CN102134275B

CN102134275B - 表皮生长因子受体变异体

Info

Publication number: CN102134275B
Application number: CN2010101009490A
Authority: CN
Inventors: 李宗海; 王海; 周敏; 潘晓蓉; 顾健人; 杨胜利
Original assignee: Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Shanghai Cancer Institute
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2030-01-26
Also published as: CN102134275A; US20130034558A1; WO2011091716A1; US8703917B2; WO2011091716A9

Abstract

本发明提供了一种新的表皮生长因子受体变异体-EGFRvA蛋白，编码EGFRvA蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种EGFRvA蛋白的方法。本发明还公开了编码这种EGFRvA蛋白的多核苷酸的用途。EGFRvA蛋白具有促进肿瘤细胞侵袭或促进肿瘤细胞迁移功能。

Description

表皮生长因子受体变异体

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码人表皮生长因子受体变异体EGFRvA(Epidermal growth factor receptor variant A，EGFRvA)的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erb B的170千道尔顿(Kilodalton)膜糖蛋白产物⁽¹⁾。EGFR基因是最初在鸟类红细胞增多症病毒中识别的erb B致癌基因的细胞同系物^(1，2)。已在各种人类肿瘤中观察到这种致癌基因通过基因放大的活化^(3-6)。

已有文献表明，EGFR在多种类型的人类实体瘤中过表达⁽⁷⁾。这些肿瘤包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌和前列腺癌⁽⁷⁾。v-erbB致癌基因和正常EGFR基因之间的一个主要区别在于病毒致癌基因是正常受体截断氨基的变型；它们缺少大部分细胞质外结构域，但保留了跨膜和酪氨酸激酶结构域^(8-11)。这导致了它不能结合表皮生长因子(EGF)，但仍可以磷酸化其它蛋白质^(14-15)。

各种基因变化都可以发生于病毒性erb B致癌基因中，例如，基因的羧基末端中发生氨基酸的取代和缺失。其中氨基端缺失对于致癌作用尤为关键。氨基端缺失是大多v-erb B致癌基因的一个特征，包括由启动子的插入或逆转录病毒转导引起的那些氨基端缺失^(13，16)。相反，羧基末端缺失似乎只与逆转录病毒转导引起的肿瘤有关，而且似乎决定于宿主范围和肿瘤类型的特异性^(11，15)。以氨基端缺失的鸟类c-erb B基因或人EGF受体的转染实验表明该缺失可以使细胞转化^(16-17)。

EGFR基因的放大发生于40％的恶性人类神经胶质瘤中^(3，7)，受体基因的重排在许多具有基因放大的肿瘤中较为明显。重排似乎更多地影响基因的氨基末端^(6，18)。

迄今已发现至少有八种EGFR变体：1)EGFRvI缺少EGFR的大部分细胞外结构域。2)EGFRvII由EGFR的细胞外结构域中的83aa框内缺失组成。3)EGFRvIII由EGFR的细胞外结构域中的267aa框内缺失组成。4)EGFRvIV含有EGFR的细胞质结构域中的缺失。5)EGFRvV含有EGFR的细胞质结构域中的缺失。6)EGFR.TDM/2-7含有EGFR的细胞外结构域中的外显子2-7的重复。7)EGFR.TDM/18-26含有EGFR的细胞外结构域中的外显子18-26的重复。8)另外，存在第二种更为罕见的具有在外显子11和14之间的连接点引入新颖组氨酸残基的缺失的EGFRvIII突变体(EGFRvIII/Δ12-13)⁽²⁴⁾。

EGFRvIII是在人类癌症中表皮生长因子(EGF)受体最常见发生的变体⁽²⁴⁾。在基因放大的过程中，在胞外区发生267个氨基酸缺失，产生新的连接点(甘氨酸)。已知EGFRvIII未表达于任何正常组织^(19，20)。然而，EGFRvIII在许多肿瘤细胞中有表达，例如，27-76％乳腺癌活检组织检查表达EGFRvIII⁽²¹⁾，50-70％神经胶质瘤表达EGFRvIII^(19，22)，16％非小细胞肺癌表达EGFRvIII⁽²³⁾，75％卵巢癌表达EGFRvIII⁽²²⁾。此外，本发明者所在实验室在最近也发现了肝癌中有EGFRvIII的存在⁽²⁵⁾。

然而，迄今为止，人们对于癌症侵袭和转移的原因和机理的了解还不够深入，因此本领域迫切需要开发与癌症侵袭和转移相关的蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的、与癌症侵袭和转移密切相关的表皮生长因子受体变异体EGFRvA多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的EGFRvA多肽，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进肿瘤细胞侵袭和/或促进肿瘤细胞迁移功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与SEQ ID NO：2氨基酸序列有≥95％同源性，且具有促进肿瘤细胞侵袭或促进肿瘤细胞迁移功能的由(a)衍生的多肽。

更佳地，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该EGFRvA突变体缺失了表皮生长因子的胞内区末端的120个氨基酸，并且在末端又增加了如SEQ ID NO：2中第1091-1136位所示的46个氨基酸构成的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少80％(较佳地至少90％，更佳地至少95％)相同性：(a)编码上述人EGFRvA多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中44-3454位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-3763位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人EGFRvA蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达人EGFRvA蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人EGFRvA蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人EGFRvA多肽特异性结合的抗体。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人EGFRvA多肽活性的化合物，以及抑制人EGFRvA多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人EGFRvA多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测(尤其是非诊断地体外检测)样品中是否存在EGFRvA蛋白的方法，它包括：将样品与EGFRvA蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在EGFRvA蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人EGFRvA多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人EGFRvA多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人EGFRvA多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人EGFRvA蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人EGFRvA多肽的拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗乳腺癌、脑胶质瘤等病症。

在另一优选例中，所述的拮抗剂是特异性结合于EGFRvA多肽且不结合于人表皮生长因子受体的抗体。

在本发明的第十一方面，提供了一种确定测试化合物是否是EGFRvA多肽的拮抗剂或激动剂的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将测试化合物加入体外培养的肿瘤细胞的培养体系作为测试组；并将体外培养的相同的肿瘤细胞作为对照组，

其中所述的肿瘤细胞来自于哺乳动物，并且表达本发明的EGFRvA多肽；

(b)观察测试组和对照组中肿瘤细胞的迁移程度，如果测试组的肿瘤细胞的迁移程度大于对照组，则表示测试化合物是EGFRvA多肽的激动剂；如果测试组的胚泡着床数量小于对照组，则表示测试化合物是EGFRvA多肽的拮抗剂。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞来自于人。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1：EGFRvA与EGFR的差异显示图。

图2A：EGFRvA在各个正常组织中的RNA水平检测。

图2B：EGFR在肿瘤细胞系中的表达(RT-PCR)。

图2C：EGFR在肿瘤细胞系中的表达(Western印迹法)。

图2D：EGFRvA在肺癌组织中的表达，T是肿瘤组织，N是癌旁组织。

图3：EGFRvA稳定表达细胞系的建立及分析。其中，3A：Western Blot；3B：流式分析。

图4：EGFRvA促进细胞的体外增生。

图5：EGFRvA促进细胞在体外的侵袭和迁移。

图6：EGFRvA促进U87细胞在体内的肺转移，其中A显示了荷瘤小鼠的体重；B显示了荷瘤小鼠的体重变化；C显示了荷瘤小鼠的肺重。*：P＜0.05，**：P＜0.01。

图7：EGFRvA与EGFR相比，其稳定表达细胞系对针对EGFR的抑制剂Erotinib的敏感性要低。

图8：shRNA的特异性检测，表明所选的shRNA可特异干扰靶序列。其中，mock为随机引物对照，blank为空白对照。

图9：在H1299细胞内，所选的shRNA可有效抑制相应的EGFR mRNA表达。其中，mock为随机引物对照。

图10：在MDA-MB-468细胞内，所选的shRNA可有效抑制相应的EGFR多肽的表达。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现并分离了一种新的EGFR变异体(EGFRvA)，它有如下几个特征：1)在表皮生长因子受体的胞内区末端出现120个氨基酸的缺失，而增加了46个新的氨基酸序列。2)它在多种正常组织和肿瘤组织中存在，在某些肿瘤组织中过表达。3)该变异体在体外能够明显促进肿瘤细胞的侵袭，迁移。4)该变异体在体内能够明显促进肿瘤细胞的转移。5)与野生型EGFR(EGFRwt)相比，它对小分子激酶抑制剂的敏感性更低。6)RNA干扰该变异体可导致某些细胞死亡。7)该变异体在一些肺癌病人中也存在19号外显子或21号外显子的突变。在此基础上完成了本发明。

此外，本发明人还开发一些检测这个基因的方法：1)用RT-PCR检测该基因及该基因在19号及21号外显子的突变。2)筛选了一些单克隆抗体用于EGFRvA和EGFRwt的蛋白水平检测。3)找到了能特异针对EGFRvA的shRNA。

在本发明中，术语“EGFRvA蛋白”、“EGFRvA多肽”或“表皮生长因子受体变异体EGFRvA”可互换使用，都指具有人表皮生长因子受体变异体EGFRvA氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的表皮生长因子受体变异体EGFRvA。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的EGFRvA蛋白或多肽”是指EGFRvA多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EGFRvA蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。EGFRvA多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人EGFRvA蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人EGFRvA蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人EGFRvA多肽”指具有人EGFRvA蛋白活性的SEQ IDNO：2序列的多肽。该术语还包括具有与人EGFRvA蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人EGFRvA蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人EGFRvA DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人EGFRvA多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人EGFRvA多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO：3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人EGFRvA多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人EGFRvA多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人EGFRvA蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人EGFRvA多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人EGFRvA蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码EGFRvA蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人EGFRvA核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或EGFRvA蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的EGFRvA多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人EGFRvA多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人EGFRvA多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人EGFRvA编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人EGFRvA蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗EGFRvA蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗EGFRvA蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人EGFRvA蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人EGFRvA蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人EGFRvA DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人EGFRvA基因产物或片段。较佳地，指那些能与人EGFRvA基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人EGFRvA蛋白的分子，也包括那些并不影响人EGFRvA蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人EGFRvA基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人EGFRvA基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人EGFRvA蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人EGFRvA蛋白功能的抗体以及不影响人EGFRvA蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人EGFRvA基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人EGFRvA基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人EGFRvA蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人EGFRvA蛋白。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人EGFRvA蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人EGFRvA蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人EGFRvA蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人EGFRvA蛋白阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用人EGFRvA蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与EGFRvA蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

抗本发明EGFRvA蛋白的抗体用于疾病治疗，例如，用于抑制肿瘤细胞的侵袭或抑制肿瘤细胞的迁移。在使用本发明的抗体时，还可同时使用其他治疗剂，如抗肿瘤的化疗剂等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明EGFRvA多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的EGFRvA蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人EGFRvA蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于EGFRvA蛋白的无表达或异常/无活性的EGFRvA蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的EGFRvA蛋白，以抑制内源性的EGFRvA蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将EGFRvA基因转移至细胞内。构建携带EGFRvA基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人EGFRvA基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人EGFRvA mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人EGFRvA蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人EGFRvA蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人EGFRvA蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人EGFRvA蛋白水平，可以用作解释人EGFRvA蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断EGFRvA蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在EGFRvA蛋白的方法是利用EGFRvA蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与EGFRvA蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在EGFRvA蛋白。

EGFRvA蛋白的多聚核苷酸可用于EGFRvA蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，EGFRvA蛋白的多聚核苷酸可用于检测EGFRvA蛋白的表达与否或在疾病状态下EGFRvA蛋白的异常表达。如EGFRvA DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断EGFRvA蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用EGFRvA蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测EGFRvA蛋白的转录产物。

检测EGFRvA基因的突变也可用于诊断EGFRvA蛋白相关的疾病。EGFRvA蛋白突变的形式包括与正常野生型EGFRvA DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明EGFRvA蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为3763个碱基，其开放读框位于44-3454位，编码全长为1136个氨基酸的人EGFRvA蛋白(SEQ ID NO：2)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：采用PCR方法获得EGFRvA的序列

材料方法：正常组织RNA样品购自Clontech。涉及组织包括：脑(货号636530)、结肠(货号636553)、肾脏(货号636529)、肝脏(货号636531)、肺(货号636524)、卵巢(货号636555)、胰腺(货号636577)、胎盘(货号636527)、脾脏(货号636525)、胃(货号636578)、前列腺(货号636550)、乳腺(货号636576)。

运用巢氏PCR对上述样本进行扩增。

实验结果：所有组织中均能扩增到野生型EGFR。但是，在肝脏、肺、胃、结肠和乳腺中，均不能扩增得到明显的VA条带。其中，在胎盘和前列腺正常组织中获得一个全长的EGFRvA序列(图2A)。

实施例2：在肿瘤细胞和组织中检测EGFRvA的mRNA表达水平

本实施例所用的细胞来源如下：人上皮癌细胞：A431(ATCC，Manassas，VA，USA)，人乳腺癌细胞：MDA-MB-468(ATCC，Manassas，VA，USA)，人脑胶质瘤细胞：U87MG(ATCC，Manassas，VA，USA)，人肝癌细胞：Bel-7402(中国科学院，上海，中国)，人前列腺癌细胞：PC-3(ATCC，Manassas，VA，USA)，人肺腺癌细胞：H1299(ATCC，Manassas，VA，USA)，人卵巢癌细胞SKOV-3(ATCC，Manassas，VA，USA).。细胞用含10％胎牛血清和抗生素的DMEM培养基(Gibco，Grand Island，NY)培养。本实施例所用的肺癌及癌旁组织来自上海市胸科医院。本实验所用的肝癌及癌旁组织来自江苏启东肝癌研究所。这些标本的获得都有知情同意书。这些研究都经过相关伦理委员会的许可。

实验结果：几乎所有肿瘤细胞系以及大部分癌和癌旁组织中均存在EGFRvARNA水平的表达(图2B和2D)。

实施例3：识别EGFRvA或EGFRwt的单克隆抗体制备

分别合成EGFRwt胞内区和EGFRvA胞内区的多肽CSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA(EGFRwt)(SEQ ID NO：15)和CPSQVLPPASPEGETVADKQTQ(EGFRvA)(SEQ ID NO：16)。然后将多肽与铜蓝蛋白(KLH)以1∶1的质量比交联。将100ug peptide-KLH与弗氏完全佐剂以1∶1混合，免疫小鼠，4周后用100μg多肽-KLH与弗氏不完全佐剂1∶1混合，免疫小鼠，2周后再重复免疫1次。单克隆抗体采用传统的杂交瘤技术进行筛选，用EGFRwt和EGFRvA稳定表达的细胞系鉴定其特异性。这些抗体可以用于EGFRwt和EGFRvA的ELISA，Western Blot(WB)，immunofluorescence(IF)andimmunohistochemistry(IHC)检测。

结果，获得了能特异识别EGFRvA的单抗1F3-52，能特异识别EGFRwt的单抗1C5。

实施例4：在肿瘤细胞和组织中检测EGFRvA的蛋白表达水平

用BCA Kit(Pierce，Rockford，IL)对组织和细胞裂解物(Lysates)进行定量。将30μg蛋白在10％SDS-PAGE进行电泳分离，然后电转到硝酸纤维素膜(MilliporeBillerica，MA)，用5％脱脂牛奶封闭，然后与一抗孵育，4℃过夜。小鼠抗GAPDH抗体购自康成生物技术有限公司(上海，中国)。兔抗人EGFR抗体，SC-03购自Santa Cruz生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，CA)。1F3-52单抗为特异性识别EGFRvA的单抗，1C5单抗为特异性识别EGFRwt的单抗，均由本实验室制备。免疫复合物与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(Immu-ClubLabs，Sunnyvale，CA)在室温下孵育1小时后用化学发光试剂(Pierce，Rockford，1L)进行检测。

实验结果：在一些肿瘤细胞系如A431，MDA-MB-468存在EGFRvA蛋白质水平的表达(图2C)。在肺癌组织中也检测到了EGFRvA的广泛表达。

实施例5：制备慢病毒及建立稳定转染细胞：

EGFRwt和EGFRvA序列分别从A431细胞系中扩增。测序后插入pWPT载体(可购自Addgene公司)并替换掉GFP，从而产生pWPT-EGFRwt和pWPT-EGFRvA。将pWPT-EGFRwt或pWPT-EGFRvA分别与包装质粒psPAX2及G-protein of vesicular stomatitis virus(VSV-G)胞膜质粒pMD2.G(可购自Addgene公司)磷酸钙共转染到293T细胞(中国科学院，上海，中国)。用病毒感染NIH/3T3细胞及U87MG细胞(1×10⁵)，感染时添加6μg/mL Polybrene(SigmaChemical，USA).Western blot鉴定混合克隆后，取100个细胞铺板，各挑取6个单克隆，再次进行Western blot鉴定，挑取表达丰度一致的克隆进行下一步实验。

实验结果：获得了表达水平相对一致的U87MG EGFRwt和U87MG EGFRvA细胞株。NIH/3T3 EGFRwt和NIH/3T3 EGFRvA细胞系的总EGFR表达水平也基本一致(图3A)。

实施例6：流式检测

取NIH/3T3 EGFRwt/NIH/3T3 EGFRvA以及U87MG EGFRwt/U87MGEGFRvA候选克隆各1X10⁶细胞数。10mmol EDTA消化重悬后分别与EGFR抗体(单克隆鼠抗M225，稀释倍数1∶100)以及同型无关抗体孵育，室温1h。之后加入二抗(羊抗鼠-FITC，稀释倍数1∶50)室温孵育30min。收集样品，选用BDFACSCalibur流式操作仪分析样品。用winMDI2.9软件对所得数据进行处理并绘图。

实验结果：我们发现U87MG EGFRwt和U87MG EGFRvA的总EGFR表达水平基本一致。NIH/3T3 EGFRwt和NIH/3T3 EGFRvA细胞系的总EGFR表达水平也基本一致。4株细胞均为单克隆(见图3B)。

实施例7：细胞增殖实验

材料：CCK-8试剂盒购自Dojindo Laboratories

取对数生长期的细胞，计数后种6块96孔板，每孔300个细胞，每块板上每种细胞种5个复孔，每隔24h取1块板，将原有培基更换为含10％CCK-8的培养基，继续孵育2h测定0D450值，总共6天，绘制细胞生长曲线。

结果见图4：从第5天开始，相对于对照U87MG GFP细胞，过表达EGFRwt和EGFRvA的U87MG细胞均显示了更强的细胞增殖能力(p＜0.01)。而U87MGEGFRwt和U87MG EGFRvA细胞两者之间的增殖的能力无明显差异(p＞0.05)。NIH/3T3系列细胞也显示了同样的结果。

实施例8：细胞迁移和侵袭实验

材料：Transwell小室(孔径：8.0μm)及基质胶均购自BD Bioscience公司。

方法：

划痕实验：为了初步检测EGFRvA对细胞迁移能力的作用，选用NIH/3T3稳转细胞系进行了划痕实验。取对数生长期的细胞，计数后种6孔板，每孔1×10⁶的细胞。培养细胞至100％的融合度后，用无菌的黄Tip在细胞层上划出宽度约1mm的划痕，无血清培养基洗细胞3次，去除划痕时掉下来的细胞，然后分别于24h，48h和72h时在显微镜下拍照，计数迁移的细胞。

Transwell迁移实验(Transwell migration assay)：为了更精确地检测EGFRvA对细胞迁移能力的作用，进行了Trasnwell迁移实验。将5×10⁴的细胞，重悬于200μl无血清培基，加入Transwell上层小室，下层加入600μl含10％FBS的培基，培养12h(NIH/3T3 GFP，NIH/3T3 EGFRwt，NIH/3T3 EGFRvA)或24h(U87MG GFP，U87MG EGFR，U87MG EGFRvA)后，4％多聚甲醛固定1h，用棉签拭去Transwell上层小室内未迁移的细胞，0.1％结晶紫染色30分钟，显微镜下拍照(放大100倍)，计数。

细胞侵袭实验(Transwell invasion assay)：为了检测EGFRvA对细胞侵袭能力的作用，进行了细胞侵袭实验。在Transwell上层小室平铺稀释为1μg/μl的Matrigel 100μl，37℃孵育4h，用无血清培养基轻洗Matrigel两次。计数1×10⁵的细胞，重悬于200μl无血清培基，加入已铺好Matrigel的Transwell上层小室，下层加入600μl含10％FBS的培基，培养24h后，4％多聚甲醛固定1h，用棉签擦去Transwell上层小室内的细胞，0.1％结晶紫染色30分钟，显微镜下拍照(放大100倍)，计数。

结果：从划痕后24小时到72小时，相对于NIH/3T3 GFP对照细胞，可见NIH/3T3 EGFRwt细胞与NIH/3T3 EGFRvA细胞有明显的细胞迁移能力，而NIH/3T3 EGFRvA的细胞迁移能力相对更强(p＜0.05)。而Transwell实验显示了更明显的结果，无论是在小鼠成纤维细胞系NIH/3T3还是在人脑胶质瘤细胞系U87MG，EGFRvA均具有比EGFRwt更强的促进细胞迁移和侵袭的能力(表2和图5)。

表2.EGFRvA具有比EGFRwt更强的促进细胞迁移和侵袭的能力

实施例9：体内转移实验：

取6-8周龄裸鼠，分为3组，每组10只。以1×10⁶细胞/只的接种量对三组小鼠尾静脉注射U87MG-GFP、U87MG EGFRwt以及U87MG EGFRvA细胞系。18天后进行microCT扫描。小鼠于种瘤及处死前两次测量体重。体重测量完毕后处死小鼠，取肺脏称重，并对组织进行组化检测。数据处理软件选用SPSS 11.0，先通过lenvene检验证明各组之间方差齐性，接着用方差检验验证各组之间总体上是否存在显著性差异，最后用LSD检验在组间进行两两比较。

结果：观察到EGFRvA有较之野生型EGFR更强的促进肿瘤转移的能力。这体现在小鼠的肺部变化以及体重变化中。U87MG-GFP接种的小鼠肺部偶有结节，但基本维持了肺脏的基本形态。而EGFRwt以及EGFRvA接种的小鼠肺部均出现了相当多的肺部结节。通过观察比较以及组化鉴定，发现EGFRvA接种组的小鼠肺部肿瘤侵润的程度高于EGFRwt接种组。事实上，EGFRwt(P＝0.001)和EGFRvA(P＜0.001)接种组小鼠的肺重都明显超过U87MG-GFP组，而VA接种组的肺重又超过了EGFRwt接种组(P＝0.018)。VA接种组的小鼠的身体状况在3组中也是最差的。体重数据表明，VA组的小鼠体重较之GFP组和EGFRwt组明显更轻(P＜0.001)。而体重变化程度也能得出同样的结论(P＜0.001)。以上证据都有力地表明：EGFRvA比野生型EGFR具有更强的促进肿瘤细胞侵袭的能力(图6)。

实施例10：EGFR小分子抑制剂抑制细胞生长实验

材料：AG1478购自Calbiochem公司，Erlotinib可购自罗氏制药公司。

方法：取对数生长期的细胞铺96孔板，每孔3000个细胞。培养24h后，加入不同浓度的Erlotinib或AG1478，继续培养72h，更换为含10％CCK-8试剂的培养基孵育2h，测定0D450值。

实验结果：EGFR小分子抑制剂Erlotinib和AG1478作用于EGFRvA的IC₅₀值是野生型EGFR的3倍以上，说明EGFRvA对EGFR小分子抑制剂有更强的抵抗能力(表3和图7)。

表3.EGFRvA对EGFR小分子抑制剂有更强的抵抗能力

实施例11筛选EGFRvA多肽的拮抗剂

按实施例8所述方法，将以下两组物质施用于U87-EGFRvA细胞系，然后观察对细胞迁移的影响：(a)候选物质；(b)空白对照。

如果组(a)的细胞迁移在统计学上显著低于组(b)的细胞迁移，则表明该候选物质是EGFRvA多肽的拮抗剂；如果显著高于组(b)，则表明该候选物质是EGFRvA多肽的激动剂。

类似地，按实施例8所述方法，将以下两组物质施用于MDA-MB-468细胞(表达EGFRvA)，然后观察对细胞侵袭能力的影响：(a)候选物质；(b)空白对照。

如果组(a)的细胞侵袭能力在统计学上显著低于组(b)的细胞侵袭能力，则表明该候选物质是EGFRvA多肽的拮抗剂。如果显著高于组(b)，则表明该候选物质是EGFRvA多肽的激动剂。

实施例12EGFRvA蛋白重组表达和纯化

挑NIH3T3-EGFRvA阳性克隆扩大培养，用pH7.4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次，加入缓冲液A(2％Triton X-100 100mM NaCl，50mM Hepes，1mMEGTA，0.5ug/ml Leupeptin，20uM pmsf pH＝7.4)，溶液冰浴15min，刮下单层细胞，4℃10000g 5min离心，收集上清。上清用0.22mm滤膜过滤后，过CNBr活化的Sepharose 4B抗EGFRvA抗体(1F3-52)亲和层析柱，经缓冲液B(0.5％Triton X-100 100mM NaCl，50mM Hepes，20uM pmsf，1mM EGTA，pH＝7.4)充分洗涤后，加入缓冲液C(0.5％Triton X-100 100mM NaCl，100mM Citrate，20uM pmsf，1mM EGTA，pH＝3.0)洗脱，收集洗脱液，加入1/10体积1M TrisHcl(pH9.6)溶液中和，即得到人EGFRvA蛋白。

实施例13抗EGFRvA蛋白抗体的产生

将实施例12中获得的重组人EGFRvA蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人EGFRvA蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。

实施例14shRNA干扰实验

针对EGFR-WT和EGFR-VA的3′末端特异序列分别设计特异序列：

特异性干扰EGFR-WT的序列：

5′-GCCACAAAGCAGTGAATTTATTCAAGAGATAAATTCACTGCTTTGTGGCTTTTT-3′。(SEQ ID NO：17)

特异性干扰EGFR-VA的序列：

5′-GAGCAGCCAGTCTCCAGTGTCCAATCAAGAGTTGGACACTGGAGACTGGCTGCTTTTT-3′

Mock对照序列(随机引物)：

5′-GTCTCCGAACGTGTCACGTTCAAGAGACGTGACACGTTCGGAGACTTTTT-3′。

所有DNA序列经人工合成，克隆进pLV-THM质粒。克隆成功后的载体与包装质粒psPAX2以及pMD2.G共转293T细胞。收集病毒上清，感染目的细胞。由于pLV-THM带有EGFP基因，因此感染成功的细胞可观察到绿色荧光。干扰结果通过逆转录PCR和Western Blot验证。

实验结果：

如图8所示，以U87MG EGFR-WT和U87MG EGFR-VA作为模式细胞，分别检测shRNA-antiWT和shRNA-antiVA的有效性和特异性。实验结果表明，在模式细胞内，shRNA-antiWT以及shRNA-antiVA均能有效地敲除目的基因，且彼此之间不存在交叉干扰。

如图9所示：对H1299细胞对EGFR-WT和EGFR-VA分别进行基因敲除，结果发现在mRNA表达水平上，shRNA-antiWT以及shRNA-antiVA在敲除靶向基因的同时，也造成了另一种形式EGFR的mRNA水平的显著下调。

如图10所示：为了验证上述结果，对MDA-MB-468细胞也进行了同样的基因敲除，并直接在蛋白水平上通过Western Blot进行检测，最后得到了与H1299细胞类似的结果，即：两种shRNA干扰都能同时造成除靶基因以外的另一形式EGFR的表达下调。鉴于我们已通过模型细胞系的基因敲除实验排除了干扰序列存在脱靶效应的可能性，那么必然存在其他机制造成了H1299和MDA-MB-468细胞内EGFR-WT和EGFR-VA的同步下调。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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序列表

<110>上海市肿瘤研究所

<120>表皮生长因子受体变异体

<130>097196

<160>19

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>3763

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(44)..(3454)

<400>1

gtattgatcg ggagagccgg agcgagctct tcggggagca gcg atg cga ccc tcc 55

Met Arg Pro Ser

1

ggg acg gcc ggg gca gcg ctc ctg gcg ctg ctg gct gcg ctc tgc ccg 103

Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ala Leu Cys Pro

5 10 15 20

gcg agt cgg gct ctg gag gaa aag aaa gtt tgc caa ggc acg agt aac 151

Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn

25 30 35

aag ctc acg cag ttg ggc act ttt gaa gat cat ttt ctc agc ctc cag 199

Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln

40 45 50

agg atg ttc aat aac tgt gag gtg gtc ctt ggg aat ttg gaa att acc 247

Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr

55 60 65

tat gtg cag agg aat tat gat ctt tcc ttc tta aag acc atc cag gag 295

Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu

70 75 80

gtg gct ggt tat gtc ctc att gcc ctc aac aca gtg gag cga att cct 343

Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro

85 90 95 100

ttg gaa aac ctg cag atc atc aga gga aat atg tac tac gaa aat tcc 391

Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser

105 110 115

tat gcc tta gca gtc tta tct aac tat gat gca aat aaa acc gga ctg 439

Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu

120 125 130

aag gag ctg ccc atg aga aat tta cag gaa atc ctg cat ggc gcc gtg 487

Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val

135 140 145

cgg ttc agc aac aac cct gcc ctg tgc aac gtg gag agc atc cag tgg 535

Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp

150 155 160

cgg gac ata gtc agc agt gac ttt ctc agc aac atg tcg atg gac ttc 583

Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe

165 170 175 180

cag aac cac ctg ggc agc tgc caa aag tgt gat cca agc tgt ccc aat 631

Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn

185 190 195

ggg agc tgc tgg ggt gca gga gag gag aac tgc cag aaa ctg acc aaa 679

Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys

200 205 210

atc atc tgt gcc cag cag tgc tcc ggg cgc tgc cgt ggc aag tcc ccc 727

Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro

215 220 225

agt gac tgc tgc cac aac cag tgt gct gca ggc tgc aca ggc ccc cgg 775

Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg

230 235 240

gag agc gac tgc ctg gtc tgc cgc aaa ttc cga gac gaa gcc acg tgc 823

Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys

245 250 255 260

aag gac acc tgc ccc cca ctc atg ctc tac aac ccc acc acg tac cag 871

Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln

265 270 275

atg gat gtg aac ccc gag ggc aaa tac agc ttt ggt gcc acc tgc gtg 919

Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val

280 285 290

aag aag tgt ccc cgt aat tat gtg gtg aca gat cac ggc tcg tgc gtc 967

Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val

295 300 305

cga gcc tgt ggg gcc gac agc tat gag atg gag gaa gac ggc gtc cgc 1015

Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg

310 315 320

aag tgt aag aag tgc gaa ggg cct tgc cgc aaa gtg tgt aac gga ata 1063

Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile

325 330 335 340

ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca ctc tcc ata aat gct acg aat att 1111

Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile

345 350 355

aaa cac ttc aaa aac tgc acc tcc atc agt ggc gat ctc cac atc ctg 1159

Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu

360 365 370

ccg gtg gca ttt agg ggt gac tcc ttc aca cat act cct cct ctg gat 1207

Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp

375 380 385

cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag gaa atc aca ggg ttt 1255

Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe

390 395 400

ttg ctg att cag gct tgg cct gaa aac agg acg gac ctc cat gcc ttt 1303

Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe

405 410 415 420

gag aac cta gaa atc ata cgc ggc agg acc aag caa cat ggt cag ttt 1351

Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe

425 430 435

tct ctt gca gtc gtc agc ctg aac ata aca tcc ttg gga tta cgc tcc 1399

Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser

440 445 450

ctc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att tca gga aac aaa aat 1447

Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn

455 460 465

ttg tgc tat gca aat aca ata aac tgg aaa aaa ctg ttt ggg acc tcc 1495

Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser

470 475 480

ggt cag aaa acc aaa att ata agc aac aga ggt gaa aac agc tgc aag 1543

Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys

485 490 495 500

gcc aca ggc cag gtc tgc cat gcc ttg tgc tcc ccc gag ggc tgc tgg 1591

Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp

505 510 515

ggc ccg gag ccc agg gac tgc gtc tct tgc cgg aat gtc agc cga ggc 1639

Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly

520 525 530

agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag ggt gag cca agg gag 1687

Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu

535 540 545

ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc cac cca gag tgc ctg cct 1735

Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro

550 555 560

cag gcc atg aac atc acc tgc aca gga cgg gga cca gac aac tgt atc 1783

Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile

565 570 575 580

cag tgt gcc cac tac att gac ggc ccc cac tgc gtc aag acc tgc ccg 1831

Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro

585 590 595

gca gga gtc atg gga gaa aac aac acc ctg gtc tgg aag tac gca gac 1879

Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp

600 605 610

gcc ggc cat gtg tgc cac ctg tgc cat cca aac tgc acc tac gga tgc 1927

Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys

615 620 625

act ggg cca ggt ctt gaa ggc tgt cca acg aat ggg cct aag atc ccg 1975

Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro

630 635 640

tcc atc gcc act ggg atg gtg ggg gcc ctc ctc ttg ctg ctg gtg gtg 2023

Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val

645 650 655 660

gcc ctg ggg atc ggc ctc ttc atg cga agg cgc cac atc gtt cgg aag 2071

Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys

665 670 675

cgc acg ctg cgg agg ctg ctg cag gag agg gag ctt gtg gag cct ctt 2119

Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Val Glu Pro Leu

680 685 690

aca ccc agt gga gaa gct ccc aac caa gct ctc ttg agg atc ttg aag 2167

Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu Arg Ile Leu Lys

695 700 705

gaa act gaa ttc aaa aag atc aaa gtg ctg ggc tcc ggt gcg ttc ggc 2215

Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly

710 715 720

acg gtg tat aag gga ctc tgg atc cca gaa ggt gag aaa gtt aaa att 2263

Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile

725 730 735 740

ccc gtc gct atc aag gaa tta aga gaa gca aca tct ccg aaa gcc aac 2311

Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn

745 750 755

aag gaa atc ctc gat gaa gcc tac gtg atg gcc agc gtg gac aac ccc 2359

Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro

760 765 770

cac gtg tgc cgc ctg ctg ggc atc tgc ctc acc tcc acc gtg cag ctc 2407

His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu

775 780 785

atc acg cag ctc atg ccc ttc ggc tgc ctc ctg gac tat gtc cgg gaa 2455

Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu

790 795 800

cac aaa gac aat att ggc tcc cag tac ctg ctc aac tgg tgt gtg cag 2503

His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln

805 810 815 820

atc gca aag ggc atg aac tac ttg gag gac cgt cgc ttg gtg cac cgc 2551

Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His Arg

825 830 835

gac ctg gca gcc agg aac gta ctg gtg aaa aca ccg cag cat gtc aag 2599

Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val Lys

840 845 850

atc aca gat ttt ggg ctg gcc aaa ctg ctg ggt gcg gaa gag aaa gaa 2647

Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu

855 860 865

tac cat gca gaa gga ggc aaa gtg cct atc aag tgg atg gca ttg gaa 2695

Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu

870 875 880

tca att tta cac aga atc tat acc cac cag agt gat gtc tgg agc tac 2743

Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr

885 890 895 900

ggg gtg acc gtt tgg gag ttg atg acc ttt gga tcc aag cca tat gac 2791

Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp

905 910 915

gga atc cct gcc agc gag atc tcc tcc atc ctg gag aaa gga gaa cgc 2839

Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg

920 925 930

ctc cct cag cca ccc ata tgt acc atc gat gtc tac atg atc atg gtc 2887

Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val

935 940 945

aag tgc tgg atg ata gac gca gat agt cgc cca aag ttc cgt gag ttg 2935

Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu

950 955 960

atc atc gaa ttc tcc aaa atg gcc cga gac ccc cag cgc tac ctt gtc 2983

Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val

965 970 975 980

att cag ggg gat gaa aga atg cat ttg cca agt cct aca gac tcc aac 3031

Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser Asn

985 990 995

ttc tac cgt gcc ctg atg gat gaa gaa gac atg gac gac gtg gtg 3076

Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val

1000 1005 1010

gat gcc gac gag tac ctc atc cca cag cag ggc ttc ttc agc agc 3121

Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser

1015 1020 1025

ccc tcc acg tca cgg act ccc ctc ctg agc tct ctg agt gca acc 3166

Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr

1030 1035 1040

agc aac aat tcc acc gtg gct tgc att gat aga aat ggg ctg caa 3211

Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln

1045 1050 1055

agc tgt ccc atc aag gaa gac agc ttc ttg cag cga tac agc tca 3256

Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser

1060 1065 1070

gac ccc aca ggc gcc ttg act gag gac agc ata gac gac acc ttc 3301

Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe

1075 1080 1085

ctc cca gtg cct ggt gag tgg ctt gtc tgg aaa cag tcc tgc tcc 3346

Leu Pro Val Pro Gly Glu Trp Leu Val Trp Lys Gln Ser Cys Ser

1090 1095 1100

tca acc tcc tcg acc cac tca gca gca gcc agt ctc cag tgt cca 3391

Ser Thr Ser Ser Thr His Ser Ala Ala Ala Ser Leu Gln Cys Pro

1105 1110 1115

agc cag gtg ctc cct cca gca tct cca gag ggg gaa aca gtg gca 3436

Ser Gln Val Leu Pro Pro Ala Ser Pro Glu Gly Glu Thr Val Ala

1120 1125 1130

gat ttg cag aca cag tga agggcgtaag gagcagataa acacatgacc 3484

Asp Leu Gln Thr Gln

1135

gagcctgcac aagctctttg ttgtgtctgg ttgtttgctg tacctctgtt gtaagaatga 3544

atctgcaaaa tttctagctt atgaagcaaa tcacggacat acacatctgt atgtgtgagt 3604

gttcatgatg tgtgtacatc tgtgtatgtg tgtgtgtgta tgtgtgtgtt tgtgacagat 3664

ttgatccctg ttctctctgc tggctctatc ttgacctgtg aaacgtatat ttaactaatt 3724

aaatattagt taatattaat aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3763

<210>2

<211>1136

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu

130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu

145 150 155 160

Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg

210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys

225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp

245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His

290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

305 310 315 320

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

325 330 335

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

385 390 395 400

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly

530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu

645 650 655

Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His

660 665 670

Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu

675 680 685

Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu

690 695 700

Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser

705 710 715 720

Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu

725 730 735

Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser

740 745 750

Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser

755 760 765

Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser

770 775 780

Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp

785 790 795 800

Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn

805 810 815

Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg

820 825 830

Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro

835 840 845

Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala

850 855 860

Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp

865 870 875 880

Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp

885 890 895

Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser

900 905 910

Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu

915 920 925

Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr

930 935 940

Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys

945 950 955 960

Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln

965 970 975

Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro

980 985 990

Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp

995 1000 1005

Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe

1010 1015 1020

Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu

1025 1030 1035

Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn

1040 1045 1050

Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg

1055 1060 1065

Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp

1070 1075 1080

Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Gly Glu Trp Leu Val Trp Lys Gln

1085 1090 1095

Ser Cys Ser Ser Thr Ser Ser Thr His Ser Ala Ala Ala Ser Leu

1100 1105 1110

Gln Cys Pro Ser Gln Val Leu Pro Pro Ala Ser Pro Glu Gly Glu

1115 1120 1125

Thr Val Ala Asp Leu Gln Thr Gln

1130 1135

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

tcccctcctg agctctctga g 21

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

tgacttgata cagtaccgat ccgg 24

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

tgtacacaca tcatgaacac tcacaca 27

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

agtgcaacca gcaacaattc ca 22

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

ggaatcaagc atcctctgga agac 24

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

caacagaggt acagcaaaca accag 25

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>9

gtattgatcg ggagagccg 19

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>10

tgacttgata cagtaccgat ccgg 24

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>11

tgtacacaca tcatgaacac tcacaca 27

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>12

atgcgaccct ccgggacg 18

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>13

ggaatcaagc atcctctgga agac 24

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>14

caacagaggt acagcaaaca accag 25

<210>15

<211>22

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>15

Cys Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser

1 5 10 15

Ser Glu Phe Ile Gly Ala

20

<210>16

<211>22

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>16

Cys Pro Ser Gln Val Leu Pro Pro Ala Ser Pro Glu Gly Glu Thr Val

1 5 10 15

Ala Asp Lys Gln Thr Gln

20

<210>17

<211>54

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>17

gccacaaagc agtgaattta ttcaagagat aaattcactg ctttgtggct tttt 54

<210>18

<211>58

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>18

gagcagccag tctccagtgt ccaatcaaga gttggacact ggagactggc tgcttttt 58

<210>19

<211>50

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>19

gtctccgaac gtgtcacgtt caagagacgt gacacgttcg gagacttttt 50

Claims

1.一种分离的人EGFRvA多肽，其特征在于，该多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:2的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组：

(i)SEQ ID NO:1中44-3454位的序列;

(ii)SEQ ID NO:1中1-3763位的序列。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。

7.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出人EGFRvA多肽。

8.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽的拮抗剂以及药学上可接受的载体。

9.一种确定测试化合物是否是EGFRvA多肽的拮抗剂或激动剂的方法，其特征在于，包括步骤：

其中所述的肿瘤细胞来自于哺乳动物，并且表达权利要求1所述的EGFRvA多肽；