CN101970021A - 包含活性成分的明胶海绵、其制备及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有活性成分层的、改进的干燥交联明胶海绵，及其制备方法和用途。

Description

包含活性成分的明胶海绵、其制备及用途

技术领域

本发明涉及具有活性成分层的改进的干而柔韧的交联明胶海绵及其用途。

背景技术

较大表面上的快速失血尤其难以控制，因为无法用缝线或其他结扎方法控制。人们已经尝试了开发止血海绵，它提供促进伤口或出血部位快速凝血及止血的快速而有效的组合物。一种此类止血海绵组合物为可吸收性明胶海绵。明胶海绵的海绵质物理特性能加速血块形成，并对形成的血块提供结构支持。

通过搅拌明胶溶液使其形成泡沫，并通常通过冻干法使泡沫干燥来制备明胶海绵。与天然不溶于中性水溶液的胶原不同，明胶在30℃以上的温度，尤其是在37℃的生理温度下是可溶的。该特性使得该海绵不适用于体内应用，因为海绵会快速溶解，并失去其结构完整性和多孔结构。因此，为了防止明胶在血液中快速溶解，必须对其进行交联。交联方法包括用化学交联剂(如甲醛、戊二醛和碳二亚胺(如EDC))处理海绵，或通过干热处理干燥的海绵(100-160℃下若干小时)。

尽管还不完全了解其作用方式，但目前认为其效用似乎与明胶海绵将多倍于其重量的血液和其他体液吸收并保持在其空隙内的能力有关。捕获的血小板与海绵相互作用，并被活化，从而形成血栓，并停止出血。该血栓与通常在受伤后于身体中形成的天然血栓相似。活化的血小板还可引发凝血级联反应，反应的最后在凝血酶的作用下可溶性纤维蛋白原被转化成不溶性纤维蛋白网。在Ca²⁺的存在下被凝血酶活化的因子XIII发生交联并使血块的纤维蛋白单体稳定。

和

为止血装置的例子，它可通过干燥的或者用无菌生理盐水或凝血酶润湿的形式直接应用到受伤部位上，以控制出血。为了提高明胶的天然止血性能，已开发和制造了结合明胶海绵、凝血酶和Ca²⁺的止血特征的产品或套件。例如，通常在外科手术中，将明胶海绵从其包装中取出，浸入经稀释的凝血酶溶液中，用力捏揉，直到挤出所有空气。然后第二次浸入凝血酶溶液中，在轻微的压力下将湿海绵敷到出血器官上。然而，浸泡海绵耗时而又繁琐，包括解冻和预稀释浓缩的凝血酶溶液。每个制备步骤都会引入潜在的失误，这可能对无菌制剂产生不利影响并改变海绵的功效。此外，复杂的步骤还需要由训练有素的急救人员来施用海绵。该技术的另一个主要缺点是要用大量的液体来填充海绵空隙，因此会导致在海绵与受伤部位之间的界面处凝血酶和Ca²⁺浓度较低。这样一来，海绵在提供和维持止血方面将是无效的。为了克服这一问题，外科医生通常借助于高浓度的凝血酶，而这会导致局部血栓形成。

以下专利公开公开了用活性成分的溶液涂覆交联的明胶海绵，并干燥该海绵。

美国专利5,643,596和WO9512371公开了一种止血贴片，它具有基质(如可吸收性明胶海绵)以及仅位于基质一面上的有效量的ε-氨基己酸(EACA)。根据说明，可在添加EACA之前和之后用凝血酶溶液涂覆基质。可以通过喷涂粉末、通过在基质上涂覆溶液、或通过完全或部分浸渍施加EACA。优选地通过冻干法干燥润湿的海绵。该专利申请强调了EACA在贴片中的重要性，但未描述无EACA的可生物降解的基质。

WO9013320涉及一种止血海绵，它具有生物可吸收性多孔结构、固体材料(如变性的明胶海绵)、凝血酶和一种或多种凝血酶稳定剂。这种止血海绵通过在多个部位处将凝血酶水溶液注射到海绵中而制备。在不让注射的液体渗到海绵材料表面上的情况下进行注射。然后将海绵在30-100℃下风干足以使水含量降至50％以下的一段时间。根据说明，注射凝血酶溶液可导致海绵结构变形。

US 2,558,395公开了包含凝血酶的即用型明胶海绵。根据该专利，将凝血酶加入明胶水溶液中，转变成泡沫，并在真空和低温下进行干燥。该专利中的明胶在制备过程中的任何阶段都不进行交联。因此，与血液接触后，明胶组分溶解，凝血酶立即释放，导致纤维蛋白原转化成纤维蛋白，并在伤口上形成纤维蛋白膜。

美国专利4,292,972涉及具有水性胶体组合物的冻干泡沫海绵产品。根据说明，通过在冻干工序之前或之后进行交联可降低冻干泡沫产品的溶解度和吸收性。冻干泡沫产品由明胶、果胶和羧甲基纤维素钠的混合物形成。

美国专利4,265,233公开了一种伤口愈合材料，其中通过共价键、离子键吸附或包埋将含或不含凝血酶的因子XIII固定在其上。根据说明，该伤口愈合材料可以为合成的或天然的聚合物。该专利公开了若干种天然蛋白，包括纤维素、粘胶法人造丝、铜铵法人造丝、乙酸纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、支链淀粉、果胶、藻酸、甲壳质、多糖(如粘多糖)以及蛋白质，如羊毛、丝、胶原、明胶和酪蛋白。实例公开了将尺寸为5×2.5×0.5cm的明胶海绵浸入10mL含或不含凝血酶的因子XIII的水溶液中，然后冷冻干燥20小时。

EP0277096公开了止血材料，如

和

以及可有效地与稳定化凝血酶制剂联合使用的胶原。根据该专利，制剂必须包含多羟基化合物和至少一种缓冲剂，如醋酸盐或磷酸盐缓冲剂。根据说明，优选地让稳定化溶液吸收到止血剂上，并以无菌方式对该止血贴进行冷冻干燥和包装。

WO02072128公开了具有掺入其中的润湿剂的交联明胶组合物。根据说明，可以将润湿剂涂覆到明胶海绵的表面上。实例示出了通过将海绵放入装有润湿剂与溶剂的溶液的小瓶中，从而将润湿剂加到海绵的表面上。然后将小瓶倒转，使溶液浸入海绵中。然后取出涂覆的组合物，倒出多余的液体并风干过夜。根据说明，明胶组合物还可以包含药物，如凝血酶、纤维蛋白原、因子XIII和其他凝血因子。

EP0568334涉及含胶原的海绵，它具有可吸收性明胶海绵、胶原和活性成分。可以通过将预定量的胶原溶液转移到明胶海绵的顶部使可吸收性明胶海绵与胶原及活性成分结合。实例公开了通过将0.24或0.4mL含血小板衍生生长因子(PDGF)的胶原溶液移液到1mm明胶片的顶部制备胶原海绵。浸泡之后，优选地在室温下将海绵干燥约1小时至约5天。该专利指出，为了提高海绵的柔韧性，可以使用合适的增塑剂。

WO9306855涉及止血组合物，其包含止血有效量的因子VIIa以及生物相容的载体，如可生物降解的海绵材料。载体不含凝血酶或任何其他凝血因子。说明书公开了若干种用于制备止血海绵的材料，如胶原、明胶(如变性的明胶)、甲壳质、纤维素、聚乙醇酸和聚乙酸。可以通过用FVIIa溶液浸透干燥的海绵，然后进行冷冻干燥来制备海绵。实例公开了将5mm明胶海绵芯浸入2mL含因子VIIa的无菌水中。然后将未干燥的湿海绵敷到出血部位上。

发明内容

在多种外科手术中可使用可吸收性明胶海绵来帮助止血。当前认为，海绵的止血作用与海绵的孔隙度及其吸收血液的能力有关。此外，由于海绵的孔隙度，可以捕获血小板，并激活凝血级联反应，使可溶性纤维蛋白原转化成止血的不溶性纤维蛋白网。因此，海绵结构被认为对海绵的作用方式至关重要。使用时，可在应用于受伤组织之前将明胶海绵浸入凝血酶溶液中，以增强其止血性能。该步骤耗时、复杂，还会导致伤口接触表面处的凝血酶浓度较低。

为了便于使用，可以提供干燥形式的含凝血酶的明胶海绵。然而，根据本发明，我们发现将湿海绵干燥会导致海绵萎陷和/或海绵材料的原有形状或结构完整性发生改变。此外，根据本发明，我们还发现这种结构改变会降低海绵材料吸收血液的能力和/或海绵易适形于身体表面形状的能力。

通过将少量的含活性成分的液体吸收到海绵中，使得只有一小部分海绵被润湿，而大部分海绵保持干燥，本发明解决了这些问题；因此，在干燥步骤之后，基本上保留了海绵的原始结构特性(如厚度、纹理和外观)和柔韧性。此外，在完全浸泡的情况下，凝血酶会分散到海绵的空隙中，从而在接触伤口的海绵表面处形成低浓度的凝血酶。因此，海绵无法有效地帮助止血。有利的是，本发明提供了在海绵的表面包含高浓度凝血酶薄层的海绵。

现已公开的技术未涉及与润湿和干燥后海绵柔韧性或厚度降低有关的任何问题；也未建议或公开施加活性成分过程中施用给海绵的最佳限度的液体量。

本发明的一个目的是提供制造包含蛋白质或肽活性成分的改进的交联明胶海绵的方法，其包括以下步骤：

a)提供具有至少一个表面的交联明胶海绵；

b)将包含蛋白质或肽活性成分的液体均匀地施加到所述海绵的所述至少一个表面上，其中施加的液体体积等于或小于a)中海绵体积的5％；以及

c)干燥海绵，

从而获得在海绵的至少一个表面上具有稳定的蛋白质或肽活性成分层的柔韧的干燥交联明胶海绵。

在本发明的一个实施例中，所述液体施加步骤以单个步骤进行。

在本发明的另一个实施例中，所述液体不含ε氨基己酸。

在本发明的另一个实施例中，使用辊进行所述液体施加步骤。

在本发明的另一个实施例中，所述液体施加步骤包括以下步骤：

a)提供具有外表面的旋转辊，其中所述外表面的至少一部分接触包含所述液体的贮存器；

b)转动辊，用所述液体覆盖所述外表面；

c)使辊的所述外表面与所述海绵的所述至少一个表面接触；以及

d)相对于彼此移动辊的所述外表面和所述海绵的所述至少一个表面；

从而将所述液体沉积到所述海绵的所述至少一个表面上。

在本发明的另一个实施例中，所述外表面包括多个能够容纳所述液体的空腔。

在本发明的一个实施例中，使用液体分配器执行所述液体施加步骤。

在本发明的另一个实施例中，通过使用PipeJet^TM技术进行所述液体施加步骤。

在本发明的另一个实施例中，干燥海绵的厚度和柔韧性与原来的明胶海绵基本上类似。

在本发明的另一个实施例中，保留了原来的明胶海绵厚度的至少75％。

在本发明的另一个实施例中，在干燥步骤后，所述层的厚度等于或小于海绵总厚度的24％。

在本发明的另一个实施例中，通过选自以下的方法进行所述干燥步骤：真空烘箱、冷冻干燥和风干。

在本发明的另一个实施例中，通过真空烘箱进行所述干燥步骤。

在本发明的一个实施例中，所述活性成分包含凝血酶。在本发明的另一个实施例中，所述液体中的凝血酶活性在约2至约15,000IU/ml的范围内，在约2至约4,000IU/mL的范围内，或在约4,000至约10,000IU/mL的范围内。

在另一方面，本发明涉及改进的干燥交联明胶海绵，在所述海绵的至少一个表面上具有蛋白质或肽活性成分层，所述层的平均厚度不超过海绵总厚度的约24％，其中该层是稳定的，并基本上均匀地分布在整个所述表面上；并且海绵的厚度和柔韧性基本上类似于原来的对应未分层明胶海绵。

在本发明的一个实施例中，所述层不含润湿剂。

在本发明的另一个实施例中，活性成分包含凝血酶。凝血酶活性可以在约1至约300IU/cm²的范围内，在约10至约40IU/cm²的范围内，或在约20至约40IU/cm²的范围内。

根据本发明的海绵可用于外科手术中。在本发明的另一个实施例中，根据本发明的海绵可用于促进凝血。

本发明的另一个目的是提供包含根据本发明的无菌交联明胶海绵的包装。

本发明的另一个方面是提供促进凝血的方法，所述方法包括按照或使用根据本发明的包装将交联明胶海绵施用到伤口或出血部位上。

根据本发明的交联明胶海绵可用于促进凝血。

附图说明

参照以下具体实施方式、实例、权利要求以及附图，本发明的特征、方面和优点将变得更易理解。

图1示出了在干燥工序后部分浸入500μl盐水的明胶海绵(A，海绵编号1)与部分浸入500μl蒸馏水+0.1％NP40的海绵(B，海绵编号2)相对比的顶视图。海绵的侧视图以C和D(海绵编号分别为1和2)示出。

图2分别示出了部分浸入600μL L9+盐水+0.5％亚甲蓝(MB)和L9+盐水+0.01％NP40+0.5％MB中的编号为6(A)和7(B)的明胶海绵的顶视图。海绵的侧视图以C和D(海绵编号分别为6和7)示出。

图3分别示出了部分浸入200或600μL L9+盐水+0.5％MB中的编号为3(A)和5(B)的明胶海绵的顶视图。海绵3和5的侧视图分别示于图3C和D中。

图4示出了增加L9(20mM乙酸钠、40mM CaCl₂、110mM NaCl、0.5％w/w的人蛋白、2％w/w的甘露糖醇；pH 6.9-7.1)+0.1M NaCl的体积时，乙醇对GELITASPON^TM(商购的明胶海绵)液体吸收的影响。

图5示出了液体通过毛细管作用吸入

或自制明胶海绵(在Omrix IL制造)的动力学以及表面活性剂对海绵吸收液体的影响。

图6示出了根据干燥前海绵的液体摄入量绘制的真空干燥

明胶海绵的厚度。

图7示出了根据真空干燥海绵的厚度绘制的

明胶海绵吸水倍数。

图8示出了干燥工序后海绵的厚度与干燥工序前海绵的净液体摄入量之间的反比关系。PV-部分浸泡的海绵，然后真空干燥；PL-部分浸泡的海绵，然后冷冻干燥。

图9示出了在真空干燥的明胶海绵A，C和冷冻干燥的明胶海绵B，D内施加的活性成分层的厚度。

图10示出了自制海绵的净液体摄入量与干燥后海绵厚度之间的关系。

图11示出了从完全浸泡然后进行冷冻干燥的海绵以及部分浸泡然后真空烘箱干燥的海绵中释放活性成分的对比图。

图12示出了这些实验中使用的组装设备。1-下辊；2-上辊；3-聚丙烯网；4-基板；5-载体(5a-支承下辊，5b-支承上辊)；6-弹簧；7-螺钉；8-调节螺钉；9-调节板；10-轴；11-浴；12-海绵。

图13示出了以开放侧A或封闭侧B送入设备时，多种操作速度(20-100RPM)下

海绵的液体摄入量。

图14示出了使用L9缓冲溶液或凝血酶溶液(4000IU/ml)时海绵的液体摄入量与辊速度的关系图。将海绵以封闭侧向下穿过设备(第1次通过)，进行真空干燥，然后以开放侧向下再次穿过(第2次通过)。

具体实施方式

在一个方面，本发明提供了制造改进的干燥即用型交联明胶海绵的方法，所述海绵在其表面上具有稳定的蛋白质或肽活性成分层。

根据本发明获得的结果显示了在海绵的至少一个表面上具有蛋白质或肽活性成分层的明胶海绵的优点，其中所述海绵通过包括以下步骤的方法获得：a)提供交联明胶海绵；b)将包含蛋白质或肽活性成分的液体均匀地施加到海绵的至少一个表面上，施加的液体体积等于或小于海绵初始体积的5％；以及c)干燥海绵。

术语“包含蛋白质或肽活性成分的改进的明胶海绵”是指在至少一个表面上具有稳定的蛋白质/肽活性成分层的明胶海绵，所述层均匀地分布在海绵的整个表面上，并且海绵的厚度和柔韧性基本上类似于原来的对应明胶海绵。

术语“包含凝血酶的改进的明胶海绵”是指在至少一个表面上具有稳定的凝血酶层的明胶海绵，所述层均匀地分布在海绵的整个表面上，并且海绵的厚度和柔韧性基本上类似于原来的对应明胶海绵。

在整篇说明书中，术语“厚度”与术语“高度”是可互换的。

施加到根据本发明的海绵上的可接受的液体量计算如下：例如，当使用尺寸为2.5×2.5×1cm(6.25cm³)(相当于6250μL的体积)的海绵时，吸入海绵的液体应等于或小于312μl。当在海绵的不只一个表面上施加液体时，每个表面上的液体体积应分别等于或小于海绵体积的5％。

术语“海绵的初始体积”是指液体施加步骤之前的海绵体积。

根据本发明发现，干燥润湿的海绵会导致海绵萎陷，而且增大海绵的液体摄入量会显著影响冻干或真空干燥工序后海绵的总厚度。事实上，润湿步骤中的液体摄入量与干燥工序后的海绵厚度成反比。例如，通过使用表面活性剂增加海绵的液体摄入量会使干燥海绵的总厚度减小。

术语“表面活性剂”是指有利于润湿海绵或缩短海绵的水化时间的试剂。合适的表面活性剂的例子包括但不限于0.01和0.1％的NP40、20％的乙醇和0.02％的Tween 20。术语“表面活性剂”与术语“润湿剂”是可互换的。

这种海绵厚度的减小会导致海绵结构改变，如变形、海绵的完整性/孔隙度损坏，和/或海绵的机械特性(如柔韧性)改变。我们还发现，这种结构改变会影响海绵吸水的能力，即，通过干燥在润湿步骤中吸收了大量液体的海绵而获得的薄海绵比通过干燥在润湿步骤中吸收了少量水的海绵而制备的厚海绵吸收的水要少。

值得注意的是，将等于或小于海绵初始体积的5％的液体施加到海绵上使得液体摄入/吸收量等于或小于海绵初始体积的5％。

使用该方法可制备根据本发明的海绵，与原来的对应非分层明胶海绵相比，所述海绵具有基本上不变的吸收能力。值得注意的是，美国药典指出，可吸收性明胶海绵应吸收不小于其重量35倍的水。根据本发明发现，为了符合药典要求，初始厚度为10mm的明胶海绵(如

)在润湿和干燥后可保持等于或大于7.44mm的厚度，以便吸收不小于其重量35倍的水，即，明胶海绵润湿和干燥后的厚度损失应不大于初始高度的26％。

例如，当明胶海绵的初始厚度为10mm时，根据本发明的干燥即用型海绵的总厚度可以在约7至约9.8mm的范围内，例如约7.2、7.3、7.44、7.5、8、8.2、8.5、9和9.5mm，即海绵在润湿和干燥步骤后可以保留原来明胶海绵初始厚度的约70至约98％，例如73、74、75、80、82、85、90和95％。

此外，根据本发明发现，为了保留初始厚度的至少约74％，施加到

海绵上的液体体积如上文所述应等于或小于液体施加步骤之前海绵体积的5％，如4.5、4、3.5、3、2.5、2％。例如，据发现用2.5×2.5×1cm的海绵制备的预制干燥明胶在涂覆有活性成分时吸收少量的液体(如最多约220uL)，即计算的液体摄入量小于海绵体积的3.5％，与原来的明胶海绵相比，其机械性能(如柔韧性)和结构特性(如厚度)基本上不会改变。该海绵在其面向伤口侧上包含高度浓缩的、薄而干燥的活性成分层，可容易地将该侧与海绵的非生物侧区分开，因为与海绵的其他未处理表面相比，它在外观上孔比较少。包含活性成分的层在储存时是稳定的，并且在润湿时，活性成分会溶解和扩散出来。术语“稳定的”是指不会片状剥落的层，例如，不会断裂的层和/或不会碎成单个小片的层。

在本发明的一个实施例中，可以如下评估层的稳定性：切割特定尺寸的干燥即用型海绵，并测定其重量。然后将样本放入硼硅酸盐玻璃闪烁瓶中，使分层的表面向上，并将瓶子盖住。然后将能够保持塑料管的具有万能夹的支承架放在硬质水平表面上。将塑料管垂直插入夹具中，紧固夹具，并将固体硅树脂塞子放入塑料管的底部。将塑料块放在塞子的下面，以防止塞子在测量过程中射出。然后，使装有样本的小瓶以顶盖侧向上从塑料管的顶部落下，进行4次，然后称取样本的重量。为了排除变化性并确保标准化，所有测试中落点都相同。通过从样本的坠落前重量中减去样本的坠落后重量计算粉末损失，通过用粉末损失除以坠落前重量其结果乘以100计算样品的重量减轻百分比。例如，当样本的尺寸为约1.7cm，并进行上述稳定性测试时，可取的样本重量减轻百分比小于5％。

根据本发明还发现，冷冻干燥或真空干燥工序(两者都是目前使用的方法并适用于蛋白质/肽成分)会影响海绵表面上的层的厚度。结果显示，润湿步骤中5％的液体摄入量会导致真空干燥和冷冻干燥海绵的干燥顶层(或涂覆的活性成分层)分别为海绵总厚度的5.8-8.3％和12.5-24％。获得的结果表明，要获得具有较薄活性成分层和/或具有缓慢释放活性物质的能力的海绵，可以使用真空干燥工序。要获得具有较厚活性成分层的海绵，可以使用冷冻干燥法。

可以通过本领域已知的不会使对热工序敏感的活性成分降解或变性的任何工序进行干燥，包括但不限于真空干燥、冷冻干燥和风干，如室温干燥。

通常，与风干和冷冻干燥相比，真空干燥工序可具有若干优势。室温干燥会使含水量逐渐降低。冷冻干燥可以基本上保持海绵的原有结构，但工艺复杂而又昂贵。真空干燥是一种廉价而且快速的干燥工序，其可以基本上保持海绵的原有多孔结构。

根据本发明的发现还表明，当将凝血酶用作活性成分时，与通过部分浸泡并在真空烘箱中干燥而制备的海绵(凝血酶逐渐释放)相比，在通过完全浸泡然后冻干制备的海绵中凝血酶释放得更快。在测试结束时，两种海绵具有相似的恢复的活性，这表明在真空烘箱中干燥的部分浸泡的海绵可以保持凝血酶活性。根据本发明的方法的一个重要优点是可以基本上保持即用型海绵中活性成分的活性。

如本文所用，术语“部分浸泡”是指将液体施加到海绵的至少一个表面上，其中施加到海绵上的液体体积等于或小于海绵初始体积的5％。术语“完全浸泡”是指将液体施加到海绵上，其中施加到海绵上的液体体积大于海绵初始体积的5％。

根据本发明的海绵的另一个优点是其柔韧性。柔韧性能够使海绵易适形于要施加的身体表面的形状，相比之下，完全浸泡和干燥的海绵表现为干燥的饼干结构，柔韧性要差得多。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量海绵的柔韧性。例如，通过使用弯曲夹具(如GF-54 3点弯曲夹具(LLOYD instruments Ltd.))以及拉压试验机(如LF plus系列，LLOYD instruments Ltd，Hampshire，UK)进行三点弯曲试验。该试验测量当沿着一条轴施加反向力时，物体沿着该轴变形的倾向。

术语“蛋白质或肽活性成分”包括由氨基酸制备和通过肽键结合在一起的任何化合物。该术语包括寡肽、蛋白片段、类似物、融合蛋白等。氨基酸链可以包含其他部分，如脂质、低聚糖链。活性成分可以是天然的或合成的。蛋白质或肽活性成分的例子包括但不限于凝血因子，如凝血酶、可从蛇毒获得的蛋白水解酶、纤维蛋白原、维生素K依赖性凝血因子、因子XIII、纤粘蛋白、von Willebrand；RGD肽；生长因子，如血小板衍生生长因子、软骨诱导因子、类骨诱导因子、骨骼生长因子、胶原生长因子；细胞因子；干扰素；激素；治疗剂，如抗微生物剂、抗炎剂；抗癌药；化疗剂；止痛药；白介素；矿物质；刺激细胞迁移、附着和/或增殖的分子；酶；神经营养因子，如神经生长因子(NGF)；睫状神经营养因子(CNTF)，以及它们的组合。活性成分可以从人类或哺乳动物血浆中分离，或可以为重组的。

海绵上可以涂覆多种蛋白酶，如透明质酸酶或胶原酶，或涂覆具体蛋白酶抑制剂的多种组合，以治疗不愈合溃疡或促进皮肤再生。

涂覆到海绵上的溶液中的蛋白质或肽活性成分的量可以各不相同，从极低到超过饱和。当然，活性成分的实际用量将取决于(例如)其预期目的、其效力、患者的疾病状况、年龄和体重。根据本发明，可以将胶状溶液涂覆到海绵的表面上。理想的是，干燥工序后蛋白质或肽活性成分可基本上保留其活性。

可以通过技术人员已知的任何方法凭经验确定层中活性成分的量和浓度。例如，可以通过改进的欧洲药典检测分析(0903/1997)程序直接确定凝血酶活性，通过凝血机自动计算凝血时间，从用合适的凝血酶标准品绘制的校准曲线内插得到活性，和/或通过测量倾斜表面(或坠落试验模型)上的迁移长度间接确定活性，或通过技术人员已知的任何其他方法确定。

包含活性成分的液体可以是任何液体载体。术语“载体”是指与活性成分混合或调配以便将其涂覆到海绵表面上的稀释剂或溶媒。载体可以选自本领域已知的适于施用到体内的任何载体。载体的非限制性例子有水、氯化钠溶液(如生理盐水)和有机溶剂以及它们的混合物。

在本发明的一个实施例中，活性成分为凝血酶。在这样的实施例中，凝血酶可由初始血液组合物制备而得。血液组合物可以是全血或血液成分，即全血制品，如血浆。凝血酶可以为自体的、人类来源的(包括混合血浆)、或非人类来源的。也可以通过重组方法制备凝血酶。凝血酶可以包含作为附加活性成分的氯化钙。

溶液中凝血酶的浓度可以在约2至约15,000IU/ml的范围内，在约2至约4,000IU/ml的范围内，或在约4,000至约10,000IU/ml的范围内。溶液中氯化钙的浓度可以在约2至约6.2mg/ml的范围内，或在约5.6至约6.2mg/ml的范围内，如浓度为5.88mg/ml。凝血酶还可以包含赋形剂。如本文所用，术语“赋形剂”是指添加到溶液中的惰性物质。可将赋形剂添加到溶液中，以确保活性成分在储存后仍保持其化学稳定性和生物活性，或出于美观目的(如颜色)。赋形剂的例子包括但不限于人白蛋白、甘露糖醇和醋酸钠。溶液中的人白蛋白可以在约2至约8mg/ml的范围内。甘露糖醇的浓度可以在约15至约25mg/ml的范围内。加入溶液中的乙酸钠可以在约2至约3mg/ml的范围内。凝血酶还可以包含载体，如注射用水。

在本发明的另一个实施例中，活性成分为用L9缓冲溶液(20mM乙酸钠、40mM CaCl₂、110mM NaCl、0.5％w/w人白蛋白、2％w/w甘露糖醇，pH值为6.9-7.1)调配的凝血酶。

如实例方法中所述，在体内大鼠肾出血模型中测试明胶海绵的止血特性，其中明胶海绵通过用凝血酶溶液部分浸泡并用真空烘箱干燥制备而得。结果显示，根据本发明的方法制备并在真空烘箱中干燥的海绵在敷到出血表面上时可有效地防止失血，并且比完全浸泡并干燥的海绵更柔韧。

此外，结果还显示，包含凝血酶(作为活性成分)的根据本发明的即用型明胶海绵在体内环境中可非常有效地防止失血。例如，据发现根据本发明用凝血酶制备的海绵在止血效力方面是不含凝血酶的对照海绵的至少3倍。在本发明的一个实施例中，凝血酶和氯化钙为即用型海绵层中唯一的活性成分。术语“唯一的活性成分”是指指定的活性成分为产品功能所需的唯一的化学活性成分。在本发明的另一个实施例中，包含活性成分的层无ε氨基己酸(EACA)。

有利的是，可在单个步骤中一次性将包含活性成分的液体施加到海绵表面上。该方法使制程放大变易。可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法施加液体，包括但不限于物理吸附、毛细力、喷雾、部分浸泡、移液、将海绵压在被含活性成分的溶液饱和的辊上、通过使用具有至少一个喷嘴的滴注设备或涂敷器，或通过使用分配器(如喷雾机)或通过使用PipeJet^TM技术。在任何情况下，润湿步骤中施加到海绵上的液体体积都不应超过海绵初始体积的5％，如上文所述。在本发明的一个实施例中，通过被动毛细力施加液体。在本发明的另一个实施例中，通过将海绵压在被含活性成分的溶液饱和的辊上施加液体。根据本发明，可以使用具有外表面的任何辊，在其滚动面上具有多个能够容纳液体的空腔。这样的表面允许准确地确定每单位面积辊表面上容纳的液体体积。在本发明的一个实施例中，将空腔刻在辊的外表面上。在本发明的另一个实施例中，在辊上覆盖多孔网。空腔可以具有任何合适的几何形状，如菱形、正方形或矩形。网可以是适于与生物溶液一起使用的任何材料，如聚丙烯、聚酯。所谓“适于”是指不会与生物溶液相互作用的惰性材料。

空腔保持液体的能力会受到不同的因素影响，例如，溶液的表面张力和粘度以及辊的材料，即亲水或疏水物质。通常根据溶液的性质和辊的材料确定待使用的空腔尺寸。

也可以使用具有平滑表面的辊，通过合适的技术在其周围涂覆预定量的液体，例如通过浸泡、浸渍或使用刷子或在辊表面上喷涂液体溶液。

与要涂覆的海绵表面接触的辊外表面的至少一部分应接触包含液体溶液的贮存器。从辊外表面到海绵表面上的流体转移机制可以利用驱动力(如重力)，以帮助流体分布到海绵的整个表面上。可以通过使辊的外表面与要涂覆的海绵的表面接触，并相对于彼此移动辊的外表面和海绵表面而将液体转移到海绵表面上。在本发明的一个实施例中，沿着要涂覆的海绵表面滚动辊。在本发明的另一个实施例中，海绵紧靠辊的表面移动。

在本发明的一个实施例中，将海绵送入具有两个反转辊的设备中，该设备包括：下辊和可垂直移动的上辊，能够调节上辊与下辊之间的间隙的两个升高部分(如两颗调整螺钉)，用于旋转至少一个辊的装置(如马达)，以及用于容纳生物溶液的浴，如以下举例说明。在这样的实施例中，下辊包括多个空腔，并与包含液体溶液的贮存器接触。下辊可以是固定的，或者能够可交换地移动。

当使用以下示例的此类设备时，液体施加步骤可以如下进行：使辊之间的间隙与要涂覆的海绵厚度相匹配。然后，将设备放在硬质水平表面上，用调平工具调节设备的水平性。将液体施加到浴中，并运行设备。将速度调节至所需的转速(RPM)。一般来讲，应将速度调节至可允许施加的液体量等于或小于海绵初始体积的5％。下辊在包含液体组合物的浴中运行，它在辊的灌注结构中填层涂层材料。有利的是，将该步骤进行到实现下辊与浴之间液体平衡摄入。希望在下辊的表面上具有连续均匀的液体材料层。这可以通过使用从辊表面上去除多余材料的装置(如刮粉刀组)获得。这样，液体可以保留在多孔结构内。然后，让海绵在两个辊之间通过，生物溶液通过毛细力被动地沉积到基底的底面上。在润湿步骤中，上辊在海绵上施加压力，从而将海绵从设备中挤出，并控制海绵的液体摄入能力。在润湿步骤前后称取海绵的重量，通过从海绵润湿之前的重量中减去润湿步骤后的重量计算液体摄入量。

可根据本发明使用的另一种辊设备在美国专利4,522,057中有所公开，其内容以引用方式并入本文。结果表明，使用辊设备在海绵表面上施加液体是有利的，因为通过该技术可以控制施加到海绵上的液体。

在本发明的另一个实施例中，使用液体分配器将液体溶液施加到海绵的表面上。在本发明的另一个实施例中，使用PipeJet^TM技术将液体溶液施加到海绵表面上。该技术是一种无阀方法，用于非接触分配几纳升至最多几微升的液体。结果还表明，使用液体分配器(如PipeJet^TM技术)能以限定和准确的方式控制整个海绵表面上的液体分配量，从而在海绵表面上基本上均匀地分布含有活性成分的液体。

有利的是，不使用会在海绵上施加机械压力的注射或任何其他方法将液体溶液施加到海绵表面上；因为用这些方法施加会导致液体渗入海绵较深，使海绵表面上的活性成分分布不均匀，和/或使海绵产生相当大的变形。

在此背景下使用的术语“均匀的”代表包含活性成分的液体基本上均匀地施加到海绵的整个表面上。因此，活性成分以薄层形式均匀地分布在海绵表面上。有利的是，层尺寸相等的不同区域具有大致相同的生物活性。

合适的交联明胶海绵可以是任何可吸收性海绵产品，例如：自制的明胶海绵，如实例中所述的海绵，或使用多种市售海绵，如

GELITASPON。

制备根据本发明的即用型交联明胶海绵时，可以将润湿剂在发泡之前掺入明胶溶液中，在润湿步骤之前施加到交联明胶海绵的表面上，或包含在含有活性成分的液体中。然而，此添加不是必需的。在任何情况下，在润湿步骤中施加到海绵上的液体体积都应等于或小于海绵体积的5％。

可以根据预期用途制备和提供多种尺寸和形状的本发明的海绵，如正方形、多边形、球形、圆锥形、立方体、卵形、矩形或圆柱形。例如，可以用以下海绵尺寸制备本发明的即用型交联明胶海绵：10×10×1cm、1×1×1cm、7×5×1cm、2.5×2.5×1cm。

本发明的另一个方面涉及改进的干燥即用型交联明胶海绵，在海绵的至少一个表面上具有蛋白质或肽活性成分层。该层的平均厚度不大于即用型海绵总厚度的约24％。

层中的活性成分可以是任何适于给予患者并可诱导上述所需效应的物质。在本发明的一个实施例中，活性成分为凝血酶。在本发明的另一个实施例中，活性成分为凝血酶和氯化钙。可以使用备选量及浓度的凝血酶和氯化钙。优选地对包含活性成分的层中的量和浓度进行选择，以优化蛋白质的功效和功能。即用型海绵的层中的凝血酶活性可以在约1至约300IU/cm²的范围内，在约10至约40IU/cm²的范围内，在约20至约40IU/cm²的范围内，或为约35IU/cm²的凝血酶。

在本发明的上下文中，术语“凝血酶”包括凝血素，它是凝血酶的前体。在使用凝血素的情况下，它在即用型海绵的层中的浓度可对应于约1至约300IU/cm²的凝血酶活性。

层还可以包含上文所述的赋形剂和/或载体。赋形剂的例子包括但不限于人白蛋白、甘露糖醇和醋酸钠。在一个非限制性例子中，液体载体为注射用水。

层的特征在于它是稳定的，并且大致均匀地分布在海绵的整个表面上。可用上述稳定性测试或通过技术人员已知的任何方法评估层的稳定性。在本发明的一个实施例中，当样本的尺寸为约1.7cm²并进行上述稳定性测试时，样本的重量损失可小于5％。

根据本发明发现，可在不添加润湿剂的水溶液存在下均匀地润湿即用型交联明胶海绵。因此，在本发明的一个实施例中，即用型交联明胶海绵的层不需要润湿剂，以缩短海绵的水化时间。

根据本发明的改进的海绵的厚度和柔韧性基本上类似于原来的对应未分层明胶海绵。基本上类似的海绵可以是可保留了原来未分层海绵厚度的至少75％和原来海绵柔韧性的至少80％的海绵。

本发明的主题包括含有根据本发明的无菌即用型交联明胶海绵的密封包装，该包装能够在无污染的情况下取出贴片。该包装可以采用多种材料，如铝箔小袋等。

可以使用本领域已知的不会使对热工序敏感的生物化合物降解的任何灭菌方法，包括但不限于电子束照射、γ照射、环氧乙烷(EtO)灭菌。在本发明的一个实施例中，用(例如)γ辐射将即用型海绵和包装材料一起灭菌。

根据本发明的海绵可以按照包括任何上述海绵的套件形式提供。套件可以包括多个即用型海绵。可以将海绵装在密封的无菌包装中。此外，套件可以包括经灭菌的外科器械，例如解剖刀、止血剂和/或使用说明书。套件还可以包括无菌绷带、无菌垫、纱布和/或消毒剂。套件还可以包括无菌盐水溶液。

根据本发明的即用型海绵或套件可有利地用于外科手术，如神经外科；脑外科；组织重建和美容术，如软骨、神经和骨骼再生。即用型海绵或套件还可以用于止血、防粘连和/或用于修复和/或治疗受损组织。

在本发明的一个实施例中，将海绵涂上止血剂。如本文所用，术语“止血剂”是指能够在有效的时间内控制、减少或停止毛细管、静脉或小动脉出血(包括严重或活跃出血)的试剂，如本领域的技术人员所知。出血可因外科手术、止血障碍或其他情况而发生，例如，在具有凝血障碍或接受肝素或抗凝血剂的患者中发生。

如本文所用，“严重或活跃出血”是指大量和快速出血的情况。严重和活跃出血的例子包括但不限于因以下情况而产生的出血：动脉穿刺、肝脏切除、肾脏切除、血友病患者和接受抗凝血剂药物治疗的患者等等。

止血剂的例子包括但不限于凝血素、凝血酶、纤维蛋白、纤粘蛋白、因子XfXa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa、因子X1/XIa、因子XII/XIIa、因子XIII、因子VIII、玻连蛋白、组织因子、可从蛇毒获得的蛋白水解酶(如巴曲酶)、von Willebrand因子、纤溶酶原激活因子抑制剂、血小板活化剂、具有止血活性的合成肽、上述物质的衍生物以及它们的任何组合。

将海绵用作止血产品时，在包含活性成分的层中可包括促进血块形成的附加物质，如氯化钙。

例如，当体液不足以提供足够的海绵水化时，可以在使用前将即用型海绵浸泡在无菌盐水溶液中。作为另外一种选择，可在不首先将海绵浸泡在盐水溶液中的情况下施加海绵，而通过体液活化止血剂。

可将即用型海绵施加到所需的部位上，并在压力下保持足够的时间，使得在海绵与施用部位之间的界面处产生凝血，并基本上停止出血。

在本发明的另一个实施例中，活性成分为抗粘连剂。在这样的实施例中，即用型海绵可用于防止粘连。粘连是不希望的副作用，发生粘连时，正常情况下分离的身体组织会长在一起。这种不希望的副作用可因以下情况而发生：外科手术或非外科手术侵袭，如子宫内膜异位、感染、创伤、化疗、辐射和癌症。通常，抗粘连剂是指能够形成物理屏障(涂层)的试剂，该物理屏障将手术部位的相邻组织分开，从而防止和/或减少术后粘连的形成。

海绵还可以包含一种或多种蛋白质或肽活性成分，并用作药物递送体系。

术语“药物递送体系”是指掺入海绵中的活性蛋白或肽的递送允许在体内的具体组织中受控地递送蛋白质或肽。

根据本发明制备的海绵具有以下优点中的至少一个：保持原有的柔韧性、纹理、多孔结构的完整性，活性成分在与伤口接触的界面处作为薄层以高浓度存在，层稳定，以及性能稳健。

技术人员能容易地理解在本发明描述中公开的范围。这表示公开了范围界限之间的连续值和数字，包括具有中间子范围的所有组合的限制数字和值。

以上或以下引用的专利申请、专利和出版物的公开内容在此均以引用方式并入。

以下实例为示例性的，而非限制性的。

实例

方法

冷冻干燥过程。使用CHRIST，EPSILON 2-8D冻干机按照下列步骤进行冻干过程：将搁板温度降至-45℃维持2小时。接下来，将温度降至-50℃再维持30分钟。然后，将搁板温度保持在-50℃维持5小时。接着在-15℃和0.14mbar下升华最多24小时。然后，将搁板温度增至+25℃，将压力降至0.02mbar，并进行第二次干燥，持续最多24小时。

真空干燥过程。在0.1bar或更低的压力下在设置为室温的烘箱(ShelLaB 1430-2E型)中持续3至4小时完成真空干燥过程。

明胶海绵(自制海绵)的制备。将30g明胶片(PB明胶；药用明胶，得自猪皮的A型，250勃鲁姆(Bloom)，8目；目录号1154)加入500ml蒸馏水中。将分散体加热到60℃直到明胶完全溶解。然后将溶液(6％w/v)冷却到50℃并转移到搅拌碗(KitchenAid Heavy Duty KSM 150型)中，在速度6下将溶液搅拌约2分钟，直至形成体积为明胶溶液原体积的6-8倍的稳定泡沫。将泡沫倒进金属模具(21×30cm，深1.5cm)中。为了使泡沫硬化，将模具放在4℃下1小时。之后，将模具转移到隔板预冷(4℃)的冻干机中。如上所述进行冷冻干燥过程。干燥过程后，将干燥的海绵在160℃和大气压下交联3小时。

凝血酶从海绵的释放。将海绵(2.5×2.5×1(厚度)cm)浸入装于50ml聚丙烯管的10ml缓冲液(0.4％无水柠檬酸三钠、154mM氯化钠和1％BSA)中。在室温下将聚丙烯管置于辊上。

通过在多个时间点测定缓冲液中恢复的凝血酶活性来测量凝血酶从海绵的释放。根据以下改进的欧洲药典检测分析(0903/1997)程序测定凝血酶凝结活性。简单地说，将每种凝血酶标准溶液(4、6、8和10IU/ml；OmrixIL；按照美国专利5,143,838和欧洲专利378,798中所述的方法制备)在30℃下孵育2分钟。然后从每个标准溶液中取40μl凝血酶溶液与160μl纤维蛋白原溶液(0.1％，Enzyme research Laboratories，目录号FIB1)混合，并测定凝结时间(Haemostaisi分析仪：Diagnostica Stago；型号Start)。绘制凝结时间的对数相对于凝血酶浓度的对数的校准曲线。然后，从管中取出0.3ml样品，其中40μl用于测定(回加相同量的缓冲液以补偿样品体积)。在实验开始后的下列时间点：2、5、10、15、30、45和60min一式两份进行测定。通过测得的凝结时间(由凝血机自动计算，由校准曲线内插并乘以稀释因子)确定每个样品中的凝血酶活性。

大鼠肾出血模型。根据当前的伦理要求，将体重为350-500g的Sprague Dawley白化大鼠关在经批准的设施中。确定每只动物的健康状况，只将明显健康的动物用于试验。收到动物后，使它们接受至少5天的驯化期。为动物随意提供购买的啮齿动物饲料，并使它们可自由饮水。通过腹膜内注射戊巴比妥(Pental)(30-50mg/kg)将动物麻醉。之后，在动物的左侧刮去毛以实施腰椎旁剖腹术。用乙醇擦拭刮毛部位。为了维持38-40℃的温度，将大鼠放在位于预热到40℃的水浴上的塑料盖板上。将测温探针插入动物的直肠并监测体温。将动物横放，将肝素钠(2000ILVKg)通过尾静脉注入。从左髋到第12肋制作一条左腰椎旁切口，将左肾暴露并与肾周脂肪分离。重新定位大鼠，使其背卧，并稳定5分钟的时间，或直到体温达到39℃的极限。在从腹取出的肾和切开的腹壁之间，用软血管夹闭塞肾血管，将纱布垫塞进切口的背侧，以吸收任何从切口或从肾后的腹腔流出的血液或体液。将一片预切的透明塑料放到纱布垫顶部以将血流从肾导进纱布垫。将另外一片或两片正方形纱布放在塑料平台的底部，用软血管夹闭塞肾血管。实施矢状半肾切除术，垂直于肾血管移切除肾的远侧整半。将肾切下部分的切口表面在一张滤纸上印三次以测量切口的表面积。对三个肾印迹的每一个进行描图，以帮助测定表面积。将留下的肾的切口表面吸干。在压力下将明胶海绵敷到肾的切口表面上1分钟，然后释放肾血管夹。在1小时内观察肾的出血情况。当血液流出海绵时，用纱布轻轻蘸吸出血区域。从出血表面移去明胶海绵导致了再次出血，表明止血是因采用了明胶海绵而发生的。通过对被血浸湿的纱布垫称重以评估肾血损失。通过CO₂窒息对存活的动物实施安乐死。

蛋白质层的稳定性评估。稳定性评估测定海绵的蛋白质层的脆性。采用模切机从交联的即用型明胶海绵上切下约1.7cm的样品，并测定其重量。然后将样品放入硼硅酸盐玻璃闪烁瓶(Fisher Scientific；目录号03-337-4)中，使带涂层的表面向上，将瓶子盖上。将能够保持塑料管(48英寸长，1.625英寸直径)的具有万能夹的支承架放在硬质水平表面上。将塑料管垂直插入夹具中，紧固夹具，并将固体硅树脂塞子(Fisher Scientific；目录号09-704-IP)放入塑料管的底部。将塑料块放在硅树脂塞子的下面，以防止塞子在测量过程中弹出。然后，将装有样品的瓶以顶盖向上从塑料管的顶部落下。为了排除变化性并确保标准化，进行每次下落时落点相同。样品落下4次后，将样品称重。通过从落下前的样品重量减去落下后的样品重量计算粉末损失。根据以下公式计算样品的重量减轻百分比：

少于5％的重量减轻被视为不会从海绵表面剥落的稳定层。

8000和4000IU/ml凝血酶溶液的制备。

1000IU/ml凝血酶溶液(Omrix，IL；如美国专利5,143,838和欧洲专利378,798中所述进行制备)的浓缩和渗滤使用10K Omega^TM超滤膜圆盘过滤器(序列号39182101)进行，从而获得8000IU/ml的凝血酶溶液。通过用L9缓冲溶液稀释8000IU/ml的溶液(1∶1的比率)以制备4000IU/ml的凝血酶溶液。使用上述指定的过滤器进行L9缓冲溶液的浓缩和渗滤。

三点弯曲测试。此测试提供弹性模量值，弹性模量度量当沿着一条轴对物体施加力时，物体沿着该轴向相反方向变形的趋势。使用弯曲夹具(GF-54 3点弯曲夹具(LLOYD instruments Ltd.))进行测定。一旦将夹具的弯曲中心调整到40mm的跨度后，即将标本放到其上，在整个弯曲测试期间向标本施加压缩力(LF plus系列，LLOYD instruments Ltd，Hampshire，UK)。将延伸速率设为15mm/min。进行弯曲测试，直到标本破裂。

实例1：海绵对液体的摄入与真空干燥过程后明胶海绵的厚度及外观的 关系。

此实验的目的是确定海绵对液体的摄入对干燥后海绵厚度和外观的影响。将非离子表面活性剂NP40加入液体配方中，以改变海绵对液体的摄入。为此，将7×5×1(厚度)cm的

海绵(由Johnson &Johnson提供；目录号MS 0002)切成2.5×2.5×1cm的大小。将这些重量为80-90mg的海绵放进具有各种液体配方和体积的塑料托盘(3×3×0.2(深度)cm)中3分钟。下表1列出了本研究的设计。水化因毛细管作用而发生。通过在润湿过程前后对海绵称重来定量监测海绵对液体的摄入(其中1mg被视为1μl)。此后，如上所述将海绵在真空烘箱中干燥，并测量它们的厚度。下表1详细列出了结果。

表1：在不同的配方中海绵对液体的摄入以及干燥过程后海绵的厚度。

*L9组成-20mM醋酸钠、40mM CaCl₂、110mM NaCl、0.5％w/w人白蛋白以及2％w/w甘露糖醇；pH 6.9-7.1。

**MB-亚甲蓝(Spectrum Chemicals and Laboratory Products；目录号ME141，USP-25g)。

A.海绵对液体的摄入对真空干燥后海绵厚度的影响。

分别将1和2号海绵部分地浸在500μl生理盐水和蒸馏水+0.1％NP40中。对海绵的液体摄入量的测定表明，与生理盐水浸泡的明胶海绵相比，在含有蒸馏水+0.1％NP40的流体中部分浸泡导致了更高的液体吸收以及真空干燥后海绵厚度的明显降低(1号和2号海绵；分别为457.8mg液体摄入量和3.7mm厚度以及118.4mg液体摄入量和9mm厚度)。表1列出了液体摄入量和海绵厚度。

图IA-B示出了干燥过程后，与部分浸入蒸馏水+0.1％NP40(B；2号海绵)的海绵相比，部分浸入生理盐水(A；1号海绵)的海绵的顶视图。结果显示，海绵B发生了扭曲和收缩，特别是在其吸收液体的上侧。在海绵的侧视图中，明显可以看出2号海绵比1号海绵薄(分别为图ID和C)。这表明干燥后的海绵厚度与液体摄入量成反比。

当比较6号和7号海绵(分别为600μ1的L9+生理盐水+0.5％亚甲蓝(MB)和600μl的L9+生理盐水+0.01％NP40+0.5％MB)时，结果表明，7号海绵比6号海绵多吸收了3倍以上的液体(分别为567.8和164.7mg)。如在之前的实验组中所示，7号海绵的高液体摄入量导致了真空干燥后海绵厚度的明显降低(与6号海绵的8.25mm厚度相比，其厚度为4.75mm)。6号和7号海绵的顶视图(分别为图2A-B)显示，与6号海绵相比，7号海绵发生了收缩。侧视图显示，与6号海绵相比，7号海绵更薄并发生了扭曲(分别为图2C和D)。这是由于海绵的高液体摄入量所致，导致了海绵在干燥期间萎缩。

另外，比较分别部分浸入200μl L9+生理盐水+0.5％MB和200μlL9+生理盐水+0.01％NP40+0.5％MB的3号和4号海绵，结果显示，由于表面活性剂的存在导致了液体摄入量的增加。

以上结果表明，将表面活性剂(如NP40)加入溶液会缩短海绵的水化时间。包含表面活性剂导致了液体组合物中表面张力降低，继而导致海绵对液体的摄入量增加。据观察，这导致了真空干燥后海绵厚度的显著降低。因此，与不含表面活性剂的相同组合物的水化时间相比，当使用含有表面活性剂的组合物时，浸泡时间应缩短，以避免干燥收缩和海绵变形。

B.在润湿期间液体渗入海绵的深度对干燥步骤后海绵厚度的影响。

在另一组实验中，将

海绵放进装有200或600μl L9+生理盐水+0.5％MB的托盘中(分别为3号和5号海绵)(海绵的尺寸和托盘如上所述)。

结果显示，与3号海绵相比，5号海绵吸收了约3.5倍的液体(分别为44mg和161.2mg摄入量)。与3号海绵相比，5号海绵的高液体吸收率导致了海绵的强染色(图3A-B分别示出了3号和5号海绵的顶视图)。

图3C-D分别示出了3号和5号海绵的侧视图。上述结果表明，浸泡期间在托盘中存在的体积可影响海绵对液体的摄入。由于液体渗入深度相对较浅(对于3号和5号海绵，分别为初始高度的0.704和2.57％)，因此两种海绵在真空干燥后发生的萎缩极小(分别为9和8.25mm)。

实例2：乙醇对明胶海绵的液体摄入的影响。

上述实例示出了海绵通过毛细管作用摄入液体会受到液体类型的影响(如表面活性剂的加入)。还观察到，增加的液体摄入量导致了干燥收缩的显著减少。实施以下实例以进一步探究将表面活性剂加入润湿组合物的影响。将乙醇和GELITASPON(Gelita Medical；目录号GS010 Standard10；大小80×50×10mm)用于这些实验。将海绵切成2.5×2.5×1cm的大小，并放入装有各种体积的含或不含20％乙醇的L9+0.1M NaCl的塑料托盘(3×3×0.2cm(深度))中。将海绵孵育15分钟并称重。下表2详列了本研究的设计。

表2：测试组的构成。

液体体积(μL)	液体
		250	L9+NaCl 0.1M
250	L9+NaCl 0.1M+20％乙醇

400	L9+NaCl 0.1M
		400	L9+NaCl 0.1M+20％乙醇
550	L9+NaCl 0.1M
		550	L9+NaCl 0.1M+20％乙醇
700	L9+NaCl 0.1M
		700	L9+NaCl 0.1M+20％乙醇

图4中汇总的结果确证了之前的结果，并表明表面活性剂(如20％乙醇)的加入会导致海绵的液体摄入能力的改变。

实例3：表面活性剂对凝血酶凝结活性的影响。

本实例的目的是确定加入表面活性剂对凝血酶活性的影响。为此，将0.8ml凝血酶溶液(1000IU/ml；Omrix IL)与0.2ml 95％的乙醇混合。将此混合物在室温下孵育至多60分钟，每15分钟测定一次凝血酶活性。在对照组中，用蒸馏水代替乙醇。根据在上面方法章节中指定的改进的欧洲药典检测分析(0903/1997)程序测定恢复的凝血酶活性。表3汇总了不同时间点在配方中恢复的凝血酶活性。

表3：不同时间点恢复的凝血酶活性。

在含有乙醇的配方中恢复的活性与在对照组中恢复的活性相似。这些发现表明20％的乙醇不会影响凝血酶的凝结活性。

实例4：各种海绵通过毛细管作用吸入液体的动力学。

此实例阐述海绵吸入液体的动力学。吸收因毛细管作用而进行。在两种不同来源的海绵中开展此实验：

(80-90mg)或自制海绵(如上所述在Omrix IL制造)。将海绵放进装有400μl L9缓冲液+0.1M NaCl的塑料托盘(3×3×0.2cm)中。此外，将

海绵放进装有400μlL9缓冲液+0.1M NaCl+0.02％Tween 20的另一配方中。通过在各时间点对海绵称重来监测液体吸收。

结果表明，在配方中添加0.02％的Tween 20明显降低了润湿海绵所需的水化时间，并增强了

海绵的液体摄入能力。另外，结果还表明，与

海绵相比，自制海绵吸收液体的速度更快(图5)。

实例5：海绵的液体摄入对真空干燥后海绵厚度的影响。

已发现，海绵液体摄入的增加会导致真空干燥后海绵厚度的减小。这些结果通过以下实验组进行验证。将2.5×2.5×1cm的

海绵(从5×7×1cm切取)放进装有各种液体体积的L9+0.1M NaCl的托盘(3×3×0.2cm)中3分钟。润湿步骤后，如上面方法章节中所述，将海绵在真空烘箱中干燥。下表4详细列出了托盘中的液体体积、干燥的海绵重量、液体摄入量和真空干燥海绵的厚度。图6示出了相对于海绵的液体摄入量绘制的真空干燥过程后海绵的厚度。此结果确证了之前的结果，并表明真空干燥过程会导致过度润湿的海绵萎缩。因此，尤其有利的是，将含有蛋白质或肽活性成分的少量液体施加到海绵的一个表面上。使用少量的液体施加活性成分导致了海绵在该表面上具有蛋白质或活性成分的薄层；并且基本上保留了海绵的原有特性(高度、纹理和外观)。

实例6：干燥后海绵厚度对海绵吸水能力的影响。

为了检查干燥步骤后海绵的厚度对其液体吸收能力的影响，按照美国药典(USP)将上述真空干燥的海绵(得自实例5)浸入蒸馏水中2分钟。在浸泡过程前后对海绵称重。下表4列出了海绵厚度、真空干燥的海绵重量、成品的水吸收和海绵的吸水能力。按照以下公式计算海绵的吸水能力：(成品的净水吸收-真空干燥后的干重)/真空干燥后的干重。图7中示出了相对于厚度绘制的海绵吸收倍数。结果表明，海绵吸收流体的能力与真空干燥过程后海绵的厚度成正比，即薄海绵比厚海绵吸收的流体少。

根据美国药典，可吸收性明胶海绵应吸收不少于其重量35倍的水。为了满足药典要求，

海绵应保持等于或大于7.44mm的厚度，即这些海绵在干燥过程中的损失量不应超过其初始高度的25％。另外，为了获得等于或大于7.44mm的厚度，海绵的液体摄入应等于或小于219μl(根据实例5；图6)。对海绵的液体摄入进行计算，结果显示，为了保持其原有结构并避免可能在干燥后发生的变形，海绵的液体摄入量可等于或小于干燥步骤前海绵体积的3.5％。

表4：液体摄入对真空干燥后的海绵厚度以及真空干燥的海绵的吸水能 力的影响。

*按照以下公式计算海绵的吸水能力：(成品的净水吸收-真空干燥后的干重)/真空干燥后的干重。

实例7：比较冷冻干燥和真空干燥过程后的海绵厚度。

前面的实例表明，真空干燥过程会导致润湿的海绵发生收缩。实施以下实例，以验证上述结果并检查冷冻干燥和真空干燥过程对海绵厚度的影响。使用两种不同的明胶海绵进行实验：市售海绵(5×7×1cm

海绵)和自制海绵(如上所述进行制造)。

将两种海绵切成2.5×2.5×1cm的大小、80-90mg的重量，放进装有体积渐增的L9+0.1M NaCl的塑料托盘(3×3×0.2cm)中三分钟。测定润湿步骤后海绵的重量并计算净液体摄入。

此后，将

进行真空烘箱干燥或冷冻干燥(如上所述)，将自制海绵通过真空烘箱进行干燥。干燥过程后测定海绵的厚度。

图8示出了干燥过程后市售海绵

的厚度与浸泡步骤中净液体摄入的反比关系。PV-部分浸泡的海绵，接着进行真空干燥；PL-部分浸泡的海绵，接着进行冷冻干燥。

结果显示，净液体摄入的增加导致了干燥过程后海绵厚度的减小，其程度在冷冻干燥和真空干燥过程间相似。然而，当比较施加的活性成分的层厚度时，结果显示，与冷冻干燥过程(图9B、D)相比，真空干燥(图9A、C)产生了更薄的层。真空干燥海绵的干燥顶层为干燥海绵总厚度的5.8-8.3％，相比之下，冷冻干燥海绵的相应值为12.5-24％。在每张图的顶部用黑色方块标记所施用材料的厚度层。

图10展示了自制海绵在浸泡步骤中的净液体摄入与干燥后海绵厚度之间的关系结果。这些结果与之前的结果一致，表明在浸泡步骤中的液体摄入与干燥过程后海绵厚度之间成反比关系，即干燥步骤导致了过度润湿的海绵收缩。这些结果突出了以非常薄的层施加液体组合物的优势。

实例8：活性成分从不同明胶海绵上的释放。

实施以下实例，以确定活性物质从明胶海绵的释放，并评估海绵的体内性能。为此，按照如下方法将2.5×2.5×1cm的

明胶海绵完全或部分地浸泡：对于完全浸泡的海绵：将2ml凝血酶溶液(1000IU/ml)加入20ml L9缓冲液中以得到90IU/ml的溶液。将海绵润湿、揉捏并浸入此溶液中约1分钟。海绵吸收了约2.5ml溶液，对应于35IU/cm²(225IU/平方英寸)。将部分浸泡的海绵浸入装有400μl凝血酶溶液(1600IU/ml)的3×3×0.2cm塑料托盘中约3分钟。通过毛细管作用吸收溶液。这样，海绵平均吸收了140mg液体，对应于225IU/平方英寸。之后，将完全浸泡的海绵进行冷冻干燥，将部分浸泡的海绵在真空烘箱中干燥(按照上面方法章节中所述，完成两个干燥过程)。

如方法章节中所述，通过在各个时间点测定凝血酶凝结活性来测试凝血酶从海绵的释放。

结果表明，对于通过完全浸泡然后进行冷冻干燥制备的海绵，其释放凝血酶的速度比通过部分浸泡然后在真空烘箱中干燥制备的海绵更快，其中凝血酶是逐渐释放的。另外，结果还显示，在测试结束时，两种海绵具有类似的恢复活性，表明通过部分浸泡然后在真空烘箱中干燥制备的海绵保留了凝血酶活性(图11)。

通过测定如上所述的大鼠肾出血模型中的失血，完成这两种明胶海绵的止血特性的体内评估(完全浸泡然后进行冷冻干燥(A)和部分浸泡然后在真空烘箱中干燥(B))。表5给出了结果。

表5：在使用不同明胶海绵的大鼠肾模型中的失血。

*使用t检验分析在0.05的显著性水平上未发现这两个组之间存在统计差异。

*用含有35IU/cm²凝血酶的

明胶海绵进行所有实验。

趋势显示部分浸泡的海绵比完全浸泡的海绵在防止失血方面更有效。另外，部分浸泡的海绵与完全浸泡的海绵相比，在干燥步骤后更具有延展性。

实例9：通过部分浸泡和真空干燥制备的明胶海绵达到的止血功效。

此实例使用上述大鼠肾出血模型评估通过部分浸泡和真空干燥制备的即用型明胶海绵的止血特性。

按照实例8(部分浸泡的海绵)所述制备明胶海绵。施加到海绵的伤口接触表面上的凝血酶总量为35IU/cm²。表6汇总了使用即用型明胶海绵的失血。

表6：在使用不同明胶海绵组成的大鼠肾模型中的失血。

*A组对B组，p＝0.0091，使用t检验分析。

*用含有35IU/cm²凝血酶的

明胶海绵进行所有实验。将不含凝血酶的

海绵用作对照组。

上述数据表明，含有凝血酶(组成B)的明胶海绵比对照明胶海绵(组成A)在防止失血方面更有效，即，使用在海绵的一个表面上具有凝血酶薄层的明胶海绵明显减少了失血。

实例10：辊设备：结构和操作技术。

结构：使用下列组件组装辊设备：

-两个辊(60mm长，20mm直径)。其中一个辊用聚丙烯网(参见图12中的标号3；对角线尺寸：1100μm)覆盖，并用作下辊。

-浴[外部尺寸：38×72×15mm(W×L×H)]。壁厚为3mm。浴可装最多9.5ml的液体。

-能够改变上辊与下辊之间的间隙的调节单元。此单元由两颗螺钉和两个调节板组成(每侧一个)。

-支持整个结构的基板。

-速度在5到200RPM范围内的马达。

使用在辊每一端的两个支撑件(5a-b)，在基板4上将两个辊设置为一个在另一个之上(分别用1和2表示下辊和上辊)。5a-支撑下辊，5b-支撑活动的上辊。

在组件5a和5b之间，存在弹簧6(每侧两个)；以保持组件5a和5b之间的间隙。

使用螺钉7(辊每端两个)；将支撑件固定到基板上。下辊在y轴上是固定的，上辊能够在下辊上方在y轴上往复运动。在每个支撑件的中央具有调整螺钉8，其能够移动组件4b，从而导致两辊之间的间隙变窄或增宽。调节板9支持此调整螺钉。轴10通过组件5a连接到下辊。轴通过马达旋转，其速度可控。启动设备可使两辊以相反方向旋转。将浴11设置在下辊的下方。在基板的下面，每个拐角都具有螺钉(未示出)，用于将设备校平。辊设备适于下列范围内的任何基底：宽度：最多60mm；长度：不限；厚度：片状，最多30mm。可调整设备的尺寸，以适于具有各种宽度和厚度的任何基底。

操作技术。调整下辊与上辊之间的间隙，将设备设置在硬质水平面上，使用校平工具调平。将溶液(约9.5ml)倒入浴中，操作设备约5分钟以在下辊和浴之间达到液体平衡摄入。然后，让海绵通过两个辊(参见图12中的标号12)，溶液通过毛细力被动地沉积到海绵的底侧上。在润湿步骤中，上辊将压力施于海绵上，以此使得从设备中推出海绵并控制海绵的液体摄入能力。在润湿过程前后对海绵称重，并通过从润湿之前的海绵重量减去润湿步骤之后的海绵重量来计算液体摄入量。在进行另外的进料之前，将溶液加到浴中以维持储量，并操作辊以在下辊和浴之间达到液体平衡摄入。

图12示出了在这些实验中使用的组装设备。1-下辊；2-上辊；3-聚丙烯网；4-基板；5-支撑件(5a-支撑下辊和5b-支撑活动的上辊)；6-弹簧；7-螺钉；8-调节螺钉；9-调节板；10-轴；11-浴；12-海绵。

实例11：对市售海绵的厚度测量。

在将海绵喂入辊设备前，需要调整上辊和下辊之间的间隙。由于海绵的厚度可能存在变化，因此使用数显卡尺来测量21个海绵(

5×7×1cm)的厚度。在海绵的中央进行测量。表7列出了结果。

表7：市售海绵的厚度。

结果表明海绵的厚度存在变化；因此，在让海绵通过设备之前监测其厚度是有利的。由于平均厚度为10.1±0.45，因此，自此以后将辊之间的间隙调为10mm。

实例12：使用辊设备施加凝血酶涂层。

本实例阐述了可通过使用辊设备控制在润湿过程中海绵对液体的摄入体积。

观察海绵的质地剖面，在海绵的不同区域间存在变化：海绵的上部区域密度低，具有大孔(本文称为“开口侧”)，而底侧更致密，具有较小的孔(本文称为“闭合侧”)。

如上所述操作设备(实例10)。将海绵(

5×7×1cm)插入设备，使开口侧向下。将浓缩的凝血酶溶液(8000IU/ml)用作涂层溶液。将辊速设为20RPM。表8示出了在两组实验中的凝血酶溶液摄入。

表8：摄入海绵开口侧的凝血酶。

结果显示在所有的测试海绵中，凝血酶摄入基本相同。使用浓度为4000IU/ml的凝血酶溶液对这些结果进行验证。在此研究中，如下所述进行液体施加步骤：将海绵开口侧向下(

5×7×1cm)喂入设备，在真空烘箱中在约0.4mbar的压力下干燥3小时，再次让海绵以闭合侧向下通过设备。将辊速设为20RPM。在每次喂入前后对每个海绵称重，并计算净重。在下表9中展示了结果。

表9：凝血酶摄入海绵的开口侧和闭合侧。

此研究的结果与之前的结果一致，表明辊设备是一种将液体施加到海绵表面上的有效方法。

实例13：在液体施加步骤期间辊速对海绵的液体摄入的影响。

此研究的目的是确定辊速对海绵的液体摄入的影响。使用从20至100RPM的渐增辊速进行评估。在实验期间，将海绵(

5×7×1cm)以开口侧或闭合侧向下插入设备。按照实例10所述的方法操作设备。使用经超滤的L9缓冲溶液将浴充满。

图13示出了将海绵以开口侧A或闭合侧B喂入设备时，在各种操作速度下海绵的液体摄入。

显然的是，当将海绵以开口侧向下插入设备时，辊速的增加对液体摄入具有显著的影响。结果显示，海绵的液体摄入与速度成正比。相比之下，当将海绵以闭合侧向下插入设备时，未观察到液体摄入的显著差异。

此外，如本实例中所示，与开口侧相比，在所有测试速度下，海绵的闭合侧都表现出低液体摄入。这些结果表明海绵的密度会影响其液体摄入能力；与致密海绵相比，低密度海绵通常具有更多的气孔，因此能够吸收更多的液体。

注意，在实例12中，与开口侧相比，闭合侧表现出略高的液体吸收(分别为137.74±6.3和163.75±10.0)。在此实验中，开始时将海绵以开口侧向下插入设备，接着进行干燥，然后以闭合侧向下喂入设备。这些在前的步骤似乎改变了海绵的液体摄入能力。

此实例表明，可通过改变辊速来调节施加到海绵上的液体水平。

实例14：海绵和溶液的特性对海绵的液体摄入能力的影响。

前面的实例表明，海绵的密度会影响其液体吸收能力。进行以下实例，以验证这些结果并进一步评估溶液特性(如粘度)对液体摄入的影响。如上所述操作设备。用L9缓冲溶液或如上所述制备的凝血酶溶液(4000IU/ml)将浴充满。润湿步骤如下：将海绵(

5×7×1cm)以闭合侧向下通过设备(第一次通过)，接着如方法章节中所述进行真空干燥，然后再次以开口侧向下通过设备(第二次通过)。使用与第一次喂入时相同的溶液进行第二次喂入。在每次喂入前后对每个海绵称重，并计算净重。在不同的辊速(40至140RPM)下进行此过程。

图14示出了使用L9缓冲溶液或凝血酶溶液(4000IU/ml)时海绵的液体摄入与辊速的关系。

结果确证了之前的结果，并表明与海绵的开口侧相比，海绵的闭合侧(更致密侧)吸收的液体更少。此外，同样显而易见的是，如上所证实，不像开口侧，闭合侧在不同的辊速下表现出类似的液体摄入。

而且，当使用凝血酶溶液作为润湿溶液时，在海绵的两侧都观察到了较高的液体摄入。这可能是由于溶液的粘度差异(对于L9和凝血酶溶液，分别为0.95和1.31cPs)所致。按照制造商说明，使用玻璃毛细管粘度计在25℃下测定粘度。测得的结果表明在高粘度溶液中的液体摄入大于在低粘度溶液中的液体摄入。

实例15：使用PipeJet ^TM 技术施加凝血酶涂层。

以下实例展示使用PipeJet^TM技术将凝血酶溶液施加到明胶海绵上。该技术是一种无阀方法，用于非接触分配几纳升至最多几微升范围内的液体。连接到贮存器的分配器包括活塞(“压电叠堆致动器”)和聚合物软管(“管”)。将活塞靠着管子压下，从喷嘴中排出液体。当施加溶液时，移动基底，将液体分布在海绵的表面上(分配器是固定的)。首先将支持海绵的平台在y轴上移动，然后在x轴上移动一步(下面指出了落点之间的距离)。重复这两个步骤直到完全覆盖海绵。在每个停止点释放一滴。通过致动器振幅控制由PipeJet^TM方法分配的体积。使用重量在430到448mg之间的7×5×1cm

海绵进行两组实验。在第一组实验中，使用的分配器管内径为200μm，按以下参数对喷射编程：给液频率：37Hz；液滴体积：7nl；在x轴上液滴之间的距离：0.4mm；在y轴上液滴之间的距离：0.4mm。此组包括4个不同的海绵；两个在其开口侧上被覆盖，两个在其闭合侧上被覆盖。在第二组实验中，使用的分配器管内径为500μm，按以下参数对喷射编程：给液频率：90Hz；液滴体积：44nl。此组包括四个不同的海绵，对于其中三个海绵(一个涂覆在其开口侧上，两个涂覆在其闭合侧上)，将距离设置如下：x轴-1mm；y轴-1mm。另外的海绵(样品8)在其开口侧上被覆盖，其中将x轴上的距离设为1mm，将y轴上的距离设为0.4或1mm(在第一行中使用0.4mm的距离，在第二行中使用1mm的距离，等等)。

在这两个实验中，使用的涂层材料为含有0.01％靛蓝胭脂红(Amresco编码目录号9827-25g)的8000IU/ml凝血酶溶液，将处理速度设为1500步/秒，分配的总体积为150μl，并使用Pipejet^TMP9模块。液体施加步骤后，如上所述对海绵进行真空干燥。

目视检查干燥的海绵，结果显示，在每个海绵中，凝血酶层相对均匀地分布在海绵的整个表面上。为了定量层的均一性，从干燥海绵(评估每个实验的两个海绵)的拐角和中部切下两个样品(1.5×1.5mm)，并按照方法章节中所述测定凝血酶活性。对每个样品计算样品面积(100％)预期的凝血酶活性百分比。下表10列出了对拐角和中央样品测得的活性之间的Δ值。

表10：凝血酶在整个海绵表面上均匀分布。

结果显示，在每个海绵的拐角和中央样品中凝血酶活性基本相同(在所有测试海绵中，观察到小于3的Δ值)，表明活性成分均匀分布在海绵表面上。这些结果证明，PipeJet^TM技术是一种有效和准确的方法，其能够控制分配的体积，从而使得含有活性成分的液体在海绵的表面上均匀分布。

实例16：蛋白质层在海绵表面上的稳定性。

此实例检查凝血酶层在即用型明胶海绵表面上的稳定性。为此，使用如上所述的辊设备，将150μl凝血酶溶液(8000IU/ml，如上所述进行制备)施加到海绵(7×5×1cm)的开口侧。润湿步骤后，如方法章节中所述将海绵进行真空干燥。按照方法章节中所述进行稳定性测试。在如上所述制备的两种不同海绵上进行测量。从每个海绵单独取下3到4个不同的样品。下表11展示了结果。

表11：蛋白质层的稳定性。

结果显示对于海绵I和II，海绵的重量减轻分别为1.14％和1.90％。

这些结果表明蛋白质层是稳定的并且蛋白质不会发生片状剥落，蛋白质层是连续的，不会断裂和/或碎成单个的小片。

实例17：海绵摄入的液体体积对其机械性能的影响。

以下实例评估海绵摄入的液体体积对海绵的原有特性(如柔韧性)的影响。

为此，将

海绵切成5.5×2×1cm的大小并部分浸入装有L9缓冲溶液的托盘(3×3×0.2(深度)cm)中，直到获得74、111和176μL的摄入。不向对照

海绵施加液体。在润湿步骤前后测定海绵的重量。然后，将海绵真空干燥，测量其高度，并进行三点弯曲测试(参见上文的方法章节)。下表12列出了润湿步骤中的液体摄入、干燥步骤后的海绵厚度以及即用型海绵的弹性模量。

表12：即用型海绵的弹性模量。

结果显示，测试的所有样品具有大致相同的弯曲强度，从而表明在润湿和干燥步骤后，基本上保留了即用型海绵的柔韧性。

Claims (24)

1.一种制造包含蛋白质或肽活性成分的改进的交联明胶海绵的方法，包括以下步骤：

a)提供具有至少一个表面的交联明胶海绵；

b)均匀地将包含蛋白质或肽活性成分的液体施加到所述海绵的所述至少一个表面上，其中施加的所述液体的体积等于或小于a)中所述海绵的体积的5％；以及

c)将所述海绵干燥，

从而获得柔韧、干燥的交联明胶海绵，所述海绵在其至少一个表面上具有稳定的蛋白质或肽活性成分层。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体施加步骤在单个阶段中进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体不含ε-氨基己酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过使用辊进行所述液体施加步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述液体施加步骤包括以下步骤：

a)提供具有外表面的旋转辊，其中所述外表面的至少一部分与含有所述液体的贮存器接触；

b)旋转所述辊以用所述液体覆盖所述外表面；

c)使所述辊的所述外表面与所述海绵的所述至少一个表面接触；以及

d)使所述辊的所述外表面和所述海绵的所述至少一个表面彼此相对移动；

从而将所述液体沉积到所述海绵的所述至少一个表面上。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述外表面包括多个能够容纳所述液体的空腔。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过使用液体分配器进行所述液体施加步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其中通过使用PipeJetTM技术进行所述液体施加步骤。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述干燥海绵的厚度和柔韧性基本上类似于a)中所述海绵的厚度和柔韧性。

10.根据权利要求9所述的方法，其中保留了a)中所述海绵厚度的至少75％。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述层的厚度等于或小于干燥步骤后所述海绵总厚度的24％。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中通过选自下列的方法进行所述干燥步骤：真空烘箱、冷冻干燥和风干。

13.根据权利要求12所述的方法，其中通过真空烘箱进行所述干燥步骤。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述活性成分包含凝血酶。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述液体中凝血酶的活性在约2至约15,000IU/ml的范围内，在约2至约4,000IU/ml的范围内，或在约4,000至约10,000IU/ml的范围内。

16.一种改进的、干燥的交联明胶海绵，所述海绵在其至少一个表面上具有蛋白质或肽活性成分层，所述层的平均厚度不大于所述海绵总厚度的约24％，其中所述层是稳定的，并基本上均匀地分布在整个所述表面上；并且所述海绵的厚度和柔韧性也基本上类似于原来的对应未分层明胶海绵的厚度和柔韧性。

17.根据权利要求16所述的海绵，其中所述层中不含润湿剂。

18.根据权利要求16或17所述的海绵，其中所述活性成分包含凝血酶。

19.根据权利要求18所述的海绵，其中凝血酶活性在约1至约300IU/cm²的范围内，在约10至约40IU/cm²的范围内，或在约20至约40IU/cm²的范围内。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的海绵，用于外科手术。

21.根据权利要求20所述的海绵，用于促进凝血。

22.一种包装，包含根据权利要求16至19中任一项所述的无菌交联明胶海绵。

23.一种促进凝血的方法，包括向伤口或出血部位给予根据权利要求16至19中任一项所述的交联明胶海绵，或使用根据权利要求22所述的包装。

24.根据权利要求16至19中任一项所述的交联明胶海绵或根据权利要求22中所述的包装的用途，用于促进凝血。

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