CN101948543A

CN101948543A - 一种融合蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN101948543A
Application number: CN2010102675111A
Authority: CN
Inventors: 肖卫华; 郭雨刚; 康文瑶; 李光伟
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2010-08-30
Filing date: 2010-08-30
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2030-08-30
Also published as: CN101948543B

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的融合蛋白，是在人白细胞介素-10蛋白的羧基端连接如下任一所述蛋白形成的融合蛋白：1)人IgGFc-γ1或其突变蛋白；2)人IgG Fc-γ2或其突变蛋白；所述人白细胞介素10蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1自氨基端第1-160为氨基酸序列。本发明的实验证明，利用毕赤酵母发酵表达系统，生产出白细胞介素-10活性的IL-10-IgG/Fc融合蛋白，为下一步临床前研究IL-10-IgG/Fc融合蛋白的治疗作用打好基础。

Description

一种融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及由具有人白细胞介素10活性的融合蛋白及其编码基因，以及该融合蛋白的表达方法和在制备治疗炎症以及自身免疫性疾病药物中的应用。

背景技术

白细胞介素10(Interleukin-10，IL-10)，又名细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)、B细胞衍生的T细胞生长因子(B cell-derived T cell growth factor，B-TCGF)等。IL-10是正常人体的一类重要细胞因子，成熟的IL-10有160个氨基酸残基，单体分子量为18.7KD，含有4个半胱氨酸形成的二硫键(12-108，62-114)，其天然活性形式是由非共价键连接的分子量为38KD的同源寡二聚体。IL-10是一种多功能的细胞因子，由多种细胞分泌，主要由Th2细胞产生，能够抑制T细胞介导的免疫炎症反应以及刺激B淋巴细胞反应，参与体液免疫调节；另外它能调控一系列淋巴细胞的生长增殖。研究表明，IL-10在组织特异性自身免疫性损伤的启动和发展中起着关键性作用，并已应用于包括I型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化、丙型肝炎等多种免疫性疾病的临床实验研究。其中对银屑病的治疗效果表现最为明显，欧美国家均已进入III期临床观察。

国内外对IL-10作用机制及临床治疗疾病的应用进行了广泛而深入的研究，一方面确认了IL-10生物学功能，另一方面也扩展了其临床应用范围；因此，市场对IL-10的需要将越来愈大。目前国内外已报道IL-10的重组表达系统主要有Ecoli，CHO-K1，还有一些研究人员使用植物叶片表达；使用酵母表达IL-10的相关工作也很少，关键是难以大量得到具有天然活性的同源寡二聚体。国际市场上重组IL-10非常昂贵，且国内尚无企业生产。国际上商品化重组IL-10主要是大肠杆菌来源的，具有161个氨基酸，比正常IL-10多一个氨基酸，在治疗上具有潜在的危害。而大肠杆菌主要以包涵体的形式表达IL-10，是无生物学活性的蛋白复合物。即使经过纯化和复性，仍然会有部分蛋白不能形成正确的二硫键和适当的空间折叠，从而影响其活性。而且工艺复杂、回收率低，增加了生产成本。

然而细胞因子这样具有生物活性的药物，半衰期太短，例如IL-10在体内的半衰期仅仅2-3h，蛋白很快被清除，无法持续发挥治疗作用，因而需要大剂量地频繁使用才能达到有效的治疗浓度，然而如此频繁用药很不方便且很痛苦，以致某些患者无法忍受该药物治疗。而在II期临床观察中也发现，IL-10使用剂量小则治疗效果差；而提高剂量则产生明显副作用。如果可以延长IL-10在体内的半衰期，则可以有效的降低药物用量，从而避免产生副作用。因此，迫切需要疗效显著，半衰期长且毒副作用小的IL-10。研究表明，通过融合免疫球蛋白Fc段来提高细胞因子的半衰期是一种行之有效的方法。免疫球蛋白(Immunoglobulins，Ig)是具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。免疫球蛋白分子是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成，这种四链结构为Ig分子的单体，是构成Ig分子的基本单位。根据重链恒定区氨基酸序列及抗原性不同，重链可分为γ、α、μ、δ和ε五类，相应的Ig分别被命名为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。其中IgG在血清中以单体形式存在，占血清Ig总量的75-80％，半衰期20-23天。人IgG有4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，他们主要区别在于免疫球蛋白Fc段序列有所差异，因此常称为IgG Fc-γ1、IgG Fc-γ2、IgG Fc-γ3和IgG Fc-γ4，其中IgG Fc-γ1和IgG Fc-γ2约占到人体总IgG的90％IgG为体内主要的抗感染抗体，能通过胎盘，可激活补体，通过Fc受体结合细胞发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和调理作用(IgG的Fc段与巨噬细胞、中性粒细胞表面的IgG Fc受体结合，促进吞噬细胞对抗原的吞噬)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种融合蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的融合蛋白，是在人白细胞介素10蛋白的羧基末端连接如下任一所述蛋白形成的融合蛋白：1)人IgG Fc-γ1或其突变蛋白；2)人IgG Fc-γ2或其突变蛋白；所述人白细胞介素10蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1自氨基端第1-160的氨基酸序列。

所述融合蛋白，为如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白；

2)将序列1的氨基酸序列经过几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有人白细胞介素-10活性的由1)衍生的蛋白。

序列表中序列1由392个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-160位为人IL-10的氨基酸残基序列，自氨基端第161-392位为人IgG Fc-γ1的氨基酸残基序列。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述融合蛋白的编码基因也是本发明保护的范围。

所述融合蛋白的编码基因是下述1)-4)中任一所述基因：

1)序列表中序列2所示的DNA分子

2)序列表中序列2自5’末端第256-1431位核苷酸所示的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码具有人白细胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交的且编码具有人白细胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子。

所述严格条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的序列2由1431个碱基组成，其编码序列为序列2自5’末端第1-1431位碱基，序列2自5’末端第256-735位碱基为人IL-10的编码序列，序列2自5’末端第736-1431位碱基为人IgG Fc-γ1的编码序列，序列2自5’末端第1-255位碱基为具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段的编码序列。

含有所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、表达盒或重组菌也是本发明保护的范围。

扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

所述重组表达载体为将所述融合蛋白的编码基因插入pPIC9K的BamH I和EcoR I的识别位点间，得到重组表达载体pPIC9K-α-Factor-IL-10-Fc-γ1。

用于构建所述重组表达载体的出发载体为任意一种可在毕赤酵母中表达外源基因的重组表达载体，如pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pPICZα、pHIL-D1、pA0804、pA0815或pPSC3K等。

所述重组菌为将所述的表达载体导入宿主菌得到的重组菌，所述宿主菌优选为毕氏酵母，所述毕氏酵母尤其优选为GS115、KM71或SMD1168。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述融合蛋白的方法。

本发明提供的制备所述融合蛋白的方法包括如下步骤：

1)诱导培养所述重组菌，离心收集上清液；

2)纯化步骤1)获得的上清液，得到融合蛋白；

在步骤1)中，所述诱导培养的温度为30℃，所述诱导所用的培养基为添加有甲醇的培养基，所述甲醇在所述诱导所用的培养基中的浓度为0.5％(体积百分含量)培养基，所述诱导方式为：每隔24h补加甲醇至终浓度为0.5％((体积百分含量)，所述离心的转速为3000g，离心时间为5min；所述培养基为BMMY培养基；

在步骤2)中，所述纯化的方式为：依次进行亲和层析和分子筛层析，所述亲和层析的层析柱优选为Mabselect，所述分子筛层析的层析柱优选为S-200HR预装柱；

所述亲和层析的洗脱液为浓度为50mM、pH为3.5的醋酸钠水溶液；

所述分子筛层析的洗脱液由17.55g氯化钠和1000ml浓度为20mM、pH为8.0的Tris·HCl缓冲液组成。

所述的融合蛋白在制备治疗炎症或自身免疫性疾病药物中的应用也是本发明保护的范围；所述融合蛋白的编码基因在制备治疗炎症或自身免疫性疾病药物中的应用也是本发明保护的范围；或所述的融合蛋白在制备抑制IFN-γ产生的抑制剂中的应用也是本发明保护的范围；或所述融合蛋白的编码基因在制备抑制IFN-γ产生的抑制剂中的应用也是本发明保护的范围；

本发明的第三个目的是提供一种治疗炎症或自身免疫性疾病药物。

本发明提供的治疗炎症或自身免疫性疾病药物，其活性成分为所述的融合蛋白、所述融合蛋白的编码基因或所述的重组表达载体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、吸收促进剂或吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为：成人一般剂量为10-20μg具有白细胞介素-10活性的融合蛋白/kg体重。银屑病治疗方案一般为每次20ug具有白细胞介素-10活性的融合蛋白/kg体重，肌肉注射，每周三次。

本发明的实验证明，将人IL-10和人IgG Fc-γ1融合在一起得到的融合蛋白，与进口重组白细胞介素-10相比具有以下优点：1)白细胞介素-10活性高，可达1×10⁶IU/mg；2)半衰期长，动物实验结果表明在注射后，本发明具有白细胞介素-10活性的融合蛋白的消除半衰期可达24小时。本发明所提供的表达该融合蛋白的方法具有表达量高，使用发酵罐中试规模表达后可达100mg/L，易纯化，生产周期短，生产规模大，制备成本低的优点。基于上述优点，本发明的融合蛋白及其编码基因在医学和生物制药领域，尤其是在制备治疗炎症以及自身免疫性疾病药物中的应用中具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1为具有白细胞介素-10活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体的构建流程图

图2为具有白细胞介素-10活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体的部分物理图谱

图3为工程菌培养上清液的非还原电泳Western blot检测结果

图4为重组毕赤酵母培养上清液经Mab-Select、S200纯化的SDS-PAGE检测结果

图5为具有白细胞介素-10活性的融合蛋白免疫抑制活性测定结果

图6为具有白细胞介素-10活性的融合蛋白IL-10-IgG/Fc-γ1在大鼠体内的血药浓度曲线

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的所有引物合成和测序工作均由上海生工完成。

实施例1、具有白细胞介素-10活性的融合蛋白编码基因的获得

用PCR法扩增本发明具有白细胞介素-10活性的融合蛋白的编码基因，具体过程包括以下步骤：

一、人IL-10基因的扩增

使用TRIzol(购自invitrogen公司，货号15596-018)并按其说明书抽取离体的健康人外周血(购自合肥血站)单核细胞的总RNA，在Turbo Reverse Transcriptase(购自北京原平皓公司，货号PC108)的作用下，以oligo dT(购自上海生工，货号B0181)为引物合成人cDNA，以合成的cDNA为模板，在正向引物5’-ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTG-3’和反向引物5’-GTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3’的引导下进行PCR，将PCR产物插入到载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO(购自Invitrogen公司，货号K4800-01)TA克隆位点得到质粒pcDNA3.1-IL-10。

以质粒pcDNA3.1-IL-10为模板，在上游引物P1(5’-CTCGAGAAAAGAAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTC-3’)和下游引物P2(5’-GTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3’)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃1分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，将得到的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约540bp的条带，与预期结果相符。用BBI公司的PCR产物回收试剂盒回收目的条带，该片段命名为“IL-10/γ1”。

二、具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子(α-Factor)信号肽片段编码序列的扩增

以pPIC9k质粒(购自invitrogen公司)为模板，在引物P3(5’-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’和引物P4(5’-TGCCCTGGCCTGGGCTTCTTTTCTCGAGAGATACCC-3’)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃30秒，共32个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约255bp的条带，与预期结果相符。用BBI公司的PCR产物回收试剂盒回收目的条带，命名为“α-Factor-”。

三、5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的人白细胞介素10基因的扩增

以步骤一获得的“IL-10/γ1”和步骤二获得的“a-factor-”为模板，在引物P3(5’-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’)和引物P2(5’-GTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3’)的引导下PCR扩增，PCR反应条件为：94℃2分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃1.0分钟，循环32次；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约为750bp的条带，与预期结果相符。用BBI公司的PCR产物回收试剂盒回收目的条带，命名为“α-Factor-IL-10/γ1”。

四、人IgG Fc基因的扩增

以含有人IgG Fc-γ1基因的质粒pEF6/V5-His-TOPO-IGH7为模板，在引物P8(5’-CATGACAATGAAGATACGAAACGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC-3’)和P7(5’-CTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3’)的引导下进行PCR扩增。PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃1分钟，共32个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约700bp的条带，与预期结果相符，用BBI公司的PCR产物回收试剂盒回收目的条带，该片段命名为“-IgG Fc-γ1”。

质粒pEF6/V5-His-TOPO-IGH7的构建方法：使用TRIzol(购自invitrogen公司，货号15596-018)并按其说明书抽取健康人外周血(购自合肥血站)单核细胞的总RNA，在Turbo Reverse Transcriptase(购自北京原平皓公司，货号PC108)的作用下，以oligo dT(购自上海生工，货号B0181)为引物合成人cDNA，以合成的cDNA为模板，在正向引物5’-GAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC-3’和反向引物5’-TTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’的引导下进行PCR，将PCR产物插入到载体pEF6/V5-His-TOPO(购自Invitrogen公司，货号：K9610-20)TA克隆位点得到质粒pEF6/V5-His-TOPO-IGH7。

五、含有信号肽的融合蛋白α-Factor-IL-10-Fc-γ1的扩增

以步骤三获得的“α-Factor-IL-10/γ1”和步骤四获得的“-IgG Fc-γ1”为模板，在引物P3(5’-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’)和引物P7(5’-CTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3’)的引导下进行PCR扩增，并在序列两端分别添加上限制性内切酶BamH I和EcoR I识别位点。PCR反应条件为：94℃2分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃1.5分钟，循环32次；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约为1500bp的条带，与预期结果相符。用BBI公司的PCR产物回收试剂盒回收目的条带，经过测序，该PCR产物具有序列2的核苷酸，将该PCR产物的基因命名为“α-Factor-IL-10-Fc-γ1”，该基因的蛋白命名为α-Factor-IL-10-Fc-γ1，该蛋白的氨基酸为序列表中的序列1。

实施例2、α-Factor-IL-10-Fc-γ1在毕赤酵母中表达及表达产物的纯化

一、含有α-Factor-IL-10-Fc-γ1的毕赤酵母表达载体的构建

参见图1构建含有α-Factor-IL-10-Fc-γ1的毕赤酵母表达载体，具体方法为：用限制性内切酶BamH I(购自Promega，货号R6021)和EcoR I(购自Promega，货号R6011)对实施例1获得的PCR产物(α-Factor-IL-10-Fc-γ1)进行双酶切，再将酶切片段与经相同酶双酶切的质粒pPIC9K用T4DNA连接酶(购自上海生工，货号EL0015)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒，测序，测序结果为该质粒为将序列2插入pPIC9K的BamHI和EcoRI的识别位点间构成的重组载体，与预期结果一致，将该质粒命名为pPIC9K-α-Factor-IL-10-Fc-γ1，部分物理图谱见图2。

二、α-Factor-IL-10-Fc-γ1在毕赤酵母中的表达

1、电转化毕赤酵母GS115菌株

用限制性内切酶Sal I(购自Promega，货号：R6051)对步骤一获得的pPIC9K-α-Factor-IL-10-Fc-γ1进行单酶切使其线性化，再按每100ul毕赤酵母GS115(购自invitrogen公司，货号：C18100)感受态细胞加入20ul线性化质粒(约10ug)的比例，用0.2cm电转化杯(购自invitrogen，货号)进行电转化(参数设定：电压1500V、电容25uF、电阻200欧姆、放电时间4-5ms)，用MD平板(培养基配方参见invitrogen公司的产品说明书-A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris，以下简“invitrogen公司的产品说明书”)和含1mg/L G418的YPD平板(培养基配方参见invitrogen公司的产品说明书)筛选阳性克隆，将得到的阳性克隆提取质粒后测序，测序结果为该质粒为pPIC9K-α-Factor-IL-10-Fc-γ1，将含有该质粒的阳性克隆命名为GS115/pPIC9K-α-Factor-IL-10-Fc-γ1。

采用同样的方法将空载体pPIC9K转染毕赤酵母GS115菌株，获得重组菌GS115/pPIC9K，将重组菌提取质粒测序验证，结果为不含有α-Factor-IL-10-Fc-γ1的序列(序列2)。

2、具有白细胞介素-10活性的融合蛋白的诱导表达

挑取步骤1获得的GS115/pPIC9K-α-Factor-IL-10-Fc-γ1，将其接种于MGY液体培养基(培养基配方参见invitrogen公司的产品说明书)中，以重组菌GS115/pPIC9K为对照，在30℃、250rpm下培养至OD₆₀₀约为2-6，离心收集菌体细胞，加入含体积百分浓度0.5％甲醇的BMMY(培养基配方参见invitrogen公司的产品说明书)进行诱导培养，且每隔24h补加0.5％甲醇(体积百分含量，甲醇占初始发酵培养基体积的百分含量。)，第4天停止诱导培养，将离心收集的菌体细胞加入含体积百分浓度0.5％甲醇的BMMY的当天记作第0天。将发酵容器中所有物质记作培养物。

培养结束后，将发酵容器中的培养物经3000g离心5分钟，收集上清液，得到融合蛋白，命名为IL-10-IgG/Fc-γ1。将发酵容器中的所有产物记作培养物。

采用同样的方法对重组菌GS115/pPIC9K进行诱导表达、收集上清液得到对照蛋白。

3、阳性克隆表达产物的鉴定

1)用ELISA法测定培养上清液中融合蛋白的表达量

采用Bender公司的人IL-10ELISA试剂盒(购自Bender公司，货号BSM215/MST)并参照试剂盒说明书对步骤2的获得的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)进行检测。以上述对照蛋白为对照。结果为：融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)的检测结果呈阳性，表明融合蛋白均得到了正确表达，且融合蛋白表达量为10mg/L上清液。对照蛋白成阴性，证明没有融合蛋白的表达。

2)Western Blot鉴定

以步骤2获得的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)进行非还原SDS-PAGE电泳，再进行Western blot检测，Western blot检测时所用的一抗为anti-IL-10mAb(购自Santa Cruz，货号：sc8438)，以及HRP-conjugated goat anti HuIgG(H+L)抗体(购自中杉，货号ZB2304)，二抗为anti-mouse lgG-HRP(购自Bio Legend，货号405306)。融合蛋白经非还原SDS-PAGE电泳后的Western Blot检测结果如图3所示，其中A为人IL-10单抗所检测到条带，B为人IgG Fc多抗所检测到的条带(1为GS115/pPIC9K-α-Factor-IL-10-Fc-γ1，2为对照组GS115/pPIC9K)。从图3中可以看出：融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)得到正确表达。

三、融合蛋白的浓缩及纯化

1、用Mabselect对含有融合蛋白的上清进行浓缩和纯化

先用Mabselect(购自GE，货号：17-5199-01)对步骤二中的2获得的培养物进行浓缩和纯化，包括以下步骤：

1)取300mL上述步骤二中的2获得的培养物，12000rpm离心10min，收集上清液再过0.45um滤膜(上海半岛)，并用50Kd超滤管(购自millipore，货号：UFC905096)对其经行超滤浓缩至30ml，得到浓缩液；

2)浓缩液再经0.45um滤膜(上海半岛)过滤后，通过经Binding buffer(由17.55gNaCl和1000ml浓度为20mM、pH为8.0的Tri s·HCl组成。)平衡后的Mabselect层析柱；经过5-10个柱体积的Binding buffer冲洗之后，与Mabselect结合的融合蛋白经醋酸钠缓冲液(NaAc 50mM，pH 3.5)洗脱，然后加入中和buffer(1.5M Tris·HCl，pH 8.0)调节pH至中性，获得Mab-select纯化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)。

3)融合蛋白的纯度可以用SDS-PAGE检测。

将上述2)获得的Mab-select纯化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)使用非还原凝胶电泳，结果如图4A所示，目的产物在110Kd附近，比理论值(约90kd)偏大，可能由于酵母具有一定程度的糖基化所致。分析发现，经过Mab-select一步纯化，使目的蛋白得到进一步富集，获得Mab-select纯化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)，纯度达到70％。

2、S200分子筛层析纯化

将经步骤1获得的Mab-select纯化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)用HiPrep26/60Sephacryl S-200HR预装柱(购自GE，货号：17-1195-01)做进一步纯化，用洗脱液(由17.55g NaCl和1000ml浓度为20mM、pH为8.0的Tri s·HCl组成。)进行洗脱，收集洗脱液得到S200HR分子筛层析纯化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)。

对S200HR分子筛层析纯化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)进行SDS电泳，结果如图4B所示。经过S200分子筛纯化后，无明显杂蛋白条带，杂蛋白含量小于1％，获得纯度为92％的S200分子筛层析纯化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)。

将上述步骤二获得的对照蛋白也经过同样的纯化，获得纯化的对照蛋白。

实施例3、融合蛋白的IL-10活性检测

外周血淋巴细胞(PBMC)的培养基RPMI-1640(购自HyClone，货号SH30809.01B)；

取健康人外周血(购自合肥血站)，使用Ficoll(购自天津灏洋生物制品科技有限公司，货号：LTS1077)并按照其使用说明分离得到外周血淋巴细胞(PBMC)。于96孔板中加入0.1ml人PBMC(2×10⁵细胞)，分别加入不同稀释浓度的由实施例2获得的S200分子筛层析纯化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)以及商品化的rhIL-10(购自Rochy Hill公司，货号：200-10)，每个稀释度设置三个复孔，于37℃5％的CO₂培养24h后，再加入终浓度为0.1ug/ml的植物血球凝集素PHA-P(购自sigma，货号：L8754)，空白对照孔(加的是等体积的培养基)不加PHA-P。以实施例2获得的纯化的对照蛋白作为阴性对照。于37℃5％的CO₂继续培养24h后，收集每孔上清，使用人IFN-γELISA试剂盒(购自Bender Medsystems公司，货号BSM228TEN)并参照试剂盒说明书对各样品中人IFN-γ表达水平，实验重复三次，结果取平均值。

实验结果如图5所示，融合蛋白IL-10-IgG/Fc-γ1与作对照的商品化rhIL-10相比，具有更强的IL-10的抑制活性，能够显著的抑制人PBMC细胞在PHA-P的诱导下产生IFN-γ。空白对照孔和阴性对照均无活性。

实施例4、本发明具有白细胞介素-10活性的融合蛋白的在大鼠体内的半衰期测定

通过尾静脉注射，将商品化的rhIL-10(购自Rochy Hill公司，货号：200-10)和由实施例2获得的S200分子筛层析纯化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)分别注入平均体重约200g的SD大鼠(购自上海斯莱克，货号：Slac:SD。)(注射剂量：200ng/Kg体重)，注射后，在不同时间点(0、1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、96小时)通过剪尾取血法收集血样(每个时间点用4只大鼠)，肝素钠抗凝，将采集的血样12000g离心5min，收集血清，-70℃冷冻保藏。将血样用人IL-10ELISA试剂盒(购自Bender Medsystem公司，货号BSM215/MST)并参照说明书检测血清中本发明具有白细胞介素-10活性的融合蛋白的含量，并根据结果绘制出反映蛋白含量变化的曲线图，实验重复三次，结果取平均值，如图6所示。

从图中看出，S200分子筛层析纯化的融合蛋白(IL-10-IgG/Fc-γ1)消除半衰期为24小时，而用商品化rhIL-10经尾静脉注射后，消除半衰期为4小时，表明本发明的具有白细胞介素-10活性的融合蛋白的半衰期较之rhIL-10对照品具有很大程度的提高。

Claims

1.一种融合蛋白，是在人白细胞介素10蛋白的羧基末端连接如下任一所述蛋白形成的融合蛋白：

1)人IgG Fc-γ1或其突变蛋白；

2)人IgG Fc-γ2或其突变蛋白；

所述人白细胞介素10蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1自氨基端第1-160的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白；

2)将序列1的氨基酸序列经过几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有人白细胞介素10活性的由1)衍生的蛋白。

3.权利要求1或2所述融合蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因是下述1)-4)中任一所述基因：

1)序列表中序列2所示的DNA分子

2)序列表中序列2自5’末端第256-1431位核苷酸所示的DNA分子；

5.含有权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、表达盒或重组菌。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：

所述重组表达载体为将权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因插入如下任一出发载体得到的：pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pPICZα、pHIL-D1、pA0804、pA0815或pPSC3K。

7.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求5或6所述的重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌，所述宿主菌优选为毕氏酵母，所述毕氏酵母尤其优选为GS115、KM71或SMD1168。

8.一种制备权利要求1或2所述融合蛋白的方法，包括如下步骤：

1)诱导培养权利要求7所述重组菌，离心收集上清液；

2)纯化步骤1)获得的上清液，得到融合蛋白；

在步骤1)中，所述诱导培养的温度为30℃，所述诱导所用的培养基为添加有甲醇的培养基，所述甲醇在所述诱导所用的培养基中的浓度为0.5％(体积百分含量)，所述诱导方式为：每隔24h补加甲醇至终浓度为0.5％(体积百分含量)；

在步骤2)中，所述纯化的方式为：依次进行亲和层析和分子筛层析，所述亲和层析的层析柱优选为Mabselect，所述分子筛层析的层析柱优选为S200HR预装柱；

9.权利要求1或2所述的融合蛋白在制备治疗炎症或自身免疫性疾病药物中的应用；或权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因在制备治疗炎症或自身免疫性疾病药物中的应用；或权利要求1或2所述的融合蛋白在制备抑制IFN-γ产生的抑制剂中的应用；或权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因在制备抑制IFN-γ产生的抑制剂中的应用；

10.一种治疗炎症或自身免疫性疾病药物，其活性成分为权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因或权利要求5或6所述的重组表达载体。