CN102099458A - 用于高通量试验的三维组织 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过进行使用三维生物人工组织的试验检测生物人工组织对试剂的响应的方法。所述方法适用于高通量平台。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年6月5日提交的美国临时专利申请No.61/059,126的优先权的权益，在此作为参考引用其全部内容。
关于联邦资助研究的声明
本发明在由NIH/NCCAM授予的R41基金号AT003984的政府支持下进行。美国政府对本发明具有一定权利。
背景技术
对在正常发育过程中以及在疾病状态下的活细胞中的各种生物分子的表征的需要促进了细胞基试验的发展。如今高通量细胞基试验形成了生物医学研究的基础。这些试验不仅用于基础研究，如细胞组分和方法的发现，也用于应用研究，如药物开发。例如，已开发细胞基试验用于监测细胞活动和功能，如细胞生存能力、细胞增殖、基因表达和细胞内信号和细胞间信号。这种试验可用于高通量(HTP)筛选应用。然而，许多细胞基试验不适于高通量筛选，因为检测灵敏度或信号强度过低。此外，高通量细胞基试验通常在单层细胞上进行，这些试验不能充分描述组织内的细胞行为。需要增加的灵敏度和增加的信号强度，使得细胞基试验可适用于高通量应用。
发明内容
本文提供了使用三维组织模型的高通量细胞试验体系以及进行这种试验的方法。所述试验可用于监测组织对使用各种试剂和应激源的处理的响应。三维组织在置于多孔板中的一个孔内的支架上形成。组织悬浮于孔底部以上。试验在悬浮的组织上进行，试验的输出(output)在孔中测量。
在一个方面，本文提供了检测组织对试剂的响应的方法。所述方法包括使生物人工组织与试剂接触，使用生物人工组织进行产生指示剂的试验，以及检测孔中的指示剂水平。指示剂水平表示生物人工组织对试剂的响应。在试验中所用的生物人工组织包含细胞和细胞外基质，并在支架支撑上形成而不使用促进组织粘合的持着器(fastener)。所述支架支撑位于孔底部以上。
试验输出可为比色或荧光产物，产物的积聚可使用板阅读器测量。可使用本发明的体系进行的示例性的试验包括但不限于细胞增殖试验、细胞死亡试验、细胞凋亡试验、蛋白质表达试验、基因表达试验、酶试验、信号试验(如激酶活性试验、Ca2+信号试验和GPCR信号试验)、评估线粒体活性的试验，以及细胞外基质降解试验。
附图说明
本发明可参照结合附图的具体实施方案的详细描述而得以更好的理解。
图1a显示了一个高通量体系，其说明了图1b所示的三角形和矩形(可选择的形状)支架的使用，所述支架由直径为约1毫米的不锈钢丝制成，并提供了形成重组三维组织的支撑。
图2显示了支架的几种视图。图2a为支架的俯视图。图2b为支架的侧视图。图2c为为了易于在高通量应用中使用将几个支架彼此连接的一种方式的侧视图。
图3为显示典型设计的三维组织的照片。
图4为表示三维组织与细胞单层之间的区别的图示。该图演示了可通过使用三维组织代替细胞单层而实现的增加的细胞基试验信号强度。
图5(A)为The PalpatorTM的照片。该体系包括等长力(isometric force)传感器(a)、探针浴(b)和在温度调节器板(d)上的水凝胶组织构建物(HTC)台(c)。图5(B)为显示将带有连接的探针的力传感器置于HTCs上并降低探针至用于力测量的组织之上的x-y-z移动机械臂的照片。图5(C)为带有连接的力传感器和探针的机械臂的示意图。图5(D)为置于HCT的中平面以上1毫米处的探针(a)，然后降低直至该探针首先接触(b)，然后拉伸(c)组织的照片。图5(E)为显示在HTC压入过程中记录的代表性力的图。箭头a、b和c显示与在(D)中所示的探针位置相关的力测量。图5(f和g)为显示依赖于Rho激酶抑制剂1(RKI1)、细胞松弛素D(CD)、鱼藤酮(ROT)和2，4-二硝基苯酚(DNP)的剂量而减小的HTC收缩力的图。将HTCs预处理，然后用所示四种药物的不同浓度进行处理。在3小时(f)和24小时(g)时测量力。力测量相对于对照介质处理的HTCs(Fc)进行表示。数据显示主要是4次重复，几个2和3次重复的平均值和SEM；Z-因子＞0.44(#)和0.59(*)。图5(h)为显示细胞松弛素D处理减少的细胞F肌动蛋白的图。将用药物处理24小时的HTCs固定并用Alexa 568共轭毒伞素标记。荧光强度在板阅读器上读取并相对于对照介质处理的HTCs(Ic)作图。数据显示3次重复的平均值和SEM；通过Student的t-测试相比对照物(Ctrl)，@p＜0.02。图5(i-w)为显示用介质(i，n，s)、CD(j，o，t)、RKI1(k，p，u)、DNP(l，q，v)和ROT(m，r，w)处理的REF单层的显微图片。在3小时(i-m)和24小时(n-r，s-w)后处理时，将代表性的单层固定，并用Alexa 568共轭毒伞素和DAPI染色。在3小时之时(j)，CD引起大量肌动蛋白解聚。RKI1、DNP和ROT限于无影响。CD和ROT引发的细胞毒性由细胞收缩(g，i和j)、双核形成(l)和核分裂(o)而得以证实。请注意在(g)和(l)中的更大的比例。图像在Leica SP5共焦显微镜上使用浸水63x物镜，比例尺＝50微米截取。
图6(a)为显示DNP的解偶联效应使用板阅读器在细胞单层中不可计量的图。平均值和SEM显示，n＝11。图6(b)为显示相同的效应在HTCs中可计量的图。平均值和SEM显示，n＝4。图6(c)为显示在用DNP处理的REF单层中的显微镜定量的TMRE信号的代表性图线的图。图6(d)为显示在用DNP处理的HTC底细胞层中的显微镜定量的TMRE信号的代表性图线的图。相比于来自HTCs的细胞层的结果(c)，TMRE信号的降低量级更高。图6(e和f)为显示DNP剂量依赖的解偶联HTC线粒体电位的图。预载TMRE(100nM，30分钟)的HTCs用不同浓度的CD、RKI1、DNP和ROT进行处理。在3(a)和24(b)小时后处理时使用板阅读器测量TMRE荧光信号。信号强度相对于对照的介质处理的HTCs(Ic)表示。显示了4次(几种为2或3次)重复的平均值和SEM；Z-因子＞0.64(#)和0.46(*)。
图7(a)为显示CD和ROT表现出剂量依赖的细胞毒性的图。药物处理的HTCs的生存能力在24小时时通过MTT试验测定。甲臜(formazan)(由活细胞中的MTT转化)的吸光度在板阅读器上读取，并相对于对照的介质处理的HTCs(Ac)表示。10％DMSO处理用作该试验的阳性对照(positive control)，其得到0.11±9×10-3的A/Ac(在图中未显示)；对于对照相比10％DMSO分析，Z-因子＞0.85。数据显示主要4次(几种为2和3次)重复的平均值和SEM。图7(b)为HTC筛选的工作流程图。持续时间表示加工每一板(plate)HTCs所需的时间量。合成HTCs，并在使用之前使其收缩48小时。修色的(Shaded)平形四边形指示数据点获取。对于原位指示器，例如TMRE而言，重复测量是可能的。终点试验法，例如MTT，需要牺牲HTCs，并在实验结束时进行。图7(c-f)为显示用于筛选化合物的表型图线(profiles)的图。每个化合物在24小时时的生理学数据，即组织力(tissue force)(Force)、线粒体电位(Mit.Pot.)和MTT转化率(MTT Conv.)归一化至最大效应(通过四个化合物之一)，然后用线性或四参数逻辑函数(直线)进行拟合。由1减少至0的图线表示化合物对特定的生理学具有最大负效应。表型图线通过证实RKI1为最佳候选化合物(因为RKI1有效降低了组织力(由1至0)，并同时表现出最小解偶联活性(线粒体毒性)和MTT转化率(细胞毒性)的降低)而简化了化合物选择过程。
具体实施方式
由于由比色指示剂或荧光指示剂产生的低信号强度，许多可得的细胞基高通量筛选试验的有用性是有限的。这种试验通常使用在单层或悬浮体培养基中的细胞，而不是存在于组织中的细胞。此外，单层和悬浮细胞不必然与组织的三维环境中的体内细胞表现类似。本文呈现的试验和组织使得这些高通量试验能够在更接近类似于体内环境(setting)的组织基体系中进行。此外，由于相比于在相同区域中的细胞单层，更多数目的细胞存在于三维组织中，在三维组织上进行的试验的输出所产生的信号得以放大。
本发明改进了使用光检测系统(如分光光度测量和荧光板阅读器)的试验测量细胞生理学的效率。这是使用组织(如工程化或生物人工组织)的生理曲线体系的另一特征。如美国专利No.7,449,306中所在先描述，工程化组织(生物人工组织)可以小型形式，包括96孔板形式得以构造。例如，在工程化组织(3D组织类器官)中的细胞生长可加载荧光探针，该荧光探针用于报告细胞内和/或细胞外活性的生理学。荧光探针通过改变其强度或移动其发射光谱而报告生理状态。
本文提供了检测组织对试剂的响应的方法。所述方法包括使生物人工组织与试剂接触，在生物人工组织上进行产生指示剂的试验，以及检测孔中的指示剂水平。指示剂水平表示生物人工组织对试剂的响应。在试验中所用的生物人工组织包含细胞和细胞外基质，并在支架支撑上形成而不使用促进组织粘合的持着器。试验可适用于高通量筛选方法。
可经由本领域技术人员可得到的任何方式使生物人工组织与试剂接触。例如，可将试剂加入含有生物人工组织的孔中，或者可在形成生物人工组织之前将试剂提供至细胞。可选择地，可利用载体(如病毒载体或脂质体)，或经由受体介导靶向而使试剂与细胞接触。
生物人工组织模型可用于定量和快速地评估许多不同类的试剂的效应，所述试剂包括但不限于药物或潜在的药物、毒素、化学物质、核酸、肽、多肽和包括病原体或载体的微生物。例如，可用作活化剂的试剂包括但不限于胎牛血清(FBS)、溶血磷脂酸(LPA)；凝血酶、包括表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)的生长因子，血管紧张素-II，内皮素-1，加压素及其组合。抑制剂包括但不限于结合细胞表面受体的抑制剂(包括血管紧张素II受体的受体拮抗剂)以及在细胞内作用的抑制剂。本文可用的抑制剂包括但不限于抑制信号传导通道的那些，包括染料木素、除莠霉素和在细胞骨架上作用的试剂。抑制剂也包括但不限于细胞松弛素D、拉春库林B、帕克利托科(paclitoxol)、诺考达唑、花萼海绵诱癌素A、丁烷二酮一肟(BDM)及其组合。
提供至生物人工组织的试剂的含量为有效引起来自组织模型或经由组织模型的响应的含量。有效含量通常在约1nM至100mM，合适地100nM至1mM，更合适的500nM至500μM之间。
在用试剂处理之后，可在生物人工组织上进行试验。设计用以产生如比色指示剂、荧光指示剂或放射性指示剂的指示剂的任何试验可适用于本发明的3D生物人工组织。包括但不限于细胞增殖试验、细胞死亡试验、凋亡试验、蛋白质表达试验、基因表达试验、酶试验、信号试验(如激酶活性试验、Ca2+信号试验和GPCR信号试验)、评估线粒体活性的试验和细胞外基质降解试验的试验可用于本文所述的方法中。开发用于细胞单层，特别是依赖于细胞摄取的试剂或试验试剂的那些的试验需要较长的培养时间以使得试剂和试验试剂由生物人工组织内的细胞吸收。试验试剂浓度也需要调节。
最后，检测由试验产生的指示剂水平。产生的指示剂水平是指由试验进行所产生的试验输出或信号。所述水平可与产生的指示剂含量或指示剂本身的变化(例如发射光谱的改变，或由细胞摄取的标记指示剂的改变)相关。指示剂水平表示生物人工组织对试剂的响应。指示剂水平的检测可利用显微镜、光学或荧光板阅读器或闪烁器，这取决于所选的指示剂和试验。由显微镜检测的信号灵敏度高于板阅读器检测的信号灵敏度。显微镜聚焦于细胞层以极有效地收集光信号(检测体积集中且小)。板阅读器使用散射(未聚焦)光束(例如未聚焦激光)以检测在由光束照明的大体积中的分子。在常规细胞培养体系中，板阅读器测量来自单个细胞层的光信号。然而，在工程化组织中的细胞形成至少5-10层，因此板阅读器可立刻测量大量细胞，从而得到被放大至少5-10倍的由板阅读器检测的光信号。参见图4。板阅读器可快得多地读取信号，因为它们不需要聚焦于单个细胞，因此板阅读器的使用适于高通量应用。由显微镜拍摄的图像的分析也比使用板阅读器拍摄的那些更耗时。
用于测量细胞生理学的常规细胞基试验常常使用图像分析。图像通常由自动化显微镜捕获并由图像分析软件进行分析。治疗和测量治疗效果的试验必须通过收集来自数百个细胞的数据而进行评估。自单个细胞获得的数据的统计方差过高而不能预测任何治疗的平均效果。为了获得统计上显著的数据，必须收集来自至少数百个细胞的数据。
板阅读器可用于获得相同的信息(例如Ca浓度)，但信号比由自动化显微镜获得的信号弱得多。该问题的一个解决办法是增加由板阅读器测量的细胞数目。细胞形成工程化3D组织中的多层，因此板阅读器可测量在相同区域中更多的细胞。
对于分析活细胞的动力学性质，板阅读器优于显微镜。使用本文所公开的组织构建物的测量的改进信号和高统计上的显著性将使得许多小规模试验可应用于细胞基高含量分析。由于增大的灵敏度，目前通常使用显微镜，但本文所述的方法使得板阅读器可用于细胞基高含量分析。
现在参照图1a和1b，其中显示了支架20，该支架合适地包括框架22，例如三角形框架。重组组织26在支架20上形成。在此说明性的具体实施方案中，孔42向底部略微逐渐变细，并且是96孔板40的孔。支架20牢固地位于每个孔42的底部以上，合适地为约1毫米以上。将含有所述的细胞和适当的细胞培养介质的胶原的非聚合溶液倾入孔中，将孔填充至孔底部以上3毫米的水平(图1a)。96孔板40可在37℃下用5％ CO2培养。在培养过程中，细胞自组装为生物人工组织26，并通过挤出液体而压缩胶原基体，由此总体积减少了约10倍。无支架20时，重组或生物人工组织收缩为漂浮于组织培养介质中的小球。
支架20合适地由任何无孔生物可相容的材料，如金属、非金属或塑料制成。在实施例中，支架由不锈钢制成。本领域技术人员将理解包括但不限于玻璃、聚丙烯或聚苯乙烯的其他材料也可合适地用于制备支架。
框架22合适地支撑于孔42的底部43以上。可通过使用具有锥形孔的组织培养板40由孔侧支撑框架22。可选择地，可通过使用具有连接至孔侧的内置支架或具有带壁架(框架22搁在该壁架上)的孔的特别设计的板40而将框架22支撑于孔42的底部以上。在另一可选择的具体实施方案中，支架20可包括至少一个连接至框架22的支柱24以将框架支撑于孔底部以上。支撑框架所需的支柱24的数目取决于框架的形状而变化。图1b显示了具有4个支柱的支架20，但可如图2所示将支架设计为具有更少或更多个支柱。支柱24可通过从框架向下伸出并接触孔42的底部而用于支撑框架22，或者支柱24可从框架22向上伸出并通过将支架固定至孔42的顶部45而支撑支架20的框架。例如，支柱24可在末端具有小钩结构，其使得支架20能够悬挂于孔的顶部(图2(b))。尽管支架20的框架22合适地支撑于孔42的底部以上，只要组织可浸入介质中，则精确的距离并不关键。合适地，框架22在孔底部以上至少约0.25毫米，更合适地，框架在孔底部以上至少约0.5或1.0毫米。
支架20可采用多种形状。使用不同的支架形状，如环状或矩形(如图2所示)可将含胶原基体压缩至不同的形状。其他支架形状，如图1b和图2中所示的那些，产生具有不同宽度和形状的组织条。可使用任何形状的支架20，包括但不限于环状、矩形、三角形、五边形、六边形或其他更高阶多边形。支架也可由超过一个元件形成。例如，支架22可由两个分隔的平行元件形成，其具有或不具有一个或多个连接所述平行元件的垂直元件(图1b和图2)。
根据本发明的具体实施方案，细胞自组装形成与支架，即支撑(例如线框)的形状相符合的组织模型。在形成中，组织覆盖支架的元件并跨越元件之间的间距。例如，在三角形支架上，细胞形成跨越在三个边之间的膜，如图1a所示。在实施例中的支架由截面直径为约1毫米的元件制成，但支架可适当地具有更小或更大的截面直径。合适地，支架由一个或多个截面直径在约100微米至约2毫米之间的元件制成。支架通常由圆柱状或管状元件组成，其使得组织围绕元件形成，从而使得组织覆盖元件。组成支架的元件合适地为稍微圆形以将施用力时组织的撕裂最小化。例如，若边为圆形的，可使用具有矩形截面的元件使得在施用力时组织不会被撕裂。所述元件合适地由无孔材料制成，并具有约2毫米以下，合适地约1毫米以下的截面直径。
生物人工组织形成跨越组成支架的元件之间或横过元件的水平截面空间的膜结构。生物人工组织跨越的水平截面空间合适地大于10微米，但也可为孔42所允许的那样大，合适地，组织跨越约100微米至约5毫米之间，更合适地1毫米至4毫米之间的空间。如图3所示的典型的生物人工组织为大约4x4x0.8毫米，并在8毫米x 8毫米方形盒(chamber)中形成。(调节盒的形状以观察样品。组织用甲醛(10％)固定并用橙色染料染色以清楚观察)。
图3显示包括支架20的原型多孔板40。在所示具体实施方案中，使用桌面CNC碾磨机(Sherline Products Inc.，Vista，CA)自聚碳酸酯棒(25 x 60 x 10毫米)机器加工8孔板。8 x 8毫米的8个方形孔42含有制造框架22(1毫米直径)的2个不锈钢棒。不锈钢棒的中心位于孔底部以上2毫米，并距孔侧2毫米，使得2个棒分隔4毫米。使用硅胶(Dow Chemical Co.，Midland，MI)，使用显微镜盖玻片(1号厚度，Fisherbrand)密封每个孔底部以促进显微镜成像。
为了便于在高通量体系中使用多孔板形式，可将支架20通过连接体28一起连接成组，且包括但不限于如图2C所示的2、4、8、12或96个支架。通过将支架20一起连接成组，支架可易于定位于多孔板40中。可将连接体28制备为易于分离，例如，使得快速牵引动作将打破连接并允许使用者自定义所用的支架数目。本领域技术人员也可使本文所述的支架和生物人工组织体系适用于任何多孔板，包括但不限于6孔、8孔、12孔、24孔、48孔、192孔或384孔板。
由如下实施例可以看出，不需要多孔支撑材料或如Velcro持着器的其他持着器以促进组织甚至粘附至所用线框的无孔不锈钢表面。胶原在膜的外部或组织条上被较大程度地压缩，并使得组织悬浮于支架上而无需持着器。因此，该膜的外部可承受由细胞产生的应力，并防止生物人工组织从线框上撕裂。
如图4所示，根据本发明的数个具体实施方案的生物人工组织提供了比现有细胞基试验的细胞单层更类似于体内环境的三维组织。增加的细胞数目导致特定测试试验的增加的信号输出。因此本发明提供了一种机理，通过该机理，所有方式的细胞基试验可在高通量体系中成功产生。此外，不同于其他三维组织，本文的组织并非在筛网或框架(其随后会干扰光学测量)上生长。相反，组织跨越框架，有可能进行光学测量。
本发明的体系不仅使用更少量的试剂(由于用于测试所需组织的小尺寸)，而且使得组织分析能够保持在组织培养条件中，包括在整个试验程序中保持恒定的温度和无菌条件。例如，试验可在层流通风橱中进行以避免生物人工组织的污染。此外，组织内的细胞是稳定的，使得试验可在数小时、数天或甚至数周过程中在同一组生物人工组织上重复数次。
多孔板40可为包括用于保持生物人工组织的支架20的特定设计的板，或者合适地为可加入支架的通常市售的组织培养多孔板。每个板的孔数目可变化。通常使用具有2至1000个孔的板，合适地使用具有50至500个孔的板。
用于形成生物人工组织的细胞可包括但不限于肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞和心脏细胞。生物人工组织可包含细胞和胶原或者细胞和细胞外基质。可用于形成生物人工组织的胶原包括胶原1-4类，其包括所有的I-XIII型及其组合。各种类型的细胞外基质也可用于形成生物人工组织，如水凝胶或Matrigel
在根据本发明的数个具体实施方案的重组组织模型中的细胞在类似于它们在天然组织和器官中的条件的环境中。因此，使用该方法的试验结果产生类似于使用动物模型获得的那些结果的结果。预期一些动物测试可由本发明的组织模型代替。例如，作用于皮肤的试剂的一些测试可使用人工活组织进行。
实施例
方法
由直径为1毫米的不锈钢线制成的三角形框架用作支架，重组组织在其上形成。孔向底部略微逐渐变细，框架牢固地定位于孔底部以上1毫米处(图1a)。将含有细胞和适当的细胞培养介质的胶原的非聚合溶液倾入孔中，将孔填充至底部以上3毫米的水平(图1b和3)。图3中的8孔板可在37℃下用5％ CO2培养。在培养过程中，细胞通过从多孔胶原基体挤出液体而压缩胶原基体。在无线框下，重组组织收缩为漂浮于组织培养介质中的小球。发现通过使用不同形状的线框，胶原基体被压缩为对应于框架形状的形状。说明性地，三角形线框制得跨越在三条边之间的膜，如图1a所示。其他线框形状，如图1b所示的一种，生成具有不同宽度的组织条。无需如Velcro持着器的多孔支撑材料以促进组织甚至粘合至线的无孔不锈钢表面。胶原在膜或条的外部更大程度地被压缩。因此，该膜的外部可承受由细胞产生的应力，并防止其从线框上撕裂膜。
细胞培养和HTC形成
在补加有10％胎牛血清(FBS，S11050，Atlanta Biologicals，Lawrenceville，GA)的Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM，MT10013CM，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)中培养大鼠胚胎纤维母细胞(REF-52)。每2至3天将细胞进行再次培养(subcultured)。为了制备水凝胶组织构建物(HTCs)，通过用0.05％胰蛋白酶(MT-25-025-Cl，Fisher Scientific)处理10至15分钟而将REF-52细胞(40至70传代(passages))自培养板解离。然后在1000g下离心细胞10分钟。倒出胰蛋白酶溶液，将细胞小球再悬浮于10％ FBS DMEM介质中。将该细胞悬浮体稀释至HTC组织溶液中以获得8×105细胞/毫升的最终浓度。所述HTC组织溶液由10％ FBS DMEM、1毫克/毫升的在0.02N乙酸中的类型1胶原(354249，BD Biosciences，San Jose，CA)、充足的用以中和胶原中的酸的氢氧化钠，和充足的用以补偿胶原和NaOH的体积的5×DMEM组成。为了防止过早的胶原聚合，将HTC组织溶液保持于冰上直至其分布至发明人的定制组织模具中(图3)。每个模具含有8个分开的具有两个内置水平支撑棒的HTC-形成孔。将300毫升的HTC组织溶液等分至在这些模具中的每个孔中，然后在37℃和5％ CO2下培养30分钟。在培养阶段之后，将350毫升10％ FBS DMEM介质加入每个孔中，模具进一步培养48小时。在此时间中，溶液收缩，从而形成跨越孔中的支撑棒的HTCs。
HTC力测量
使用PalpatorTM(如美国专利No.7,449,306中所述，其以全文引用方式并入本文)定量HTCs的收缩性。将模具置于PalpatorTM的台上，其将探针自动插入每个孔中，并拉伸单独的HTC。将探针连接至力传感器，该力传感器测量在HTC中引起的对拉伸响应的阻力，并将数值输出至计算机以记录。使用常规Matlab算法处理并分析力数据以报导数值参数，该数值参数指示在HTC中的活细胞力。为了获得HTC收缩力的稳定测量，必要的是通过在实际力测量之前通过拉伸三次以预处理HTCs。若随后的力测量在先前拉伸的30分钟之内，则无需预处理。在24小时后处理之时的HTCs总是在力测量之前进行预处理。
HTC TMRE标记和MTT试验
使用四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)的乙酯(TMRE，T-669，Invitrogen，Carlsbad，CA)定量HTCs的线粒体电位。HTCs在100nM TMRE中培养30分钟，然后在不含酚红的10％ FBS DMEM中培养60分钟。使用不含酚红的介质以避免干扰TMRE荧光读取。在标记之后，在背景力测量之前以三次拉伸预处理HTCs。然后在Synergy HT板阅读器(Biotek Instruments，Winooski，VT)上读取HTC TMRE信号。使用定制固定板(adapter plate)将组织模具定位于板阅读器的板固定架上。使用543/590激发/发射过滤设定和50的增益设定从底部读取荧光信号。在药物处理之后在预定的时间点时在每次力测量之后也读取TMRE荧光强度。
使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT，M-6494，Invitrogen)定量HTCs中的细胞活力。在药物暴露之后，在预定时间将MTT加入每个孔中以获得0.5毫克/毫升。将MTT留在孔中2小时，然后去除。然后将在细胞内形成的甲臜染料悬浮于含有0.1N盐酸的500微升异丙醇(S77795，Fisher Scientific)中。然后将200毫升甲臜溶液置入96孔板孔中，并在Synergy HT板阅读器上读取。记录在570和650纳米处的吸光度，差异(A570-A650)用作甲臜的吸光度强度。
HTC药物处理
除非另外指出，所有的化学品均来自Sigma(Sigma-Alrich，St.Louis，MO)。将细胞松弛素D(CD，C8273)、鱼藤酮(ROT，R8875)、2，4-二硝基苯酚(DNP，D198501)，和Rho激酶抑制剂1(RKI1，555550，Calbiochem，Gibbstown，NJ)悬浮于二甲亚砜(DMSO，D4540)中以进行储存。CD、ROT和RKI1的储液为1mM，将其连续稀释至在不含酚红、FBS、葡萄糖或丙酮酸盐(-F/P/G)的DMEM中100、10和1μM。将DNP稀释至在DMSO中1M，然后稀释至在-F/G/P DMEM中100、10和1mM。在HTC预处理和背景力(即前药)测量之后，将50微升适当的药物稀释液加入每个孔中以获得所需的处理浓度。将50微升-F/G/P DMEM加入对照孔中。当加入药物时，通过移液四次混合孔中的介质。
REF-52细胞处理和固定
将REF-52细胞置于35毫米培养皿(50,000个细胞)的10％ FBS介质(2毫升)中。将细胞培养过夜，然后用化合物进行处理。将浓缩CD、RKI1、DNP和ROT溶解于-F/G/P介质中，然后在每个细胞板(每2毫升介质220微升)中稀释10×。在固定之前，细胞用药物培养24小时。为了固定，经处理的细胞用2毫升磷酸盐缓冲盐水(PBS，D5652)润洗一次，然后在1毫升4％的多聚甲醛(Sigma)溶液(在PBS中)培养30分钟。经固定的细胞润洗两次，然后在2毫升PBS中储存。
REF-52标记和成像
通过在1毫升0.1％ Triton(BP151，Fisher Scientific)溶液(在PBS中)中培养15分钟渗透经固定的REF-52细胞。经渗透的细胞用1毫升TBST缓冲液润洗两次，然后用在TBST中的1毫升5％山羊血清封闭1小时。然后将在具有2％山羊血清的TBST中的1毫升1∶200稀释的Alexa 568共轭毒伞素(A12380，Invitrogen)加入细胞。该染色溶液也含有400nM的DAPI(D9564)。将细胞染色30分钟，然后用TBST润洗两次。将标记的细胞安装在Vectashield(Vector Laboratories，Burlingame，CA)上，用盖玻片覆盖然后用指甲油密封。然后将板倒扣在Leica SP5共焦显微镜(Leica Microsystems，Bannockburn，IL)上，并用63×水浸泡物镜成像。使用543激光线激发Alexa 568，并使用MaiTai多光子激光激发DAPI。
统计分析
使用Student的t测试对CD处理的HTCs和对照HTCs中的荧光信号的降低进行测试(图1h)。使用Z因子评估Palpator(图1f和1g)、TMRE(图2a和2b)和MTT(图3a)试验的信噪比。在MTT试验中，使用10％ DMSO作为阳性对照。
结果
为了测量细胞力学以进行化合物筛选，发明人开发了制造小型化的水凝胶组织构建物(HTCs)和高通量筛选体系PalpatorTM(图5a、5b、5c)的技术以定量组织的力学性质。3D HTCs提供了更天然的微环境，且细胞可更好地模拟体内形态和生理学。此外，可使用力探针拉伸自支撑HTCs以测量细胞力学(图6d)。使用该体系，HTCs的力学性质可定量测得(图6e)而无需细胞标记、复杂的显微镜学或图像分析。
在该研究中，将具有已知靶向和生物效应的四种不同类型的化合物加入HTCs并测定它们对HTC力学的剂量依赖效应。用ρ激酶抑制剂(RKI)、H-1152和细胞松弛素D(CD)处理HTC 3和24小时，其干扰肌动蛋白聚合，剂量依赖地降低组织力(两者EC50≈0.1μM，图5f，3小时)。二硝基苯酚(DNP)、线粒体膜电位(MMP)的解偶联也降低组织力，但在比H-1152或CD～10,000倍更高的浓度下。广泛使用的对哺乳动物细胞具有公知毒性效应的杀虫剂鱼藤酮(ROT)也降低组织力。由于其在水性介质中的低溶解度(～100μM)，发明人不能进一步增加ROT浓度。通常所有化合物的24小时培养会增加它们对力降低的效应(图5g)。特别地，通过另外～20小时的培养，DNP的EC50由1.3mM下降至20μM。然而，最高浓度的DNP、CD和H-1152在24小时时不会进一步降低组织力，这表明这些剂量在3小时内达到最大效应。这些结果说明每个化合物对于降低组织力是有效的。
组织力在整个细胞骨架(特别是肌动蛋白和肌球蛋白)的整体得以保持。为了定量在用所述化合物处理的HTCs中的F(细丝状)-肌动蛋白的含量，用Alexa 546共轭毒伞素染色HTCs。Alexa-毒伞素的强度通过板阅读器测量，在用CD(2μM)处理的HTCs中的F-肌动蛋白含量显著降低(图5h)。这与发明人的先前报道，即CD介导的组织力降低是由于完整F肌动蛋白的损失相一致。然而，通过H1152和DNP力降低与F-肌动蛋白的损失无关。在这些HTCs中的Alexa-毒伞素标记可相比于对照物。F-肌动蛋白也通过ROT处理而得以降低，然而，由于不充足的统计显著性，该结果是非决定性的。用2μM CD处理的毒伞素-染色的细胞的显微镜分析显示早在3小时时F-肌动蛋白大量破裂(图5j)。在24小时时，短F-肌动蛋白被再分布于较不铺展(图5o)的细胞和双核(图5t)细胞内。
RKI、DNP和ROT不显著影响F-肌动蛋白形貌(图5k-m)。RKI处理的细胞不显示有限的膜皱褶和降低的在细胞的中心区域中的毒伞素染色(图5c)。用DNP(图5q)和ROT(图5r)处理24小时的细胞的融合度低于对照物的融合度(图5n)。在ROT处理的细胞中的显著核碎裂表明凋亡的引发(图5w)。这些形貌变化可人工地在这些图像中确认，而自动化定量HTP分析将需要复杂的分析算法。
为了进一步确定化合物降低组织力的基础(underling)机理，使用生物染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE)定量线粒体电位的变化。TMRE为阳离子型，并作为MMP的函数而积聚在线粒体中。在96孔板中的DNP处理的单层和HTCs的最初研究显示在板阅读器上在单层中无法检测到DNP介导的TMRE标记的降低(图6a)，但在HTCs中易于量化(图6b)。使用共焦显微学对DNP对TMRE积聚的影响的更详细研究改进了在单层和HTCs两者中的信号检测(图6c，d)。然而，HTC实验仍然显示比细胞单层实验更优越的在检测通过DNP的剂量依赖MMP降低上的灵敏度。考虑到信号检测的优越灵敏度、改进的数据信噪比和板阅读器扫描对HTP应用的兼容性，发明人使用HTCs用于研究化合物对MMP的效应。
DNP处理3小时解偶联MMP并剂量依赖地降低TMRE信号(图6e)，且EC50～340μM。培养另外21小时仅略微增大DNP的效应并将EC50进一步降低至～95μM(图6f)。该通过24小时处理将TMRE EC50降低3.6倍显著小于DNP的EC50的65倍降低对组织力的影响(图5f，g)。该差异表明DNP的快速MMP解偶联导致细胞收缩活性的逐渐降低。由于肌动蛋白聚合和肌球蛋白依赖的细胞收缩需要ATP，预期MMP的快速损失将降低线粒体中ATP的生成，并因此降低细胞收缩性。该细胞力的时间延迟降低表明细胞内ATP储备的存在和/或细胞上调糖酵解以生成ATP的能力。经由糖酵解上调ATP生成已经在肿瘤细胞和一些细胞系中报导。CD、RKI和ROT处理降低了线粒体膜电位，但它们降低MMP的程度局限于10-20％(图6e，f)。
最后，为了测量化合物对细胞生存能力的效应，进行使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)的试验。在细胞中，通过琥珀酸脱氢酶将黄色MTT转化为紫色甲臜，该变化可通过在500-600纳米之间的吸光度定量，所述吸光度使用板阅读器定量记录。处理3小时不会导致生存能力的显著损失，如MTT试验所测得(结果未显示)。CD和ROT处理24小时显示HTCs的生存能力的剂量依赖降低(图7a)。0.2和2μM CD处理将MTT信号降低40％。CD毒性的观察水平类似于报导的人类表皮样细胞系中的5-30μM的LD50。需要更高的ROT浓度，10μM以将MTT信号降低40％(图7a)。该ROT毒性水平略高于先前报道的在HepG2细胞中的25％毒性。RKI和DNP处理24小时不影响MTT信号。
HTC力测量、TMRE定量和MMT试验在相同的HTC样品上进行。完整筛选工作流程图(图7b)显示了使用HTCs获得高含量生理学信息的效率。结果总结为表示化合物的生理学影响的表型图线板(图7c-f)。DNP、CD和RKI对于降低HTC力都非常有效。然而，DNP显示线粒体电位的大量解偶联效应(图7c)，而CD是高度毒性的(图7d)。在另一方面，ROT对HTC力、线粒体电位和生存能力具有中等负影响(图7f)。RKI确定为最佳候选化合物，其具有0.1μM的力降低EC50和有限的线粒体和生存能力毒性。该结果并不令人惊讶，因为公知RKIs为可有效降低组织刚度的心脏保护的非毒性化合物。此外，最近RKI药物Fasudil已完成用于动脉粥样硬化和高胆固醇血症的第II阶段临床研究。
总之，发明人已说明HTCs可如何用于筛选可降低组织收缩力并仍然对线粒体功能和细胞生存能力具有最小影响的化合物。使用该HTC基筛选体系，发明人能够研究细胞生理学并在比二维培养更天然的微环境(即埋入三维基体结构)中定量机械力。
此外，在HTCs中细胞的紧密和多层排列大大增加了荧光试验的检测极限和信噪比。具有0.44至0.85的Z因子的所述试验的高准确度和稳健性(robustness)将有利于HTCs引入现有的HTP筛选工作流程。
总之，发明人提供了使用三维组织模型用于进行细胞基试验的高通量体系。认为前述描述仅为本发明原理的说明。此外，由于本领域技术人员易于想到许多改变和变化，其不旨在将本发明限制为所显示和描述的精确的结构和操作，因此，认为所有的改变和等同形式落入本发明的范围内。
Claims (15)
1.一种检测组织对试剂的响应的方法，该方法包括：
(a)使生物人工组织与试剂接触，所述生物人工组织包含细胞和细胞外基质，该生物人工组织在支架支撑上形成而不使用促进组织粘合的持着器，所述支架支撑位于孔底部以上，
(b)使用所述生物人工组织进行试验，其中所述试验产生指示剂；以及
(c)检测孔中的指示剂水平，其中该指示剂水平表示生物人工组织对试剂的响应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自肌细胞、非肌细胞、内皮细胞或心脏细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述孔位于多孔板内。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多孔板包含2至10,000个孔。
5.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述支架支撑为线框。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述线为不锈钢线。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述细胞包括已知的参与疾病的细胞。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述指示剂为比色指示剂或荧光指示剂。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述指示剂水平使用显微镜进行检测。
10.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述指示剂为放射性标记。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述指示剂水平使用闪烁器进行检测。
12.根据权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述指示剂水平使用多孔板阅读器进行检测。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述试验选自细胞增殖试验、细胞死亡试验、凋亡试验、蛋白质表达试验、基因表达试验、酶试验或细胞信号试验。
14.根据权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述试剂为候选药物。
15.根据权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述方法为高通量筛选方法。
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