CN102154270B - 一种对阪崎肠杆菌o抗原特异的核苷酸及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)O抗原特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸包括1)SEQ ID NO：1-14所示的核苷酸中的至少一种；2)与SEQ ID NO：1-14所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。这些核苷酸可用于制备检测阪崎肠杆菌用PCR试剂盒和基因芯片。本发明的对阪崎肠杆菌O抗原特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片实用性强，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种对阪崎肠杆菌O抗原基因簇特异的核苷酸及其应用，尤其涉及一种对阪崎肠杆菌O抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。
背景技术
阪崎肠杆菌是人和动物的肠道寄生菌和条件致病菌，已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，可导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎，死亡率可达40％～80％。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，阪崎肠杆菌已引起世界多国相关部门的重视，已被列为婴儿配方奶粉的A类致病菌。
目前阪崎肠杆菌的分类地位刚刚建立，其O抗原血清型的研究也逐渐成为热点。脂多糖是革兰式阴性细菌的主要表面成分，包括类脂A，核心多糖和O抗原。O抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖分子的最外层结构，它是由多个寡糖重复单位组成的多糖链，重复单位一般由3～6个单糖组成。在大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌中，负责O抗原合成的基因相邻排列于两个持家基因galF和gnd之间，在染色体上形成一个基因簇。O抗原基因簇内部的基因通常分为三类：单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。单糖合成酶负责单糖前体的合成，糖基转移酶负责将单糖串联成寡糖重复单位，而寡塘单位处理酶负责将寡糖单位从内膜内侧转运到内膜外侧，并将寡糖单位进行串联。
脂多糖特别是其中的O-抗原的组成和结构的变化决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性，比如国际上根据脂多糖的结构特性而鉴定过沙门氏菌属的抗原类型多达2107个。血清分型是一种经典和常用的流行病学调查手段，对于临床研究及疫苗研制具有重要意义。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不同的O抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清鉴定方法成为目前的发展方向。现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。
近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于阪崎肠杆菌的快速血清分型筛查，稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。
不同抗原的糖基转移酶和寡糖单位处理酶的序列同源性很低，具有高度的血清型特异性，可用作靶基因进行分子生物学鉴定。寡糖单位处理酶基因包括O抗原转运酶基因(wzx)和O抗原聚合酶基因(wzy)。利用上述两个基因作为血清型分型检测的特异靶基因是十分理想的。如大肠杆菌(王威，彭霞，2006年)、变形杆菌和沙门氏菌均有利用该基因做特异检测的实例。
聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，简称PCR技术)作为微生物检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为阪崎肠杆菌的防控提供有效技术支持是十分重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对阪崎肠杆菌抗原特异的核苷酸，所述核苷酸包括：
1)SEQ ID NO：1-15所示核苷酸中的至少一种；
2)与SEQ ID NO：1-15所示核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。
本发明进一步公开了核苷酸序列在制备检测阪崎肠杆菌用PCR试剂盒或基因芯片方面的应用。
本发明还公开了一种快速检测临床标本的PCR试剂盒，该试剂盒包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括SEQ ID NO：1-15所示的核苷酸中的至少一种。
该试剂盒包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括SEQ IDNO：1-15所示的核苷酸中的至少一种；其中10μM引物各0.5μl，10mM dNTP 0.5μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，5U/μl耐热DNA聚合酶0.3μl，25mM MgCl22.5μl，余下的体积在除去5μl待测样品的量后用ddH2O补足至25μl。
本发明公开的对阪崎肠杆菌O抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用与现有技术相比，具有如下优点：
(1)实用性强
本发明提供血清分型检测所用到的特异引物，利用该PCR方法可以对临床标本进行检测。最终能够利用PCR的方法检测鉴别7个血清型。
本发明所配制的PCR试剂盒等配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低。
(2)准确性高
本发明通过对阪崎肠杆菌的各血清型特异的基因wzx和wzy的PCR反应，每个样品得到一条目的条带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可以得到阪崎肠杆菌所属的血清型。
(3)灵敏度高
本发明提供的检测引物及阪崎肠杆菌检测试剂盒等具有较高的敏感性，检测精度高，可以检测到1ng/μl的DNA模板。
附图说明
图1表示O1wzy基因P1和P2引物的筛选，目的条带为364bp，其余的血清型没有任何条带。
图2表示O2wzy基因P3和P4引物的筛选，目的条带为473bp，其余的血清型没有任何条带。
图3表示O3wzy基因P5和P6引物的筛选，目的条带为704bp，其余的血清型没有任何条带。
图4表示O4wzy基因P7和P8引物的筛选，目的条带为890bp，其余的血清型没有任何条带。
图5表示O5wzy基因P9和P10引物的筛选，目的条带为235bp，其余的血清型没有任何条带。
图6表示O6wzx基因P11和P12引物的筛选，目的条带为615bp，其余的血清型没有任何条带。
图7表示O7wzy基因P13和P14引物的筛选，目的条带为424bp，其余的血清型没有任何条带。
图8表示种特异性的鉴定，其中检测了种间的四株细菌和其他种属四株细菌，均无任何条带。具体菌株信息见表2。
图9表示PCR试剂盒应用分型结果，能够检测出相应O型的菌株并且非对应O型无条带。
其中：O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7和负对照(-)表示相应血清型引物扩增结果，最后一个泳道是2000bp ladder marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件。
实施例1：基因组的提取
37℃LB液体培养基培养阪崎肠杆菌，收集细菌，提取基因组具体步骤如下：
用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2：序列破译
(1)通过Long-PCR扩增阪崎肠杆菌的O抗原基因簇。根据Genbank中galF基因和O抗原基因簇之间的JumpStart设计上游引物为wl-10324，5’-GCACTGGTAGCTATTGAGCCAGGGGCGGTAGCAT-3’，再根据gnd基因设计下游引物为wl-22115’-ACTGCCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGG-3’(分别为SEQ ID NO：15-16)。
PCR反应程序如下：在94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸8分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并8管50μl long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
(2)构建O抗原基因簇文库：用shot-gun法构建O抗原基因簇文库，反应体系是600ngPCR纯化产物，经过核酸片段仪剪切成1～3kb片段、补平粘性术端、pUC18的载体连接(采用fastlink ligase)连接得到测序的基因文库。
(3)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的200个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到8～10倍的覆盖率，从而获得O抗原基因簇的所有序列。
(4)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC分子生物学实验室出版的Stadenpackage软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列后，用美国国家生物技术信息学中心的orf finder发现基因，找到开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国Sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到阪崎肠杆菌的基因簇的序列。
实施例3：引物设计及筛选
根据基因簇破译情况，我们发现wzy和wzx基因确实是血清型特异的基因，所以选取该基因特异区段设计特异引物。由于wzy更加特异，所以主要以wzy基因为靶基因，但是因为有O6血清型中不含该基因，所以该血清型以wzx为靶基因设计引物。
引物设计是该发明的核心部分。设计引物根据文献中叙述的特异基因来设计。wzx和wzy这两个基因是阪崎肠杆菌O抗原基因簇中比较特异的基因，可以作为血清型鉴定的靶基因。将上述基因导入Primer Premier 5进行引物设计，引物的长度最好在18～24bp之间，Tm值在50～55℃。每个基因设计一对引物，有单一目的条带。
引物设计之后在Genbank中进行BLAST，设计的引物不能与其它近缘细菌的序列相似性过高，这样就能确保该引物只在自己的预定位置进行扩增，而不与其它的近缘菌或者采集标本的环境中的近缘菌不产生阳性反应。这一点对于避免非特异条带的产生和实验的成败十分重要。
设计出的引物如表1所示。
表1用于PCR的引物序列
基因鉴定引物筛选用到的PCR体系(25μl)和反应条件如下：
超纯水 15.7μl
缓冲液(10X) 2.5μl
dNTP(10mM) 0.5μl
引物1(10μM) 0.5μl
引物2(10μM) 0.5μl
DNA聚合酶(rTaq) 0.3μl(5U/μl)
模板DNA 5μl
这个步骤中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：
94℃，5分钟
72℃，5分钟
其中，O1、O3及O5使用50℃扩增，其他类型采用55℃扩增效果最好。为简便起见，也可均用50℃，但有非目标条带的非特异扩增存在。
上述步骤在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：
①取2～5μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以5∶1的体积比混合；
②将混合液上样于1.2％的琼脂糖凝胶上；
③将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约10分钟，用DL2000Marker进行对照；
④观察并记录结果。
引物筛选这个环节用到的基因组模板提取采用煮菌法。通过基本PCR反应之后引物筛选的工作基本结束，必要的长度调整对整体反应条件影响不大，本发明中用到的引物序列全部总结在表1中。
实施例4：灵敏度检测
按照上述培养方法培养阪崎肠杆菌各个O抗原类型后，用生理盐水按照100～10-8次方稀释后进行PCR检测。最终的灵敏度就是25μl体系中要有至少102个以上细菌才能检测得到。
实施例5：种间特异性的检测
选取阪崎肠杆菌的种间菌株和其他相近种属菌株进行特异性检测，方法同上。所用菌株见表2，结果见图8。所有非阪崎肠杆菌均没有扩增条带，说明发明中设计的引物特异性良好，适于作为阪崎肠杆菌种内分型适用。
表2用于特异性检测的菌株
实施例6：PCR试剂盒的应用
(1)PCR试剂盒的组成
包括PCR引物、dNTP、缓冲液、DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品。试剂盒使用的量都是20μl为一个基本用量。每个试剂盒可以检测20个样品。
(2)检测实验所需材料及设备的准备
其中MgCl2、10×缓冲液、dNTP、rTaq聚合酶由上海生工提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和超纯水由我们自行制备，其中阳性对照品为阪崎肠杆菌O1型基因组，每个反应用量为1μl，作为模板加入反应体系，加超纯水补足到25μl，阴性对照品为超纯水，加入5μl至反应体系中。
实验的设备PCR仪、电泳设备、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2ml PCR薄壁管。
(3)PCR试剂盒的使用具体实例
①待测样品的处理。如果有条件提取基因组也可以，为了节省时间和耗材，可以直接取500μl菌液，离心后用500μl ddH2O重悬，100℃煮沸10分钟，然后12000rpm离心10min，取中层上清为模板。待测样品具体信息见表3。
表3待测样品
②取PCR试剂盒的试剂20μl于PCR管中，加入5μl模板。
③PCR反应条件如下：
94℃，5分钟
72℃，5分钟
④1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测试验结果。
⑤结果的分析和记录。结果见图9。对应的菌株有相应的单一正确条带，非相关菌株无条带。
以上所述，仅是本发明的操作和实施方法而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (3)
1.一种对阪崎肠杆菌O抗原特异的寡核苷酸引物组，其特征在于选自以下7组中的任意1组：
(a)由SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸引物和SEQ ID NO：2所示的寡核苷酸引物组成的寡核苷酸引物组；
(b)由SEQ ID NO：3所示的寡核苷酸引物和SEQ ID NO：4所示的寡核苷酸引物组成的寡核苷酸引物组；
(c)由SEQ ID NO：5所示的寡核苷酸引物和SEQ ID NO：6所示的寡核苷酸引物组成的寡核苷酸引物组；
(d)由SEQ ID NO：7所示的寡核苷酸引物和SEQ ID NO：8所示的寡核苷酸引物组成的寡核苷酸引物组；
(e)由SEQ ID NO：9所示的寡核苷酸引物和SEQ ID NO：10所示的寡核苷酸引物组成的寡核苷酸引物组；
(f)由SEQ ID NO：11所示的寡核苷酸引物和SEQ ID NO：12所示的寡核苷酸引物组成的寡核苷酸引物组；
(g)由SEQ ID NO：13所示的寡核苷酸引物和SEQ ID NO：14所示的寡核苷酸引物组成的寡核苷酸引物组；
2.权利要求1所述的寡核苷酸引物组在制备检测阪崎肠杆菌用PCR试剂盒中的应用。
3.一种PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括权利要求1所述的7组寡核苷酸引物组中的至少一组；其中10μM引物各0.5μl，10mM dNTP 0.5μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，5U/μl耐热DNA聚合酶0.3μl，25mM MgCl22.5μl，余下的体积在除去5μl待测样品的量后用ddH2O补足至25μl。
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| 王威.大肠杆菌O11 O-抗原基因簇序列的破译及特异分子标识的鉴定.《微生物学报》.2006,第46卷(第3期),341-346. * |
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