CN102071163A

CN102071163A - 一株降解毒死蜱的多功能工程菌株及其构建方法

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Publication number: CN102071163A
Application number: CN 201010561807
Authority: CN
Inventors: 张新建; 李红梅; 李纪顺; 黄玉杰; 任艳; 魏艳丽; 扈进冬; 杨合同
Original assignee: BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Priority date: 2010-11-29
Filing date: 2010-11-29
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2030-11-29
Also published as: CN102071163B

Abstract

本发明为一株降解毒死蜱的多功能工程菌株及其构建方法，涉及伯克氏菌多功能工程菌株(Burkholderia vietnamiensis)P418-M，该菌种保藏号为CGMCC No.4166。伯克氏菌多功能工程菌株的构建方法是利用越南伯克氏菌，通过Tn5转座，将来自不动杆菌的有机磷降解酶基因通过自杀性质粒整合到越南伯克氏菌的染色体上，使多功能微生物在具有解磷、解钾、固氮，促进植物生长和根际定殖能力的基础上，增加降解农药残留的功能，实现伯克氏菌的多重功能。

Description

一株降解毒死蜱的多功能工程菌株及其构建方法

技术领域

本发明属于化学农药生物降解技术领域，涉及一株对有机磷农药毒死蜱具高效降解能力，同时具有固氮、解磷、解钾和生防功能的多功能工程菌株及其构建方法。

背景技术

毒死蜱(chlorpyrifos)，又称乐斯本、氯吡硫磷等，化学名称为O，O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，1965年由美国陶氏化学公司开发研制，具高效、广谱、高效等特性，广泛用于大田作物、果蔬、花卉及家庭害虫的防治。

我国自2007年1月1日全面禁止高毒有机磷农药后，毒死蜱作为低毒、高效的有机磷农药替代品迅速占据主导地位。毒死蜱的频繁大量使用不仅造成农产品残留超标，严重影响出口创汇和国民经济的发展；而且对水体及土壤生态环境造成严重的污染，尤其是对土壤的污染，不仅影响土壤肥力，且对土壤微生物种群、微生物多样性、固氮菌活性、土壤酶活性等影响极大。因此，毒死蜱污染土壤的治理问题越来越受到人们的关注。

在过去的研究工作中，各国学者已分离到了多种不同来源的毒死蜱降解菌。但这些降解菌株的筛选只是从毒死蜱降解一个方面获得，对土壤病虫害的防治考虑较少，大多不具有促生作用，农民不易接受。同时，与两种原始菌株同时发酵生产相比较，重组多功能工程菌株在生产工艺环节可大大降低成本、减少污染；而且，重组多功能工程菌株在制剂使用时，可避免2种或多种菌剂同时使用所产生的可能相互抑制作用。因此利用基因工程手段构建多功能工程菌株，开发既具有降解农药残留，同时又具备防治植物病害和促进农作物生长的菌剂，用于农药污染土壤的修复，具有较高的社会和生态效益。

越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)P418分离自白俄罗斯明斯克市的大麦根际土壤中，经研究该菌株具有根际定殖能力，解磷、解钾、固氮及促进植物生长作用，是一株多功能生防菌株，对植物根结线虫也具有一定的防治效果。通过基因导入，使该生防菌同时具备了降解有机磷农药毒死蜱的功能，为该工程菌株的制剂研究及开发打下了良好的基础。

发明内容

本发明的目的是针对我国农药污染的实际问题和需求，提供一株毒死蜱污染土壤修复的越南伯克霍尔德氏菌多功能工程菌株(Burkholderia vietnamiensis)P418-M及其构建方法。

本发明所提供的降解毒死蜱的越南伯克霍尔德氏菌多功能工程菌株(Burkholderia vietnamiensis)P418-M，已于2010年9月13日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院生物研究所，保藏编号：CGMCC No.4166。

本发明利用的原始菌株是一株越南伯克霍尔德氏菌P418，具有解磷、解钾、固氮、防土传病害和根际定殖能力。本发明利用基因工程手段，通过Tn5转座，将来自不动杆菌的有机磷降解酶基因通过自杀性质粒整合到P418的染色体上，使其在具有解磷、解钾、固氮、防病和根际定殖能力的基础上，增加降解农药残留的功能，实现伯克氏菌的多重功能。

本发明所述的降毒死蜱多功能工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

1)重组质粒pUT-M的构建

根据有机磷降解酶基因序列设计引物mf和mr(引入Not I酶切位点及SD序列)，利用PCR技术扩增有机磷降解酶基因，Not I分别酶切有机磷降解酶基因和质粒pUT-Km1，再将酶切后的基因和质粒pUT-Km1连接，转入大肠杆菌S17-1(λ-pir)，得到重组质粒pUT-M；

2)转化越南伯克氏菌P418

含重组质粒的大肠杆菌S17-1，与越南伯克氏菌P418混合进行转化，经抗性平板筛选，得到68个单菌株；

3)筛选

通过PCR扩增、电泳、Southern杂交及对毒死蜱的降解能力检测，对步骤2)中的68个单菌株进行筛选，最终获得1个对毒死蜱降解活性最高的单菌株，即为降毒死蜱的越南伯克霍尔德氏菌多功能工程菌(Burkholderia vietnamiensis)P418-M。

上述的降毒死蜱多功能工程菌的筛选主要采用以下三个步骤进行：

(1)PCR扩增和电泳

利用mf和mr通过PCR扩增和电泳技术对步骤2)中的68个单菌株进行筛选，有26个单菌株扩增出目的条带；

(2)Southern杂交

对上述步骤(1)得到的26个单菌株在同等条件下分别进行Southern杂交，所用探针为有机磷降解酶基因全长序列。经检测有20个单菌株的有机磷降解酶基因是单拷贝插入到P418染色体中，保留这20个单菌株备用。

(3)突变菌株对有机磷农药降解能力的检测

通过降解能力检测对上述步骤(2)中的20个菌株进行进一步筛选。相同条件下接种到含有机磷农药的无机盐培养基平板上，通过透明圈筛选，参见图4，其中7个菌株产生透明圈；再将这7个菌株分别接到含有机磷农药的液体无机盐培养基中，培养48小时，利用HPLC检测各菌株对有机磷农药的降解率，得到1株降解率最高的菌株，即为本发明的目标产物-降毒死蜱的越南伯克霍尔德氏菌多功能工程菌株(Burkholderiavietnamiensis)P418-M。

上述步骤1)的引物mf和mr序列如下：

mf：5’-GATCGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGCCCCTGAAGAAC-3’

mr：5’-GATAGCGGCCGCCTTGGGGTTGACGACCG-3’

本发明降毒死蜱多功能工程菌株的生物学特性研究：

(1)多功能工程菌P418-M与原始菌株P418的生长曲线研究，参见图5

(2)对得到的多功能工程菌P418-M进行解磷、解钾和固氮能力的检测，参见表2。

(3)越南伯克氏菌P418及降毒死蜱多功能工程菌P418-M在小麦根部的定殖能力检测，参见图6。

(4)越南伯克氏菌P418及降毒死蜱多功能工程菌P418-M对土传病原菌的抑制能力检测，参见表3。

(5)对多功能工程菌P418-M和原始有机磷降解菌株N16进行土壤中毒死蜱降解能力的检测，参见表4

本发明降毒死蜱多功能工程菌P418-M的应用：

本发明降毒死蜱多功能工程菌株P418-M可用于土壤有机磷农药毒死蜱残留的生物降解；同时还可用于常见植物病害的防治及促生，如立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，植物根结线虫等。因此，该多功能工程菌株可作为主要有效成分用于微生物肥料的制备。

本发明的优点是：针对目前化学农药尤其是有机磷农药带来严重的环境污染等问题，应用基因工程手段，通过Tn5转座，将有机磷降解酶编码基因整合到越南伯克氏菌P418染色体上，使多功能微生物在具有防病、解磷、解钾、固氮，促进植物生长和根际定殖能力的基础上，增加其降农残功能，实现降农残、防病和促生等多重功能。在平板拮抗实验中，工程菌株与原始菌株越南伯克氏菌P418相比，其抑菌能力没有受到影响；降解能力检测，构建的工程菌5天对室内模拟污染土壤的降解率达82％。工程菌P418-M与原始菌P418的生长曲线相近，利用原始菌株的培养基对工程菌进行发酵后，以草炭土为载体制成粉剂，该制剂对小区模拟污染土壤的降解率7天达到70％左右。

本发明将来自不动杆菌的有机磷降解酶基因通过自杀性质粒整合到越南伯克氏菌P418的染色体DNA上，获得了稳定高效的降毒死蜱多功能工程菌P418-M。以原始菌株的培养基发酵后制成的粉剂，对毒死蜱污染土壤有很好的修复效果。附图说明

图1是重组质粒pUT-M的酶切图谱，其中泳道1为1kb的标准DNA分子量Marker，泳道23为阳性质粒酶切结果。

图2是工程菌株的PCR电泳图谱，其中泳道1为1kb的标准DNA分子量Marker，其它为部分工程菌株的PCR结果。

图3是Southern杂交照片，以有机磷降解酶基因序列全长作为DNA探针，对步骤3)中的第(1)步得到的26个单菌落进行Southern杂交。经检测这26个单菌株中有20个单菌株的有机磷降解酶基因是单拷贝插入到越南伯克氏菌P418的染色体中，图3是部分单菌株的Southern杂交照片。

图4是毒死蜱平板照片，对步骤3)中的第(2)步得到的20个单菌株接种到含有机磷的无机盐平板上，通过透明圈筛选菌株，图中7个单菌株能正常生长并产生透明圈，具有有机磷降解酶活性。

图5是工程菌株P418-M与原始菌株P418生长曲线。

图6是降毒死蜱多功能工程菌株P418-M与原始菌株P418在小麦根尖的定殖数量，其中，A图是灭菌土中多功能工程菌株P418-M与原始菌株P418在小麦根尖的定殖数量关系图；B图是自然土中二者在小麦根尖的定殖数量关系图。

图7是工程菌制剂对大田模拟污染土壤的降解能力，其中，左图中毒死蜱按推荐剂量(0.5kg.a.i.ha^-1)，右图中毒死蜱为加倍剂量(1kg.a.i.ha^-1)。具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：降毒死蜱多功能工程菌株的构建

1)重组质粒pUT-M的构建

根据有机磷降解酶基因设计引物：

mf：5’GATCGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGCCCCTGAAGAAC-3’

mr：5’-GATAGCGGCCGCCTTGGGGTTGACGACCG-3’

在该基因两端引入Not I酶切位点及SD序列，以pGM-T-M为模板，进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30min，55℃退火50min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

利用Not I单酶切有机磷降解酶基因和质粒pUT-Km1，进行连接，转化入E.coli S17-1(λ-pir)，转化子利用上述引物进行PCR检测，反应条件同上。

通过PCR检测得到的阳性克隆，提取质粒，利用Not I进一步进行酶切鉴定，参见图1，阳性克隆即为重组质粒pUT-M

2)转化

将重组质粒pUT-M转化到E.coli S17-1(λ-pir)感受态细胞中，用其作为供体菌，以菌株P418作受体菌，二者混合，使有机磷降解酶基因整合到原始菌P418染色体上。即将过夜培养的供体菌悬液、受体菌悬液以1∶1(体积比)于1.5ml离心管中混合，收集菌体，无菌水冲洗一次，再次收集菌体悬浮于200μl的无菌水中，将菌液点接于P418菌平板上，28℃培养6-8h后，用无菌水收集菌体，稀释后涂于含Kan的P418平板上，28℃培养48h，得到68个单菌株。挑取部分单菌落涂片镜检，转化后的菌株菌体很小，呈小短杆状，与原始菌株形态一致。

3)降毒死蜱多功能工程菌P418M的筛选

主要采用以下三个步骤进行降农残多功能工程菌株的筛选：

(1)PCR扩增和电泳技术

利用mf和mr通过PCR扩增和电泳技术对步骤2)中的68个单菌株进行突变子筛选，PCR反应条件参见实施例1中的PCR反应条件。经PCR扩增和电泳技术检测得到26个单菌株，结果见图2。

(2)Southern杂交

通过Southern杂交对(1)中的26个单菌种进行验证，方法参照分子克隆试验指南(第三版)。以有机磷降解酶基因序列全长作为探针，用DIG HIGH PRIME LABELING MIX(Roche)标示DNA探针。经检测实施例1中3)中第(1)步得到的26个单菌株中有20个单菌株的有机磷降解酶基因是单拷贝插入到P418的染色体中，结果见图3。

(3)有机磷降解能力检测

将步骤3)中的(2)Southern杂交后获得的20个单菌株同时接种到含有机磷(毒死蜱)的无机盐平板上，28℃培养3-5天后，通过透明圈检测筛选到7个单菌株具有有机磷降解酶活性，参见图4。将这7个单菌株接种到无机盐液体培养基中(含毒死蜱100mg·L^-1)，摇床培养48h后，利用高效液相色谱(HPLC)检测各菌株对有机磷(毒死蜱) 的降解能力。

由表1可以看出编号为43的工程菌株降解活性较高，为70％，将其确定为目的产物-降毒死蜱多功能工程菌株(Burkholderia vietnamiensis)P418-M。

表1：经无机盐平板检测后7个单菌株的降解活性检测

Figure 665016DEST_PATH_GSB00000452829800061

实施例2：降毒死蜱多功能工程菌株P418-M的生物学特性

(1)多功能工程菌株P418-M与原始菌株P418的生长曲线测定

2个菌株的生长速度测定在P418液体培养基中检测。结果显示(图5)，工程菌株染色体上插入了外源基因，但其生长曲线与原始菌株P418相比，没有有明显的差异，表明外源基因的导入只是增加了原始菌株的功能，对其生长没有影响。这说明原始菌株的培养基条件能够完全用于工程菌株的培养。

(2)降毒死蜱多功能工程菌株P418-M与原始菌株P418的解磷、解钾、固氮能力比较

分别利用以下方法对多功能工程菌株P418-M和原始菌株P418进行有关固氮、解磷、解钾能力的测定。

固氮活性测定(全氮比色法)

在250mL三角瓶中加入50mL阿须贝氏(Ashby)液体培养基，121℃灭菌30min。无菌操作，每瓶接入2mL斜面冲洗的菌悬液，同时做不接菌的空白对照，均于30℃、160r/min培养5d后，取出测氮。

吸取固氮菌液1.0mL于30mL消化管中，加3mL硫酸，加0.1g催化剂和5滴双氧水消煮至清亮，若反应液久煮不清，可冷却后加1-2滴双氧水，继续煮至无色透明，取下冷却。加少许蒸馏水，摇匀，滴加氢氧化钠(400g/L)至出现氢氧化铜沉淀(约11-12mL)，加20滴酒石酸钾钠，以去除氢氧化物沉淀掩蔽钙镁，将试管液全部转移至100mL容量瓶中，消化管洗涤液一并倒入容量瓶，稀释至刻度，摇匀。过滤，滤液10.00mL于比色管中，加1.0mL氢氧化钠，1.0mL酒石酸钾钠，3.0mL奈氏试剂，摇匀，显色2-3min后，即倒入比色杯中，于420nm处比色计测定。

解磷活性测定

将活化好的待测菌株28℃培养48h，菌体浓度达10⁸cfu/ml后备用。设接菌、接灭活菌、接培养基(对照)3个处理，每个处理3个重复。按5％接种量分别将上述种子液接种在50ml发酵培养基中，28℃培养10d。121℃灭活40min后加6％H₂O₂ 2滴于三角瓶中，60℃水浴48h以使微生物量磷释放出来。发酵液用无磷滤纸过滤至澄清，定容，用钼锑抗比色法测滤液有效磷含量。

解钾活性测定

每250ml三角瓶中加钾长石0.1g和缺K培养基50ml，在121℃灭菌20min，然后接入菌悬液3ml，对照接等量灭活菌液和不加菌液，28℃振荡培养5天，取发酵液用60g/L的稀H₂O₂消煮、过滤、定容、四苯硼钠比浊法测K。

表2多功能菌株与原始菌株的解磷、解钾活性测定

结果如表2所示，重组多功能工程菌与原始菌株P418相比，其解磷、解钾及固氮活性没有明显差异，说明有机磷降解酶基因的导入没有影响到工程菌株的原有解磷、解钾及固氮功能。

(3)伯克氏菌P418与降毒死蜱多功能工程菌株P418-M在小麦根部的定殖

小麦种子用70％乙醇消毒后28～30℃催芽，种子露白后用2×10⁸cfu/ml利福平标记的越南伯克氏菌P418与利福平和卡那霉素标记的伯克氏菌多功能工程菌菌液浸种，分别播种在灭菌土和自然土中。21天后取根尖(根尖以上2cm)，加入灭菌水，混匀后梯度稀释。涂板统计菌落数。

结果如图6所示，不管在灭菌土中还是在自然土中，多功能工程菌株与原始菌株P418相比，定殖能力相当。说明外源基因的插入没有影响到原有菌株的定殖能力。

(4)伯克氏菌P418与多功能工程菌株P418-M的抑菌活性测定

采用平板对峙法，用无菌打孔器分别将平板培养的立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)病原真菌打成直径为5mm的菌片，接入PDA平板的中央；距病原菌菌苔2cm的圆周上点接伯克氏菌P418与降毒死蜱多功能工程菌株P418-M，28℃培养5～7天后记录抑菌带的宽度。

从表3中可以看出，工程菌株和原始菌株P418都对禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)的抑制率最高，工程菌株与原始菌株P418相比，对病原菌的拮抗能力没有明显差异，说明原始菌株P418插入外源基因后没有丧失抑菌能力。

表3多功能工程菌株与原始菌株P418对病原菌的拮抗能力比较

Figure 754511DEST_PATH_GSB00000452829800081

注：CK为未接生防菌处的病原菌扩展半径；表中数据为三次重复的平均值。

(5)降毒死蜱多功能工程菌株P418-M与实验室已有降毒死蜱菌株N16对室内模拟毒死蜱污染土壤的降解能力检测。

取大田土壤(pH 6.7)，自然风干后过20目筛，灭菌，称50g到250ml三角瓶中，加入毒死蜱乙醇溶液，混合均匀使终浓度为50mg·kg^-1干土，吸附24h后作为模拟的毒死蜱污染土壤。试验设不接菌对照组和接菌处理组，处理组分别加入多功能工程菌株P418-M和已有降毒死蜱菌株N16的菌液，使土壤中菌浓度为10⁸CFU·g^-1干土，调整各组土壤水含量为土壤最大持水量的50％，暗处培养。接种5天后取样，测定土壤中毒死蜱的含量。

由表4可以看出，工程菌株P418-M对土壤中有机磷(毒死蜱)的降解率比N16还稍高，可能是工程菌株在土壤中的定殖能力强于N16，能更好的发挥作用。

表4多功能工程菌株与已有降解菌株N16对毒死蜱污染土壤降解能力的比较

Figure 953412DEST_PATH_GSB00000452829800082

注：表中各数据为三次重复的平均值

降解率(％)＝(对照中毒死蜱含量-样品中毒死蜱含量)/对照毒死蜱含量×100％

(6)多功能工程菌株制剂制备及对大田模拟污染土壤的降解能力

以原始菌株的培养基摇瓶发酵36h后，将发酵原液(含菌量在每克90亿以上)调节pH值至7.0-7.3，按10％的比例添加到无菌草炭土中，同时加入黄原胶(1.0％)、黄腐酸钠(0.1％)、SDS(2.5％)，充分混匀，密封包装。

小区模拟污染土壤降解能力的检测在无植被的菜地进行，试验设如下5个处理：1)对照；2)毒死蜱推荐剂量；3)毒死蜱推荐剂量+降解菌剂；4)毒死蜱加倍剂量；5)毒死蜱加倍剂量+降解菌剂。每个处理设3个小区，每个小区面积为5m²。毒死蜱分别按推荐剂量(0.5kg.a.i.ha^-1)、加倍剂量(1kg.a.i.ha^-1)兑水进行喷雾。

上述处理后24h后，将降解菌制剂(有效菌数为30×10⁸cfu·g^-1)按15Kg·ha^-1的剂量兑水喷洒，同时向对照和毒死蜱单独处理的小区中喷洒同样剂量的灭菌水。喷洒降解菌剂后0d，1d，7d，14d，21d取土样，过20目筛后取10克检测毒死蜱残留量。

由图7可以看出，多功能降解菌剂对毒死蜱推荐剂量的降解率高于加倍剂量处理的降解率，但加倍剂量处理的绝对去除率高。于室内相比，虽然大田条件下降解菌剂对土壤中毒死蜱的降解速率慢一些，但与未接种土壤相比，降解菌剂的加入能快速有效地降解土壤中的毒死蜱残留，这对农药土攘污染的修复来说具有重要的意义。

Claims

1.一株降解毒死蜱的越南伯克霍尔德氏菌多功能工程菌株(Burkholderia vietnamiensis)P418-M，已于2010年09月13日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号：CGMCC No.4166。

2.如权利要求1所述降解毒死蜱的越南伯克霍尔德氏菌多功能工程菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)重组质粒pUT-M的构建

根据有机磷降解酶基因序列设计引物mf和mr(引入NotI酶切位点)，利用PCR技术扩增有机磷降解酶基因，NotI分别酶切有机磷降解酶基因和质粒pUT-Km1，再将酶切后的基因和质粒pUT-Km1连接，转入大肠杆菌S17-1(λ-pir)，得到重组质粒pUT-M；

(2)转化

含重组质粒的大肠杆菌S17-1，与越南伯克霍尔德氏菌P418混合进行转化，经抗性平板筛选，得到68个单菌株；

(3)筛选

通过PCR扩增、电泳、、Southern杂交及对毒死蜱的降解能力检测步骤(2)中的68个单菌株，筛选获得1个对毒死蜱降解活性最高的单菌株，即为降解毒死蜱的越南伯克霍尔德氏菌多功能工程菌(Burkholderia vietnamiensis)P418-M。

3.权利要求1所述的降解毒死蜱的多功能工程菌株的用途，其特征在于既能用于毒死蜱污染土壤的修复治理，又能防治植物病原菌，还具有解磷、解钾、固氮促生作用，。

4.如权利要求3所述的降解毒死蜱的多功能工程菌株的用途，其特征在于所述植物病原菌是立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，禾谷丝核菌(Rhizoc tonia cerealis)。

5.权利要求3所述的降解毒死蜱的多功能工程菌株的用途，其特征在于用于微生物肥料的制备。