CN102060929A

CN102060929A - T细胞免疫平衡肽

Info

Publication number: CN102060929A
Application number: CN2010101961328A
Authority: CN
Inventors: 夏书奇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-06-07
Filing date: 2010-06-07
Publication date: 2011-05-18
Also published as: WO2011153763A1; US20110301101A1

Abstract

本发明涉及一种多肽混合物，它可以不必考虑病人的遗传背景，干扰MHC-病原肽-TCR的形成，包括干扰病原肽与MHC的结合以及pMHC与特异性TCR的结合，抑制特异性T细胞免疫反应发生时的免疫突触形成，抑制免疫突触中MHC-特异性免疫反应介导病原肽-TCR的数量和密度，抑制免疫突触中强烈的活化信号的传递，对正在发生的剧烈的T细胞所介导的特异性免疫反应进行负向调节，降低特异性免疫细胞的活化、增值、效应能力，使过激的T细胞特异性免疫反应变得更平和而持久，用于严重的流感、SARS、手足口病、病毒性肺炎、细菌感染和严重的自身免疫病等伴随有过度T细胞特异性免疫反应发生的疾病的治疗。

Description

T细胞免疫平衡肽

技术领域

本发明涉及一种负向调节大分子蛋白、病毒、细菌等所引起的T细胞介导的特异性免疫反应，特别是过度剧烈的T细胞特异性免疫反应的多肽混合物，它能使T细胞特异性免疫反应更加温和而持久地进行。

背景技术

用于超敏反应、自身免疫病、移植排斥、炎症等免疫功能亢进性疾病的治疗的药物包括：①非特异性免疫抑制剂：如化学制剂(烷化剂和抗代谢药)、激素、真菌代谢产物(环孢素A和FK-506)及一些中药成分。此类制剂大多具有明显的毒副作用，可导致机体免疫功能下降，增加感染机会，长期应用还可能诱发肿瘤，主要用于器官移植排斥反应。②淋巴细胞及其表面分子的抗体：能用于抗移植物排斥反应、自身免疫病等疾病的治疗。如CD3单抗治疗急性心、肝、肾移植排斥的治疗；抗CD4单抗治疗RA等自身免疫疾病。

但近年来发生的病毒感染，如传染性非典型肺炎，全称严重急性呼吸综合症(SevereAcute Respiratory Syndromes)，简称SARS，是一种因感染SARS相关冠状病毒而导致的以发热、干咳、胸闷为主要症状，严重者出现快速进展的呼吸系统衰竭，是一种新的呼吸道传染病，传染性极强、病情进展快速。该疾病一般有一两周的潜伏期，而后快速进展。病毒感染的清除，最终都要激发有效的特异性T细胞免疫反应，而SARS引起的特异性免疫反应(包括Th1相关的细胞免疫和Th2相关的体液免疫)过度激烈，导致了大量的糖皮质激素的广泛使用，糖皮质激素对固有免疫和适应性免疫都有广泛的抑制作用，对控制病毒的感染起负面作用，另外可继发的支原体、衣原体、肺炎球菌等其他微生物的感染，加重病人肺脏损伤。该病除了导致多例病人死亡外，治愈者也留下了严重后的遗症，肺部功能严重受损，并出现股骨头坏死。SARS感染肺、肾和消化道上皮细胞，但是未见慢性感染报道。儿童感染通常预后较好，而青壮年感染反而症状严重，与其免疫高反应性有关。

如何开发一种免疫抑制作用更有特异性、更温和、更安全的药物，面对以后可能再次发生的烈性感染病，具有很强的现实意义。

发明内容

在人体面临异常的异源性蛋白、病毒、细菌入侵时，机体往往能激发自我保护的免疫反应，清除这些外来物，但某些时候，机体会作出过度反应，导致疾病症状加重，甚至致残致死的情况。某些特殊的自身抗原，也能导致机体作出过度的免疫反应，导致自身免疫病的发生。

在这些情况出现的时候，最好能在机体免疫反应过度剧烈发生时，给予某种程度的负向调节。为了克服当前免疫抑制剂的作用过于强烈和广泛的情况，根据最近十多年的免疫学进展，本发明提供一种作用于特异性T细胞免疫反应的负向调节剂。

一、T细胞特异性免疫反应

T细胞不能识别完整的天然抗原分子，需要抗原提呈细胞(APC)先将抗原降解为抗原肽段，然后与抗原提呈分子(MHC)结合后迁移至APC细胞膜表面时才能被识别。T细胞识别的抗原主要由经典的MHCⅠ类和Ⅱ类分子提呈。由MHC分子、抗原肽和TCR分子形成的复合体简称为TCR-pMHC三元体，其中pMHC是“肽-MHC”的简化形式。TCR-pMHC三元体是T-APC相互作用中能够体现T细胞抗原识别特异性的最重要的分子结构群。Ⅰ类分子提呈的抗原肽和Ⅱ类分子提呈的抗原片段不仅结构上不同，而且两种分子的近膜端结构域所结合的辅助受体也不同，分别为CD8和CD4分子，由此造就了下列不同的抗原提呈格局：Ⅰ类分子提呈内源性抗原供CD8CTL识别；Ⅱ类分子提呈外源性抗原供CD4Th细胞识别。Ⅰ类分子的结合槽两端封闭，接纳8～10肽，肽段N端和C端埋在槽的两端。Ⅱ类分子的抗原结合槽开放，能容纳13～25肽的长链。

TCR-pMHC中的三个组成成分皆显示高度变异性。

首先，抗原的数量极大，进入MHC抗原结合槽中的抗原肽，不仅可以来自不同的抗原分子，而且可以是同一抗原分子上的不同肽段，其多样性之大难以估算。

第二，MHC的变异性来自两个方面：多基因性和多态性。仅以提呈抗原的经典HLA分子而言，不仅有Ⅰ类和Ⅱ类之别，Ⅰ类中又分成HLA-A、HLA-B、HLA-C不同座位的产物，各自构成结构不同的抗原提呈分子。而且，HLA的多态性极为丰富，即经典的Ⅰ类和Ⅱ类分子有大量的等位基因。

第三，TCR分子的多样性更是以十万到百万计。

T细胞识别抗原的过程中，受体TCR和配体pMHC之间的密切结合，而构成配体分子pMHC的两种成分即抗原肽和MHC分子之间，也发生相互作用。抗原肽一般含有2个或2个以上与某个特定MHC分子结合的部位，成为锚着点，位于该部位上的氨基酸称为锚着残基。这些锚着残基插入MHC分子抗原结合槽的小袋中，通过氢键与MHC分子相结合。抗原肽中间部位一般均有一定程度的隆起，可作为T细胞表位供TCR识别。某一抗原肽与某一特定MHCⅡ类分子的结合是抗原肽与结合槽氨基酸残基之间相互吸引和排斥的结果。

抗原肽和MHC分子间的相互作用能否实现，是由MHC等位基因分子抗原结合槽的结构特点、进入该结合槽的抗原肽是否符合其接纳抗原肽的共同基序，以及这些肽可能显示的抑制性残基的部位和类型所决定的。MHC等位基因的差异(多态性)体现在个体之间，因而，抗原肽-MHC相互作用的不同格局，有可能直接参与构成不同个体对同一抗原应答格局的差异，甚至决定对同一种病原体引起的疾病是否存在遗传易感性。

TCR复合物识别APC表面的pMHC之后，使一些受体及其相连接的胞内信号转导分子迅速被动员到T-APC的接触部位。形成免疫突触。

免疫突触形成的意义：首先，多个TCR-pMHC三元体的聚集使得单一受体(TCR)和单一配体(pMHC)间的亲和力有机会转变成一种结构性亲和力。结构亲和力为相应信号转导提供足够强的动力，促进T细胞行使其抗原识别后的生物学功能，包括增值、细胞因子分泌和对靶细胞的杀伤。其中涉及多种机制：1.稳定的超分子结构使多个TCR分子成簇，以平行的方式传递T细胞的活化信号，使T细胞完全活化。2.在免疫突触的微结构域中，缩小了T-APC相互作用的空间，使TCR有连续被触发的机会。3.TCR-pMHC复合物向中心移动，可使之浓缩100倍左右，而且T细胞受力均衡，基本不会移动。4.免疫突触提供了一个生化反应的极化界面和分子间相互作用的平台，增强了T细胞识别抗原的能力，也增强了APC上B7-1/B7-2和T细胞CD28的相互作用而产生协同刺激信号，参见图1和图2。

在自然界形成的TCR的配体pMHC，一部分对免疫反应起激活作用，一部分肽似乎起拮抗作用。一篇2004年发表在The Journal of Cell Biology上，由Cenk Sumen等撰写的文章对pMHC对TCR的拮抗作用作了深入的研究，名为“T cell receptor antagonism interfereswith MHC clustering and integrin patterning during immunological synapseformation”。在前言中他们写到：非自身肽pMHC引起的T细胞活化过程，可以被特定序列变异的T细胞受体(TCR)的拮抗肽所阻断。其抑制机理尚不清楚，但这类变异可以在病毒感染过程中遇到，并且可能对促进病毒进行免疫逃避有帮助。在这里，我们研究了肽拮抗剂对T细胞免疫突触形成的影响作用。我们发现，在复合膜上表达拮抗-激动复合物形成的免疫突触时，MHC密度降低，从而使T细胞的增殖减少，并且这种减少是增加共刺激配体CD48和B7-1所克服不了的。在膜上面由高度密集的ICAM-1形成的新月接触面缓慢滑行过程中，大多数T细胞最终不能捕获，从而不能形成免疫突触。因此，拮抗肽选择性阻断MHC集群，并产生停止信号。

从上可知，由pMHC-TCR介导的T细胞特异性免疫反应是极其复杂的。

二、用免疫双向选择学说阐释T细胞特异性免疫反应中MHC与多肽以及pMHC与TCR的相互作用

为了更方便理解MHC与多肽以及pMHC与TCR的相互作用以及由此引发的T细胞特异性免疫反应，发明人引入免疫双向选择学说。

为了更深入地理解免疫系统，发明人提出免疫双向选择学说：生物体对进入体内的药物、抗原、微生物、病原细胞或其他异体细胞生物体等的选择性排斥作用称为顺向选择；进入生物体的药物、抗原、微生物、病原细胞或其他异体细胞等对生物体的选择性排斥作用称为反向选择；人体中各种细胞和各种成分之间的双向选择作用中数量增大的一方的选择性排斥作用为顺向选择，被动方的选择性排斥作用为反向选择。

相互的选择性排斥作用将使对方的数量和结构(结构决定功能、性状等)发生改变，使二者组成的体系趋向于稳定。双方对对方的选择性排斥作用由各自的数量和结构决定，这种双向作用都将导致适者存在，不适者被淘汰或被改造适应，最终趋向于实现免疫双向选择平衡。由于各自的数量和结构均能被二者组成的体系之外的因素所改变，所以二者组成的体系所需要达到的稳定是发展变化的。即以数量和结构决定的双向选择，适者存在，不适者被改造或被淘汰。亦即以数量和结构决定的阴阳，平衡，相生相克。

结构相似的物体称为相似体。结构的组成包括其内所含的相似体的种类和数量，以及它们之间的相对位置和相对运动。结构内部的相似体之间的相对运动可导致相对位置的改变，从而使结构发生改变，也使其内部的相似体内部结构发生改变，超过一定界限时，生成新的相似体，发生数量改变。

相似体的相似度用0～1表示，当相似度等于1时，表示用当前所有技术方法均不能检测到它们的不同，称为同一体，当相似体的相似度向0靠近时，超过一定的数值，可以认为它不再是相似体，可以把它归为不同体。

免疫双向选择方程：

F1+F2→S1+S2(F1的相似度趋近于1、F2的相似度趋近于1、S1的相似度趋近于1和S2的相似度趋近于1)

方程一般为不可逆，方程左边为相克的两种相似体F1和F2，右边为F1和F2相克后相生的S1和S2。在化学方程式中，左边的同样为相克，右边的为左边相克后相生的产物。

在一个双向选择双方平衡共存的体系中，对于大分子或细胞之间的双向选择，反应式一般为不可逆过程，反应的启动和中止，只与左边的F1和F2有关系，所以，双方的浓度(或者频率)与它们之间的选择亲和力应存在着如下的关系：

F₁ ^a×F₂ ^b×Q＝T(F₁和F₂为浓度(或频率)；a，b为结合效价；Q为F₁和F₂的选择亲和力；T为双向选择平衡常数，也称共存常数，其值可能受温度的影响)

通常的免疫学观念认为：DC细胞在外周捕获抗原后，逐渐成熟，进入淋巴结后，就能激活初始的T细胞，似乎是生命过程中自然而然的事情。而双向选择学说认为：DC细胞成熟后，就会选择性对初始的T细胞产生排斥作用，尤其对它们之间有高的选择亲和力的那一小部分初始T细胞，这是两种结构不同的物体的一种“势不两立、有你没我”的不能在同一体系中共存的关系，必然导致相互的结构改造，使各自的频率减少，并且同时产生新的相似体。

TCR是一个高分子蛋白，由两个亚基组成。每个T细胞只表达一类TCR。在pMHC的选择性排斥作用下，同一个TCR的多个重复频率，其中部分将发生空间结构的改变，由同一体向相似体迁移，当pMHC的频率进一步增大时，这些相似体继续向不同体迁移，即形成pMHC-TCR的结构。pMHC引起同一体TCR的结构改变，这是改造作用，当结构巨变，形成pMHC-TCR的结构，就发生了淘汰作用，使同一体TCR频率减少。其变化如图3所示。

在pMHC与TCR的二者双向选择作用关系中，用F1代表某一个个体中的某一同一体pMHC，F2代表同一个个体中的某一同一体TCR，它们在这个个体中的共存关系应符合双向选择平衡常数的限制，但人体属于非均匀的选择体系，F1和F2代表频率，而不是浓度。

为了使方程F₁ ^a×F₂ ^b×Q＝T变得简单化，令a＝b＝1，令T＝1，那么就有F₁×F₂×Q＝1，将方程变换，有F₁＝(1/F₂)×(1/Q)；如果这个个体中F₂的频率在一定时间内恒定，而F₁和F₂的选择亲和力受它们之间的结构本身决定，为定值，那么F₁等于(或小于)某一定值。

当把同一体F1，扩张到这个个体其他与F1相似的其他多种同一体pMHC(f1)时，F2与f1的亲和力就发生了变化，此时亲和力用q表示，此时有：

f₁＝(1/F₂)×(1/q)，变成了f₁与q的函数，那么它表示就是类似y＝1/x的函数，在坐标中为双曲线。f1中某一个具体的pMHC与一定频率的F2的亲和力是唯一的，也就是说不同的多肽与相同的MHC和TCR的亲和力都是不同的，不存在重叠。如果亲和力相同，那么一定是同一肽所介导。

如果将同一体F2，扩张到这个个体其他与F2相似的其他多种同一体TCR(f2)时，f₁×f₂×q＝1，那么它表示的就是类似xyz＝1的函数，在坐标中为钟型的面。这种情况复杂，在此不再做讨论。

f₁＝(1/F₂)×(1/q)，在坐标中形成的曲线，称为F2的双向选择平衡曲线，也称为F2的共存曲线，意即在F2的频率为F₂时，在某一亲和力位点，f1的频率要小于等于f₁，如果超过，就会发生双向选择，引发相克淘汰作用，同时相生新的相似体。如图4所示。

同一个个体，MHC结构一定，没有TCR那么多的多样性。长度能被MHC接纳的多肽群(p)与MHC(M)的作用同样符合双向选择作用关系，即有：

p(单个多肽的频率)×M(MHC的频率)×q＝T

在一个个体中，M结构一定，当q极大时，这一群p的结构特征有相对固定的锚着点，这只不过是MHC与多肽双向选择作用关系中最高亲和力时的一种极端特征，并不能代表p与M作用的全部特征，只要有亲和力，那么当M频率一定时，p中某一多肽的频率增加，根据双向选择平衡方程，就一定能出现pMHC的结构，因此不必考虑锚着点氨基酸的限制。

图5中，亲和力q轴上，数字1～12代表某蛋白与MHC可形成的pMHC的12个多肽片段的编号，在此蛋白一定分子数量的情况下，它们出现的频率是一样的，等高，但它们与MHC的亲和力是依次增高的，假设细胞内MHC的频率能及时得到表达补充，使MHC频率维持恒定，即共存曲线不发生移动，那么，5、6、7、8、9、10、11、12号肽可以形成pMHC的结构，而1-4号不能。要使1-4号肽出现pMHC的结构，需再进一步增加蛋白的分子数量，以使其频率增加，向上触及共存曲线，方可形成pMHC结构。图中可形成的pMHC结构的多肽中，第12号肽的形成量是最大的，那么这种蛋白形成的pMHC与某TCR的亲和力，第12号肽最具代表性，其他5-11号肽形成的pMHC与此TCR的亲和力以12号为中心，在其两侧分布，其频率类似正态分布。在图6中，对肽与MHC的亲和力，以及它们的生物活性进行了对比，显示与MHC高结合力的肽的生物活性不一定是最高的，而中等亲和力的3条肽有更高或者更低的增殖强度。

同时，在生物学中，同一群体的某种特性指标，如某地区同龄组儿童的身高、体重、肺活量，在一定条件下生长的农作物的产量等一般服从正态分布。可以认为，在F2的共存曲线的左下方的f1，或者独立体系的f1，在没有共存曲线的限制下，某一病毒蛋白的形成的多肽序列与MHC形成的pMHC与F2的亲和力的频率呈正态分布，某一随机的混合的数目极多的多肽序列与MHC形成的pMHC与F2的亲和力的频率呈正态分布，该个体自身某蛋白形成的pMHC与F2的亲和力的频率也呈正态分布。如果一个正态分布的肽-MHC群与TCR处于最高亲和力，q轴的最右端的时候，它一定能由高亲和力介导剧烈的特异性免疫反应，在一定程度时，它可能是有益的，但如果这种反应持续时间过长，或者强度过强，将导致疾病产生或者疾病加重，介导这种反应的多肽，称为病原肽。如果F2所代表的TCR是这个个体介导乙肝病毒核心抗原特异性免疫反应最主要的TCR，那么这个个体乙肝病毒核心抗原(HBcAg)所有可形成的pMHC的正态分布应处于亲和力最大的位置，也就是说其亲和力均数最靠右侧。其他病毒蛋白的均数均位于其左侧，随机混合多肽的也是如此，自身蛋白的均数位于最左侧，如图7所示。

在图7中，E代表HBcAg形成的pMHC，A代表人体自身蛋白形成的pMHC，B代表与人较接近的动物蛋白形成的pMHC，C代表随机氨基酸序列的混合多肽形成的pMHC，D代表其他病毒细菌蛋白形成的pMHC。

在人体内，F2与f1的共存体系中，人体由于自身抗原肽，多种寄生微生物，被轻微感染的微生物，它们形成的f1在双向选择曲线下应该有分布，某些亲和力位点可能出现超越曲线的高频率出现，引起轻微的免疫反应。如图8所示。

为了更便于简化分析，在接下来的分析中，以上f1的背景分布将不会再被考虑。下面分析特异性免疫反应中免疫激活和效应阶段的双向选择作用，F2以介导HBcAg免疫的高亲和力的某种TCR为代表进行分析：

形成的pMHC-TCR处于免疫激活阶段，如图9所示。

随着乙肝病毒的感染，病毒在人体内表达越来越多的HBcAg，按正态分布的f1(APC上表达)的频率曲线向上移动，先不考虑共存曲线的限制，当f1的频率曲线(C)较大地高于共存曲线时，假设此时固定双向选择的双方的频率和分布，对双方的双向选择结果进行分析。

F2在双向选择中频率减少，即幼稚型T细胞上的TCR，转变成了活化T细胞上的TCR(CenkSumen，Michael L.Dustin，et al.T cell receptor antagonism interferes with MHCclustering and integrin patterning during immunological synapse formation.TheJournal of Cell Biology，Volume 166，Number 4，August 16，2004579-590，文章中T细胞结合后分离，大部分不能再结合，说明结构已改变)，虽然它们的一级结构没有改变，但空间结构一定发生了改变，归为不同体，此时共存曲线向右上移动，原来正态分布曲线(C)与共存曲线的交叉区域向下移动。事实上，在免疫反应发生的短暂时间内，F2的频率是一定的，而HBcAg的正态分布曲线在免疫反应发生的前期，直到病毒复制和表达被较大程度抑制前，它都是一直向上的，伴随F2的共存曲线(A)向右上离去。这种动态的变化，称为追击型双向选择模式。活化效应产生了大量的单克隆活化T细胞，包括Th1、Th2和CTL，同时产生大量细胞因子，如IFN-gamma，TNF等，协助B细胞产生大量抗体。活化的T细胞上的TCR，虽然其与初始T细胞的一级结构相同，但它们的空间结构，在活化前与被活化后，一定不相同，它们与APC上同一个pMHC的亲和力也必然不同。活化的T细胞上的TCR形成效应阶段的F2*，大量细胞因子表达，有利于被病毒感染细胞形成HBcAg pMHC，形成f1*，以*表示它们和激活阶段的相似体已属于不同体。

形成的pMHC-TCR处于免疫效应阶段，中间的MHC由Ⅰ类分子介导，如图10所示。

在乙肝病毒感染发生的过程中，由于病毒在肝细胞内的持续复制并进行多种蛋白的表达，又由于它们刺激机体产生免疫反应，释放大量的细胞因子，特别是IFN-gamma，使MHC表达增加，按正态分布的f1*(肝细胞上表达)的频率曲线(C)向上移动，先不考虑共存曲线的限制，F2*的频率大增，共存曲线(A)快速向左下移动，二者的这种动态变化，称为对冲型双向选择模式。病毒感染为细胞内感染，而特异性免疫反应一般都在96小时后，才能产生作用。此时，在被感染的细胞内已经大量复制表达，f1*的分布曲线都已经上移了很多，而F2*的频率此时大增，共存曲线快速下压，导致剧烈的免疫反应，大量被感染的细胞被通过颗粒酶、穿孔素、Fas、TNF等作用而被杀死。同时释放的大量炎症物质，导致感染部位充血肿胀，继而发生组织缺血缺氧和缺血-再灌注损伤，严重者导致组织坏死，并引起局部免疫能力低下，可继发多种感染，严重时很可以出现重症情况，甚至出现病人死亡。

在急性乙肝患者在固有免疫和IFN-gamma的细胞因子作用下，可在不发生细胞破坏和调亡的情况下，清除肝脏内的乙肝病毒，但随后而来的大量特异性T细胞和非特异性T细胞导致了大量的炎症和肝细胞损伤，甚至出现重症化的情况。虽然病毒滴度或者其DNA已经检测不到，但留在感染细胞中的积累的病毒蛋白及其已被酶解的相关多肽，此时仍在大量的被MHC高效提呈表达出来，通过pMHC-TCR的特异性交联，介导了高峰值的CTL的杀灭作用，这些杀灭作用在很多程度上来说是本不必再发生，或者不需要高强度的再发生。

三、免疫双向选择学说在T细胞特异性免疫反应中的运用：T细胞免疫平衡肽的产生

如图7和图9所示，对于介导HBcAg发生T细胞特异性免疫反应的TCR，相对于HBcAg形成的pMHC有很高的亲和力，以此形成高效的活化免疫突触，激活T细胞特异性细胞免疫反应。如果引入一群如图7中所示的位于E左侧的低亲和力的pMHC群(用J表示)，在图9中出现，那么就形成了图11所示的情形。

J群的出现，将共存曲线A移至G的位置，那么，分布曲线C将降至F的位置，而不是原来D的位置，这样，C群中参与反应的频率将大大减少，使得HBcAg相关的高亲和力的pMHC-TCR形成减少，那么它将使HBcAg特异性T细胞免疫反应减弱。

J群的出现，推动共存曲线右上移动，使右侧高亲和力的C群形成pMHC-TCR减少，J群形成的pMHC-TCR的出现能产生什么样的生物活性呢？双向选择在数量上的变化，由于受共存常数的限制，超过一定的程度，可以判断结构必然发生变化，但这种变化形成的新结构能带来什么功能，什么样的生物学活性，是未知的。pMHC与TCR的免疫双向选择作用只说明了二者不能共存的关系，它们不能共存的结果是形成pMHC-TCR，但这种结构会带来什么样的功能，是从理论上不可知的。

在Cenk Sumen等的文章中，作者提供了答案。根据亲和力的不同，作者将TCR的可修改的肽配体(alterd peptide ligands，API，由自然存在的天然氨基酸组成、氨基酸的排列顺序可以改变的多肽-MHC复合体，对TCR的刺激，其范围从可以诱导多种不同的细胞因子产生过渡到毫无作用)分为：无效型，亲和力检测不到；拮抗型，低亲和力；激活型，更高的亲和力。他们用蛾细胞色素c(MCC；88-103)作为激活型pMHC，MCC肽中一个氨基酸改变形成的K99R作为拮抗型pMHC，另一个K99A作为无效型pMHC进行了研究。将k99R和K99A以10倍的比例参与MCC介导的增殖反应中时，MCC的介导的增殖能力明显减弱(图12)。形成的免疫突触中央的MHC的密度明显降低。同时，在APC细胞表面一定MCC-MHC密度的情况下，加入k99R和K99A，可使其诱生T细胞产生IL-2的浓度减少(图13)，它们的使用量是MCC的10倍的情况下开始出现，100倍的情况下就更明显了，特别是K99R。文中提到，拮抗肽和无效肽(pMHC)都可以参与到激活肽(pMHC)形成的免疫突触中，减少突触中MHC的数量，并起到阻断活化信号传递的作用。

在其讨论部分中的附图(图14)，对某一个TCR作用下，一群pMHC与之的亲和力关系从低亲和力至高亲和力、从左至右依次分布“null peptides”、“TCR antagonists”、“weakagonists”和“strong agonists”。

本专利所指pMHC与TCR之间的亲和力是细胞上的pMHC与TCR(目前有三种测量pMHC与TCR之间亲和力的方法，见David K.Cole，Nicholas J.Pumphrey，et al.Human TCR-BindingAffinity is Governed by MHC Class Restriction.J.Immunol.2007；178；5727-5734)，代表细胞之间的亲和力，用细胞通过pMHC-TCR相互作用的半衰期T1/2来表示亲和力，是与T细胞活化最相关的方法。作者将pMHC与TCR的亲和力由低至高，从左至右，依次排列为“无能肽”、“拮抗肽”、“低能激活肽”和“高能激活肽”。由于他们的实验，是通过pMHC与TCR的类似实体细胞反应，进行的实际的测量，所以他们的实验结果应受到双向选择平衡方程的限制，他们得出了一条双曲线，跟理论一致，说明双向选择理论在处理pMHC与TCR的作用关系是符合实际情况的。但是他们可能考虑了很多种肽-MHC，高亲和力的肽的频率较少，而低亲和力的频率较多，所以图14中的曲线又有点像某一非共存体系某一多肽群与某一TCR的正态分布图，但这个图只有正态分布曲线很右侧的一部分。这就是理论与实际测量的矛盾之处。

根据图11所示，那么J群可以形成大量的“无能肽”、“拮抗肽”和“低能激活肽”，这些肽-MHC的复合体，在同一APC上分布时，“无能肽”和“拮抗肽”对“高能激活肽”形成免疫突触起到了明显的抑制作用。

综上所述，J群肽主要通过减少C群肽形成TCR-pMHC的数量，并且在MHC-C群肽-TCR形成的免疫突触中抑制其活化信号的传递。

在上面的说明中，采用的是HBcAg的高亲和力TCR为代表，如果J群的抑制作用可以放大到任意高亲和力的pMHC-TCR，可以超越任意个体MHC甚至不同种属的MHC限制，那么这种介导的亲和力介于MHC-自身肽-TCR和特异性高亲和力的MHC-病原肽-TCR之间，能降低特异性高亲和力的MHC-病原肽-TCR介导的促进T细胞的活化、增值和效应的多肽或多肽混合物，称为T细胞免疫平衡肽。

四、T细胞免疫平衡肽

T细胞免疫平衡肽可以不考虑个体的遗传背景，即MHC的限制，使其形成的pMHC群或群的主要部分对任意一TCR的亲和力，处于高亲和力pMHC(或群)与人体自身pMHC群之间，对高亲和力pMHC(或群)的T细胞免疫反应起负向调节作用。相同的肽-MHC对个体内的不同的TCR亲和力不同，在q轴上的位置不确定，相同的肽，在另一个个体中，由于MHC和TCR都不同，其亲和力变异更大，但是，作为一个多条多肽组成的整体，在q轴上的位置却是可以确定的。从理论上讲，可能可以找到单独的一条多肽，其在q轴上的位置都是相对恒定的，处于低亲和力的位置，符合平衡肽的要求，但这种方法不是本专利的追求。本专利是在单一多肽的不确定性中，追求混合多肽的整体的确定性。

1.随机序列

对于病毒和细菌引起的剧烈的T细胞特异性免疫，介导的MHC-病原肽-TCR必然处于高亲和力水平，其pMHC群必然处于q轴的最右侧。随机的肽与MHC形成的pMHC群的亲和力，必然处于其左侧的中间位置。在Cenk Sumen的文章中，它们使用的多肽大多都是人工合成的，他们提到相对于任意一个TCR，无效肽的频率相对于高效肽的频率总是很多的。因此，这样合成的随机多肽群，形成的pMHC群，对于任意一个高亲和力的pMHC-TCR来说，其频率的主要分布(均数)在q轴上应该都是位于左侧的。为了排除偶然性，多肽的种类是越多越好。

2.从接近人的脊椎动物蛋白中提取

从脊椎动物开始，形成pMHC-TCR的特异性免疫系统，它们的结构可能有不同之处，但也有相似之处。它们体内的蛋白，都是这种选择系统选择后保留的。它们的蛋白形成的pMHC相对于病毒和细菌形成的pMHC与人体的TCR的亲和力，从整体上来说，应该要小得多。从动物发生的胚系分析，外源性的强弱和物种间胚系基因的差异程度有关。抗原来自系统发育距离越远的物种，其外源性越突出，免疫原性也越强。因而病原体有很强的免疫原性。近亲性，低亲和力，免疫原性较弱，越远，亲和力越高，免疫原性更强。因此，可以从脊椎动物蛋白中提取多肽，形成T细胞免疫平衡肽。

上述两种来源的T细胞免疫平衡肽，其序列多样、长短不限，但一般都要含有可以覆盖Ⅰ和Ⅱ分子长度的多肽，可以加入比它们长或短的多肽，但分子不超过10000。

五、T细胞免疫平衡肽对T细胞特异性免疫反应的影响

1.T细胞免疫平衡肽与MHC结合过程，对特异性抗原与MHC结合的影响

多肽与MHC的双向选择关系，除Ⅰ、Ⅱ类分子长度的多肽外，过长的多肽可通过内体-溶酶体途径水解或酶解成合适的长度，对于小于8个氨基酸的多肽，也有可能对MHC起作用，它们在不同的亲和力位点上，共同推动共存曲线向右上移动，导致特异性病原肽与MHC的结合减少，从而减少病原肽-MHC的形成。从另外一个角度上来讲，这也可能导致了病原肽的积压，使病原肽提呈速度减慢，延长了提呈时间，从而使病原肽引起的特异性免疫反应时间延长。

从猪的肝脏中提取的多肽物质促肝细胞生长素(pHGF)对大多数受检对象的单核细胞HLA-DR的表达有不同程度的促进作用，对健康人的促进作用明显(朱晴晖，张宜俊。pHGF对人单核——巨噬细胞HLA——DR表达的影响，上海免疫学杂志，1996年第01期)，说明PHGF中的多肽与人体的MHC结合，形成了大量的pMHC，并在淋巴细胞上大量表达。

2.T细胞免疫平衡肽-MHC对对T细胞特异性免疫反应的影响

多肽进入人体后，很可能绝大部分被单核巨噬粒细胞、DC和B细胞所捕获，通过内体-溶酶体途径，主要由Ⅱ类分子提呈，其主要影响激活阶段。也可能某些多肽可以直接和细胞表面的Ⅱ类分子直接结合。虽然不排除抗原可以通过交叉途径，由Ⅰ类分子提呈，可能影响CTL的激活，仍处于激活阶段。人体实体细胞的吞饮功能较差，摄取多肽后经过交叉途径提呈的可能性不大，另外被感染的细胞内病原蛋白丰富，MHC可能主要被它们所占据。

另外多肽可能可以直接和细胞表面的MHC结合，如很多表位肽研究经常采用CTL表位多肽直接刺激淋巴细胞，能产生特异性免疫反应。但Ⅰ类分子表达量最高的是淋巴细胞，一个细胞可含5×10⁵个分子，约占膜蛋白的1％。M、DC及中性粒细胞也高表达HLAⅠ类分子，相反，肺、心、肝细胞、成纤维细胞、肌细胞、神经细胞表达低水平的Ⅰ类分子。另外Ⅰ类分子结合一般8～10个氨基酸。T细胞免疫平衡多肽与靶器官细胞上空载的MHC结合，介导细胞毒作用的可能性微乎其微。

所以，T细胞免疫平衡肽对T细胞特异性免疫反应的激活阶段，对激活过程直接起抑制作用。通过减少激活，使Th1和CTL的数量减少，进而使特异性TCR频率减少；同时使IFN-gamma等细胞因子减少，使病原肽-MHC的提呈减少，使选择双方的数量减少，从而在效应阶段减少CTL特异性杀伤的范围、速度和强度，间接起作用。

T细胞免疫平衡肽由Ⅱ类分子提呈后，与同一APC细胞上的病原pMHC，一起竞争病原特异性TCR，减少病原pMHC与特异性TCR结合的数量，减少它们引导的免疫突触形成减少，同时在已形成的特异性免疫突触中，抑制其活化信号的传递，减少T细胞的激活，减少相应细胞因子的产生，降低特异性T细胞的增殖能力，从而降低了Th1引导的特异性细胞免疫和Th2引导特异性体液免疫的强度。pMHC-TCR介导的双向选择，只不过是细胞间双向选择关系中微观的一部分，细胞的双向选择作用，使细胞的结构发生变化，功能随之改变。

综述所述，T细胞免疫平衡肽能干扰病原肽与MHC的结合，并使单位时间内的被提呈量减少，延长抗原肽的提呈时间，是T细胞特异性免疫反应时间延长；T细胞免疫平衡肽形成pMHC以Ⅱ类分子为主，使形成的病原肽-MHC与高亲和力特异性TCR的结合减少，同时T细胞免疫平衡肽形成的pMHC参与到病原肽-MHC与特异性TCR形成的免疫突触中，起到中止或减弱其活化信号传递的作用，使T细胞活化减少，增殖能力降低和细胞因子产生减少，T细胞介导的病原特异性免疫强度减弱，但由于病原蛋白提呈时间延长，而使特异性免疫反应时间延长，使T细胞特异性免疫反应从峰形的免疫反应变成平台形，特异性免疫反应持久且更温和，如图15所示。

运用ELISPOT方法，由LLNQHACAV、env-236CTL表位、pol-538CTL表位、env313CTL表位、88-96YVNTNMGLK、pol354-365TPARVTGGVF、18-27FLPSDFFPSV、141-151STLPETTVVRR、padre AKFVAAWTLKAAA、pol501-516LHLYSHPIILGFRKI，每条肽各20μg/ml，对HBcAg(20μg/ml)诱生外周血单个核细胞IFN-gamma产生细胞频率起明显的抑制作用(P＜0.05)。从猪肝脏中提取的促肝细胞素(PHGF)能起到更明显的作用，并且呈明显的量效关系。这从一个方面反应了T细胞免疫平衡肽的负向调节特异性免疫反应的作用。

六、T细胞免疫平衡肽对正常免疫系统的影响

1.对固有免疫中的吞噬细胞功能的促进作用。

从乳猪新鲜肝脏中提取的低分子量多肽类物(促肝细胞生长因子)，按每天1m g/次给小鼠腹腔内注射共5次后，用化学发光仪测定，实验组小鼠腹腔细胞吞噬细菌后的化学发光率高比值明显高于对照组，峰时明显缩短，该制剂还能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞产生促凝血活性因子，据此认为该制剂对巨噬细胞功能有明显的促进作用(陈华青，张宜俊。pHGF对人中性粒细胞吞噬功能的影响，上海免疫学杂志，1996年第01期)。增强吞噬细胞的吞噬功能，是在感染疾病中运用T细胞免疫平衡肽的一个重要基石，有利于病原体的清除和防止并发感染的产生。

2.诱导微弱的特异性免疫反应，且具有不完整性

T细胞免疫平衡肽由大量多肽混合而成，模糊掉了个体MHC和TCR的差异性，可以不考虑个体差异。T细胞免疫平衡肽中肽的同一体重复频率低，使形成的pMHC同一体的频率降低，从而使其在与个体全体TCR的双向选择中，共存曲线位于右上方，远离坐标轴，减少其与正态分布的TCR频率的交互区域，减少发生激活反应的可能性。并且少量由平衡肽引发的高亲和力pMHC-肽结构，在形成免疫突触激活T细胞的过程中，也很可能被平衡肽中的其它多肽所干扰。

理想的抗原，其分子量应在100kDa以上，一般说，分子质量低于5～10kDa，免疫原性不佳。已有的多肽疫苗的研究中，抗原表位的免疫原性通常较弱，单独使用很难引起较强的免疫反应。它们诱生外周血单个核细胞产生IFN-gamma，通常只有ELISPOT这种高度敏感的检测方法才能检测得到，用常用的ELISA方法通常检测不到。

初始T细胞通过“MHC-抗原肽-TCR”三元体得到抗原识别信号(第一信号)之后，需要有协同刺激信号(第二信号)的出现方能活化。第二信号可有多方面来源，主要来自APC表面B7分子(配体)和T细胞表面CD28分子(受体)的结合。没有第二信号，很多基因(如编码IL-12的基因)不发生转录激活，因而获得了抗原识别信号的T细胞不能进入克隆增殖分化阶段，呈现无能(anergy)状态。静止的APC不表达或很少表达协同刺激分子。以从猪肝脏中提取的多肽，很可能能激活人体中与对猪的种属免疫有关的TCR，也许它们在体内能形成这样的pMHC-TCR结构，但由于多肽缺乏病原体相关分子模式(PAMP)，用来激活固有免疫的模式识别受体，以此来促进共刺激分子和多种细胞因子的表达，缺乏共刺激分子和相应的细胞因子环境，其免疫活化能力非常有限，另外，即使有激活的效应性T细胞，也缺乏具体的作用靶器官，它们很可能介导很微量且分散的细胞毒作用，但这引起的机体细胞死亡，可能相对于机体正常的新陈代谢也是微乎其微。运用多年的PHGF还未发现由于激活免疫细胞，而导致自身免疫病发生的报告，说明其形成的亲和力的整体水平仍低于发生自身免疫抗原介导的亲和力水平。

七、T细胞免疫平衡肽的制造和使用

1.随机序列，化学合成各肽，组成T细胞平衡肽，用于病毒、细菌等微生物急性时T细胞免疫的负向调节；可能可以用于自身免疫病的治疗。

2.动物提取，可以取牛、猪、羊等的肝脏、心脏、肾脏、脾脏制作。可以单独一种器官制作，也可以选多种器官一起混合制造，也可以选不同动物的多种器官一起混合制造，以此来提高多肽的种类，从而减少单个肽的使用剂量。对于从蛋白中分解多肽的方式应用物理切割的方式，不得使用有具体酶切位点的蛋白酶水解。用于病毒、细菌等微生物感染和自身免疫病的治疗。特别是人体脏器提取的多肽，相对于从猪和牛身上提取的，对于人体TCR更具有普遍的低亲和力，非常适合用于人体自身免疫病的治疗。由于伦理的问题，不能批量生产，但可以用来制作复制的模板。

3.对动物提取的T细胞免疫平衡肽，采用化学分析成分后，选择部分或全部成分，采用化学合成的方式合成，如果由于多肽链过长，难于合成，可采用基因工程的方式，采用原核表达生产。

4.多肽的广泛亲和力(生物制品一般具有的广泛亲和力，即有广泛的选择作用)，在与人体的双向选择中，多肽种类多、单个肽使用重复频率低，减少对某一具体同一体的选择强度，能减少毒性的产生。由于T细胞免疫平衡肽在q轴上处于左侧，而病源蛋白在体内的表达量通常达到μg以上，甚至mg以上，T细胞免疫平衡肽的使用剂量应该要高100倍，甚至1000倍以上，达到mg和g水平，才能推动业已被病原蛋白多肽向右上推远的两条共存曲线。在这么大的剂量要求下，多肽的种类多样性显得尤为重要，这与安全性密切相关。从动物脏器提取的促肝细胞生长素一次静脉给药可以用到360mg甚至更高的剂量，病人都是能耐受的，说明这类药物具有非常可靠的安全性。

附图说明

图1：TCR-pMHC信号传导通过T细胞骨架蛋白重排诱导免疫突触形成，摘自《免疫学原理》第144页，周光炎主编，上海科学技术出版社出版。

图2：免疫突触使多个TCR-pMHC分子间形成功能性亲和力引起T细胞激活，摘自《免疫学原理》第144页，周光炎主编，上海科学技术出版社出版。

图3：表示TCR在pMHC作用下，有同一体向相似体，直至不同体的变化过程。

图4：在亲和力q的横轴上，相似体f1中五个位点上，A、B、D不会引发双向选择排斥作用，C、E位点将发生选择排斥作用。

图5：某蛋白形成肽段与MHC发生双向选择作用时的选择关系。

图6：某14条不同多肽与某MHC的亲和力以及与之对应的对Th的促增殖能力对比图。摘自《免疫学原理》第8页，周光炎主编，上海科学技术出版社出版。

图7：其它不同来源的多肽群与介导核心抗原多肽群高亲和力的TCR的亲和力在核心抗原多肽群与其相关高亲和力的TCR的双向选择作用坐标中的示意图。

图8：正常人体中某TCR共存曲线下pMHC分布背景示意图。

图9：乙肝病毒核心抗原形成的pMHC与其相对于的某特异性TCR发生免疫激活过程的双向选择作用关系图。

图10：乙肝病毒核心抗原形成的pMHC与其相对于的某特异性TCR发生免疫杀伤过程的双向选择作用关系图。

图11：低亲和力肽群J对高亲和力肽群C与其特异性TCR之间的双向选择作用的影响示意图。

图12：拮抗肽99R、无效肽99A与激活肽MCC的促增殖活性的比较。

图13：在限定的激活肽-MHC密度的情况下，拮抗肽和无效肽均可以阻断T细胞的效应功能。5C.C7T细胞和CH27-ICAM-GFP B细胞，加入途中相应浓度的多肽，共培养56小时，然后用ELISA方法检测IL-12的浓度。

图14：一个动态变化的狭窄范围的TCR拮抗肽模型。曲线代表了一群pMHC复合体作为某一个给定TCR的配体的假设分布。由右开始向左移动，T1/2(TCR-pMHC相互作用的半衰期)减少，最佳刺激T细胞的激动肽越来越少。越来越多的肽表现出低的活化潜力(增加f，肽的频率)，最终延伸至一个无效表型，它们没有能力参与MHC簇的形成，这些肽本身不刺激T细胞。TCR拮抗肽是假设占据了弱激动肽和无效肽之间一个狭窄的动态区域，它们能有足够的相互作用时间，传递一个信号异常或不完整的信号，而无效肽相互作用时间不足够长，它们自己的不产生任何信号活化信号。

图15：T细胞免疫平衡肽对特异性CTL效应的影响示意图。此图在《医学免疫学》第三版(陈慰峰主编，人民卫生出版社出版)第3页插图的基础上示意。

具体实施方式

实施例1

从动物组织中制备T细胞免疫平衡肽

1.选取健康的乳猪或未哺乳新生牛，取新鲜肝脏、心脏、肾脏和脾脏等，用注射用水洗净后，24℃左右剪碎或切碎；

2.按重量：体积为1∶1加入灭菌注射用水，于低温(4℃)条件下反复匀浆10分钟，得匀浆液；将匀浆液放入零下60度～70度的低温中冷冻结冰后，将速融液迅速升温至85℃，恒温10分钟，以达到大分子蛋白热变性，并去除大分子蛋白；

3.热变性后，4℃，3000转/分，离心20分钟，弃沉淀，取上清；

4.分级超滤及病毒灭活：将离心上清以超滤器进行分级超滤。一级超滤，收集分子量30000道尔顿以下的组分；二级超滤，收集分子量为10000道尔顿以下的多肽组分，然后，可按需要，进一步超滤，获取不同分子量的组分。目标组分，60℃保温10小时，灭活病毒；

5.以0.45um、0.22um微孔膜过滤，将检查合格的过滤液加入赋形剂，适量分装，冻干而成。

实施例2

采用化学合成方法制备T细胞免疫平衡肽

多肽的制备用Fmoc固相肽合成法，首先将一个用Fmoc基团对α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，随后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸-支臂-树脂。将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、耦联，直到得到目的肽。最后将肽-支臂-树脂裂解。多肽纯化，用HPLC法，粗肽产品经C18高压柱分离纯化，用液相色谱仪跟踪收集所需流出液，样品峰合并后去盐、冻干，制得多肽精品。

以HBcAg(18-27)合成为例：

(1)Fmoc-Val-Wang树脂的溶胀及脱Fmoc保护

称取Fmoc-Val-Wang树脂62.5克(150目，0.8mmol/g)，装入专用的反应器中，开启CS936生产型多肽合成仪总电源，打开工作站，调用事先编著的接肽程序。用700mlDMF浸泡，使树脂充分溶胀，氮气吹干。加入700ml20％PIP的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹虑去PIP，用DMF洗涤3次，氮气吹干。

(2)Fmoc-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Ser(tBu)-OH57.5g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

加入400ml20％PIP的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。

(3)Fmoc-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Pro-OH 50.6g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

(4)Fmoc-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Phe-OH 58.1g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

(5)Fmoc-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

(6)Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH 61.7g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

(7)Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Ser(tBu)-OH 57.5g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

(8)Fmoc-Pro-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Phe-Phe Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

(9)Fmoc-Leu-Pro-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Leu-OH 53.1g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

(10)Fmoc-Phe-Leu-Pro-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备2

再用无水乙醇洗涤3次。抽干后，放入真空氮气吹干器中氮气吹干，得保护的HBcAg(18-27)树脂103g。

(11)Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val的制备

取103g保护的HbcAg(18-27)树脂转移到切肽瓶中，冷却，边搅拌边加入切肽试剂(TFA/HBr/TIS/EDT＝700ml/28ml/43ml/21ml)，25℃搅拌4小时。过滤，减压浓缩，滤液加无水乙醚沉淀，收集沉淀，用乙醚洗，P₂O₅干燥，获得切肽后的HBcAg(18-27)粗品，约45g。

纯化：

将45g HbcAg(18-27)粗品溶于20L纯化水中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：0.1MNH₄Ac：乙腈(75-25)，流速为300ml/min。用HPLC跟踪收集所需要的流出液。样品峰合并后去盐，冻干，得成品12.5g(MW：1154)，总收率约22％。

按上述方法合成其他多肽。将各种肽按一定的比例配比用无菌PBS溶解，过滤除菌，加入赋形剂冻干制成。

实施例3

ELISPOT方法检测合成多肽混合物和PHGF对HBcAg诱生IFN-gamma的抑制作用目的

采用HBcAg联合刺激人外周血单个核细胞(PBMC)诱生IFN-gamma，观察不同浓度的合成多肽混合物和PHGF对IFN-gamma产生的影响，以此反映它们对T细胞特异性免疫的调节作用

实验试剂

RPMI1640培养基和胎牛血清，淋巴细胞分离液，anti-human CD3，HBcAg，合成的十肽(前文中提及)，PHGF，ELISPOT试剂盒，固体肝素钠抗凝剂，双蒸馏水，无菌去离子水。

实验方法

健康人6名，采血前至少需禁食6小时。用高压灭菌消毒的采血管在无菌条件下取志愿者或者患者外周血5ml，肝素钠100单位抗凝，轻轻摇匀使之达到抗凝作用。每份血标本予5mlRPMI-1640(含双抗、室温)稀释混匀，2等份分置于2管盛有5ml的淋巴分层液上，注意保持界面清晰。2000转离心20分钟后吸取界面淋巴细胞层，予RPMI-1640(含双抗、室温)洗涤两次，继悬于1ml RPMI-1640(含双抗、10％FCS，室温)，冰醋酸融解红细胞，计数，将细胞浓度调至2×10⁶/ml。在操作过程中需严格无菌，动作要轻柔，减少细胞损伤，保证细胞活力。在2000r/min转速下分离单个核细胞，离心20分钟。操作前严格要求平衡，减少离心管破裂的现象。在超净台内吸取单个核细胞层，尽量少吸淋巴细胞分离液和血浆成分，减少淋巴细胞分离液和血清成分对实验结果的干扰。刺激物采用两步稀释法.第一步，将刺激物稀释成所需终浓度的10倍，然后稀释成2倍备用.在业经IFNγ单抗包被和小牛血清封闭的96孔微孔板小孔中，加入受检细胞4×10⁵个/孔和相应刺激物，同一样品均设复孔，置37℃、5％CO₂温育15～20h，经洗涤后，相继用生物素化抗IFNγ多抗和酶标记的山羊抗生物素抗体作用，继用ActivatorⅠ、Ⅱ显色后经仪器阅读计数斑点。

实验结果

刺激物	IFN-γ形成斑点数
		1.阴性对照(RPMI 1640)	1.0±0.89
2.Anti-CD3(0.2μg/ml)	＞200
		3.HBcAg(20μg/ml)	26.54±17.93*&
4.pHGF(0.075mg/ml)	1.0±0.89
		5.pHGF(0.3mg/ml)	0.67±0.82
6.pHGF(1.2mg/ml)	0.67±0.82
		7.HBcAg(20μg/ml)+十肽(各20μg/ml)	14.67±13.56&
8.HBcAg(20μg/ml)+pHGF(0.075mg/ml)	20.67±11.12
		9.HBcAg(20μg/ml)+pHGF(0.3mg/ml)	17.17±12.77*
10.HBcAg(20μg/ml)+pHGF(1.2mg/ml)	5.67±7.76*

IFN-γ形成斑点数，第9和10组与第3组差异明显，P*＜0.05，8、9、10组呈一定的量效关系，第7组与第3组差异也明显，P*＜0.05。说明混合多肽和PHGF对HBcAg抗原的特异性免疫反应有负调作用。

实施例4

采用流式细胞检测分析PHGF对PBMC IFN-gamma产生细胞的抑制作用的作用细胞分析实验方法：

1.分离PBMCs细胞：抽取静脉血10ml，肝素抗凝30U/ml血，RMPI 1640基础培养液1∶2稀释混匀，以1∶1的比例将稀释的血液沿管壁缓缓叠加于Ficoll淋巴细胞分离液(密度：1.077±0.002)上分离PBMCs细胞，再用RMPI 1640基础培养液洗两次，用含10％灭活胎牛血清的RMPI 1640基础培养液配制细胞悬液，计数细胞，同时用台盼兰检测细胞活力，要求细胞活力＞95％以上，调整细胞浓度为2×10⁶/ml。

2.激活：将浓度为2×10⁶/ml的细胞分别加入4管15ml细胞离心管中，每管1ml，方法如下：

1细胞1000μl

2细胞1000μl+HBcAg(4μg/ml)

3细胞1000μl+HBcAg(4μg/ml)+PHGF(0.3mg/ml)

注意混匀，37℃，5％CO₂分别温育24h。细胞经处理后，流失细胞仪检测IFN-γ+的T细胞、NK细胞。

实验结果：

人外周血单个核细胞经刺激24h后分泌IFN-γ的细胞百分数(％)(n＝6)

T细胞HBcAg+PHGF刺激组较HBcAg单独刺激组IFN-γ⁺阳性细胞明显降低，P*＜0.05；NK细胞HBcAg+PHGF刺激组较HBcAg单独刺激组IFN-γ⁺阳性细胞有所降低，但还不明显。

序列表

<110>夏书奇

<120>T细胞免疫平衡肽

<140>201010196132.8

<141>2010-06-07

<160>7

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人(human beings)

<220>

<221>CHAIN

<222>(218)...(226)

<223>甲胎蛋白

<400>1

Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val

1 5

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(88)...(96)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>2

Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

1 5

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(354)...(363)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>3

Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe

1 5 10

<210>4

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(18)...(27)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>4

Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val

1 5 10

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(141)...(151)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>5

Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg

1 5 10

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>VARIANT

<223>padre序列

<400>6

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

1 5 10

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(501)...(515)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>7

Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile

1 5 10

Claims

1.T细胞免疫平衡肽是由分子量在10000或以下的随机氨基酸序列、数量在10条以上的多肽混合而成，其特征在于其可以对正在发生的T细胞介导的针对大分子蛋白、细胞和组织等以及病毒和细菌等微生物的特异性免疫反应，尤其是对剧烈的特异性反应能造成干扰，对其进行负向调节，降低特异性T细胞及其相关细胞的活化、增值能力、效应能力，减少多种细胞因子的产生和分泌能力，使特异性免疫反应变得更温和而持久，并且这种作用可以不考虑病人的遗传背景。

2.根据权利要求1，该多肽混合物的分子量范围可以是0～10000，也可以是800～2000，也可以是800～3000，也可以是1000～2000，也可以是800～1000，也可以是800～10000，也可以是800～1000和1300～1800两个区段，包括0～10000中除只含0～700的区段外的任意区段和任意几个区段组合。

3.根据权利要求1，该多肽混合物对T细胞介导的特异性免疫反应的干扰作用，主要通过干扰MHC-特异性免疫反应介导病原肽-TCR形成起作用，包括干扰介导特异性免疫反应的病原肽与MHC的结合、pMHC与特异性TCR的结合；另外，也通过抑制病原特异性免疫反应的免疫突触形成、减少免疫突触中MHC-特异性免疫反应介导病原肽-TCR的数量和密度，干扰免疫突触中强烈的活化信号的传递起作用。

4.根据权利要求1，该多肽混合物可以由化学方法合成和(或)基因工程菌表达而获得，也可以从富含蛋白质的脊椎动物中提取获得。

5.根据权利要求1、2、4，该随机多肽混合物可根据药效学和(或)临床研究结果，形成多肽数目、氨基酸序列和含量限定的混合多肽，以此形成固定配方的T细胞免疫平衡肽。

6.根据权利要求4，将动物肝脏提取的多肽物质促肝细胞生长素、心脏提取的多肽物质心肌肽素转变成T细胞免疫平衡肽。

7.根据权利要求1，该多肽混合物的制剂形式为冻干粉剂，也可以是水剂。

8.根据权利要求1，该多肽混合物的使用量在0.5mg/kg～50mg/kg之间，通过静脉给药。

9.根据权利要求1，该多肽混合物在严重的流感、SARS、手足口病、病毒性肺炎、细菌感染和严重的自身免疫病等伴随有过度特异性T细胞介导的免疫反应，而导致病理过程的疾病中的运用。

10.根据权利要求4和9，从人体脏器中提取的T细胞免疫平衡肽，用于人类自身免疫疾病的治疗，该多肽混合物可根据化学成分分析结果，选择部分或全部成分，用化学合成和基因工程表达联用的方法制备。