于胞内。当其见于胞外时，其为细胞死亡并进出其内含物的标志。该非程序性的细胞死亡(坏死)仅作为创伤、疾病或损伤的结果发生，并因此在体内，胞外HSP触发免疫系统的应答以抗击感染和疾病。结合胞外HSP的双特异性物可定位于疾病位点。

■涉及Fc运输的蛋白质，如：

○Brambell受体(也称作FcBB)。该Fc受体具有两种功能，其均潜在地可用于递送。所述功能包括将IgG从母亲穿过胎盘运输给孩子，以及保护IgG免受降解由此延长IgG的血清半衰期。认为所述受体使IgG自内体再循环(参见Holliger等(1997)Nat.Biotechnol.15：632-6)。

○其他涉及Fc运输的蛋白质包括描述于Gastinel等(1992)PNAS 89：638；及Roopenian等(2003)J.Immunol.170：3528的新生儿Fc受体(FcRn)。

■本文中公开的受体可设计为对上述靶特异性的，而不需要在体内延长半衰期。例如，本文中公开的配体可对选自前述为组织特异性的靶特异性的，由此能够实现所述双特异性配体的组织特异性靶向，或可为结合组织特异性治疗相关的靶的域抗体，而不管任何半衰期的延长(虽然这可能发生)。而且，当所述配体或域抗体靶向肾脏或肝脏时，这可在体内将所述配体或域抗体重新导向另一种的清除途径(例如，所述配体可从肝脏清除导向肾脏清除)。

可用于延长半衰期的多肽包括但不仅限于示于附录I中的那些。

7.2.提高对蛋白酶降解的抗性

本文中还公开了本文中所述的经PEG化的域抗体和域抗体多聚物提高针对蛋白酶作用的稳定性。在胃蛋白酶存在下，许多域抗体在pH 2完全降解，因为蛋白质在酸性条件下解折叠，从而使得蛋白酶更容易接近蛋白酶。本文中提供了PEG化的域抗体分子，包括域抗体多聚物，其中相信PEG聚合物提供了对多肽骨架的保护，这是因为PEG聚合物对所述骨架的物理覆盖，从而阻止所述蛋白酶实现接近多肽骨架并将其切割。在一个实施方案中，生成了如本文中公开的具有更大流体动力学大小(例如200至500kD)的经PEG化的域抗体，因为较大的流体动力学大小会比具有较小流体动力学大小的经PEG化的域抗体巩固更高水平的针对蛋白酶降解的保护。在一个实施方案中，PEG或其他聚合物连接的抗体单一可变域单体或多聚物当暴露于胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶之一种或多种时，降解了不超过10％，其中如果该蛋白酶是胃蛋白酶，则是在pH 2.0实施暴露30分钟，而如果所述蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶之一种或多种，则是在pH 8.0实施暴露30分钟。在一个实施方案中，PEG或其他聚合物连接的域抗体单体或多聚物当pH 2.0暴露于胃蛋白酶30分钟时降解了不超过10％，在一方面，不超过5％，且在另一方面，根本未降解。在另一个实施方案中，本文中公开的PEG或其他聚合物连接的域抗体聚合物(例如，异或同二聚物、三聚物、四聚物、八聚物等)在pH 2.0胃蛋白酶存在30分钟下降解了少于5％，且在一方面，根本未降解。在一个示例性实施方案中，PEG或其他聚合物连接的域抗体单体或多聚物在pH 8.0暴露于胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶30分钟时，降解了不超过10％，在一方面，不超过5％，且在另一方面，根本未降解。在另一个示例性实施方案中，本文中公开的PEG或其他聚合物连接的域抗体多聚物(例如，异或同二聚物、三聚物、四聚物、八聚物等)在pH 8.0胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶存在30分钟下降解了少于5％，且在一方面，根本未降解。

蛋白酶：PEG-域抗体的相对比例可如本文中公开地进行改变以取得上述所需水平的降解。例如，蛋白酶对PEG-域抗体的比例可为约1∶30至约10∶40，至约20∶50，至约30∶50，约40∶50，约50∶50，约50∶40，约50∶30，约50∶20，约50∶10，约50∶1，约40∶1，以及约30∶1。

因此，本文中公开了减少域抗体降解的方法，包括根据本文中所述的任何实施方案将域抗体单体或多聚物连接于PEG聚合物。如本文中所公开，域抗体在pH 2.0在胃蛋白酶存在下在30分钟降解不超过10％。具体而言，PEG连接的dAb多聚物在pH2.0在胃蛋白酶存在下在30分钟降解不超过5％，且在一方面，根本未降解。在另一个实施方案中，所述域抗体在pH 8.0在暴露于胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶30分钟时，降解了不超过10％，且在一方面，不超过5％，且在另一方面，根本未降解。

如本文中所述的PEG连接的域抗体单体和多聚物的降解可使用本领域技术人员众所周知的方法来测量。例如，在用胃蛋白酶在pH 2.0将PEG连接的域抗体温育30分钟之后，或用胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶在pH 8.0温育30分钟之后，可通过凝胶过滤来分析域抗体样品，其中域抗体单体或多聚物的降解显示为具有与未降解的(即，未经胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶或羧肽酶处理的对照域抗体)域抗体相比具有较小分子量的凝胶条带。凝胶上域抗体条带的分子量可通过将该条带的迁移与分子量梯形物的迁移相比较来确定(参见图5)。其他测量蛋白质降解的方法在本领域是已知的，且可适应来评估如本文中所公开的PEG连接的域抗体单体和多聚物。

8.域抗体的用途

如本文中所述的域抗体可用于拮抗CD28的活性。因此，如本文中所述的域抗体可用于治疗罹患完全或部分由CD28活性介导的病状、疾病或病症的患者。

如本文中所述的域抗体可用于治疗或预防其中涉及CD28介导途径不适当激活的疾病或病症。如本文中所述的域抗体还可用于治疗、预防或减轻其中涉及CD28介导途径不适当激活的疾病或病症的症状。

在一方面，自身免疫性疾病常常涉及CD28途径的不适当调节或活性。将本文中所述的域抗体施药于罹患上述疾病(包括自身免疫性疾病)的个体，可减轻所述疾病的一种或多种症状。本文中所述的域抗体在治疗上有用的疾病的非限定性实例包括但不仅限于阿狄森氏病、变态反应、强直性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化、耳部自身免疫性疾病、眼部自身免疫性疾病、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性溶血性(hymolytic)贫血、自身免疫性腮腺炎、原发性胆汁性肝硬化、良性淋巴细胞性aniitis、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病、糖尿病(I型)、糖尿病(包括I型和/或2型糖尿病)、附睾炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘氏综合征、格雷夫斯氏病、格巴二氏综合征、桥本氏病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病(IBD)、针对重组药物产品(例如血友病中的因子VII)的免疫应答、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、男性不育、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、原发性粘液水肿、天疱疮、恶性贫血、多肌炎、银屑病、银屑病关节炎、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病、交感性眼炎、T细胞淋巴瘤、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、睾丸抗中心(antiocentric)T细胞淋巴瘤、甲状腺炎、移植物排斥、溃疡性结肠炎、自身免疫性葡萄膜炎和血管炎。自身免疫介导的病状包括但不仅限于，其中影响的组织是主要靶的病状，以及在一些情况下，影响的组织是次要靶的病状。上述病状包括但不仅限于：AIDS、特应性变态反应、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织和器官的移植、慢性疲乏综合征、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、心肌梗死、中风、孤独症、癫痫、阿蒂斯现象、过敏反应以及酒精和药物成瘾。

本文中所述的域抗体在治疗上还可用于移植物相关疾病，如移植物抗宿主病(GVHD)、急性移植排斥和慢性移植排斥。

本文中所述的域抗体还可用于通常任何抗体制备物可用的方式，例如，用于体内成像或诊断用途，体外诊断用途等等。

对于这些和其他用提，可能需要对域抗体进行标记，例如，用荧光、比色、酶或放射性标记物进行标记。标记域抗体的方法在本领域是众所周知的。

9.药物组合物、剂量和施药

本文中所述的域抗体可掺入适用于对受试者进行施药的药物组合物。通常，所述药物组合物包含域抗体和药学可接受载体。如本文中使用的“药学可接受载体”包括任何和所有生理学上相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。术语“药学可接受载体”排除了包含牛或马血清的组织培养基。药学可接受载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及其组合。在许多情况下，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或者氯化钠。药学可接受物质包括少量辅助性物质如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其增强所述域抗体的保质期或有效性。

如本文中所述的组合物可为多种形式。这些包括，例如，液体，半固体和固体剂量形式，如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分散液或悬浮液，粉末剂，脂质体以及栓剂。优选的形式取决于所意欲的施药模式和治疗应用。通常优选的组合物为可注射和可输注的溶液，如与那些用于用其他抗体对人进行被动免疫接种的类似的组合物。一种施药模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。

治疗组合物通常必须是无菌的，并在生产和储藏条件下是稳定的。所述组合物可配制为溶液、微乳液、分散液、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。无菌的可注射溶液可通过将活性化合物以所需量掺入合适的具有上面列举的成分之一或其组合的溶剂，若需要，继以过滤除菌来制备。一般而言，分散液是通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和来自上述列举的所需的其他成分的无菌介质来制备的。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末剂的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，以自其之前经无菌过滤的溶液得到所述活性成分加上任何其他所需成分的粉末。溶液的适当流动性可通过，例如使用如卵磷脂的涂层，(在分散的情况下)通过维持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持。

本文中所述的域抗体可通过多种本领域已知方法来施药，尽管对于许多治疗应用，优选的施药途径/模式是静脉内注射或输注。该多肽也可通过肌内或皮下注射来施药。

本领域技术人员会理解的是，施药途径和/或模式会取决于所需结果而变化。在某些实施方案中，可将活性化合物与会保护所述化合物免于迅速释放的载体一同制备，如受控释放配制剂，包括植入物和微囊递送系统。域抗体非常适于作为延长释放制备物的配制剂，这部分地是因为其较小的大小，而使得每剂的摩尔数可显著高于例如完整大小的抗体的剂量。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚正酯和聚乳酸。可注射组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来实现。许多用于制备上述配制剂的方法已获得专利或对于本领域技术人员通常是已知的。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。其他可用于受控或延长释放多肽试剂如本文中公开的单价域抗体的方法描述于，例如，美国专利6,306,406和6,346,274号，以及，例如，美国专利公开US20020182254和US20020051808号，其均以提述的方式并入本文以供所有目的。

还可将其他的活性化合物掺入所述组合物。在某些实施方案中，域抗体与一种或多种其他治疗剂共配制和/或共施药。例如，域抗体可与一种或多种结合其他靶的其他抗体(例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)或例如一种或多种细胞因子共配制和/或共施药。上述组合疗法可使用所施药的治疗剂的较低剂量，从而避免与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。

本文中公开的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的域抗体。“治疗有效量”指在对取得所需治疗结果所需的剂量和时间间隔为有效的量。域抗体的治疗有效量可根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及域抗体在该个体中引发所需应答的能力等因素而变动。治疗有效量还为其中所述抗体或抗体部分的治疗上有益的作用胜于其任何有毒或有害作用的量。“预防有效量”指对取得所需预防结果所需的剂量和时间间隔为有效的量。通常，由于预防剂量是在疾病早期阶段或其之前使用的量，预防有效量会少于治疗有效量。

可调整剂量方案以提供最优的期望应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可给予单一的推注，可随时间施药几个分剂，或者所述剂量可根据治疗状况的紧迫程度成比例减少或增加。为了施药方便和剂量的均一，以剂量单位形式配制肠胃外组合物是有利的。如本文中使用的剂量单位形式指作为单元剂量适用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上分立的单位；每个单位含有与所需的药学载体相联合的预决数量的活性化合物，其经计算产生期望的治疗效果。

域抗体治疗或预防有效量的一个非限定性范围是0.1-20mg/kg，且在一方面，1-10mg/kg。应注意剂量值可随着待减轻的病状的类型和严重性而变动。应进一步理解的是，对于任何特定受试者，应根据个体的需要和进行施药的临床医师的职业判断来随时间调整具体的剂量方案。

使用如本文中所述的域抗体的治疗的效力可由熟练临床医师根据所治疗的疾病状态或病症的一种或多种症状或指标的改善来加以判断。一种或多种临床指标的至少10％的改善(增加或减少，取决于所测量的指标)被视为“有效的治疗”，虽然包括更大的改善，如约20％、30％、40％、50％、75％、90％或甚至100％，或者，取决于所测量的指标，超过100％(例如，两倍、三倍、十倍等，高至包括获得无疾病的状态)。指标可为体格(physical)测量，例如，酶、细胞因子、生长因子或代谢物水平，细胞生长或细胞死亡的速率，或异常细胞的存在或量。还可测量例如所述疾病或病症的症状发作之间的时间量上的差异(例如，对于缓和/复发疾病，如多发性硬化)。或者，可依赖非体格测量，如疼痛或不适或其他疾病状态指标的报告减轻来衡量治疗的有效性。当进行非体格测量时，可使用多种临床上可接受的尺度或指数，例如，克罗恩氏病活性指数，即CDAI(Best等(1976)Gastroenterology 70：439)，其组合了体格指标如血细胞比容和液体的或非常软的粪便的次数等，以及患者报告的因素如腹痛或痛性痉挛的严重性以及一般的健康状态，以给出疾病得分。

对于银屑病治疗的效力，例如，可使用Salford银屑病指数(SPI)或银屑病面积严重性指数(PASI)来监测。PASI是最常用于在临床试验中评价银屑病严重性的方法，虽然其对于在日常临床实践中使用可为极度麻烦的。所述方法涉及将身体分为四个区域(腿部，其具有个体皮肤的40％；躯体(躯干：腹部、胸部、背部等)具有30％；臂部(20％)；以及头部(10％))。对每个区域进行单独评分，然后组合四个得分以获得最终PASI。对于每个这些区域，估算涉及皮肤的面积的百分比，然后将其转化为0至6的等级：

0％相关面积，等级：0

＜10％相关面积，等级：1

10-29％相关面积，等级：2

30-49％相关面积，等级：3

50-69％相关面积，等级：4

70-89％相关面积，等级：5

90-100％相关面积，等级：6

严重性可通过四个不同的参数来估计：瘙痒(I)，红斑(发红)(E)，脱皮(S)和厚度(T)(银屑病皮肤比正常皮肤要厚)。严重性参数测量为0至4的尺度，从无到最严重。

然后对于皮肤的每个区域计算所有四个严重性参数的总合，乘以该区域的面积得分并乘以各区域的权重(头部为0.1，臂部为0.2，躯体为0.3而腿部为0.4)。实例：(I头部+E头部+S头部+T头部)x A头部x 0.1＝总头部。

最后，总PASI计算为所有四个皮肤区域的PASI的总和。发现计算机协助的银屑病损伤面积测量与标准方法相比，提高了临床试验的检验功效(power)。内科医师对银屑病损伤面积的估计倾向于过高估计。改进的PASI指数，其中不将银屑病面积转化为面积等级，但维持为连续的变量，也提高了临床试验的检验功效。涉及计算机协助的将面积测量作为连续变量的经修正的PASI称作：计算机协助的银屑病连续面积和严重性得分cPcASI。

也可监测对于器官移植排斥的治疗的效力。器官移植患者的生存率(目前对于所有移植器官而言5年的生存率为约70至85％)作为器官保存和免疫抑制治疗的进展的结果有所改善。然而，器官排斥，特别是发生于手术后最初几周的急性排斥以及慢性移植物排斥，仍旧为器官移植中功能衰竭的主要原因之一。目前对实体器官移植之后移植排斥的诊断和确证需要对组织进行活检以检测免疫细胞(例如，T细胞，巨噬细胞等)浸润入移植物和其他病理学改变。组织生检不仅具有侵袭性，而且还与对患者增加的健康风险相关，并倾向于取样错误，能导致假阴性结果。正在开发替代性的非侵袭性方法，如磁共振成像(MRI)，其可用于监测免疫细胞在被排斥器官处的蓄积(Ho等，(2004)Curr.Pharm.Biotech.，5：551-566)。

如本文中使用的术语，如果一种或多种症状的发作或严重性相对于该症状在未经该组合物治疗的相似的个体(人或动物模型)中延迟或减少了至少10％或消除，则使用如本文中所述的组合物进行的“预防”是“有效的”。

虽然本文中所述的域抗体结合人CD28，但当在动物模型系统中评估其作用时，该多肽必须与动物模型系统中一种或多种抗原交叉反应，在一方面，以高亲和力交叉反应。本领域技术人员能容易地确定对于给定动物模型系统和给定域抗体，该条件是否满足。如果该条件已满足，则所述域抗体的效力可通过将其在模拟疾病状态的条件下施药于动物模型，并监测该疾病状态的一种或多种指标改善至少10％来进行检查。

10.动物模型

如本文中所述的域抗体可用于治疗其中CD28信号传导有不适当活性的自身免疫性病症。有几种动物模型其中可对给定域抗体的治疗效力进行评价，如下所述。

10.1.炎性肠病(IBD)模型(CD4⁺CD45RB^高针对SCID或Rag^-/-小鼠)-慢性模型

IBD模型包括使用De Winter等(1999)Am.J.Physiol.276：G1317-1321讨论的粘膜免疫和炎症系统。简言之，IBD是未知病因的多因素免疫性病症。几种类似IBD的粘膜炎症小鼠模型提供了对主宰正常和病理粘膜免疫功能的机理的一窥。在一方面，向免疫缺陷小鼠注射CD4(+)T淋巴细胞的子集，CD4(+)CD45RB高细胞，导致肠部的炎症。疾病发生部分是因为促炎性细胞因子的分泌。在另一方面，结肠炎的诱导可通过共转移另一种CD4(+)亚群，CD4(+)CD45RB低T细胞来阻止。该群与CD4(+)CD45RB高群在获得激活标记和归巢至宿主肠部方面的表现类似。然而，当其激活时，它们的淋巴因子概貌不同，且由CD4(+)CD45RB低T细胞分泌和/或诱导的抗炎性细胞因子阻止结肠炎。De Winter等提供了对过继转移模型以及促进和阻止结肠炎疾病发生的因素的描述。

10.2.与NOD杂交的KRN TCR Tg小鼠中的自发性关节炎模型-慢性模型

Kouskoff等(1996)Cell 87：811-822提供了由系统自身免疫引发的器官特异性疾病模型。类风湿性关节炎(RA)是以白血病侵袭和滑膜细胞激活继以软骨和骨破坏为特征的慢性关节疾病。对RA的病因和疾病发生所知不详。Kouskoff等提出了RA的自发性小鼠模型，其通过将T细胞受体(TCR)转基因系与NOD品系杂交产生。在所有后代中发生了高度近似人中的RA的关节疾病。鼠病症的触发因素是转基因TCR对NOD衍生的II型主要组织相容性复合物(MHC)分子的偶然识别；向关节炎的进展涉及CD4+T、B和可能的髓样细胞。

10.3.小鼠胶原蛋白诱导的关节炎-慢性模型

Brand等(2004)Methods Mol.Med.102：295-312提供了胶原蛋白诱导的关节炎的小鼠模型。简言之，胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)是可在啮齿类(大鼠和小鼠)和非人灵长类的易感品系中通过用II型胶原蛋白(CII)，关节软骨的主要构成蛋白质免疫接种来引发的实验性自身免疫性疾病。在免疫接种之后，动物发生自身免疫性多关节炎，其与RA共有几种临床和组织学特征。啮齿类中对CIA的易感性与主要组织相容性复合物(MHC)的II型分子有联系，而对CII的免疫应答以对胶原蛋白特异性T细胞的刺激和高滴度的对免疫原(异源CII)和自身抗原(小鼠CII)特异性的抗体的产生为特征。组织学上，鼠类CIA以强烈的滑膜炎为特征，其准确地与关节炎的临床发作相一致。该实验数据可用于评估CIA，因为CIA和RA在病理学上的相似性。

10.4.体内抗原诱导的T细胞增殖-急性模型

使用T细胞抗原受体转基因T细胞的过继转移以供研究体内T细胞激活提供了抗原诱导T细胞增殖的模型。Pape等，(1997)Immunol.Rev.156：67-78讨论了均一地表达具有已知的肽/MHC特异性的可鉴定的TCR的TCR转基因T细胞的过继转移可用于监测抗原特异性T细胞的体内表现。该系统是用于表明幼稚T细胞起初是在二级淋巴样组织的T细胞区内以B7依赖性方式激活的。如果在该期间存在助剂或炎性细胞因子，则数目增加T细胞蓄积，迁移至富含B细胞的滤泡，并获得产生IFN-γ及帮助B细胞产生IgG2a的能力。如果不存在炎症，大部分初始激活的抗原特异性T细胞未进入滤泡即已消失，而存活的细胞是IL-2和IFN-γ的不良产生者。

实施例

实施例1：结合的域抗体的选择

对结合的域抗体(dAb)的选择是用重组人CD28/Fc嵌合物(R&D Systems，Abingdon，UK)实施的。用于选择的域抗体文库是基于单一的人VH框架(V3-23即DP47和JH4b)和单一的人VL框架(012/02即DPκ9和Jκ1)。在pDOM4载体中的GAS1前导序列的调控下dAb基因在遗传上与fd噬菌体基因III蛋白质连锁(图1)，所述载体含有生成感染性噬菌体颗粒所需要的所有fd基因。第一轮噬菌体选择是通过将噬菌体文库(VH文库的四个集合[VH11-13，VH14-15，VH16-17，VH18-19]，和VK文库的单一集合)与2％MPBS(补充以2％Marvel脱脂奶粉的磷酸盐缓冲盐水)预混合并添加CD28-Fc(R&D Systems，UK)至100nM的终浓度来进行的。将所述混合物在室温颠倒混合温育至少1小时，然后使用蛋白质G Dynabead(Dynal，Sweden)捕捉抗原-噬菌体复合物，并用1ml PBST(补充以0.1％Tween 20的PBS)洗涤洗8次，然后用1ml PBS洗涤一次。将经洗涤的噬菌体从抗原/珠复合物通过与0.5ml PBS(补充以5mM Tris-HCl pH 7.4，0.1mM CaCl₂)中1mg/ml来自牛胰脏的XIII型胰蛋白酶((Sigma Aldrich，UK)温育来洗脱。将经洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌，而产出的噬菌体滴度确定为1x10⁴至1x10⁵滴度单位(t.u)/ml，其中t.u./ml是每ml感染性噬菌体颗粒的量度。对t.u的量度是通过用给定稀释度的噬菌体感染大肠杆菌，继以将受感染的大肠杆菌在选择性琼脂板上生长来确定的。

第二轮选择是使用富集的从前一轮选择回收的噬菌体用终浓度为50nMCD28-Fc继以如前所述使用蛋白质G珠的捕捉来进行的。产出的滴度为1x10⁶至1x10⁹t.u./ml的范围。

进行了使用10nM CD28-Fc继以使用蛋白质G珠捕捉的第三轮选择。洗脱的噬菌体滴度为2x10⁹至8x10⁹t.u./ml的范围。

单克隆噬菌体ELISA是在选择轮次2和3之后实施的。所有的洗涤是使用3次250μl PBST洗涤继以3次250μl PBS洗涤来进行的。将板在4℃用1mg/ml和0.6mg/ml在PBS中的CD28-Fc分别包被过夜。洗涤板，然后将其用2％MPBS在室温封闭1小时。洗涤板，并添加噬菌体上清至相同体积的2％MPBS，并在室温温育1小时。洗涤板，并用1∶5000稀释于2％MPBS的抗M13-HRP缀合物(GE Healthcare，UK)检测结合的噬菌体，并在室温温育1小时。洗涤板，并使用SureBlue单组分TMB微孔过氧化物酶溶液(KPL Inc，USA)进行ELISA显色。特异性噬菌体是通过与包被1mg/ml Fc(Sigma Aldrich，UK)的板比较来鉴定的。在第2轮之后，特异性噬菌体主要在文库集合VH14-15、VH18-19和VK中鉴定，而到第3轮仅剩下极少的特异性噬菌体。将所有的第2轮集合亚克隆入pDOM5(图2)，并作为可溶性噬菌体进行筛选。噬菌体ELISA示于图3。

实施例2：结合的dAb的序列的鉴定

结合的dAb如下进行鉴定。从VH14-15、VH18-19和VK产出中的每一个挑取九十六个单独菌落(pDOM5)，并在200μL含有OnEx Autoinduction培养基(Novagen，UK)的Terrific Broth中在37℃以250rpm在Costar 96孔细胞培养簇(Corning Incorporated，USA)中摇动表达过夜。将培养物离心以沉淀细胞，并通过抗原结合ELISA对上清就其结合CD28的dAb进行测定。将Maxisorp 96孔免疫板(Nunc，USA)在4℃用1mg/ml PBS中的CD28-Fc包被过夜，然后洗涤。所有的洗涤如对于噬菌体ELISA所述进行。将板在室温用200μl含有1％Tween 20的PBS封闭1小时，然后洗涤。将澄清的含dAb的培养物上清在针对VH的蛋白质A(Sigma，UK)或针对VK的蛋白质L(Sigma，UK)存在下添加至ELISA板以通过分别交联VH或VK dAb来增加ELISA信号强度。将板在室温温育1小时，然后洗涤。将结合的dAb使用两步方法进行检测，首先将1∶2000稀释于PBST的9E10(抗myc IgG，Sigma-Aldrich，UK)在室温添加，1小时后洗涤，然后在室温用1∶2000稀释于PBST的抗小鼠Fc-HRP温育1小时。洗涤板，并使用SureBlue单组分TMB微孔过氧化物酶溶液(KPL Inc，USA)进行ELISA显色，并容许颜色显现。该比色反应通过添加相同体积的1M HCL来终止，并在450nm对ELISA板进行读数。通过与仅包被Fc的对照板比较来鉴定CD28特异性克隆(对于可溶性ELISA的实例，参见图4)。对所有特异性克隆进行DNA测序，并起初鉴定了28个独特的克隆(对于序列，参见附录)。对另外两个板的dAb上清就其对CD-28的结合通过BIAcore分析(GE Healthcare，UK)进行筛选。从该筛选鉴定了其他30个独特的序列。

下述实施例中的dAb氨基酸序列并不必然严格对应于序列表中公开的dAb序列。在一些情况下，dAb氨基酸序列可在蛋白质的N-端含有额外的氨基酸残基，其是引入以协助克隆入表达载体的。在实施例5及之后的实施例中，例如，重组表达的dAb的氨基酸序列可在N-端含有Ser Thr序列。相信这些额外的N-端残基并不影响dAb的生物学活性。

实施例3：dAb结合特性的鉴定

为了表征测序的dAb的结合活性，表达并纯化所有58个克隆，并在BIAcore上针对包被了12500RU(响应单位)的CD28-Fc的CM5芯片进行测试。总共九个克隆显示结合，包括DOM21-4、DOM21-6、DOM21-18、DOM21-20、DOM21-22、DOM21-27和DOM21-28(对于BIAcore示踪，参见图5)，以及DOM21-38和DOM21-44。

用于BIAcore分析的蛋白质浓度如下所述：

对几个本文中公开和表征的dAb进行了比对以比较序列同一性与观察到的活性；

DOM21-18(VK)和1h-239-891(VK)为82.4％相同。

DOM21-28(VK)和1h-239-891(VK)为83.3％相同。

DOM21-28(VK)和1h-239-850(VK)为85.2％相同。

1h-239-891(VK)和1h-239-850(VK)为96.3％相同。

DOM21-4(VH)和1h-99-238(VH)为81.7％相同。

DOM21-20(VH)和1h-99-238(VH)为78.9％相同。

DOM21-4(VH)和1h-239-850(VK)为23.9％相同。

1 50

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DOM21-18 (1)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQ

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1 50

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1 50

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QT

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1 50

1h-239-850 (1)Q

TQSPSSLSASVGDR

TCRASRPI

P--F

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DOM21-4 (1)

Q

LES-GGGLVQPGGSR

CAASGFT

SRYHAWVRQAPGKGLEWV

51 100

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YFT

RLQSGVPSRF

GSGSG--TDFTLT

SSLQPEDFATYYCLQN

DOM21-4 (50)VIDS

GLQ

YYADSVKGRFISRDNSKNTLYLQ

NSLRAEDTAVYYCAEY

101 117

1h-239-850 (92)VSMPAT

SQGTKVE

KR(SEQ ID NO：58)

DOM21-4(100)GGAFDYGQGTLVT

SS(SEQ ID NO：401)

实施例4：体外dAb活性测定法

dAb活性在体外如下所述进行测试。将七个dAb(DOM21-4、DOM21-6、DOM21-18、DOM21-20、DOM21-22、DOM21-27和DOM21-28)在更大规模进行表达和纯化。将除尽内毒素的dAb样品以100μM的母液浓度用于确定dAb是否能在类似Boulougouris，J.Immunol.1998，161(8)：3919-3924所述的基于细胞的体外测定法中抑制CD28的活性。增殖测定是重复三次在96孔板中以每孔200μl的终体积使用含有10％FCS和抗生素的RPMI 1640培养基进行的。将人CD4阳性T细胞(5x10⁴)在1μg/ml抗CD3抗体(OKT3)加上表达CD80或CD86的转染的CHO细胞以及一系列浓度的dAb或对照抗体的存在下进行培养。将测定物在37℃在每孔1μCi[³H]-胸苷的存在下温育18小时至72小时。将细胞使用Packard(Meriden，CT)96孔收获器收获至96孔过滤板，而[³H]-胸苷摄入是通过液体闪烁计数来确定的。四种dAb，DOM21-4、DOM21-18、DOM21-20和DOM21-28显示抑制活性(图6)而DOM21-4和DOM21-28显示最大程度的抑制(图7)。

在所述受体结合测定法中鉴定为抑制CD28对CD80或CD86的结合的独特dAb的DNA序列详述于下。其氨基酸序列亦如下所述，其中对于各dAb的CDR区以粗体显示。

＞DOM21-1

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATGCGTATTCGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTACTCCGCAGGGTGATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGCAAGCTGGTTGGAGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQID NO：1)

＞DOM21-2

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTGGATTATGAGATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTTCGAATGATGGCGCTGCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATGATGCTGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAGCCCTGGTCACCGTCTCGAGCG(SEOID NO：2)

＞DOM21-3

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTGCGTATTCTATGGGGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGGATTACGGGGAATGGTGGTTCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGCGGAGGAGCCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQID NO：3)

＞DOM21-4

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＞DOM21-5

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＞DOM21-6

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＞DOM21-7

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＞DOM21-8

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＞DOM21-9

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＞DOM21-10

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＞DOM21-11

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＞DOM21-12

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＞DOM21-13

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＞DOM21-14

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＞DOM21-15

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＞DCM21-16

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＞DOM21-17

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＞DOM21-18

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＞DOM21-19

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＞DOM21-20

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＞DOM21-21

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＞DOM21-22

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＞DOM21-23

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＞DOM21-24

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＞DOM21-25

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＞DOM21-26

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＞DOM21-27

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGTATTGGGACGGGTTTACGGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTATGCTCCTGATCTATCGGGCGTCCATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTTAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGACGACTCTTCAGCCTTTTACGTTCAGCCAAGGGACTAAGGTGGAAATCAAACGGG(SEQ ID NO：27)

＞DOM21-28

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTCTATTAGTCATTCGTTAGTTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCTTCCCTTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGGTATGACTACGCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGG(SEQ ID NO：28)

＞DOM21-30

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＞DOM21-31

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＞DOM21-32

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＞DOM21-33

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＞DOM21-34

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＞DOM21-35

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＞DOM21-36

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＞DOM21-37

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＞DOM21-38

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＞DOM21-39

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＞DOM21-40

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＞DOM21-41

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＞DOM21-42

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＞DOM21-43

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＞DOM21-44

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＞DOM421-45

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＞DOM421-46

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＞DOM21-47

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＞DOM21-48

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＞DOM21-49

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＞DOM21-50

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＞DOM21-51

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTAATTATAATATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGATATTGGTCGTTATGGTAGGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAACTCAGCGTATGGTTAATCCGTCGCCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：50)

＞DOM21-52

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCTTCCGGATTCACCTTTGTTAGTTATAGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAATTATTTCGGGGCAGGGTACTGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCGCCGATGGTTTTTGCTTTGGATGGGAGGTCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：51)

＞DOM21-53

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTACAGCCTCCGGATTCACCTTTTCTGAGTATAGTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTACGCCTGTTGGTGTTTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGAGGCCTGGGCCGCATGGTTGGTCTTTTCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：52)

＞DOM21-54

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGCAGTATATGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTGATAAGTCGGGTTATAGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGTGGGATTGATTCGCGGGGTCTGATGACTAAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：53)

＞DOM21-55

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTCGTTATCGTATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTCTGAGTGATGGTGCGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACCTGGGGGGAATGCGTGGTCTACTCGGGTTACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：54)

＞DOM21-56

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTTACGTATACNATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTACGCCGCTTGGTTATAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACCGTCGGATGTGAAGGTGTCTCCGCTGCCGAGTTTTGACTACTGGGGTCGGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：55)

＞DOM21-57

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTATGTATGGTATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTTCTCAGTATGGTCTTTCTACATACTACGCAGATTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGTCTATGAGGCGGGTGTTTAGTAGTTCGGATACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO：56)

＞DOM21-58

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAATATAGGTGATCGGTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCGTATTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTTTGGGCTGTATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO：57)

DOM21-4

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYGGAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：401)

DOM21-20

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMIWVRQAPGKGLEWVSTISPLGYSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEQTAYLNRATEHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：402)

DOM21-1

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDAYSMIWVRQAPGKGLEWVSTITPQGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQAGWSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：403)

DOM21-2

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVDYEMAWVRQAPGKGLEWVSTISNDGAATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDDAAFDYWGQGALVTVSS(SEQ ID NO：404)

DOM21-3

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGAYSMGWARQAPGKGLEWVSWITGNGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAEEPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：405)

DOM21-4

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYGGAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：406)

DOM21-5

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTHYSMGWVRQAPGKGLEWVSHITPDGLITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRLVDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：407)

DOM21-6

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENYGMAWVRQAPGKGLEWVSNIGRAGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVQSWRTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：408)

DOM21-7

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMGWVRQAPEKGLEWVSYIDGRGAETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIDTLISEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：409)

DOM21-8

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPNYTMWWVRQAPGKGLEWVSSISGTGHTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKFGPNNPMFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：410)

DOM21-9

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFASYDMGWVRQAPGKGLEWVSAISADGTFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSFDKYNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：411)

DOM21-10

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAKYTMWWVRQAPGKGLEWVSSIDPVGNLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRGPTSSNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：412)

DOM21-11

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYGMKWVRQAPGKGLEWVSTIDNVGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTTPVLLPLFDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO：413)

DOM21-12

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYNMGWVRQAPGKGLEWVSAIAANGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMTNMAYGSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：414)

DOM21-13

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDLYSMAWVRQAPGKGLEWVSHIDRAGMITYYADSVKGFFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSNAVNMQFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：415)

DOM21-14

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAKYTMWWVRQAPGKGLEWVSSIDPVGNLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRHRPSTQDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：416)

DOM21-15

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPDYKMGWVRQAPGKGLEWVSWIDKGGIITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMFPKFRPAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：417)

DOM21-16

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYGMGWVRQAPGKGLEWVSHINRSGLVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLNAPNFKFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：418)

DOM21-17

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYAMGWVRQAPGKGLEWVSWIDGNGLVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRTRSHSDSGWAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：419)

DOM21-19

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYNMGWVRQAPGKGLEWVSGITKGGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGPSRMLNEPLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：420)

DOM21-20

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMIWVRQAPGKGLEWVSTISPLGYSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEQTAYLNRATEHFDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO：421)

DOM21-21

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYDMAWVRQAPGKGLEWVSSIYAIGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLKSGMQTRLNSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：422)

DOM21-22

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFELYQMGWVRQAPGKGLEWVSTIMPSGNLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMWSLNLGFHAAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：423)

DOM21-23

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYGMGWVRQAPGKGLEWVSGISPSGNYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGNGSLPPRGSIFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：424)

DOM21-24

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYNMGWVRQAPGKGLEWVSGITKGGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGPSRMLNEPLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：425)

DOM21-25

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTYYMGWARQAPGKGLEWVSSIGANGAPTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIRSLNRWAEPVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：426)

DOM21-26

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYSMYWVRQAPGKGLEWVSQISPAGSFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSKSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：427)

DOM21-40

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKTYTMRWVRQAPGKGLEWVSTINSSGTLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSSYTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：428)

DOM21-41

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAMYSMKWVRQAPGKGLEWVSSISNAGDITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAESFRSRYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：429)

DOM21-42

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYLMGWVRQAPGKGLEWVSLIRMRGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSLTTNLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：430)

DOM21-43

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYMMAWARQAPGKGLEWVSIIGTTGTWTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTNAYESEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：431)

DOM21-44

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARYTMVWVRQAPGKGLEWVSAIHFDGRTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNEWASLKHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：432)

DOM21-45

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYMMGWVRQAPGKGLEWVSFINLPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQTHGLTGYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：433)

DOM21-46

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGLYGMAWARQAPGKGLEWVSSIGMHGDTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVCGATYCNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ TD NO：434)

DOM21-47

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYVMAWVRQAPGKGLEWVSIIDSLGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGLLVHYDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：435)

DOM21-48

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEVYGMSWARQAPGKGLEWVSLIDAGGRNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTTRAYSDYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：436)

DOM21-49

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENYDMHWVRQAPGKGLEWVSGITTHGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSDNLNMNVDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：437)

DOM21-50

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFIKYDMCWARQAPGKGLEWVSCIESSGQNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKCLNDSCNVHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：438)

DOM21-51

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYNMGWVRQAPGKGLEWVSDIGRYGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTQRMVNPSPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：439)

DOM21-52

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVSYSMGWVRQAPGKGLEWVSIISGQGTVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPMVFALDGRSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：440)

DOM21-53

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSEYSMGWVRQAPGKGLEWVSSITPVGVFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRPGPHGWSFRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：441)

DOM21-54

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYMMGWVRQAPGKGLEWVSTIDKSGYSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGIDSRGLMTKFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：442)

DOM21-55

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARYRMAWVRQAPGKGLEWVSSILSDGAVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPGGNAWSTRVTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：443)

DOM21-57

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTMYGMHWVRQAPGKGLEWVSSISQYGLSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSMRRVFSSSDTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：444)

DOM21-59

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYDMNWVRQAPGKGLEWVSQISADGHFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRSSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：445)

DOM21-60

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRIDSHGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHMTGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：446)

DOM21-61

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFREYMMGWVRQAPGKGLEWVSRINGVGNSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHQVGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：447)

DOM21-62

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRITSEGSHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHTSGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：448)

DOM21-63

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGRYMMGWVRQAPGKGLEWVSRISGPGTVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDTGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：449)

DOM21-64

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSEISPYGNHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPDRRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：450)

DOM21-65

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYGMQWVRQAPGKGLEWVSSISTDGMVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGVNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：451)

DOM21-66

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDYMMGWVRQAPGKGLEWVSIIRVPGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQKGDEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：452)

DOM21-67

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFILYDMQWVRQAPGKGLEWVSRISANGHDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS LRAEDTAVYYCAKGPHYLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：453)

DOM21-68

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYFMGWVRQAPGKGLEWVSLIDPRGPHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQLGEEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：454)

DOM21-18

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLTY

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

FGQGTKVEIKR(SEQ IDNO：455)

DOM21-28

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIY

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFGQGTKVEIKR(SEQ IDNO：456)

DOM21-18

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR(SEQ IDNO：457)

DOM21-27

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGTGLRWYQQKPGKAPMLLIYRASILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTTLQPFTFSQGTKVEIKR(SEQ IDNO：458)

DOM21-28

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMTTPFTFGQGTKVEIKR(SEQ IDNO：459)

DOM21-58

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGDRLHWYQQKPGKKAPKLLIYRISRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFGLYPTTFGQGTKVEIKR(SEQ IDNO：460)

DOM21-30

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYDMNWVRQAPGKGLEWVSQISADGHFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRSSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：461)

DOM21-31

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRIDSHGNRTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHMTGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：462)

DOM21-32

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFREYMMGWVRQAPGKGLEWVSRINGVGNSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHQVGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：463)

DOM21-33

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRITSEGSHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHTSGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：464)

DOM21-34

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGRYMMGWVRQAPGKGLEWVSRISGPGTVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDTGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：465)

DOM21-35

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSEISPYGNHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPDRRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：466)

DOM21-36

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYGMQWVRQAPGKGLEWVSSISTDGMVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGVNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：467)

DOM21-37

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDYMMGWVRQAPGKGLEWVSIIRVPGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQKGDEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：468)

DOM21-38

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFILYDMQWVRQAPGKGLEWVSRISANGHDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGPHYLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：469)

DOM21-39

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYFMGWVRQAPGKGLEWVSLIDPRGPHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQLGEEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：470)

DOM21-56

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFTYXMAWVRQAPGKGLEWVSSITPLGYNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPSDVKVSPLPSFDYWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：471)

制备、分离并表征了下述额外的VH和VK dAb。各dAb的氨基酸序列如下所述，其中对于各dAb的CDR1、CDR2和CDR3区以粗体显示。各dAb的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列还分开如下所述。

VK dAb：

1h-239-850(SEQID NO：58)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIY

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

FSQGTKVEIKR

1h-35(SEQ ID NO：59)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIY

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFGQGTKVEIKR

1h-36(SEQ ID NO：60)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIK

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

FGQGTKVEIKR

1h-79(SEQ ID NO：61)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIY

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

FGQGTKVEIKR

1h-80(SEQ ID NO：62)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIY

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

FGQGTKVEIKR

1h-83(SEQ ID NO：63)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIY

GVSSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

FGQGTKVEIKR

1h-108(SEQ ID NO：64)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPPEDFATYYC

FGQGTKVEIKR

1h-203(SEQ ID NO：65)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIY

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

FGQGTKVEIKR

1h-207(SEQ ID NO：66)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWYQQKPGKAPKLLIYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFGQGTKVEIKR

1h-238(SEQ ID NO：67)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

WYQQKPGKAPKLLIY

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

GQGTKVEIKR

1h-239(SEQ ID NO：68)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWYQQKPGKAPKLLIY

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFGQGTKVEIKR

1h-18-1(SEQ ID NO：69)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASFLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR

1h-18-2(SEQ ID NO：70)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR

1h-18-3(SEQ ID NO：71)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYRASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR

1h-18-4(SEQ ID NO：72)

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1h-18-5(SEQ ID NO：73)

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1h-239-89104(SEQ ID NO：535)

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1h-239-89229(SEQ ID NO：566)

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1h-239-89230(SEQ ID NO：567)

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1h-239-89231(SEQ ID NO：568)

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1h-239-89232(SEQ ID NO：569)

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1h-239-89221(SEQ ID NO：575)

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1h-239-89222(SEQ ID NO：576)

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1h-239-89224(SEQ ID NO：578)

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1h-239-89225(SEQ ID NO：579)

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1h-239-89247(SEQ ID NO：593)

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FGQGTKVEIKR

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1h-239-891CDR3(SEQ ID NO：638)

1h-99-237(SEQ ID NO：272)

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WARQAPGKGLEWVS

RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

RGQGTLVTVSS

1h-99-238(SEQ ID NO：273)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFD

WARQAPGKGLEWVS

RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

RGQGTLVTVSS

1h-37(SEQ ID NO：274)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGWVRQAPGKGLEWVS

RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

RGQGTLVTVSS

1h-93(SEQ ID NO：275)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFP

WVRQAPGKGLEWVS

RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

WGQGTLVTVSS

1h-99(SEQ ID NO：276)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFD

WVRQAPGKGLEWVS

RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWGQGTLVTVSS

1h-4-1(SEQ ID NO：277)

EVQLLESGGGWVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQAYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSMRAEDTAVYYCAEYSGAFDYWGQGTLVTVSS

1h-4-2(SEQ ID NO：278)

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1h-4-3(SEQ ID NO：279)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYSGAFDYWGQGTLVTVSS

1h-4-4(SEQ ID NO：280)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYGGAFDYWGPGTLVTVSS

1h-29(SEQ ID NO：281)

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1h-30(SEQ ID NO：282)

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1h-37(SEQ ID NO：283)

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1h-40(SEQ ID NO：284)

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1h-91(SEQ ID NO：285)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFWFYDMQWVRQAPGKGLEWVSSITHNGKTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGQLTFDYWGQGTLVTVSS

1h-92(SEQ ID NO：286)

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1h-93(SEQ ID NO：287)

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1h-93-1(SEQ ID NO：288)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPLYEMAWVRQAPGKGLEWVSSIMSNGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRESSSSRTVFDYWGQGTLVTVSS

1h-93-2(SEQ ID NO：289)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPLYEMAWVRQAPGKGLEWVSSIMSNGIRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRESSSSRTVFDYWGQGTLVTVSS

1h-93-201(SEQ ID NO：290)

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1h-93-204(SEQ ID NO：291)

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1h-94(SEQ ID NO：292)

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1h-95(SEQ ID NO：293)

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1h-96(SEQ ID NO：294)

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1h-97(SEQ ID NO：295)

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1h-98(SEQ ID NO：296)

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1h-99(SEQ ID NO：297)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFDSANMTWVRQAPGKGLEWVSWIDDTGTQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYWGQGTLVTVSS

1h-99-1(SEQ ID NO：298)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMTWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVRGRFTISRDNFKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS

1h-99-2(SEQ ID NO：299)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS

1h-99-201(SEO ID NO：300)

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实施例5：dAb活性的其他测定法

使用了下述其他生物测定法以检查dAb对CD28活性的作用。

混合淋巴细胞应答细胞因子测定法

对于在多个时间点针对作为刺激细胞的MoDC的应答测量细胞因子的MLR实验，测定是通过将1.5x10⁵个T细胞/孔的96孔圆底板与1.5x10⁴个同种异基因的MoDC组合在总体积为300μL的10％FCS-RPMI中进行的。将CD28域抗体abatacept或belatacept的多个滴度重复三次添加以测量MLR起始之后24、48和72小时时细胞因子的释放。使用Duoset ELISA显色试剂盒(R&D Systems；Minneapolis，MN)在上清中检测了IL-2和TNF-α。使用来自Pierce Biotechnology(Rockford，IL)的配对的抗体和重组细胞因子测量IFNγ。所有的试剂盒和Ab根据生产商的推荐使用。在SpectraMax Plus分光光度计(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)上处理并读取测定板。使用Softmax软件通过针对使用已知浓度的重组细胞因子生成的标准曲线相比较来分析数据。

IL-2报道测定法(“萤光素酶测定法”)

将用IL-2启动子控制下的萤光素酶基因转染的Jurkat-CA细胞在含10％FCS(Summit Bio-technology，Ft.Collins.，CO.)，1％1-谷氨酰胺，1％丙酮酸钠，25mM HEPES和0.4mg/ml遗传霉素(均来自Life Technologies，Inc.)的RPMI 1640(Life Technologies，Inc.Gaithersburg，MD)中培养。将Raji细胞(ATCC，Rockville，MD)在含10％FCS，1％1-谷氨酰胺的RPMI 1640中培养。为了起始Jurkat细胞激活，将Jurkat-CA细胞和Raii细胞均以1.0x10⁶个细胞/ml铺于96孔不透明板(Perkin Elmer，Boston，MA)中。将组合的细胞用抗CD3克隆UCHT1(0.1μg/ml；BD Pharmingen，San Diego，CA)和多种浓度的dAb温育。在16-20小时之后，将板冷却至室温，并将Steady-Glo^TM(Promega，Madison，WI)添加至板。使用Topcount-NXT仪器(Perkin Elmer)在添加Steady-Glo 30分钟之内对板进行分析。

混合淋巴细胞反应(MLR)测定法

PBMC是通过经EDTA处理的来自正常健康供体的全血的密度梯度分离(淋巴细胞分离介质；Mediatech Inc.，Hemdon，VA)获得的。T细胞是从与SRBC(Colorado Serum Company；Denver，CO)形成花结(rosetted)的PBMC的E⁺级分制备的。成熟MoDC是如下制备的，将来自正常供体的PBMC的E级分的单核细胞粘着在6孔组织培养板中，然后大量进行温和洗涤以去除未粘着的细胞。将粘着细胞在含10％FCS与100ng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4一同任一的RPMI中培养7日，其中隔日将一半的培养基用含相同浓度的细胞因子的新鲜培养基更换。在第7日，用LPS(1μg/m1)处理24小时使细胞成熟。然后将这些成熟的MoDC在混合淋巴细胞反应中用作抗原呈递细胞。

对于测量CD28域抗体滴定的MLR增殖测定，将T细胞以1x10⁵个细胞/孔与作为APC的2x10³同种异基因MoDC在96孔圆底板在总体积200μl的10％FCS-RPMI中重复三个孔进行培养。取决于相对效力，将域抗体以100μg/ml至10ng/ml的浓度范围添加。在MLR起始之后的第5日，将培养物用一μCi的³[H]-胸苷(PerkinElmer，Boston，MA)脉冲6小时，在Packard细胞收获器(PerkinElmer)上收获，并使用Packard TopCount-NXT仪器(PerkinElmer)进行液体闪烁计数。

图3说明了使用dAb 1m74-15-P40L对体内T细胞增殖的抑制。在第“-1”日，将从DO11T细胞受体小鼠获得的30x10⁶个细胞/ml脾细胞通过尾静脉注入BALB/c小鼠。在第0日，用PBS、dAb或CTLA-4Ig对小鼠进行腹膜内给药。在该腹膜内给药之后两小时，向小鼠的足垫注射用弗氏完全佐剂1∶1乳化的50mg鸡卵清蛋白。在第一日和第二日，进行腹膜内给药。在第三日，收集引流腘淋巴结以供用抗CD4APC和克隆型抗体KJ-126PE进行染色(图3)。在图3中，CD4和KJ126双阳性细胞表示抗原特异性T细胞。从所述动物收集血以供进行暴露(exposure)，以确定dAb在血中的水平。

图4A和4B说明了使用dAb 1m74-15-P40L的九日受体占据(RO)研究的结果。用PBS或1m74-1540L以1、3或10mg/kg(n＝4)对幼稚BALB/c小鼠进行腹膜内(图4A)或皮下(图4B)注射。在时间点1、4、24、48、72、96、168和216小时从动物收集血。对于dAb处理组，将50μl血用于抗CD4APC和抗CD28PE染色，而50μl用于暴露。对于PBS组，将50μl血用于抗CD4APC和抗CD28PE染色，而50μl血用于在过量未标记的抗CD28抗体存在下用抗CD4和抗CD28PE进行染色以限定非特异性结合。将平均荧光强度(MFI)用作抗体结合的测量单位。百分比受体占据(％RO)定义为“1-[CD28MFI(dAb)-CD28MFI(非特异性)]/[CD28MFI(PBS)-CD28MFI(非特异性)]”。

共激动剂测定法

PBMC是通过经EDTA处理的来自正常健康供体的全血的密度梯度分离(淋巴细胞分离介质；Mediatech Inc.，Hemdon，VA)获得的。T细胞是从与SRBC(Colorado Serum Company；Denver，CO)形成花结的PBMC的E⁺级分制备的。将T细胞以1X10⁵个细胞/孔在总体积为200μl的10％FCS-RPMI中在之前用20μg/ml抗CD3抗体(G19-4mAb，Bristol-Myers Squibb)包被并在测定之前经洗涤的96孔平底板的孔中重复三个孔进行培养。将域抗体以100μg/ml至0.3μg/ml的浓度范围进行添加。将1.0μg/ml抗CD28(9.3mAb，Bristol-Myers Squibb；Gibson等(1996)Am Soc.Biochem.Mol.Bio.，271：7079-7083)用作阳性对照。在测定起始之后第3日，将培养物用一μCi的³[H]-胸苷(PerkinElmer，Boston，MA)脉冲6小时，在Packard细胞收获器(PerkinElmer)上收获，并在Packard TopCount NXT仪器(PerkinElmer)中进行液体闪烁计数。

图2说明了本文中所述的抗人CD28dAb并不呈现共激动剂活性。将纯化的T细胞(1X10⁵个细胞/孔)添加至包被了抗CD3(G19-4，在PBS中10μg/m1)的96孔平底板。每个dAb，以30μg/ml的终浓度，添加至重复三个孔中的细胞。作为阳性对照，将抗CD28mAb(9.3)以终浓度1μg/ml代替dAb添加。增殖是在第3日通过³[H]-胸苷掺入来测量的(图2)。

刺激剂测定法

PBMC是通过经EDTA处理的来自正常健康供体的全血的密度梯度分离(淋巴细胞分离介质；Mediatech Inc.，Herndon，VA)获得的。将PBMC以t X10⁵个细胞/孔在总体积为200μl的10％FCS-RPMI中在96孔平底板的孔中重复三个孔进行培养。将dAb以100μg/ml至0.3μg/ml的浓度范围添加。将溶液中1μg/ml的抗CD3(OKT3)用作最大增殖的阳性对照。还在一些测定中将抗CD28(9.3，在溶液中10μg/ml)与山羊抗小鼠IgG(Jackson Immunoresearch，在溶液中以50μg/ml使用)一同用作比较对象。在测定起始之后的第3日，将培养物用一μCi的³[H]-胸苷(PerkinElmer，Boston，MA)脉冲6小时，在Packard细胞收获器(PerkinElmer)上收获，并在Packard TopCount NXT仪器(PerkinElmer)中进行液体闪烁计数。

图1A和1B说明了本文中所述的抗人CD28dAb并不呈现激动剂活性。在第一个实验中，将PBMC从正常供体全血中分离，并以1X10⁵个细胞/孔接种入96孔平底板。将如本文中所述的几种dAb以图1A所示的终浓度添加至重复三个孔中。包括了抗CD3(OKT3，终浓度1μg/ml)作为阳性对照。增殖是通过在第3日³[H]-胸苷的掺入来测量的(图1A)。在另一个实验中，将本文中所述的几种dAb，抗CD28抗体(9.3)，抗CD3抗体(OKT3)或同种型对照以所示的终浓度添加至96孔圆底板的重复三个孔中并任其风干于孔上。添加PBMC(1X10⁵个细胞/孔)，并在第3日通过³[H]-胸苷的掺入测量增殖。

将在IL-2报道测定法和混合淋巴细胞反应测定法二者中获得的dAb数据总结于下面的表1以供比较。基于这些实验的结果，以及本文中所述的共激动剂实验的结果，显示本文中所述的dAb以亲和力和特异性结合CD28，且该dAb针对CD28活性是拮抗的。dAb还显示很少至无的CD28激动剂活性。

表1：使用本文中所述的dAb的MLR测定法和萤光素酶测定法的结果

实施例6：dAb的聚乙二醇修饰

对多种dAb进行PEG化以增加本文中所述的dAb的稳定性、半衰期和生物利用度。对于dAb的N-端胺的聚乙二醇(PEG)修饰(“PEG化”)，纯化样品，并将其透析至磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并将溶液中的内毒素水平减少至最大为10内毒素单位(EU)/mg(1EU＝100pg脂多糖)。然后将样品透析至0.1M磷酸钾pH 6.8。将样品在透析之后过滤，确定其蛋白质浓度，并调整至2-3mg/ml。

对于PEG(40kD线性，40kD支化或30kD线性)的附加，将甲氧基聚乙二醇丙醛固体以对dAb的3倍摩尔过量添加至溶液，并在滚筒上在室温混合1小时。此时，添加10倍摩尔过量的氰基硼氢化钠(来自0.1M磷酸钾pH 6.8中的5mg/ml储液)，并在滚筒上在室温混合5小时。另外添加10倍摩尔过量的氰基硼氢化钠，并任该反应在室温进行过夜。PEG化的进展通过SDS-PAGE监视。

对于dAb中在C端位置或内部位置(例如，在氨基酸15、41、60、70、81或100位)处的半胱氨酸残基的PEG化，将dAb纯化并透析入PBS，并将其内毒素水平减少至最高10EU/mg。在透析后过滤样品，并确定dAb浓度并调整至2-3mg/ml。

对于PEG(40kD线性，40kD支化或30kD线性)的附加，将二硫苏糖醇(DTT)用于还原dAb。将甘油添加至样品(20％(v/v))，并将样品在用二硫苏糖醇(5mM)还原之前充分混合。任反应在室温进行20分钟，然后使用26/10Hi-Prep脱盐柱(GE Healthcare)缓冲液交换至PEG偶联缓冲液(20mMBIS-Tris pH 6.5，5mM EDTA和10％甘油[v/v])。测量蛋白质浓度并调整至2-3mg/ml。将甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺固体以对dAb的3倍摩尔过量添加至溶液，并将溶液在滚筒上在室温混合4至16小时。PEG化的进展通过SDS-PAGE监视。

还将三(2-羧乙基)膦(TCEP)用于还原dAb来进行PEG化。使用26/10Hi-Prep脱盐柱(GE Healthcare)将样品透析入PEG偶联缓冲液(20mMBIS-Tris pH 6.5，5mM EDTA和10％甘油[v/v])。测量dAb浓度并调整至2-3mg/ml。使用以浓度5mM添加的TCEP在室温进行还原20分钟。然后将甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺固体以对dAb的3倍摩尔过量添加，并在滚筒上在室温混合4至16小时。PEG化的进展通过SDS-PAGE监视。

当需要时，使用马来酰亚胺封闭半胱氨酸残基。将蛋白质样品纯化并透析入PBS，并将内毒素水平减少至最高10EU/mg。

在透析后过滤样品，并确定其蛋白质浓度并调整至2-3mg/ml。对于PEG的添加，将甘油添加至样品(20％)(v/v)，并在用二硫苏糖醇(DTT 5mM)还原之前充分混合。任反应在室温进行20分钟，然后使用26/10Hi-Prep脱盐柱(GE Healthcare)透析入PEG偶联缓冲液(20mM BIS-Tris pH 6.5，5mM EDTA和10％甘油[v/v])。测量蛋白质浓度并调整至2-3mg/ml。将马来酰亚胺固体以对dAb的3倍摩尔过量添加，并使用滚筒在室温混合4至16小时。反应的程度使用SDS-PAGE监视。

用于纯化经PEG化的dAb的方法取决于所述dAb的等电点。对于具有低于7的pI的dAb，使用阴离子交换，而对于具有高于7的pI的dAb，阳离子交换是合适的。

对于纯化，将dAb首先用缓冲液A(对于阴离子交换，20mM Tris pH 8，而对于阳离子交换，20mM乙酸钠pH 4)1∶5稀释，并检查pH。使用ResourceQ(阴离子交换剂)和S(阳离子交换剂)，或者HiTrap Q或S Fast Flow柱(GEHealthcare)。将柱用10个柱体积的0.5M NaOH洗涤，然后用10个柱体积的缓冲液B(对于阴离子交换，使用20mM Tris pH 8，1M NaCl，而对于阳离子交换，使用20mM乙酸钠pH 4，1MNaCl)洗涤。在将稀释的样品加载之前，将柱用缓冲液A平衡。样品的洗脱是以下述梯度实施的：

30个柱体积的0-30％缓冲液B，

10个柱体积的30-100％缓冲液B，

5个柱体积的100％缓冲液B。

任何过量的游离PEG或马来酰亚胺穿过柱并留在流出液中。所述PEG化的样品通常在第一个梯度洗脱，并与第二个梯度分离良好，后者洗脱剩余的未经PEG化的样品。在每个梯度中收集两毫升级分，并通过SDS-PAGE进行分析。最终用0.5M NaOH洗涤柱以洗脱任何剩余物质。合并合适的级分，并且在高pI dAb的情况下，通过添加1M Tris，pH 8将pH调整为中性。

表2和3说明了经PEG化的dAb在本文中使用的测定法中保留了结合活性和生物学活性。

表2：经PEG化的人dAb的活性

表3：经PEG化的小鼠dAb的活性

实施例7：用dAb进行的动物交叉反应性研究

检查了本文中所述的dAb与非人细胞和多肽反应的能力。在交叉反应性研究中，dAb 1h-79-807显示了针对表达CD28的人和小鼠细胞二者的活性。对于人细胞研究，如上所述，使用萤光素酶和MLR测定法。对于小鼠细胞研究，使用MLR和小鼠脾细胞测定法。在这些测定法中，dAb 1h-79-807呈现了31+/-12nM(脾细胞测定法)和38+/-6nM(MLR测定法)的效力。

对于小鼠MLR测定法，从BALB\c小鼠的淋巴结和DBA\2小鼠的脾脏使用Tenbroeck组织匀浆器制备单细胞悬液。通过使用红血球裂解缓冲液(SIGMA，St Louis，Mo)裂解继以在完全培养基[(RPMI 1640(Invitrogen，Carlsbad，CA)，10％胎牛血清(Summit)，1％l-谷氨酰胺(Invitrogen)，1％丙酮酸钠(Invitrogen)，100μg/ml遗传霉素(Invitrogen)，5x10^-5M 2-巯基乙醇(SIGMA)]中的两次洗涤来从两个群中去除红血球。在最后一次洗涤之后，将细胞沉淀重悬于2ml的完全培养基，加载于单独的经预平衡的尼龙绒(wool)柱(WAKO，Richmond，VA)，并在37℃温育60分钟。将来自BALB/c淋巴结和DBA\2脾脏的T细胞从所述柱通过添加25ml温热培养基来洗脱。弃去来自DBA\2脾脏的T细胞，并添加25ml冰冷的完全培养基(描述见上)将APC群从柱洗脱。将BALB\c T细胞或DBA/2APC以400xg离心10分钟，在完全培养基中重悬，并在血细胞计数器上对细胞进行计数。将两个细胞群均在完全培养基中稀释至1.0x10⁶个细胞/ml。将DBA\2APC(0.25x10⁶/ml)与BALB\c T细胞(0.5x10⁶/ml)在圆底96孔板(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中组合，并将dAb或对照试剂的系列稀释添加至孔。将板在37℃在5％CO₂中温育96小时。将³H-胸苷(1μCi；PerkinElmer，Waltham，MA)在温育期结束之前6小时添加至孔。将板通过GF/c过滤板(PerkinElmer)进行收获，干燥，然后将50μl Microscint-20(PerkinElmer)添加至每个孔，然后在TopCount(Packard，Meriden，CT)上对放射性进行计数。使用ExcelFit程序(Microsoft，Redmond，WA)分析数据。

对于小鼠脾细胞测定法，从BALB\c小鼠的脾脏使用Tenbroeck组织匀浆器制备单细胞悬液。通过在红血球裂解缓冲液中温育，继以在完全培养基[(RPMI 1640(Invitrogen)，10％胎牛血清(Summit)，1％l-谷氨酰胺(Invitrogen)，1％丙酮酸钠(Invitrogen)，100μg/ml遗传霉素(Invitrogen)，5x10^-5M 2-巯基乙醇(SIGMA)]中的两次洗涤将红血球与其他匀浆物质分离。在最后一次洗涤之后，将细胞沉淀重悬于完全培养基并使用血细胞计数器上对脾细胞进行计数。将脾细胞在完全培养基中稀释至1.0x10⁶个细胞/ml，并将500μl添加至圆底96孔板。将抗CD3抗体(克隆145-2C11(BMS))以0.1μg/ml的浓度添加至每个孔。将dAb或对照试剂的系列稀释添加至孔，并在37℃在5％CO₂中温育48小时。将³H-胸苷(1μCi)在温育期结束之前6小时添加至孔，并将脾细胞通过GF/c过滤板(PerkinElmer)进行收获。将板干燥，然后将50μlMicroscint-20(PerkinElmer)添加至每个孔，并在TopCount上对放射性进行计数。使用ExcelFit程序分析数据。

在另一个交叉反应性研究中，使用猕猴检查dAb的药动学(PK)以关于聚乙二醇(PEG)修饰的(“经PEG化的”)dAb的大小和构象来阐明PK。携带40kD PEG部分的抗人CD28dAb 1h 99-2-PEG的作用在两组中进行检查，每组包含三只猴。组1的猴以10mg/kg的浓度在皮下接受dAb 1h 99-2P40-支化PEG。组2的猴以10mg/kg的浓度在皮下接受dAb 1h 99-2P40-线性PEG。将所有从动物收集的血清样品储藏于-70℃，并在研究结束时进行分析。使用ELISA和MSD在几种稀释度下对血清样品进行分析。

对于ELISA分析，将生物素-单体CD28以1μg/ml的浓度包被于ELISA板上。将标样、质量控制样品和所有的实验样品稀释以1％的终血清浓度制备。将猕猴样品在室温融化，并制备样品的几种稀释以在测定范围内鉴定信号。将猕猴样品添加至ELISA板上的孔，并在室温温育两小时。使用亲和纯化和单克隆抗体制备并分离兔抗Vh dAb。将驴抗兔-HRP添加至板，然后添加底物，并在反应进行测量量的时间之后，终止反应。使用微板光学阅读仪测量每个反应的光密度(OD)。生成了标准曲线，并使用标准曲线的四参数对数拟合来基于可量化范围内的OD读数计算孔中的dAb浓度。结果基于多个稀释所得的浓度的平均值。

表4-6描述了从将dAb 1h 99-2P40-支化和dAb 1h 99-2P40-线性向猕猴的施药获得的结果。图5阐明了对于猴中的经PEG化的dAb的研究中随时间的血浆浓度。

使用支化的PEG化的dAb的实验结果与使用线性PEG化的dAb的实验结果在暴露和终末半衰期方面均有所差异，其可能是由于吸收的差异而非部署上的差异。

尽管支化的dAb的半衰期(T_1/2)(T_1/2＝4.5日)似短于线性dAb的半衰期(T_1/2＝6日)，支化的PEG dAb在暴露和对靶浓度的潜在覆盖(例如，体外IC₅₀＝3μg/mL即200nM)方面是较佳的候选。支化的dAb的AUC大于线性dAb的AUC，～2.5倍(单因子ANOVA P＝0.017)。支化的dAb的平均停留时间(MRT)高于线性dAb的，约1.5倍。

在皮下施药之后，两种PEG化的蛋白质的峰浓度发生于24小时左右。两种dAb的稳态分布体积(Vss/F)值低于100mL/kg，表明所述PEG化的蛋白质主要停留于血浆中。

表4：dAb 1h 99-2P40-支化的血清水平

组1：1h 99-2p40Br(μg/ml)

表5：dAb 1h 99-2P40-线性的血清水平

组2：1h 99-2P40L(μg/ml)

表6：经PEG化的dAb的药动学(PK)参数总结

实验实施例7中，以及表4-6中的数据表明本文中所述的dAb在人、小鼠和猴模型系统中是交叉反应性的。此外，经PEG化的dAb的药动学参数表明dAb在活的受试者中是生物可利用的和有活性的。

实施例8：用于dAb的SEC-MALLS分析的方法

为了估计dAb的溶液大小和寡聚结构，将多角度激光光散射与大小排阻层析一同使用。将多肽样品纯化并透析至合适的缓冲液(即，PBS)中。将样品在透析之后过滤，确定其浓度，并调整至1mg/ml。BSA购自Sigma，并无需进一步纯化即使用。

将配置自动采样器(SIL-20A)和SPD-20A Prominence UV/可见光检测器的Shimadzu LC-20AD Prominence HPLC系统连接于Wyatt Mini Dawn Treos(MALLS，多角度激光光散射检测器)和Wyatt Optilab rEX DRI(微分折光率(differential refractive index))检测器。将检测器以下述顺序连接：LS-UV-RI。RI和LS仪均以488nm的波长工作。使用TSK2000(Tosoh corporation)或BioSep2000(Phenomenex)柱(两者均为基于二氧化硅的HPLC柱，具有类似的分离范围，1-300kD)，以50mM磷酸盐缓冲液(含或不含盐)，pH7.4或1xPBS为流动相。为了改善蛋白质从柱的回收，有时添加10％乙醇。使用的流速为0.5或1.0ml/分钟，且调整该运行的时间进程以反应不同的流速(45或23分钟)，并预计其不对所述分子的分离具有显著的影响。将蛋白质在PBS中制备至浓度为1mg/ml，且注射体积为100μl。

用甲苯根据生产商的指示校准光散射检测器。将UV检测器输出和RI检测器输出连接于光散射仪从而使得来自所有三个检测器的信号可同时用Wyatt ASTRA软件收集。在PBS移动相(0.5或1ml/分钟)中对Tosoh TSK2000柱运行几次注射BSA，其中UV、LS和RI信号由Wyatt软件收集。然后使用ASTRA软件分析示踪，并将信号标准化，根据生产商的指示比对并校正谱带增宽。然后将校准常数取平均值，并输入用于将来样品运行的模板中。

绝对摩尔质量的计算

将一百微升的1mg/ml样品注射于合适的经预平衡的柱上。在通过SEC柱处理之后，将样品经过3个连线检测器-UV、MALLS(多角度激光光散射)和DRI(微分折光率)，使得绝对摩尔质量的确定成为可能。在柱上进行的稀释为约10倍，因此确定溶液中状态(in-solution state)的浓度为100μg/ml，或约8uM dAb。

ASTRA以及Zimm作图技术中计算的基础，其常常在批次样品模式下实施，为来自Zimm(1948)J.Chem.Phys.16：1093-1099的方程：

\frac{Rθ}{K^{*} C} = MP (θ) - 2 A_{2} c M^{2} P^{2} (θ)

(方程1)

其中

·c为溶质分子在溶剂中的质量浓度(g/mL)

·M为重均摩尔质量(weight average molar mass)(g/mol)

·A₂为第二位力系数(mol mL/g²)

·K^*＝4p²n₀ ²(dn/dc)²l₀ ^-4N_A ^-1为光学常数，其中n₀是溶剂在入射辐射(真空)波长处的折光率，l₀是入射辐射(真空)波长，表示为纳米，N_A是阿伏伽德罗氏数，等于6.022x10²³mol^-1，而dn/dc是相对于溶质浓度变化而言溶剂-溶质溶液的微分折光率增量，表示为mL/g(该因子并须使用dRI检测器独立测量)。

·P(q)是大约等于1-2μ²<r²>/3！+...的理论推导形式因子，其中μ＝(4π/λ)sin(θ/2)，而<r²>是方均半径。P(q)是分子的z均大小、形状和结构的函数。

·R_q是超瑞利比(cm^-1)

该方程假定垂直偏振的入射光，且有效至c²级。

为了进行用Zimm拟合方法的计算，其为对R_q/K^*c对sin²(q/2)的拟合，我们需要将方程1的倒数扩展至c的第一级。

\frac{K^{x} c}{R_{θ}} = \frac{1}{MP (θ)} + 2 A_{2} c

(方程2)

在该情况下，合适的结果是

M＝([K^xc/R₀]-2A₂c)^-1 (方程3)

和

< r^{2} > = \frac{3 m_{0} λ^{2} M}{16 π^{2}}

(方程4)

其中

m₀＝d[K^xc/R_θ]/d[sin²(θ/2)]_θ→0 (方程5)。

计算是通过ASTRA软件自动进行的，得到对于每份数据确定的摩尔质量的图。将从对于层析图上观察到的每个峰的图得到的摩尔质量值与单个单位的蛋白质的预期分子量相比。这使得所述蛋白质的溶液中状态能够得到确定。

表7：dAb的溶液状态和大小

实施例9：抗CD28dAb在DC驱动的MLR的背景下抑制细胞因子产生。

该实施例说明抗CD28域抗体能够在树突细胞驱动的MLR背景下抑制细胞因子产生。

通过密度梯度分离来自正常人供体的全血来获得外周血单个核细胞(PBMC)。从用绵羊红血球(Colorado Serum Company)形成花结的PBMC的E⁺级分制备T细胞。通过将来自PBMC E^-级分的单核细胞粘着于塑料并与GM-CSF和IL-4(Invitrogen)培养7日继以添加LPS(Sigma，1μg/m1)放置24小时以诱导成熟来生成树突细胞(DC)。将抗CD28域抗体以半对数稀释滴定得到九点剂量应答曲线以评估其对于1∶10比例的树突细胞对T细胞的相互作用的抑制。通过商品化ELISA(R&D Systems)在上清中测量细胞因子产生。在刺激之后第2日测量IL-2和IFNγ，并在第3日测量TNFα。在第5日通过³[H]-胸苷掺入测量增殖。从每个处理的抑制曲线生成EC₅₀值。结果示于表8。下面的“239-891-D70C P30L PEG”和“239-891-D70C P40B PEG”分别代表用30kDa线性或40kDa支化的聚乙二醇任一PEG化的抗CD28人Vκ域抗体(dAb)1h-239-891-D70C。

表8

实施例10：CD28dAb对于抑制CD80和CD86驱动的T细胞增殖同样有效

该实施例说明抗CD28域抗体抑制CD80和CD86驱动的T细胞增殖。

从用绵羊红血球形成花结的PBMC E⁺级分制备T细胞。将用人CD80或CD86稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞与T细胞在1μg/mlαCD3(OKT3)存在下组合。将抗CD28域抗体以半对数稀释滴定得到九点剂量应答曲线以评估其对1∶3比例的CD80-或CD86-CHO对T细胞相互作用的抑制。在第5日通过³[H]-胸苷掺入测量增殖。从每个处理的抑制曲线生成EC₅₀值。结果示于表9。

表9

实施例11：CD28dAbs抑制由不同APC起始的T细胞增殖

该实施例说明抗CD28域抗体抑制由不同抗原呈递细胞起始的T细胞增殖。

从用绵羊红血球(Colorado Serum Company)形成花结的PBMC的E⁺级分制备T细胞。通过将来自PBMC E^-级分的单核细胞粘着于塑料并与GM-CSF和IL-4(Invitrogen)培养7日继以添加LPS(Sigma，1μg/ml)放置24小时以诱导成熟来生成树突细胞(DC)。从PBMC的E^-级分通过淘析(elutriation)制备单核细胞。类淋巴母细胞细胞系(PM-LCL)是经EBV转化的来自正常供体的B细胞系。将多种APC与同种异基因的T细胞以1∶50的比例组合。将抗CD28域抗体以半对数稀释滴定得到九点剂量应答曲线以评估其对增殖的抑制，这在第5日通过³[H]-胸苷掺入来测量。从每个处理的抑制曲线生成EC₅₀值。结果示于表10。

表10

dAb	DC	LCL B细胞	单核细胞
				239-891(n＝2)	0.2，0.2	0.3，0.1	0.2，1.4
239-891-D70C P30L PEG	0.5±0.1	0.8±0.3	2.3±0.8
				239-891-D70C P40B PEG	1.2±0.1	2.4±0.4	10±4

实施例12：抗CD28域抗体缺乏激动剂活性

该实施例说明抗CD28域抗体缺乏激动剂活性。

将抗CD28域抗体239-891-D70C和促有丝分裂的抗人CD28抗体5.11A1分别以半对数稀释在PBS中滴定，包被于96孔圆底板的底部，并任其风干。从正常人供体的全血分离PBMC，并添加至包含所述风干的抗体的孔中。在第3日通过³[H]-胸苷掺入测量增殖，如示于图10A，并测量IL-2产生，如示于图10B。

实施例13：抗CD28域抗体在体内结合其靶并缺乏激动剂活性

该实施例说明抗CD28域抗体在体内结合其靶，并缺乏激动剂活性。

向猕猴施药单剂皮下的用30kDa线性或40kDa支化的聚乙二醇(PEG)PEG化的抗CD28人Vκ域抗体(dAb)1h-239-891-D70C。

在给药之后2、4、24、48、96、168、240、336、408、504和672小时使用流式细胞计量术监视外周血T辅助细胞(CD3+CD4+CD8-)上的CD28受体占据(RO)。观察到高至100％的RO，且其维持了与血浆药物浓度相关的持续期间。

尽管非人灵长类本身对于细胞因子释放综合征(CRS)并不敏感(综述于Horvath和Milton，Toxicol.Pathol.37(3)：372-383(2009))，细胞因子浓度中度增加的存在可用于在人中预测CRS。因此，在给药前和给药后2、4、8和24小时使用多路基于珠的测定法评估血浆细胞因子浓度(IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IFN-γ和TNF-α)。未观察到药物相关的细胞因子释放，且大部分细胞因子浓度降至检出限之下。该dAb对血浆细胞因子浓度甚至中度的作用的缺乏支持其缺乏激动剂活性。

由于非人灵长类中缺乏CRS，对外周血T细胞计数的监视可预测人中不受欢迎的T细胞激活和T细胞耗尽(Horvath和Milton(2009)Toxicol.Pathol.37(3)：372-83)。因此，在给药后2、4、24、48、96、168、240、336、408、504和672小时使用流式细胞计量术监视外周血T细胞计数。并未观察到与在人中在单剂超激动性单克隆抗体TGN1412之后(Suntharalingam等(2006)New Engl.J.Med.355(10)：1018-28)或在非人灵长类中用OKT3和HuM291给药之后(综述于Horvath和Milton，2009)观察到的类似的外周血T细胞计数的迅速或深刻的变化。该dAb对外周血T细胞计数任何迅速和/或深刻的作用的缺乏支持其缺乏激动剂活性。

具体显示和描述了本文中所述的公开，并述及其具体实施方案。本领域技术人员会理解的是，可在其中进行多种形式和细节上的变化而不偏离所附权利要求所涵盖的保护范围。

Claims

1.一种域抗体(dAb)，其结合CD28，并阻止CD28对CD80和/或CD86的结合，其中所述dAb并不与CTLA4交叉反应。

2.权利要求1的dAb，其中所述dAb抑制CD28对CD80和/或CD86的结合，其中所述dAb以约100nM、约50nM、约1nM、约500pM、约100pM、约50pM、约10pM、约5pM、或约1pM的IC₅₀抑制CD28对CD80和/或CD86的结合。

3.权利要求1的dAb，其中所述dAb与T细胞受体信号传导组合时基本上不诱导T细胞增殖。

4.权利要求1的dAb，其中所述dAb与T细胞受体信号传导组合时基本上不诱导T细胞的细胞因子分泌。

5.权利要求4的dAb，其中所述细胞因子为至少一种选自下组的细胞因子：IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α和IFN-γ。

6.权利要求1的dAb，其中所述dAb结合CD28的氨基酸序列MYPPPY。

7.权利要求1的dAb，其包含

a.与选自下组的CDR1序列至少50％相同的CDR1序列：SEQ IDNO：484、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：490、SEQ ID NO：493、SEQID NO：496、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：529和SEQ ID NO：636；

b.与选自下组的CDR2序列至少50％相同的CDR2序列：SEQ IDNO：485、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：491、SEQ ID NO：494、SEQID NO：497、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：530和SEQ ID NO：637；和

c.与选自下组的CDR3序列至少50％相同的CDR3序列：SEQ IDNO：486、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：492、SEQ ID NO：495、SEQID NO：498、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：531和SEQ ID NO：638。

8.权利要求7的dAb，其包含

a.选自下组的CDR1序列：SEQ ID NO：484、SEQ ID NO：487、SEQ IDNO：490、SEQ ID NO：493、SEQ ID NO：496、SEQ ID NO：499、SEQID NO：502、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：529和SEQ ID NO：638；

b.选自下组的CDR2序列：SEQ ID NO：485、SEQ ID NO：488、SEQ IDNO：491、SEQ ID NO：494、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：500、SEQID NO：503、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：530和SEQ ID NO：637；和

c.选自下组的CDR3序列：SEQ ID NO：486、SEQ ID NO：489、SEQ IDNO：492、SEQ ID NO：495、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：501、SEQID NO：504、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：531和SEQ ID NO：638。

9.权利要求1的dAb，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：472、SEQ ID NO：473、SEQ IDNO：474、SEQ ID NO：475、SEQ ID NO：476、SEQ ID NO：477、SEQ IDNO：478、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：480、SEQ ID NO：481、SEQ IDNO：482、SEQ ID NO：483、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ IDNO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ IDNO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：547、SEQ IDNO：548、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：553、SEQ IDNO：562、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：575、SEQ IDNO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：580、SEQ IDNO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：611、SEQ IDNO：617和SEQ ID NO：622。

10.权利要求1的dAb，其包含与下述氨基酸序列相差不超过25个氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：272、SEQID NO：273、SEQ ID NO：274、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：276、SEQ IDNO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ IDNO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ IDNO：545、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：550、SEQ IDNO：551、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：567、SEQ IDNO：570、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ IDNO：578、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ IDNO：607、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：617或SEQ ID NO：622。

11.权利要求9的dAb，其经定型式以延长其体内半衰期。

12.权利要求11的dAb，其中所述定型式包括将dAb通过PEG化反应连接于聚乙二醇(PEG)。

13.权利要求12的dAb，其中所述PEG通过半胱氨酸或赖氨酸残基连接。

14.权利要求12的dAb，其中所述PEG为约10至约50kD。

15.权利要求12的dAb，其具有至少约24kD的流体动力学大小。

16.权利要求12的dAb，其具有至少约200kD的流体动力学大小。

17.权利要求12的dAb，其具有约15秒至约12小时的tα半衰期。

18.权利要求12的dAb，其具有约12小时至约744小时的tβ半衰期。

19.权利要求9的dAb，其包含与人抗体的FW1、FW2、FW3和FW4对应的FW1、FW2、FW3和FW4氨基酸序列。

20.权利要求19的dAb，其中所述FW1、FW2、FW3和FW4序列与人抗体的FW1、FW2、FW3和FW4相差不超过10个氨基酸。

21.权利要求19的dAb，其中所述FW1、FW2、FW3和FW4序列与人抗体的FW1、FW2、FW3和FW4相同。

22.权利要求19的dAb，其中所述FW2序列与人抗体的FW2相同。

23.权利要求1的dAb，其中所述dAb具有至少三个选自下组的特征：

a)阻止CD80和CD86结合CD28，

b)与T细胞受体信号传导组合时并不激动CD28信号传导，

c)对于CD28的结合具有约50nM至约1pM的K_d，

d)具有约15秒至约12小时的tα半衰期，

e)具有约12小时至约336小时的tβ半衰期，

f)结合MYPPPY序列，和

g)选自下组的CDR1序列：SEQ ID NO：484、SEQ ID NO：487、SEQ IDNO：490、SEQ ID NO：493、SEQ ID NO：496、SEQ ID NO：499、SEQID NO：502、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：529和SEQ ID NO：636；选自下组的CDR2序列：SEQ ID NO：485、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：491、SEQ ID NO：494、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：530和SEQ ID NO：637；和选自下组的CDR3序列：SEQID NO：486、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：492、SEQ ID NO：495、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：531和SEQ ID NO：638。

24.一种核酸，其编码依照权利要求1的dAb。

25.依照权利要求1的域抗体(dAb)在制备用于治疗患者的药物中的用途，其中所述患者需要结合CD28的域抗体。

26.权利要求25的用途，其中所述dAb在所述个体中拮抗CD28对CD80和/或CD86的结合。

27.权利要求25的用途，其中所述个体罹患免疫性疾病或有罹患免疫性疾病的风险。

28.权利要求27的用途，其中所述免疫性疾病是自身免疫性疾病或移植物相关疾病。

29.权利要求28的用途，其中所述移植物相关疾病选自下组：同种异体移植物排斥、异种移植物排斥和移植物抗宿主病。

30.权利要求28的用途，其中所述自身免疫性疾病选自下组：系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、糖尿病、银屑病、硬皮病、动脉粥样硬化、炎性肠病和溃疡性结肠炎。

31.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1任一的dAb和药学可接受载体。

32.一种抗体，其与域抗体(dAb)1h-239-891(D70C)(SEQ ID NO：543)结合相同的表位。

33.权利要求32的抗体，其中所述抗体是dAb。

34.权利要求33的抗体，其中所述dAb是1h-239-891(D70C)(SEQ ID NO：543)。

35.权利要求33的抗体，其中所述dAb包含具有针对第一抗原的结合特异性的第一单一可变域和具有针对第二抗原的结合活性的第二单一可变域，其中所述第一抗原是CD28，且其中所述第二抗原是除了CD28之外的抗原。

36.权利要求35的抗体，其中所述第二抗原是抗原呈递细胞表面抗原或T细胞表面抗原。

37.权利要求35的抗体，其中所述第二抗原是细胞因子。

38.一种药物组合物，其包括治疗有效量的权利要求32的抗体。

39.权利要求38的药物组合物，其还包含免疫抑制剂/免疫调节剂和/或抗炎剂。