CN102127546B - 一种骨骼肌特异性actin启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种骨骼肌特异性启动子及其应用，特别提供了一种骨骼肌特异性表达基因5′调控区特异性启动子及其在转基因猪中的应用，该启动子只在骨骼肌中具有启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子只在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，因此能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为通过转基因技术来提高猪肉的品质提供了一种重要的元件。

Description

一种骨骼肌特异性actin启动子及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种骨骼肌特异性表达基因5′调控区特异性启动子及其在转基因猪中的应用。

背景技术

真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达的调节由转录因子特异性结合于调控区相关元件，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的系列家族基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究模式。在特异高效表达的转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达，必须构建一个可以特异高效表达的动物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。

肌动蛋白(actin)是肌丝的主要成分。在哺乳动物中已经发现的肌动蛋白有6种不同亚型，根据等电点不同可以分为alpha、beta、gamma三类，其中alpha骨骼肌型肌动蛋白(alphaactin)属于收缩蛋白，是骨骼肌细胞舒缩活动的物质基础，也是骨骼肌特有的蛋白，约占骨骼肌总蛋白的12％，猪alpha肌动蛋白基因位于14号染色体上，由7个外显子和6个内含子组成，编码377个氨基酸，通过克隆该基因启动子区并在体外分析其启动特性，利用相关序列构建骨骼肌特异性表达载体是一种有效的方法，但是上述的研究均还处在起步阶段，对于转基因猪的培育和品质提高均没有起到较好的促进作用。

发明内容

基于上述的原因，本发明的发明人经过研究发现猪alpha肌动蛋白基因5′调控区具有骨骼肌特异性启动特性，并利用这一特性设计了一种骨骼肌特异性表达启动子载体，该启动子可以在转基因猪的培育中应用。该启动子载体具有骨骼肌特异性启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该启动子在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为转基因载体提供了一种重要的元件。

本发明所提供的骨骼肌特异性表达基因5′调控区特异性启动子，其基因序列如Seq IDNo：1所示；

除了上述的启动子之外，还可以是该启动子变体或者片段，均具有如Seq ID No：1所示的基因序列。

“变体”是指对猪alpha actin启动子Seq ID No：1序列进行一个或者多个碱基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或者添加所产生的序列，该序列仍然表现出类似于Seq ID No：1 DNA序列的活性。

“片段”是指基本猪alpha actin启动子Seq ID No：1序列的一个或者多个区域，其仍然类似于基本DNA序列的活性。

具有上述序列的启动子或者变体，或者片段，具有骨骼肌特异性启动特性，而在骨骼肌之外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，并能应用于转基因猪的培育中。

应用上述的启动子时，一般采用重组核酸序列，该序列中含有上述的启动子或其变体，或者片段，这样就可以使于启动子下游的目的基因在骨骼肌中特异性表达，作为分析、开发、改造骨骼肌特性的研究模型。还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目的基因的重组核酸，通过显微注射等基因导入技术获得转基因胚胎，用于建立转基因动物。重组核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一种功能基因，主要包括提高肌肉品质基因，加快生长速度基因，抗病基因，提高饲料报酬的基因以及生产特定药物的基因，这样就可以在获得骨骼肌特异性启动特性之外，提高该重组核酸序列的性能，为转基因猪的培养提供更多的功能性方向，增加其附加产值，如将去饱和脂肪酸酶基因在该启动子指导下表达可以特异性提高骨骼肌中不饱和脂肪酸的含量，提高肉品营养价值。

在获得了上述的重组核酸序列之后，还可以用其建立特殊的表达系统，以便更好的应用于转基因猪的培育过程中。将目的基因重组至该启动子下游，通过基因转入技术使调控区与目的基因共同整合进染色体中，获得转基因动物，在该启动子作用下目的基因仅在骨骼肌中表达，在其他组织器官中不表达，降低目的基因对动物的影响，提高转基因的效果。

本发明主要通过报告基因分析确定该启动子的启动特征。首先构建无启动子绿色荧光蛋白载体，为保证报告基因正确翻译，在绿色荧光蛋白基因上游插入内部核糖体进入位点(IRES)。然后通过PCR或者片段捕获等技术获得骨骼肌中特异性表达的alpha肌动蛋白5′调控区，长度为3.7kb，插入内部核糖体位点上游，得到启动子报告基因分析载体，将CMV启动子(589bp)连入空载体中作为阳性对照，空载体为阴性对照。质粒去内毒素后，转染C2C12小鼠成肌细胞系，同时转染猪原代心肌细胞和猪肾上皮细胞系PK15为对照，转染24h后更换含马血清的诱导培养基至成肌细胞，诱导细胞分化融合，48h后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，分析启动子特性。

当上述的启动子，或者重组核酸序列或者表达系统被应用到转基因猪的培育中后，可以有效的提供培育的效果，且通过各种功能性基因的添加，使得转基因猪可以获得更好的肌肉品质，更高的生长速度，更好的抗病性以及降低饲养成本，还可以在特定药物的生产中得到更为广泛的应用，对于该领域的研究有着很好的参考价值。

附图说明

图1为ActinF和ActinR引物PCR扩增alpha actin启动子片段电泳图，泳道1，2为PCR产物；

图2为无启动子CMV Enhancer IRES AcGFP载体图谱；

图3为转染CMV Enhancer alpha actin promoter pIRES-AcGFP 48h小鼠C2C12细胞照片，

左侧为80倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝光激发下照片，可见GFP表达；

图4为转染CMV Enhancer alpha actin promoter pIRES-AcGFP 48h猪心细胞照片，

左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝光激发下照片，无GFP表达；

图5为转染CMV Promoter pIRES-AcGFP 48h猪心细胞照片，

左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝光激发下照片，可见GFP表达；

图6为转染CMV Enhancer alpha actin promoter pIRES-AcGFP 48h猪肾细胞照片，

左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝光激发下照片，无GFP表达；

图7为转染CMV Promoter pIRES-AcGFP 48h猪肾细胞照片，

左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝光激发下照片，可见GFP表达；

具体实施方式

在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1无启动子IRES-AcGFP载体构建

为了避免分析序列中ATG对报告基因翻译的影响，保证下游报告基因GFP的正确表达，特构建无启动子IRES-AcGFP载体，该载体包含一个内部核糖体进入元件，该方法有利于保留转录起始位点下游的调控元件，可以获得更大的调控区分析区间。具体方法为以pIRES-AcGFP为骨架，用Ase I、Nhe I酶切，回收4723bp片段，得到无CMV启动子的片段；PCR扩增CMVEnhancer元件，下游引物加入XbaI酶切位点及保护性碱基，加粗表示。CMV Enhancer Forward基因序列如Seq ID No：2所示，CMV Enhancer Reverse基因序列如Seq ID No：3所示。

按照如下体系配制PCR反应液

2×PrimeSTAR^TM GC Buffer                   10μl

dNTP Mixture(2.5mM each)                   2μl

CMV Enhancer Forward                       0.3μM(final conc.)

CMV Enhancer Reverse                       0.3μM(final conc.)

pIRES-AcGFP质粒DNA                         100ng

PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(2.5U/μl)    0.2μl

H₂O                                        补足至20μl

PCR程序设定如下

将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至1％TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收目的片段，按Axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物，用Ase I(Fermentas)和Xba I(Fermentas)酶切纯化产物，酶切之后琼脂糖切胶回收得到粘性末端的CMV Enhancer，将CMV Enhancer元件与酶切后的载体用Rapid DNA Ligation(Fermentas)连接，克隆转化，获得含CMV Ehancer无启动子的pIRES-AcGFP。将完整的CMV启动子正向连入该载体中，得到该载体的阳性对照载体。将包含阴性对照和阳性对照载体的菌液按照1∶500的比例分别接种至含卡那霉素50μg/ml LB培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(QIAGEN)说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。ActinF和ActinR引物PCR扩增alpha actin启动子片段电泳图如图1。

实施例2启动子报告基因载体的构建

基因组提取：取大约克夏猪耳组织，按照TIANamp genomic DNA(天根)试剂盒说明书进行基因组DNA提取。

跟据NCBI(Gene ID：100154254)设计如下引物，ActinF基因序列如Seq ID No：4所示，ActinR基因序列如Seq ID No：5所示，它包含了从转录起始位点下游832bp到上游2885bp的范围。

按照如下体系配制PCR反应液

2×PrimeSTAR^TM GC Buffer                 10μl

dNTP Mixture(2.5mM each)                 2μl

ActinF                                   0.3μM(final conc.)

ActinR                                   0.3μM(final conc.)

猪基因组DNA                              100ng

PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(2.5U/μl)  0.2μl

H₂O                                      补足至20μl

PCR程序设定如下

将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至0.5％TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收大片段，按Axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物，将纯化产物连入pJET1.2克隆载体(Fermentas)中，克隆转化DH5α，挑取单菌落测序，测序无误后获得alpha actin启动子-pJET1.2质粒，用Bgl Ⅱ(Fermentas)酶切该质粒，琼脂糖切胶回收alphaactin启动子如Seq ID No：1所示。

无启动子的pIRES-AcGFP载体用Bgl Ⅱ(Fermentas)酶切，同时加入FastAP^TMThermosensitive Alkaline Phosphatase(Fermentas)进行去磷酸化处理，将alpha actin启动子用Rapid DNA Ligation(Fermentas)与去磷酸化的载体连接，并转化DH5α，涂板后挑菌验证插入的正反向，将包含正确插入方向的菌液按照1∶500的比例接种至含卡那霉素50μg/ml LB液体培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃ 6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(QIAGEN)说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。得到重组核酸CMV Enhancer alpha actin Promoter pIRES-AcGFP载体，并利用瞬时转染细胞的方法在细胞水平上验证alpha actin启动子的启动特点。

实施例3细胞培养与转染

将出生两日龄二元杂交小猪处死，无菌条件下取出心脏、肾脏至室温的生理盐水中，将心脏在生理盐水中轻轻漂洗后转移至37℃预热的1×PBS(Hyclone)中，冲洗去除血污，撕去心包膜，剪去心房，将心室剪碎成1mm³的小块，加入1×PBS(Hyclone)重悬组织块，静置3min，倒去上清，加入4℃ 0.05％胰酶(Hyclone)，置于4℃冰箱中孵育，3h后上下颠倒1次，6h后倒去胰酶，将组织块置于37℃孵育20min，加入37℃10ml完全培养基DMEM/F12(含20％FBS，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)，用吸管轻轻吹打组织块，直至组织块消失，静置30sec，取上层细胞悬液测定细胞活力并计数，将细胞按1×10⁴个/ml接种至完全培养基中，置于37℃，5％CO₂培养。

将无菌取出的肾脏，在生理盐水中轻轻漂洗后转移至37℃预热的1×PBS中，冲洗去除血污，脂肪，撕去表面筋膜，剪开肾脏，剪去肾盂仅留肾皮质约1g，将其剪碎成1mm³的小块，加入40ml 1×PBS(Hyclone)重悬组织块，静置3min，倒去上清，加入30ml 37℃0.1％胶原酶，上下颠倒10次，置于37℃孵育60min，加入2ml胎牛血清(Gibco)，用吸管轻轻吹打组织块，直至组织块消失，静置1min，取上层细胞悬液测定细胞活力并计数，将细胞按1×10⁴个/ml接种至完全培养基中，置于37℃，5％CO₂培养。

小鼠成肌细胞系C2C12培养在含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Hyclone)培养基中，培养条件为37℃，5％CO₂，保持细胞汇合度在50％，诱导培养基为含2％马血清(Hyclone)的DMEM培养基。

将待转染的细胞用1×PBS(Hyclone)漂洗贴壁细胞两次，加入37℃预热的0.05％胰酶(Hyclone)，消化7min，加入无抗生素的完全培养基重悬细胞，细胞计数后每孔按1×10⁴接种至24孔板，24h后用37℃无血清无抗生素DMEM(Hyclone)培养基洗涤细胞一次，每孔加入500μl新鲜的无抗生素的完全培养基，12h后进行转染，此时细胞汇合度为90％～95％。

将阳性对照载体CMV Promoter pIRES-AcGFP，阴性对照载体无启动子的CMV EnhancerpIRES-AcGFP，实验载体CMV Enhancer alpha actin Promoter pIRES-AcGFP三种质粒同时转染小鼠成肌细胞系C2C12，猪心肌细胞，猪肾细胞，每孔将750ng质粒稀释至100μl opti-MEM中，加入0.75μl Lipofectamine^TM PLUS(Invitrogen)彻底混匀，5min后加入4μl Lipofectamine^TMLTX(Invitrogen)转染试剂颠倒混匀，25℃孵育，30min后轻轻加至每一孔中，混匀。转染12h后更换诱导培养基至C2C12细胞系中，诱导细胞分化融合。转染48h后与荧光倒置显微镜下观察GFP表达情况：阳性对照载载体的转染效率在30％(图5、图7)，阴性对照载体转染后无绿色荧光蛋白表达。转染CMV Enhancer alpha actin Promoter pIRES-AcGFP载体后，只有经过诱导分化的小鼠成肌细胞系C2C12有绿色荧光蛋白表达(图3)，在心肌和肾细胞中均无绿色荧光蛋白表达(图4、图6)。

转染结果表明只有在成熟的肌细胞中猪alpha actin启动子才有启动活性，在另一种横纹肌心肌细胞中并没有启动活性，在肾上皮细胞中也无启动活性，表明猪alpha actin启动子具有骨骼肌特异性启动活性，可以驱动目的基因在骨骼肌特异性表达。

实施例4alpha actin启动子变体功能

根据制造商的说明，利用Stratagene QuikChange^TM定点突变试剂盒(Stratagene)，设计突变引物构建该启动子变体，包括核酸的缺失，取代和插入。变更的启动子通过序列测定验证突变。将突变后的启动子重组至目的基因上游，驱动目的基因的表达。

实施例5串联alpha actin启动子的应用

跟据NCBI(Gene ID：100154254)设计如下引物，上下游引物分别引入Xho I、EcoR I酶切位点及保护碱基。alpha actin2F基因序列如Seq ID No：6所示，alpha actin2R基因序列如Seq IDNo：7所示。

PCR程序设定如下

将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至0.5％TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收3.7kb片段，按Axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物。用XhoI(Fermentas)酶切PCR纯化产物并回收酶切产物。

将alpha actin Promoter pIRES-AcGFP载体用Xho I(Fermentas)酶切，同时加入FastAP^TMThermosensitiveAlkaline Phosphatase(Fermentas)进行去磷酸化处理，将Xho I酶切纯化过的ALPHAACTIN调控区用Rapid DNA Ligation(Fermentas)与去磷酸化的载体连接，并转化DH5α，涂板后挑菌验证插入的正反向，将包含正确插入方向的菌液按照1∶500的比例接种至含卡那霉素50μl g/ml LB液体培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(OIAGEN)说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。得到重组核酸CMV Enhancer double alphaactin Promoter pIRES-AcGFP载体，并利用瞬时转染细胞的方法在细胞水平上验证双alpha actin启动子的启动特点。

实施例6 alpha actin启动子片段应用

跟据NCBI(Gene ID：100154254)设计如下引物，alpha actin3F基因序列如Seq ID No：8所示，alpha actin3R基因序列如Seq ID No：9所示。

按照如下体系配制PCR反应液

2×PrimeSTAR^TM GC Buffer                   10μl

dNTP Mixture(2.5mM each)                   2μl

alpha actin2F                              0.3μM(final conc.)

alpha actin2R                              0.3μM(final conc.)

猪基因组DNA                                100ng

PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(2.5U/μl)    0.2μl

H₂O                                        补足至20μl

PCR程序设定如下

将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至0.5％TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收467bp片段，基因序列如Seq ID No：10所示，按Axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物，将纯化产物连入pJET1.2克隆载体(Fermentas)中，克隆转化DH5α，挑取单菌落测序，测序无误后获得alpha actin启动子片段-pJET1.2质粒，用Bgl Ⅱ(Fermentas)酶切该质粒，琼脂糖切胶回收500bp处片段。

无启动子的pIRES-AcGFP载体用Bgl Ⅱ(Fermentas)酶切，同时加入FastAP^TMThermosensitive Alkaline Phosphatase(Fermentas)进行去磷酸化处理，将alpha actin 5′调控区片段用Rapid DNA Ligation(Fermentas)与去磷酸化的载体连接，并转化DH5α，涂板后挑菌验证插入的正反向，将包含正确插入方向的菌液按照1∶500的比例接种至含卡那霉素50μg/ml LB液体培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(OIAGEN)说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。得到重组核酸CMV Enhancer alpha actin PromoterpIRES-AcGFP载体，并利用瞬时转染细胞的方法在细胞水平上验证alpha actin启动子片段的启动特点。

<110>山东农业大学

<120>一种骨骼肌特异性启动子及其应用

<160>10

<210>1

<211>3717

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

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tcagcagaaa agatcccttg aagatctgtt atgttccaga atacagaagg tgtgggagaa    120

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ggaatttttg agtctggaat gtcgtggggt ctggaagagg ctattcctcc ccggatggaa    3360

cgcccaagcc ccacccacgg catgccttcc cacccgtaca gtttcccagc ccttagggtt    3420

tgccggcctt aacccccttg gggaggccac cgaggtgcag agagggcggg tgccagaggg    3480

aaaggggaag aagagtgtgc cctgggttcc caggtggaga aattctgagg tctcttccca    3540

gcgcagtgcc ctggcagcga agctctgcca ggttgctcgg attgatcccc tggcgggatg    3600

cacgagggct gggggtgtcc ttaggtcccg ggggagggag ggcgctcgga ccagtgaggc    3660

ttcctgcctg acacgctgcg catctccacg gccttgctga tcttgcagaa acccgac       3717

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggataaccgt attaccgcca tgc                                            23

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gctctagaca aaacaaactc ccattg                                         26

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gggatgatag ataatagttg ccagtgaagc c                                   31

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ccctcgaggg atgatagata atagttgcca gtgaagcc                            38

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ggaattcgtc gggtttctgc aagatcagca ag                                  32

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

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<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gggagggaag cgaggcttct ct                                             22

<210>10

<211>467

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gaagtaggga tacagtgtgg cggcaccttc cagaggcccc gggcgcaggg tagaccgggg    60

cggggcggcc cgcggacagg tgcagcccca ggcgcaggcg cactcgcgcc tcccggcgca    120

ggcggtgaac ctcgccccac cccagcccct ccggggggca gctgggccgg gtcgggaggg    180

gcccaccagc ccgggagaca ctccatatac ggccaggccc gctttacctg ggctccggcc    240

aggccgctcc ttctttggtc agcacagggg acccgggcgg gggcccaggc cgctaacccg    300

ccgggggagg gggctccagt gcccaacacc caaatatggc tcgagaaggg gagcgacatt    360

ccagtgaggc ggctcggggg gagaacccgc gggctatata aaacctgagc gtggggacca    420

gcggccaccg cagcggacag cgccgagaga agcctcgctt ccctccc                  467

Claims (1)

1.一种骨骼肌特异性启动子，其特征在于：该启动子的基因序列如Seq ID No：1所示。

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