CN101932336B

CN101932336B - 有外来氨基酸插入的pcv2 orf2病毒样颗粒

Info

Publication number: CN101932336B
Application number: CN200880126037.1A
Authority: CN
Inventors: 埃里克·沃恩; 梅里尔·谢弗
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2007-12-31
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2028-12-31
Also published as: KR20100103535A; WO2009088950A3; US20150202282A1; BRPI0821456A2; CA2710558A1; US20110020394A1; EP2231182A2; AU2008347235A1; EP2231182A4; WO2009088950A2; JP2011508595A; CN101932336A

Abstract

本发明包含涉及氨基酸序列的生成和使用的方法和组合物。具体而言，PCV2 ORF2显示出作为病毒样颗粒是有用的，在将编码PCV2 ORF2的DNA插入表达系统时，它生成保留它们的免疫原性或抗原性的氨基酸序列。可以将对于PCV2而言外来的DNA序列“符合读码框地”附着至ORF2 DNA，并表达整个序列，包括对于PCV2而言外来的DNA。显示了此类序列保留它们的抗原性及因此它们在免疫原性组合物中的潜在效用。

Description

有外来氨基酸插入的PCV2 ORF2病毒样颗粒

相关申请

本申请要求2007年12月31日提交的临时申请61/017,863的优先权权益，在此通过述及将其教导和内容收入本文。

序列表

本申请含有计算机可读格式的序列表，通过述及将其教导和内容收入本文。

发明领域

本申请关注2型猪圆环病毒(PCV2)病毒样颗粒作为载体用于表达期望氨基酸序列的用途。更具体的说，本申请关注此类载体用于表达病原体的免疫原性氨基酸序列的用途及后续如此表达的免疫原性氨基酸序列在免疫原性组合物中的用途。还要更具体的说，本申请关注来自PCV2的可读框2(ORF2)作为载体用于表达期望氨基酸序列的用途。甚至更具体的说，本申请关注将外来氨基酸序列插入PCV2 ORF2及后续在表达系统中表达ORF2序列和外来氨基酸序列。还要更具体的说，本申请关注如此表达的序列在免疫原性组合物中的用途。

发明背景

猪圆环病毒2(PCV2)可读ORF2基因能在昆虫细胞培养物中表达。还已经显示了PCV2ORF2蛋白质有可能装配成病毒样颗粒(VLP)。这些VLP本质上是空的PCV2壳体，而且是高度免疫原性的。将有关肽区域融合至病毒样颗粒的最早描述可能在1986年(Delpeyroux et al.1986.A poliovirusneutralization epitope expressed on hybrid hepatitis B surface antigen particles.Science.Jul 25；233(4762)：472-5(通过述及将其教导和内容收入本文))。

已经显示了针对CSL 30聚物(CSL 30-mer)的单克隆抗体(3E2)在小鼠中经被动免疫疗法提供一些针对隐孢子虫感染的效能。环孢子配体(CSL)是30个氨基酸(30聚物)的免疫原性蛋白质序列。已经确定了单克隆抗体3E2识别来自CSL的N端30个氨基酸内的表位。30聚物的蛋白质序列为AINGGGATLPQKLYLTPNVLTAGFAPYIGV(SEQ ID NO.1)。此CSL 30聚物的肽可通过化学合成来生成，然后在疫苗制备中使用以在疫苗接种的动物中诱导抗体应答。通过用与佐剂组合的化学合成的CSL肽免疫，有可能生成抗CSL 30聚物免疫应答。然而，在商业性疫苗中使用化学合成的CSL肽的成本非常高。

流感病毒分成三种类型，称作A、B和C。A和B型流感病毒对几乎每个冬天发生的呼吸道疾病流行负有责任，而且常常与住院率和死亡率升高有关。A型流感病毒基于两种称作血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的病毒蛋白的差异分成亚型。流感病毒基质1(也称作M1)是装配和出芽所必需的至关重要蛋白质。HA和NA与流感病毒M1相互作用；HA经其胞质尾和跨膜域与M1结合。M2蛋白在流感病毒的复制循环中是至关重要的，而且还是病毒包膜的必需成分，因为它有形成高度选择性的、受pH调节的、传导质子的通道的能力。M2通道容许质子进入病毒的内部，而酸化削弱M1蛋白与核糖核酸核心的相互作用。

流感病毒M2蛋白质是在收到病毒感染的细胞上丰富的四聚体、III型跨膜蛋白。M2e是A型流感病毒M2蛋白的外部域。人A型流感病毒M2e序列只有23-24个氨基酸长，而且贯穿众多流行和两次重大大范围流行的发生保持几乎不变。值得注意的是，虽然最近几年出现了多种A型猪流感株，但是A型猪流感病毒的M2e区也保持相对不变。由于M2e区靶序列在A型流感病毒株中的保守性质，认为M2e是流感疫苗的“通用”抗原。24聚物M2e靶区序列的一种优选氨基酸序列为MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ IDNO.6)(在本文中也称作M2ael)。此A型流感M2e区24聚物的肽可通过化学合成来生成，然后在疫苗制备中使用以在疫苗接种的动物中诱导抗体应答。通过用与佐剂组合的化学合成的M2e肽免疫，有可能生成抗A型流感M2e 24聚物免疫应答。然而，在商业性疫苗中使用化学合成的M2e肽的成本非常高。

尚未提出使用PCV2 ORF2的病毒样颗粒特性作为系统或机械来表达氨基酸序列或蛋白质，更不用说与PCV2 ORF2无关的或对于PCV2 ORF2而言外来的氨基酸序列或蛋白质。因而，尚未提出使用PCV2 ORF2的病毒样颗粒特性作为载体来生成免疫学有关肽，包括代表性例子30聚物CSL肽或24聚物A型流感M2e肽，及后续在免疫原性组合物或疫苗中使用此类肽。

发明概述

本发明证明了有可能使用PCV2 ORF2作为病毒样颗粒，其包括或附着有对于天然PCV2 ORF2而言外来的，但是仍然保留它们的免疫原性或抗原性的区段。具体而言，本文中提供演示此类用途的例子。在优选的形式中，对于PCV2ORF2而言外来的核酸序列区段可在ORF2序列中附着或整合，并在表达系统中表达。有利的是，所表达的氨基酸区段保留它们的免疫学特性或抗原性。在优选的形式中，PCV2 ORF2和外来氨基酸序列都保留它们的免疫学特性。外来序列可在氨基末端或羧基末端或端或者它们之间的任何位置对PCV2 ORF2序列附着或整合。所表达的外来氨基酸序列优选长度为至少8个，而且更优选长度介于8个和200个氨基酸之间，由此使得所插入的外来核酸区段长度为至少24个核苷酸，而且更优选介于24个和600个核苷酸之间。任何特定核酸或氨基酸区段的优选长度会是本领域技术人员能确定的，但是会优选基于氨基酸区段在动物中在施用它后诱导的免疫学应答来选择的。优选的外来氨基酸区段会降低由病原体引起的感染的临床和/或病理学或组织病理学病征的发生率或减轻其严重性，该区段针对该病原体诱导免疫应答。优选的是，该区段会与已知在动物中诱导免疫学应答的氨基酸区段具有至少80％、更优选85％、仍更优选90％、甚至更优选92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和最优选至少99％序列同源性。甚至更优选的是，该区段会与已知在动物中诱导免疫学应答的氨基酸区段具有至少80％、更优选85％、仍更优选90％、甚至更优选92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和最优选至少99％序列同一性。优选的是，当将氨基酸区段施用于需要它的动物时，氨基酸区段会诱导免疫诱导，其降低由衍生氨基酸区段的病原体引起的感染的临床、病理学、或组织病理学病征的发生率或减轻其严重性。如此，本发明的一个方面鉴定降低由特定病原体引起的感染的临床、病理学、和/或组织病理学病征的发生率或减轻其严重性的氨基酸区段或表达氨基酸区段的核酸序列。这些氨基酸区段还可用于推导表达氨基酸区段的核酸序列，然后将其插入载体，优选PCV2 ORF2，在表达系统中表达，优选杆状病毒表达系统，回收，并最后施用于需要它的动物。在一些优选的形式中，表达产物保持完整，而且外来氨基酸区段不与表达序列分开，而在其它优选的形式中，自表达序列取出或切出外来氨基酸区段。如此，在下文所述CSL序列的情况中，外来CSL序列在表达后可以作为ORF2序列的一部分留下并作为嵌合序列施用于需要它的动物，或者可以自ORF2序列切出外来CSL序列并分开或同时施用于需要它的动物。

在一个优选的实施方案中，本发明提供使用CSL 30聚物的具体应用作为例子。在本文中通过将CSL 30聚物融合至载体蛋白PCV2 ORF2，以划算的、免疫学上相关的方式提供CSL 30聚物。这是通过以如下方式创建PCV2 ORF2CSL杆状病毒而进行的，即其表达导致CSL 30聚物符合读码框地作为“尾”附着到PCV2 ORF2序列的羧基或氨基端上，或者符合读码框地整合到PCV2ORF2序列内。本文中的例子将CSL 30聚物尾附着于PCV2 ORF2蛋白的羧基端，但是本领域技术人员会理解，可以根据需要调整此位置，正如猪流感病毒氨基酸区段的例子进一步证明的，其附着于PCV2 ORF2氨基端以及ORF2序列内这两处。如此，当昆虫细胞被PCV2 ORF2 CSL杆状病毒感染时，它们会生成也含有CSL 30聚物作为“尾”的嵌合PCV2 ORF2 VLP。此PCV2 ORF2可充当CSL 30聚物的载体。

本发明还证明了将CSL 30聚物融合至PCV2 ORF2是免疫学上相关的，而且已经处于实践中。通过针对PCV2 ORF2蛋白的抗体以及通过针对CSL 30聚物的抗体检测到了昆虫细胞中的嵌合PCV2 ORF2 CSL表达的免疫学相关性(relevance)。

先前的工作证明了PCV2 ORF2蛋白能在昆虫细胞培养物中表达至很高水平，下游加工的量极小。本申请证明了CSL 30聚物能作为符合读码框的“尾”融合到PCV2 ORF2蛋白的羧基端上，使得PCV2 ORF2壳体会充当CSL30聚物的载体。嵌合PCV2 ORF2 CSL蛋白也在昆虫细胞培养物中表达至高水平，下游加工的量极小，这继而可用作划算的疫苗制备物中的抗原。有利的是，虽然针对CSL 30聚物的单克隆抗体3E2已经显示经被动免疫疗法在小鼠中提供一些针对隐孢子虫感染的效能，但是有可能的是针对CSL 30聚物的多克隆抗体应答可诱导更加有力和有效的针对隐孢子虫感染的应答。

嵌合PCV2 ORF2 CSL抗原的一些潜在用途包括个体疫苗接种、被动免疫接种、和血清疗法。对于个体疫苗接种，将嵌合PCV2 ORF2 CSL抗原施用于需要它的动物以给动物个体疫苗接种来诱导针对隐孢子虫感染的保护性体液和/或细胞介导的应答。对于被动免疫接种，施用嵌合PCV2 ORF2 CSL抗原以诱导有力的针对CSL 30聚物的体液和/或细胞介导的应答，这能被动传递给养护的后代。此被动母体免疫继而会在后代中降低或预防隐孢子虫感染。对于血清疗法，施用嵌合PCV2 ORF2 CSL抗原诱导有力的针对CSL 30聚物的体液应答，这可用于血清疗法。可以用嵌合PCV2 ORF2 CSL超免疫大型动物(即马)以生成抗CSL 30聚物抗血清。可将该抗血清口服施用于临床上受影响的动物以降低由隐孢子虫感染引起的临床疾病。

基于本发明，本领域技术人员还会认识到，氨基酸区段诸如CSL 30聚物和猪流感病毒24聚物能与另一病毒样颗粒载体(即PCV1、细小病毒、肠道病毒、和其它具有壳体结构的病毒)融合。另外，PCV2 ORF2 VLP可用于包装和携带外来DNA(即编码有关抗原的或用于基因疗法的DNA疫苗)。

本发明的又一个方面是使用本发明的方法表达的氨基酸在抗原性或免疫原性组合物或疫苗中的用途。此类组合物或疫苗可进一步与佐剂、药学可接受载体、保护剂、和/或稳定剂组合。

如本文中所使用的，“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷类例如QuilA、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。乳剂可特别基于轻液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油诸如源自烯(特别是异丁烯或癸烯)寡聚化的角鲨烷或角鲨烯油；含有线性烃基的酸或醇的酯，更具体的说是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。与乳化剂组合地使用油以形成乳剂。乳化剂优选是非离子型表面活性剂，特别是山梨聚糖、二缩甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，其任选是乙氧基化的，和聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是Pluronic产品，尤其是L121。参见Hunter et al.，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull，D.E.S.).John Wiley and Sons，NY，pp 51-94(1995)及Todd et al.，Vaccine 15：564-570(1997)。

例如，有可能使用《Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach》(M.Powell和M.Newman编，Plenum Press，1995)第147页记载的SPT乳剂和这本书第183页记载的乳剂MF59。

佐剂的另一个例子是选自丙烯酸的或甲基丙烯酸的聚合物和马来酸酐与烯烃衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸的或甲基丙烯酸的聚合物，它们是交联的，尤其是用糖或多元醇的聚烯烃醚。这些化合物称作卡波姆(carbomer)(Phameuropa Vol.8，No.2，June 1996)。本领域技术人员还可参见美国专利No.2,909,462，其记载了用具有至少3个、优选不超过8个羟基，至少三个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族根(radical)取代的多羟基化化合物交联的此类丙烯酸聚合物。优选的根是那些含有2-4个碳原子的，例如乙烯基、烯丙基和其它乙烯不饱和基团。不饱和根自身可含有其它取代基，诸如甲基。以名称Carbopol(BF Goodrich，Ohio，USA)销售的产品特别适合于含有此类佐剂的组合物。它们用烯丙基蔗糖或用烯丙基季戊四醇交联。这些聚合物在水中的溶解产生酸性溶液，这会被中和，优选至生理学pH，以给出会掺入免疫原性组合物、免疫学组合物或疫苗组合物自身的佐剂溶液。

其它合适的佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰基脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)的热不稳定肠毒素(重组的或其它形式的)、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽等。

另外，组合物可包括一种或多种药学可接受载体。如本文中所使用的“药学可接受载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂、等等。

如本文中所使用的，“保护剂”指抗微生物活性剂，诸如例如庆大霉素、硫柳汞、等等。具体而言，添加保护剂最优选用于制备多剂组合物。以有效防止感兴趣组合物被任何微生物污染或抑制任何微生物在感兴趣组合物内生长的浓度添加那些抗微生物活性剂。

此外，这种方法还可包括添加任何稳定剂，诸如例如糖类、海藻糖、甘露醇、蔗糖等等，以提高和/或维持产物保存期。

如本文中所使用的及如本文中所提供的工艺中所使用的，PCV2 ORF2DNA指PCV2隔离群内高度保守的结构域，由此，任何PCV2 ORF2会是PCVORF2DNA的有效来源。一种优选的ORF2序列在本文中作为SEQ ID NO.7提供。

使用本发明的方法生成的氨基酸序列优选与天然的或“天然存在的”序列相同。天然存在的序列指以它们的天然状态找到的序列。例如，天然存在的PCV2 ORF2 DNA会是在对自猪动物中的PCV2分离或鉴定的全长PCV2ORF2序列测序时找到的DNA序列。然而，本领域技术人员理解，与天然序列相比，此类序列可修饰或改变多达20％的序列同源性且仍保留抗原性特征，使得它们在免疫原性组合物中有用。当然，优选的是，与天然序列细胞，变异少于15％、仍更优选少至6-10％、且甚至更优选少于5％、仍更优选少于4％、甚至更优选少于3％、仍更优选少于2％、且最优选少于1％。免疫学组合物的抗原性特征可以通过本领域知道的常规方法来评估。此外，当与处于其天然或天然存在形式的抗原相比，改良抗原赋予至少70％、优选80％、更优选90％的保护性免疫力时，改良抗原的抗原性特征仍然保留。如此，保护性免疫力一般会导致病原体感染的临床、病理学、和/或组织病理学病征的发生率或严重性降低。“临床、病理学、和/或组织病理学病征”的发生率或严重性的“降低”应当意味着当二者都被衍生所表达氨基酸序列的病原体感染时且对照组不接受所表达序列施用，与“对照组”动物相比接受所表达氨基酸序列施用的动物中临床病征的发生率或严重性有降低。在此语境中，术语“降低”指与如上文所定义的对照组相比降低至少10％、优选25％、甚至更优选50％、最优选超过100％。如本文中所使用的，“免疫原性组合物”指以对此类蛋白质或氨基酸的细胞和/或抗体介导的免疫应答在宿主中引发“免疫学应答”的氨基酸序列或蛋白质。优选的是，此免疫原性组合物能够赋予针对选定病原体的感染及与其有关的临床病征的保护性免疫力。在一些形式中，使用天然氨基酸序列或蛋白质的免疫原性部分作为此类组合物中的抗原性成分。如本文中所使用的，术语“免疫原性部分”指天然蛋白质和/或多核苷酸的截短和/或替代形式或者片段。优选的是，此类截短和/或替代形式或者片段会包含来自全长多肽的至少8个连续氨基酸。更优选的是，截短或替代形式或者片段会具有来自全长天然存在多肽的至少10个、更优选至少15个、和仍更优选至少19个连续氨基酸。进一步理解，此类序列可以是更大的片段或截短形式的一部分。

正如本领域知道的，“序列同一性”指两条或更多条多肽序列或两条或更多条多核苷酸序列(即参照序列和要与参照序列比较的给定序列)之间的相关性。序列同一性如下确定，即在将序列最佳比对以生成最高程度的序列相似性(通过多串此类序列之间的匹配来确定)后比较给定序列与参照序列。在此类比对后，逐个位置地确认序列同一性，例如如果位于特定位置的核苷酸或氨基酸残基是相同的，那么序列在该位置是“相同的”。然后将鉴定出的此类位置的总数除以参照序列中核苷酸或残基的总数以给出％序列同一性。序列同一性可通过已知方法容易地计算，包括但不限于下述文献中所记载的，Computational Molecular Biology，Lesk，A.N.，ed.，Oxford University Press，New York(1988)，Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinge，G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M.StocktonPress，New York(1991)；及Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)，通过述及将其教导收入本文。确定序列同一性的优选方法设计成给出所测试序列之间的最大匹配。确定序列同一性的方法编写成公众可得的确定给定序列间序列同一性的计算机程序。此类程序的例子包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，et al，Nucleic Acids Research，12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol，215：403-410(1990)。BLASTX程序是公众自NCBI和其它来源可得的(BLASTManual，Altschul，S.et al.，NCVI NLM NIH Bethesda，MD 20894，Altschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol，215：403-410(1990)，通过述及将其教导收入本文)。这些程序使用缺省缺口权重最佳地比对序列以生成给定和参照序列之间最高水平的序列同一性。举例而言，具有与参照核苷酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％“序列同一性”的核苷酸序列的多核苷酸，意图表示，除了给定多核苷酸序列可包括参照核苷酸序列每100个核苷酸多至15个、优选多至10个、甚至更优选多至5个点突变，给定多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同。换言之，在具有相对于参照核苷酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，参照序列中多至15％、优选10％、甚至更优选5％的核苷酸可以删除或用另一种核苷酸替代，或者可以将一定数目的核苷酸，多至参照序列中总核苷酸的15％、优选10％、甚至更优选5％插入参照序列。参照序列的这些突变可发生于参照核苷酸序列的5′或3′端位置或那些末端位置之间的任何地方，或是单个地散布在参照序列中的核苷酸间或是以一个或多个连续的组散布在参照序列内。类似地，具有与参照氨基酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％序列同一性的给定氨基酸序列的多肽，意图表示，除了给定多肽序列可包括参照氨基酸序列每100个氨基酸多至15个、优选多至10个、甚至更优选多至5个氨基酸改变，该多肽的给定氨基酸序列与参照序列相同。换言之，为了获得与参照氨基酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％序列同一性的给定多肽序列，参照序列中多至15％、优选多至10％、甚至更优选多至5％的氨基酸残基可以删除或用另一种氨基酸替代，或者可以将一定数目的氨基酸，多至参照序列中氨基酸残基总数的15％、优选多至10％、甚至更优选多至5％插入参照序列。参照序列的这些改变可发生于参照氨基酸序列的氨基或羧基端位置或那些末端位置之间的任何地方，或是单个地散布在参照序列中的残基间或是以一个或多个连续的组散布在参照序列内。优选的是，不相同的残基位置因保守氨基酸替代而不同。然而，在确定序列同一性时，保守替代不包括在匹配内。

如本文中所使用的，“序列同源性”指确定两条序列的相关性的方法。为了确定序列同源性，将两条或更多条序列最佳比对，并在必要时引入缺口。然而，与“序列同一性”不同，在确定序列同源性时将保守氨基酸替代作为匹配计数。换言之，为了获得与参照序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参照序列中85％、优选90％、甚至更优选95％的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包含另一种氨基酸或核苷酸的保守替代，或者可以将一定数目的氨基酸或核苷酸，多至参照序列中总氨基酸残基或核苷酸的15％、优选多至10％、甚至更优选多至5％(不包括保守替代)插入参照序列。优选的是，同源序列包含至少一段50个、甚至更优选100个、甚至更优选250个、甚至更优选500个核苷酸。

“保守替代”指氨基酸残基或核苷酸用具有相似特征或特性(包括大小、疏水性、等)的另一种氨基酸残基或核苷酸替代，使得总体功能性不显著变化。

“分离的”指“人为地”自其天然状态改变，即，如果它天然存在，那么它已经改变或自其原始环境取出，或二者兼之。例如，活生物体中天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，正如该术语在本文中所采用的。

本领域技术人员会理解，本文所述组合物可掺入已知的可注射的生理学可接受的无菌溶液。为了制备随时可用的溶液供胃肠外注射或输注用，等张水溶液诸如例如盐水或相应血浆蛋白质溶液是易得的。另外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可包括稀释剂、等张剂、稳定剂、或佐剂。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油、等等。等张剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂包括清蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐等。合适的佐剂是上文所描述的那些。

免疫原性组合物可进一步包括一种或多种其它免疫调控剂，诸如例如白介素、干扰素、或其它细胞因子。免疫原性组合物还可包括庆大霉素和硫柳汞。

又一个方面涉及装有至少一剂本文所提供的蛋白质的免疫原性组合物的容器。所述容器可装有1-250剂免疫原性组合物，优选它装有1、10、25、50、100、150、200、或250剂期望蛋白质或氨基酸序列的免疫原性组合物。

又一个方面涉及包括任何上文所述容器和使用手册的试剂盒，所述使用手册包括将至少一剂蛋白质的免疫原性组合物施用入需要它的动物的信息。此外，依照又一个方面，所述使用手册包括关于第二次或更多次施用至少一剂氨基酸或蛋白质的免疫原性组合物的信息。优选的是，所述使用手册还包括信息施用免疫刺激剂的信息。如本文中所使用的，“免疫刺激剂”指能触发一般性免疫应答的任何药剂或组合物，优选不启动或提高特异性免疫应答，例如针对特定病原体的免疫应答。在优选的试剂盒中，进一步指示以合适的剂量施用免疫刺激剂。此外，试剂盒还可包含包括至少一剂免疫刺激剂的容器。

然而，在此要理解，使用本发明的方法生成的抗原指包含至少一种如下抗原的任何组合物，所述抗原在施用于需要它的动物时能诱导、刺激或增强针对与所述抗原有关的感染的免疫应答。如本文中所使用的，术语“免疫原性蛋白质”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”指在宿主中引发针对包含所述免疫原性蛋白质、免疫原性多肽或免疫原性氨基酸序列的病原体的免疫或免疫学应答的任何氨基酸序列。如本文中所使用的，“免疫原性蛋白质”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”包括任何蛋白质的全长序列、其类似物、或其免疫原性片段。“免疫原性片段”指蛋白质包括一个或多个表位且如此引发针对有关病原体的免疫学应答的片段。在本发明的一个优选实施方案中，将基于蛋白质的抗体的免疫原性片段附着至ORF2序列的序列。这些基于蛋白质的抗原优选长度为至少8个氨基酸，且更优选长度介于8个和200个氨基酸之间。此类片段可使用本领域公知的多种表位定位技术来鉴定。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology，Vol.66(Glenn E.Morris，Ed.，1996)Humana Press，Totowa，NewJersey。例如，线性表位可以通过例如在固体支持物上同时合成大量的肽(所述肽对应于蛋白质分子的各部分)并在肽仍附着至支持物时使肽与抗体反应来确定。此类技术是本领域已知的且记载于例如美国专利No.4,708,871；Geysen et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002；Geysen et al.(1986)Molec.Immunol.23：709-715。类似地，构象表位易于通过测定氨基酸的空间构象来鉴定，诸如通过例如x-射线晶体学和二维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols，见上文。合成抗原也包括在该定义内，例如多表位、侧翼表位、和其它重组或合成衍生的抗原。参见例如Bergmann et al.(1993)Eur.J.Immunol.23：2777-2781；Bergmann et al.(1996)，J.Immunol.157：3242-3249；Suhrbier，A.(1997)，Immunol，and Cell Biol.75：402-408；Gardner et al.，(1998)12th World AIDS Conference，Geneva，Switzerland，June28-July 3，1998。

对组合物或疫苗的“免疫学或免疫的应答”指宿主中对感兴趣组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答的形成。通常，“免疫应答”包括但不限于下述一种或多种效应：特异性针对感兴趣组合物或疫苗中所包括的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞、和/或细胞毒性T细胞和/或yd T细胞的生成或激活。优选的是，宿主会展现治疗性或保护性免疫学应答，使得对新感染的抗性会增强和/或疾病的临床严重性会降低。此类保护会表现为如上所述与宿主感染有关的症状(临床、病理学、和组织病理学)的发生率或严重性的降低，直至且包括完全缺失。

如本文中所使用的，“免疫学活性成分”指在施用所述成分的动物中诱导或刺激免疫应答的成分。依照一个优选的实施方案，所述免疫应答针对所述成分或包含所述成分的微生物。依照另一个优选的实施方案，免疫学活性成分是减毒的微生物，包括改良活病毒(MLV)、杀死的微生物或至少是微生物的免疫学活性部分。

如本文中所使用的，“微生物的免疫学活性部分”指微生物的含有蛋白质、糖、和/或糖蛋白的级分，其包含在施用所述成分的动物中诱导或刺激免疫应答的至少一种抗原。依照一个优选的实施方案，所述免疫应答针对微生物的所述免疫学活性部分或包含所述免疫学活性部分的微生物。

另外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可包括一种或多种兽医可可接受载体。如本文中所使用的，“兽医可接受载体”包括任何和所有溶剂、发散介质、涂层、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂、等等。

依照本发明的组合物可以皮内、气管内、或阴道内应用。组合物优选可以肌肉内或鼻内应用。在动物躯体中，能证明经静脉内注射或通过直接注射入靶组织来应用如上所述的药物组合物是有利的。对于系统应用，静脉内、血管内、肌肉内、鼻内、动脉内、腹膜内、口服、或鞘内(intrathecal)路径是优选的。皮下、真皮内(intradermally)、表皮内(intracutaneously)、贲门内/心内(intracardially)、小叶内、髓内、肺内或直接在待治疗组织(结缔、骨、肌肉、神经、上皮组织)中或附近可实现更加局部的应用。根据期望的治疗持续时间和效力，依照本发明的组合物可施用一次或数次，也是间歇地，例如每天一次持续数天、数周或数月，及以不同剂量。

“外来”氨基酸区段或“外来”DNA区段应当指自不同物种衍生的此类区段。例如，CSL 30聚物对于PCV2 ORF2而言是“外来”的，而且对于杆状病毒而言是外来的。

“氨基末端”或“羧基末端”应当分别意味着氨基端或羧基端。在氨基酸的语境中，任何附着至氨基或羧基端的外来氨基酸区段应当在非外来序列的第一个氨基酸之前或者在非外来序列的最后一个氨基酸之后。例如，如果将M2ae1区段附着至PCV2O RF2的氨基端，那么M2ae1区段应当出现在PCV2ORF2的第一个氨基酸之前，如附图所显示的。

当某区段“衍生自”已知病原体或“与其有关”时，这应当指该区段的起源。例如，CSL 30聚物“衍生自”微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)或“与其有关”，而M2ae1“衍生自”猪流感病毒或“与其有关”。

“诱导”或“引发”应当意味着引起。例如，施用CSL 30聚物在接受此类施用的动物中“诱导”或“引发”免疫应答。

“临床”病征应当指自活的动物直接可观察到的由病原体引起的感染的病征，诸如症状。代表性例子会取决于所选择的病原体，但是可包括诸如鼻涕、嗜睡、咳嗽、发烧、体重增加或减轻、脱水、腹泻、肿胀、跛/瘸、等等。

“病理学”病征应当指在显微镜或分子水平、通过生化测试、或用裸眼在验尸时可观察到的感染的病征。

“组织病理学”病征应当指源自感染的组织变化的病征。

如此，本发明的一个方面提供包含来自PCV2的氨基酸区段和附着至PCV2氨基酸区段的外来氨基酸区段的免疫原性组合物，其中外来氨基酸区段来自除PCV2之外的生物体。一种优选的PCV2氨基酸区段包括可读框2或其免疫原性部分。在优选的形式中，PCV2氨基酸区段与SEQ ID NO.7具有至少80％序列同源性。优选的是，外来氨基酸区段衍生自在施用于动物后产生感染的临床、病理学、和/或组织病理学病征的病原体。甚至更优选的是，外来氨基酸序列是与已知病原体有关的或自已知病原体衍生的抗原。有利的事，外来氨基酸区段是与所述PCV2氨基酸区段分开地可检测的，意味着检测系统、测定法、单克隆抗体、免疫印迹、等等能够在PCV2氨基酸区段存在的情况中鉴定外来氨基酸区段的存在，以及辨别或区分PCV2氨基酸区段和外来氨基酸区段。优选的是，外来氨基酸区段是通过对外来氨基酸区段特异性的测定法可检测的。一种优选的测定法或测试包含对外来氨基酸区段特异性的单克隆抗体。优选的是，外来氨基酸区段与不附着至PCV2氨基酸区段的相同氨基酸区段相比保留它的免疫原性特性的至少80％。组合物的特征在于它能够在接受其施用的动物中诱导免疫学应答。这种免疫学应答可以是对外来氨基酸区段、或对PCV2氨基酸区段、或对二者特异性的。优选的是，免疫学应答足以降低感染的临床、病理学、和/或组织病理学病征的发生率或减轻感染的临床、病理学、和/或组织病理学病征的严重性。如通过本文中的实施例所证明的，外来氨基酸序列对PCV2序列的附着可位于PCV2氨基酸区段的氨基末端或羧基末端，或者位于PCV2氨基酸区段的氨基和羧基末端之间的任何点。优选的外来氨基酸区段衍生自选自下组的生物体：微小隐孢子虫、猪流感病毒、及其组合。在优选的形式中，外来氨基酸区段保留天然序列的抗原特征且与选自下组的序列具有至少80％序列同源性：SEQ ID NO.1和6。此类组合物会降低由衍生外来氨基酸区段或与外来氨基酸区段有关的生物体引起的感染的发生率或严重性。例如，对于SEQ ID NO.1和6，这些外来氨基酸区段分别衍生自微小隐孢子虫和猪流感病毒或与微小隐孢子虫和猪流感病毒有关且会降低微小隐孢子虫或猪流感病毒的发生率或减轻微小隐孢子虫或猪流感病毒的严重性，这取决于对动物施用哪种SEQ ID NO.。有利的事，当包含外来氨基酸区段和PCV2氨基酸区段的组合物保持完整或在自PCV2区段切下外来区段后共施用时，也会降低PCV2的发生率或严重性。在一些优选的形式中，组合物会进一步包含选自下组的成分：佐剂、药学可接受载体、保护剂、稳定剂、及其组合。

本发明的另一个方面提供包含载体DNA和自第一生物体物种衍生的DNA和自第二生物体物种衍生的DNA的表达载体，其中第一和第二生物体物种彼此不同且不同于衍生载体DNA的生物体物种。在一些优选的形式中，表达载体来自杆状病毒。本发明的一个实施方案包括PCV2作为第一生物体物种。当PCV2是第一生物体物种时，来自它的一种DNA区段是PCV2 ORF2。在优选的形式中，PCV2 ORF2 DNA与SEQ ID NO.7具有至少80％序列同源性。在本发明的另一个实施方案中，来自第二生物体物种的DNA编码在接受其施用的动物中诱导免疫学应答的氨基酸区段。为了本发明的目的可使用对于动物而言致病的任何生物体。优选的是，生物体会具有当施用于需要它的动物时诱导免疫学应答的氨基酸区段。还要更优选的是，所表达的氨基酸序列是与已知病原体有关的抗原。在优选的形式中，免疫学应答在降低由第一生物体物种、第二生物体物种、及这两种物种同时引起的感染的临床、病理学、或组织病理学病征的发生率或严重性方面会是有效的。在本发明的一个实施方案中，来自第二物种的DNA选自下组：微小隐孢子虫、大肠杆菌、及其组合。来自第二物种的DNA区段的具体代表性例子编码与选自下组的天然序列具有至少80％序列同源性且保留天然序列的抗原特征的氨基酸区段：SEQ ID NO.1和6。

本发明的另一个方面提供生成抗原的方法。优选的是，所述方法包括下述步骤：组合编码抗原的DNA与PCV2 DNA以生成组合DNA插入物，并在表达系统中表达组合DNA插入物。在优选的形式中，抗原具有约8-200个氨基酸的长度。优选的是，与PCV2 DNA组合的编码抗原的DNA衍生自不同于PCV2的生物体物种。可使用任何生物体物种，但优选的是，所表达的氨基酸序列是与已知病原体有关的抗原。代表性例子包括选自下组的生物体物种：微小隐孢子虫、猪流感病毒、及其组合。当使用微小隐孢子虫和猪流感病毒作为生物体物种时，优选的氨基酸区段会保留天然序列的抗原特征且与选自下组的序列：具有至少80％序列同源性SEQ ID NO.1和6。优选的PCV2序列会包括ORF2，特别是SEQ ID NO.7及保留天然序列的抗原特征且与SEQID NO.7具有至少80％序列同源性的序列。一种优选的表达系统包含杆状病毒表达系统。

本发明的另一个方面提供通过上文所述方法表达的抗原在疫苗和免疫原性组合物中的用途。优选的是，所述抗原与已知病原体有关。此类免疫原性组合物或疫苗可进一步包含选自下组的成分：佐剂、药学可接受载体、保护剂、稳定剂、及其组合。

本发明的还有一个方面提供PCV2ORF2作为病毒样颗粒的用途。

附图简述

图1a是用家兔抗CSL血清染色的感染了ORF2-CSL杆状病毒的SF细胞的照片；

图1b是用猪抗PCV2血清染色的感染了ORF2-CSL杆状病毒的SF细胞的照片；

图1c是用山羊抗家兔-FITC染色的感染了ORF2-CSL杆状病毒的SF细胞的照片；

图2是SDS-PAGE分析，验证了来自感染了杆状病毒的细胞的ORF2-CSL表达；

图3是抗PCV2，家兔免疫前第0天血清和家兔免疫后第84天血清中ORF2、CSL肽、和ORF2-CSL的点印迹结果；

图4a是Western印迹照片，显示了ORF2-CSL蛋白；

图4b是考马斯染色的印迹，显示了ORF2和ORF2-CSL蛋白；

图5是有和无内部AscI限制性位点的PCV2 ORF2序列的比较；

图6是有和无内部M2ae1氨基酸序列的PCV2 ORF2序列的比较；而

图7是有和无氨基M2ae1氨基酸序列的PCV2 ORF2序列的比较。

优选实施方案的详述

下述实施例列出了依照本发明的优选材料和规程。然而，要理解的是，这些实施例只是作为例示而提供的，而且不应解释为对本发明总的范围的限制。

实施例1

材料和方法：

CSL 30聚物逆翻译

CSL 30聚物肽的氨基酸序列为AINGGGATLPQKLYLTPNVLTAGFAPYIGV(SEQ ID NO.1)。使用果蝇属的最佳密码子选择将此30聚物氨基酸序列逆翻译成核苷酸序列。合成与ORF2基因3′端匹配的互补引物序列加CSL 30聚物的核苷酸序列。

引物设计

PCV2-5-HA引物(SEQ ID NO.2)

5′-TGGATCCGCCATGACGTATCC-3′(PCV2 ORF2 ATG起始位点标有下划线)

L-PCV2CSL引物(SEQ ID NO.3)

5′-AGATCTACACGCCGATGTAGGGGGCGAAGCCGGCGGTCAGCACGTTGGGGGTCAGGTACAGCTTCTGGGGCAGGGTGGCGCCGCCGCCGTTGATGGCGGGTTCAAGTGGGGGGTCTTTAA-3′

具有C端CSL尾的PCV2ORF2的PCR

先前已经克隆入pGEM-T Easy质粒(Promega)的PCV2 ORF2基因充当PCR反应的模板，并与Amplitaq Gold(Applied Biosystems)及PCV2-5-HA和L-PCV2CSL引物混合。将PCR反应加热至94℃达10分钟。然后将PCR反应进行40个循环的94℃30秒钟、40℃30秒钟、和72℃1分钟。PCR循环完成，之后是最终循环72℃10分钟。PCV2 ORF2 CSL PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来显现。自凝胶纯化PCR产物，并连接入pGEM-T Easy克隆载体，转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，并筛选氨苄青霉素抗性。使用转化菌落来接种3ml含氨苄青霉素的LB肉汤，并于37℃培养过夜。通过离心来收获过夜培养物的1.5ml等分试样，并用Qiagen Mini-Prep质粒试剂盒提取质粒DNA。然后通过双脱氧核苷酸测序来验证纯化的质粒DNA。

通过用限制酶BamHI和NotI消化，自pGEM-T Easy质粒切出PCV2 ORF2CSL基因，并连接入杆状病毒转移载体pVL1393。然后使用Qiagen Mini-Prep质粒试剂盒纯化所得PCV2 ORF2 CDL/pVL1393质粒，用于后续转染。

含有PCV2 ORF2 CSL基因的重组杆状病毒的生成

使用ESCORT转染试剂(Sigma)将PCV2ORF2CDL/pVL1393质粒和线性化杆状病毒DNA(Sigma)共转染入Sf9昆虫细胞，27℃5小时。除去转染培养基，然后温和清洗转染细胞，补充培养基，并于27℃温育。5天后，收获含有所生成的重组杆状病毒的细胞上清液，并保存于4℃。用丙酮甲醇固定剩余的转染Sf9细胞，并用于使用猪抗PCV2抗血清进行的免疫荧光测定法(IFA)以验证转染细胞中PCV2 ORF2的表达。

将所收获的PCV2 ORF2 CSL重组杆状病毒上清液在Sf9细胞上噬斑纯化，之后生成病毒原种。

嵌合PCV2 ORF2 CSL(融合有CSL 30聚物作为C端尾的PCV2 ORF2基因) 的观察和免疫学检测。

对转染Sf9细胞实施IFA以检测PCV2 ORF2、H5HA或H7HA抗原。材料包括固定的6孔板、猪抗PCV2、鸡抗H5和抗H7、山羊-鸡FITC、山羊抗鸡FITC、家兔抗猪FITC、1xPBS、和甘油(50∶50)。将Sf9细胞在6孔板中固定，并用1xPBS漂洗。在每个孔中留2ml PBS。向未转染Sf9细胞孔、PCV2ORF2-HA转染孔、和PCV2ORF2CSL转染孔添加20ul猪抗PCV2。抗PCV2血清处于1∶100稀释度。将板打旋以混合。如上所述向未转染Sf9细胞孔、H7HA转染孔、H7HA转染孔、和H5HA转染孔添加1∶100稀释的鸡抗H5和抗H7。将板再次打旋以混合。将板于37℃温育1小时。除去一抗溶液。接着，将孔用PBS清洗3次，并除去最后一次清洗液。向每个孔添加2ml PBS。接着，向有一抗PCV2抗血清的孔添加20ml家兔抗猪，并混合到一起。接着，向各孔添加20ml山羊抗鸡FITC，并用一抗鸡血清处理和混合。将这些于37℃温育1小时。除去FITC溶液，并将它们用PBS清洗3次。除去最后一次清洗液。接着，向每个孔添加1ml甘油，并通过手腕摇动除去过量的甘油。然后对每个孔观察特定荧光。结果指示生成了H5HA重组杆状病毒，正如PCV2 ORF2-HA和CSL重组体。

实施例2：来自受到杆状病毒感染的SF+细胞(样品070)的ORF2-CSL表达分析

材料和方法：

在96、120、和144小时时收集受到杆状病毒感染的SF+细胞的样品(沉淀物和上清液)，用于分析来自这些受到杆状病毒感染的SF+细胞的ORF2-CSL。对每份样品应用下述规程：将SF+细胞样品融化，并取出上清液。将沉淀物重悬于200ul 100mM NaHCO₃，pH 8.3，并反复吸取以混合。然后让样品于室温(约25-30℃)静置30分钟。然后将样品于4℃以20,000xg离心2分钟。将上清液和沉淀物的碳酸氢盐溶胞物分开，并将整个样品保存于约4℃的冰上。

然后将沉淀物的碳酸氢盐溶胞物和上清液样品在MOPS缓冲液中的10％Bis-Tris凝胶上进行SDS聚丙烯酰胺细胞电泳(SDS-PAGE)分析。将15ul每份沉淀物碳酸氢盐溶胞物和20ul每份上清液样品加载到凝胶上它们各自指派的道中。第1道含有10kDa标志物。第2道含有来自96小时样品的沉淀物的NaHCO₃溶胞物。第3道含有来自120小时样品的沉淀物的NaHCO₃溶胞物。第4道含有来自来自144小时样品的沉淀物的NaHCO₃溶胞物。第5道含有来自96小时样品的上清液。第6道含有来自120小时样品的上清液。第7道含有来自144小时样品的上清液。而第8道含有20ul未改变的ORF2，充当对照。图2描绘了凝胶的结果。

结果：

分别含有来自96、120和144小时样品的沉淀物的碳酸氢盐溶胞物的第2、3、和4道清楚地展示了ORF2-CSL的表达。结果提示ORF2-CSL确实自新杆状病毒构建物表达。ORF2-CSL估算为比ORF2大约3kDa，而且所观察到的分子量与估算一致。另外，观察到含有120小时和144小时样品的上清液的第6和7道中存在ORF2-CSL，其存在比144小时样品强得多。随时间显现在上清液中观察到ORF2-CSL的事实提示ORF2的病毒样颗粒(VLP)结构仍然很大程度上是完整的。

实施例3

材料和方法：

此实施例展示用免疫前和免疫后家兔血清及猪抗PCV2血清进行的ORF2、ORF2-CSL、和CSL肽的点印迹分析。在此实施例中使用三种蛋白质样品：标准ORF2蛋白、CSL样品和来自受到杆状病毒感染的SF+细胞的沉淀物(感染后144小时)的ORF2-CSL碳酸氢盐溶胞物。将5ul每份蛋白质样品点到一张硝酸纤维素上成一行，并标记每个点。此过程重复三次，得到三张点样相同的硝酸纤维素，含有来自每份好样品的一个点(总共三个点)。让每个点印迹干燥，然后在约50ml TTBS+2％奶粉(w/v)中温育至少1小时。然后将膜与一抗一起温育。将第一张硝酸纤维素与在TTBS+2％奶粉中1∶100稀释的猪抗PCV2血清一起温育(印迹)1小时。将第二张硝酸纤维素与在TTBS+2％奶粉中1∶200稀释的家兔免疫前血清一起温育(印迹)1小时。将第三张硝酸纤维素温育(印迹)与在TTBS+2％奶粉中1∶200稀释的家兔免疫后血清一起1小时。

将每个印迹用TTBS(1x TBS加0.05％Tween20，新鲜制备)清洗三次，两分钟。TBS清洗液如下配制，即向292.2g NaCl添加200ml 1M Tris，pH 8，用HCl将pH调节至7.4，通过添加水(qs)将溶液调至总体积1L，并过滤除菌。清洗后，然后将膜与二抗一起温育。将第一张硝酸纤维素与在TTBS+2％奶粉中1∶1000稀释的山羊抗猪-HRP一起温育1小时。将第二张硝酸纤维素与在TTBS+2％奶粉中1∶1000稀释的山羊抗家兔-HRP一起温育1小时。将第三张硝酸纤维素与在TTBS+2％奶粉中1∶1000稀释的山羊抗家兔-HRP一起温育1小时。然后将每个印迹用TTBS清洗两次，两分钟，然后用PBS(10x PBS 1L)清洗一次，两分钟。PBS清洗液如下配制，即添加0.96g无水NaH₂PO₄(单碱)、13.1g无水NaH₂PO₄(二碱)和87.7g NaCl，将混合物溶于水，并用HCl将pH调节至7.4，将溶液调至1L，并过滤除菌。

然后将10ml Opt-2CN底物添加至每个印迹，并让其显色不到约5分钟。用水漂洗每个印迹以终止该过程，并分析。点印迹的结果可见图3。

结果：

在第一张硝酸纤维素上，ORF2和ORF2-CSL二者都与猪抗PCV2血清起反应，指示ORF2-CSL的ORF2部分在结构上是完整的。来自第二张硝酸纤维素的结果指示ORF2-CLS也与家兔免疫前血清起反应。来自第三张硝酸纤维素的结果也提示ORF2-CSL的CSL部分如预期的那样(在结构上是完整的)，因为它与家兔免疫后血清起反应。家兔免疫后血清有与CSL肽的反应性及免疫前血清或抗PCV2血清没有与CSL肽的反应性也证实了免疫后血清中的CSL反应性的特异性。总之，这些结果强烈指示CSL肽作为与ORF2的融合蛋白表达。

实施例4：Western印迹

材料和方法：

此实施例展示用家兔免疫后血清进行的来自受到杆状病毒感染的SF+细胞(感染后144小时)的ORF2和ORF2-CSL沉淀物和上清液的Western印迹分析。将蛋白质样品在MOPS缓冲液中的10％Bis-Tris凝胶上进行SDS-PAGE分析。在相同凝胶上运行两组复制样品。第1道含有10kDa标志物。第2道含有预染色标志物。第3道含有来自受到杆状病毒感染的SF+细胞感染后144小时沉淀物的ORF2-CSL碳酸氢盐溶胞物。第4道含有来自相同样品的ORF2-CSL上清液。第5道含有标准ORF2蛋白样品。SDS-PAGE后，在Novex印迹模块(Novex；San Diego，CA)中通过电泳(30V恒压超过约1小时)将蛋白质自凝胶转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。转印迹后，将样品道在约50ml TTBS+2％奶粉中温育至少1小时。然后将印迹切成两份复制印迹。一份用在TTBS+2％奶粉中1∶200稀释的一抗家兔免疫后血清温育/印迹1小时，而另一份干燥并染色以显示总蛋白质概况。第二份印迹的结果可见图4B。

然后将第一份印迹用TTBS(1x TBS加0.05％Tween20，新鲜制备)清洗三次，2分钟。然后将印迹与在TTBS+2％奶粉中1∶1000稀释的二抗山羊抗家兔-HRP一起温育1小时。温育后，将印迹用TTBS(1x TBS加0.05％Tween20，新鲜制备)清洗两次，两分钟，并用PBS清洗一次，两分钟。然后使用10mlOpti-4CN底物显现印迹，让印迹显色不到约5分钟。用水漂洗印迹以终止该过程，并分析。此印迹的结果可见图4A。

实施例5

此实施例生成具有符合读码框的插入的PCV2 ORF2 VLP，所述插入为24个氨基酸的流感病毒M2ae区。

材料和方法：

具有AscI的M2ae1 24聚物

M2ae 124聚物的氨基酸序列为MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO.6)。使用果蝇属的最佳密码子选择将M2ae1 24聚物氨基酸序列逆翻译成其核苷酸序列。实施PCR以添加侧翼AscI限制酶位点至M2ae1编码区。

将AscI限制性位点引入PCV2 ORF2编码区

使用定点诱变，将AscI限制酶位点引入PCV2 ORF2的编码区(SEQ ID NO.7)(见图5)。如图5所示，AscI位点的引入将两处氨基酸变化引入PCV2 ORF2编码区，即Y36W(第36位氨基酸酪氨酸变成色氨酸，即一种中性极性氨基酸被另一种中性极性氨基酸替换)和W38A(第38位氨基酸色氨酸变成丙氨酸，即一种中性极性氨基酸被一种中性非极性氨基酸替换)(SEQ ID NO.8)。

将M2ae1插入PCV2 ORF2编码区

关于将M2ae1区插入PCV2 ORF2(SEQ ID NO.9)的展现见图6。简言之，使用标准分子生物学方法，将M2ae1-AscI区克隆入杆状病毒转移载体pVL1393中的PCV2 ORF2基因的AscI位点。然后使用Qiagen Mini-Prep质粒试剂盒纯化所得PCV2 ORF2内部M2ae1/pVL1393(命名为A-34)质粒，用于后续转染。

含有具有内部M2ae1的PCV2 ORF2的重组杆状病毒的生成

使用ESCORT转染试剂(Sigma)将A-34 PCV2 ORF2内部M2ae1/pVL1393质粒和线性化杆状病毒DNA(Sigma)共转染入Sf9昆虫细胞，28℃5小时。除去转染培养基，然后温和清洗转染细胞，补充培养基，并于27℃温育。5天后，收获含有所生成的重组杆状病毒的细胞上清液，并保存于4℃。用丙酮甲醇固定剩余的转染Sf9细胞，并用于使用抗A型流感病毒M2单克隆抗体14C2进行的免疫荧光测定法(IFA)以验证转染Sf9细胞中M2ae1区的表达。所表达的包含PCV2ORF2和内部M2ae1区段的嵌合蛋白的序列在本文中作为SEQ ID NO.11提供。

随后通过在Sf9细胞上有限稀释来纯化收获的A-34M2ae1 ORF2 PCV2杆状病毒DB上清液，之后生成病毒原种材料。

具有内部M2ae1的PCV2 ORF2的免疫学检测

先前通过IFA证实了受到A-34 M2ae1 ORF2 PCV2杆状病毒DB感染的Sf9细胞中M2ae1表达的验证。然而，作为进一步证实M2ae1与PCV2 ORF2一起表达的手段，对自受到杆状病毒感染的昆虫细胞培养物收获的PCV2 ORF2内部M2ae1上清液实施免疫印迹。

简言之，将自受到杆状病毒感染的昆虫细胞培养物收获的上清液印迹到PVDF膜上，并测试免疫印迹中PCV2 ORF2和/或M2ae1抗原的存在。用于PCV2 ORF2免疫印迹检测的一抗是抗PCV2 ORF2单克隆抗体6C4-2-4A3-5D10和纯化的猪抗PCV2 ORF2 IgG。用于M2ae1免疫印迹检测的一抗是抗M2单克隆抗体14C2(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)和猪抗M2aeC5血清。用于免疫印迹的相应二抗是HRP标记的山羊抗小鼠偶联物和山羊抗猪偶联物。使用Opti-4CN底物(BioRad)来进行免疫印迹的比色法检测。免疫印迹揭示了PCV2 ORF2和M2ae1抗原的存在。

下文更为详细地描述了用于此实施例的材料和方法：

材料和方法：

为了纯化质粒，使用QIAprep Spin MiniPrep(QIAGEN，Gaithersburg，MD)并遵循制造商的方案。简言之，将1.5ml培养物以14,000rpm离心1分钟。丢弃上清液，之后重复离心规程并再次丢弃上清液。在250ul缓冲液P1中重建沉淀物，并添加至250ul缓冲液P2，然后通过颠倒来混合。接着，添加350ul缓冲液N3并通过颠倒来混合，之后以14,000rpm离心10分钟。将上清液转移至离心管中的QIAprep旋转柱，以14,000rpm离心60秒，丢弃流出液并重新装配柱。接着，添加750ul缓冲液PE并以14,000离心60秒，丢弃流出液并重新装配柱。将柱以14,000rpm离心1分钟以使其干，然后将柱转移至一个新的1.5ml管。最后，添加50ul H₂O，于室温温育1分钟，然后以14,000rpm离心1分钟，之后丢弃柱。

为了切割、纯化、和连接M2ae1片段，使用New England Biolabs(Ipswich，MA)产品和规程实施限制性消化。简言之，将6ul New England Biolabs缓冲液4、49ul DNA、和5ul AscI一起在600ul离心管中混合。将管于37℃温育1小时，之后向每个管添加3ul 6X加载染料并摇匀。然后将所有反应加载到1.5％琼脂糖凝胶上，以约100伏运行60分钟，之后对凝胶拍照或扫描。自凝胶切下想要的条带并放置在1.5ml离心管中，之后每10mg凝胶片添加10ul膜结合溶液。将这漩涡震动并于50-65℃温育，直至凝胶完全溶解。将迷你柱插入收集管，并将准备好的DNA转移至柱装配装置。将这于室温温育1分钟并以14,000rpm离心1分钟，之后丢弃流出液。清洗步骤包括添加700ul膜清洗溶液，以14,000rpm离心1分钟，丢弃流出液，添加500ul膜清洗溶液，以14,000rpm离心5分钟，丢弃流出液，然后开着盖以14,000rpm再次离心1分钟以干燥膜。洗脱步骤包括将迷你柱转移至1.5ml离心管，添加50ul不含核酸酶的H₂O，于室温温育1分钟，以14,000rpm离心1分钟，丢弃柱，并保存于-20℃，供将来使用。

如下实施连接反应(1)，即在0.5ml微量离心管中混合1ul ORF2-AscI PVL1393载体、7ul M2ae1插入物、1ul 10X连接缓冲液、和1ul T4 DNA连接酶。将这于4℃温育过夜。

M2ae1/AscI-Orf2-PVL1393的转化(转化1)和M2ae1区段的重新连接使用常规方案来实施。简言之，在冰上融化Max Effc感受态DHSx细胞，并将50ul每份反应转移至17x100mm pp Falcon管。将额外的细胞在EtOH/干冰浴中重新冷冻。接着，将2ul连接反应1添加至细胞并在冰上温育30分钟，之后将细胞于精确的42℃热休克精确的45秒。将管放回冰上2分钟，之后添加950ulSOC并在约225rpm摇动中于37℃温育1小时。然后，将50和200ul等分试样涂布在LB和CIX上，倒置并于37℃温育过夜。

如下实施连接反应(2)以重新连接M2ae1，即在0.5ml微量离心管中混合1ul AscI PVL 1393载体、7ul浓缩M2ae1插入物、1ul 10X连接缓冲液、和1ul T4DNA连接酶。将这于4℃温育过夜。

为了将浓缩M2ae1/AscI-ORF2-PVL1393转化入细胞，使用常规方法实施转化反应(2)。简言之，在冰上融化Max Effc感受态DHSx细胞，并将50ul每份反应转移至17x100mm pp Falcon管。将额外的细胞在EtOH/干冰浴中重新冷冻。接着，将2ul连接反应2添加至细胞并在冰上温育30分钟，之后将细胞于精确的42℃热休克精确的45秒。将管放回冰上2分钟，之后添加950ul SOC并在约225rpm摇动中于37℃温育1小时。然后，将50和200ul等分试样涂布在LB和CIX上，倒置并于37℃温育过夜。

为了对菌落检查想要的克隆，使用下述参数和试剂建立PCR反应：1个循环的95℃5分钟，35个循环的95℃15秒钟、35个循环的50℃15秒钟、35个循环的72℃60秒钟，1个循环的72℃5分钟和1个循环的4℃无穷；12.5ul2X Amplitaq Gold Mastermix、11.5ul不含RNA酶/DNA酶的水、0.5ul引物pvl-U、0.5ul引物gel-scrnL、和选定菌落。自48孔2％琼脂糖E-凝胶盒(Invitrogen)取出梳子。将精确的10ul DEPC H₂O EMD加载到每个孔中，并将含有6X加载染料的10ul DNA标志物和10ul样品添加至想要的孔。按下电源按钮，直至显示器显示“EG”。滑动到E-凝胶Mother基座上(当正确插入时，稳定的红色灯亮起)，并再次按下电源按钮(灯会变成绿色以指示凝胶正在运行)。让凝胶运行约20分钟。然后培养选定的菌落，用于微量制备，即用一环选定的菌落接种3ml LB肉汤和6ul CAR种。然后将这在约225rpm摇动中于37℃温育过夜。

然后使用QIAprep Spin MiniPrep试剂盒依照制造商的指令及如上所述纯化质粒。

为了启动M2ae1/pGemT-easy选定菌落的过夜培养用于质粒纯化和序列分析，然后培养一环选定菌落用于微量制备，即用选定的菌落接种3ml LB肉汤和6ul CAR种。然后将这在约225rpm摇动中于37℃温育过夜。如上文关于QIAprep Spin MiniPrep所述将这些纯化。

为了切出M2ae 1片段，依照New England Biolabs常规规程进行限制性消化。简言之，将5ul New England Biolabs缓冲液4、25ul DNA、5ul AscI、和15ul H₂O was mixed together在600ul离心管中混合到一起。将管于37℃温育1小时，之后向每个管添加3ul 6X加载染料并混匀。然后将反应加载到1.5％琼脂糖凝胶上，以约100伏运行60分钟，之后对凝胶拍照或扫描。

接着，依照QIAEX II琼脂糖凝胶提取方案(QIAGEN，QIAEX II Handbook02/99)纯化M2ae1片段，并通过连接反应(3)连接入PVL 1393。简言之，为了将M2ae 1连接入PVL 1393，将2ul PVL 1393载体、6ul AscI浓缩M2ae1插入物、1ul 10X连接缓冲液、和1ul T4 DNA连接酶在0.5ml微量离心管中混合到一起并于4℃温育过夜。

为了将AscI-M2ae1/PVL1393插入物转化入DHSx细胞，在冰上融化MaxEffc感受态DHSx细胞，并将50ul每份反应转移至17x100mm pp Falcon管。将额外的细胞在EtOH/干冰浴中重新冷冻。接着，将2ul连接反应2添加至细胞并在冰上温育30分钟，之后将细胞于精确的42℃热休克精确的45秒。将管放回冰上2分钟，之后添加950ul SOC并在约225rpm摇动中于37℃温育1小时。然后，将50和200ul等分试样涂布在LB和CIX上，倒置并于37℃温育过夜。

为了用AscII限制性切割ORF2-AscI-PVL1393，将2ul New EnglandBiolabs缓冲液4、2.5ul DNA、2ul AscI、和12.5ul H₂O在600ul离心管中混合到一起。将管于37℃温育1小时，之后向每个管添加3ul 6X加载染料并混匀。然后将反应加载到1.5％琼脂糖凝胶上，以约100伏运行60分钟，之后对凝胶拍照或扫描。

接着，纯化凝胶，并实施去磷酸化反应和另一项连接反应。凝胶纯化遵循WIZARD SV凝胶清洁的步骤。简言之，将迷你柱插入收集管，并将准备好的DNA转移至柱装配装置。将这于室温温育1分钟并以14,000rpm离心1分钟，之后丢弃流出液。清洗步骤包括添加700ul膜清洗溶液，以14,000rpm离心1分钟，丢弃流出液，添加500ul膜清洗溶液，以14,000rpm离心5分钟，丢弃流出液，然后开着盖以14,000rpm再次离心1分钟以干燥膜。洗脱步骤包括将迷你柱转移至1.5ml离心管，添加50ul不含核酸酶的H₂O，于室温温育1分钟，以14,000rpm离心1分钟，丢弃柱，并保存于-20℃，供将来使用。去磷酸化步骤包括向16ul凝胶纯化的质粒添加2ul 10X SAP缓冲液，然后添加2ulSAP，之后于37℃温育15分钟，然后于65℃15分钟灭活SAP。然后实施如下连接反应，即将4ul AscI-ORF2-PVL1393载体、12ul AscI切割的M2ae1插入物、2ul 10X连接缓冲液、和2ul T4DNA连接酶在0.5ml微量离心管中混合到一起，并于4℃温育过夜。

为了将连接后的载体和插入物转化入感受态DHSx，供繁殖和将来的筛选用，在冰上融化Max Effc感受态DHSx细胞，并将50ul每份反应转移至17x100mm pp Falcon管。将额外的细胞在EtOH/干冰浴中重新冷冻。接着，将2ul连接反应2添加至细胞并在冰上温育30分钟，之后将细胞于精确的42℃热休克精确的45秒。将管放回冰上2分钟，之后添加950ul SOC并在约225rpm摇动中于37℃温育1小时。然后，将50和200ul等分试样涂布在LB和CIX上，倒置并于37℃温育过夜。

为了对转化子筛选期望插入物的存在，使用下述参数和试剂实施Amplitaq Gold PCR反应：1个循环的95℃5分钟，35个循环的95℃20秒钟、35个循环的50℃20秒钟、35个循环的72℃20秒钟，1个循环的72℃5分钟和1个循环的4℃无穷；12.5ul 2X Amplitaq Gold Mastermix、11.5ul不含RNA酶/DNA酶的水、0.5ul引物pvl-U、0.5ul引物ael scrnL、和选定菌落。自48孔2％琼脂糖E-凝胶盒(Invitrogen)取出梳子。将精确的7.5ul DEPC H₂O EMD加载到每个孔中，并将含有6X加载染料的10ul DNA标志物和10ul样品添加至想要的孔。按下电源按钮，直至显示器显示“EG”。滑动到E-凝胶Mother基座上(当正确插入时，稳定的红色灯亮起)，并再次按下电源按钮(灯会变成绿色以指示凝胶正在运行)。让凝胶运行约20分钟。然后培养选定的菌落，用于微量制备，即用一环来自M2ae1-AscI/PVL1393转化的选定菌落接种3ml LB肉汤和6ul CAR原种。然后将这在约225rpm摇动中于37℃温育过夜。为了纯化质粒用于序列分析，依照制造商的指令使用QIAprep Spin MiniPrep。简言之，将1.5ml培养物以14,000rpm离心1分钟。丢弃上清液，之后重复离心规程并再次丢弃上清液。在250ul缓冲液P1中重建沉淀物，并添加至250ul缓冲液P2，然后通过颠倒来混合。接着，添加350ul缓冲液N3并通过颠倒来混合，之后以14,000rpm离心10分钟。将上清液转移至收集管中的QIAprep旋转柱，以14,000rpm离心60秒，丢弃流出液并重新装配柱。接着，添加750ul缓冲液PE并以14,000离心60秒，丢弃流出液并重新装配柱。将柱以14,000rpm离心1分钟以使其干，然后将柱转移至一个新的1.5ml管。最后，添加50ul H₂O，于室温温育1分钟，然后以14,000rpm离心1分钟，之后丢弃柱。

为了用杆状病毒DNA转染sf9昆虫细胞，在一个无菌6ml聚苯乙烯管中装配96.4ul Excel培养基、1ul DiamondBac Cur病毒DNA(1ug/ul)、和3.6ulpVL1393中的重组转移质粒(1ug)。向每个聚苯乙烯管添加100ul ESCORT和Excell的1∶20主混合物，之后于室温温育15分钟以制备转染混合物(475ulExcell，25ul ESCORT)。用2ml体积的Excellent清洗Sf9细胞的6孔板单层两次，在第二次清洗后将培养基留在细胞上。吸掉清洗培养基后，向6孔板的每个孔添加0.8ml Excell，之后向6孔板的孔添加0.2ml转染混合物。将这于28℃温育5小时，然后吸掉转染混合物。清洗细胞一次，然后添加2ml TNM-FH并于28℃温育120-144小时。

为了收获转染和固定细胞供IFA用，在生物安全橱中无菌收获来自转染Sf9细胞的上清液并转移至2.0ml冷冻管，之后向孔中剩余的Sf9细胞添加1ml冷的丙酮∶甲醇(50∶50)。将这于室温温育10分钟，除去固定剂，并让板在通风橱中风干，之后将板保存于4℃或更冷，供最终的IFA用。

为了测试Sf9转染细胞中的M2ae1表达，实施间接免疫荧光测定法(IFA)。将板在PBS中简短清洗以使固定细胞再水合，然后除去PBS。接着，向孔中添加500ul一抗抗M2ae1，并于37℃温育1小时。除去一抗，并将孔用PBS清洗三次，除去最后一次清洗液。接着，向孔中添加500ul在PBS中1∶500稀释的二抗抗家兔FITC，并于37℃温育1小时，之后除去二抗并将孔用PBS清洗三次，除去最后一次清洗液。接着，用约0.5ml甘油∶水(50∶50)包被孔，并除去过量的甘油∶水，使得能用导致UV灯显微镜观察细胞层。

为了找到受到杆状病毒感染的Sf9细胞的克隆，在第50代Sf9细胞上实施杆状病毒有限稀释。简言之，将杆状病毒材料在TNM-FH中10倍稀释。临实施稀释前，将杆状病毒材料简短漩涡震动以确保它彻底混匀。初始10^-1稀释通过将0.1ml杆状病毒转移入0.9ml TNM-FH并简短漩涡震动以混合来实施。10^-2稀释通过将0.1ml 10^-1稀释的杆状病毒转移如入0.9ml TNM-FH并简短漩涡震动以混合来实施。10^-3稀释通过将1ml 10^-2稀释的杆状病毒转移入9mlTNM-FH并简短漩涡震动以混合来实施。10^-4和每一项后续稀释(直至10^-7)通过序贯地将1ml 10^-3稀释的杆状病毒转移入9ml TNM-FH并简短漩涡震动以混合来实施。将稀释的杆状病毒材料添加至尽可能多的96孔板孔。将板堆叠并放入大的拉锁袋，在黑暗中于28℃温育。然后在4-7天后自孔收获上清液。

为了固定细胞和染色M2ae1 ORF2板以在UV灯下观看，在生物安全橱中使用多道移液器和无菌移液器尖头将上清液无菌转移至新的96孔板。装有上清液的板可短期保存于4℃或长期保存于-70℃。向孔中剩余的Sf9细胞添加200ul冷的丙酮∶甲醇(50∶50)，并将这于室温温育10分钟。除去固定剂，并将板在通风橱中风干，之后将板在PBS中简短清洗以使固定细胞再水合。然后除去PBS，并向孔中添加100ul A型流感病毒M2(14C2)(Santa Cruz Biotech)并于37℃温育1小时。然后除去一抗，并将孔用PBS清洗三次，除去最后一次清洗液。接着，向孔中添加100ul二抗山羊+小鼠FITC，并于37℃温育1小时。然后除去二抗，并将孔用PBS清洗三次，除去最后一次清洗液。用约0.5ml甘油∶水(50∶50)包被孔，之后除去过量的甘油∶水，并用倒置UV显微镜观察细胞层。

通过在第52代96孔Sf9板上有限稀释第1代分离了一单个M2ae1 ORF2PCV2杆状病毒。简言之，将杆状病毒材料在TNM-FH中10倍稀释。临实施稀释前，将杆状病毒材料简短漩涡震动以确保它彻底混匀。初始10^-1稀释通过将0.1ml杆状病毒转移入0.9ml TNM-FH并简短漩涡震动以混合来实施。10^-2稀释通过将0.1ml 10^-1稀释的杆状病毒转移如入0.9ml TNM-FH并简短漩涡震动以混合来实施。10^-3稀释通过将0.1ml 10^-2稀释的杆状病毒转移入9mlTNM-FH并简短漩涡震动以混合来实施。10^-4和每一项后续稀释(直至10^-6)通过序贯地将0.1ml在先(例如10^-3用于10^-4稀释)稀释的杆状病毒转移入0.9mlTNM-FH并简短漩涡震动以混合来实施。10^-7稀释通过将1ml 10^-6稀释的杆状病毒转移入9ml TNM-FH并简短漩涡震动以混合来实施。10^-8稀释通过将1ml10^-7稀释的杆状病毒转移入9ml TNM-FH并简短漩涡震动以混合来实施。接着，将0.1ml 10^-7和10^-8稀释的杆状病毒材料添加至尽可能多的96孔板孔。将板堆叠并放入大的拉锁袋，在黑暗中于28℃温育。然后在4-7天后自孔收获上清液。

为了对10^-7和10^-8有限稀释实施IFA，将Sf9细胞固定并染色以检测M2ae1ORF2PCV2转染细胞的存在。简言之，在生物安全橱中使用多道移液器和无菌移液器尖头将上清液无菌转移至新的96孔板。装有上清液的板可短期保存于4℃或长期保存于-70℃。向孔中剩余的Sf9细胞添加200ul冷的丙酮∶甲醇(50∶50)，并将这于室温温育10分钟。除去固定剂，并将板在通风橱中风干，之后将板在PBS中简短清洗以使固定细胞再水合。然后除去PBS，并向孔中添加100ul一抗A型流感病毒M2(14C2)(Santa Cruz Biotech)并于37℃温育1小时。然后除去一抗，并将孔用PBS清洗三次，除去最后一次清洗液。接着，向孔中添加100ul二抗山羊+小鼠FITC，并于37℃温育1小时。然后除去二抗，并将孔用PBS清洗三次，除去最后一次清洗液。用约0.5ml甘油∶水(50∶50)包被孔，之后除去过量的甘油∶水，并用倒置UV显微镜观察细胞层。结果呈阳性。

为了自上述有限稀释扩增M2ae1 ORF2 PCV2，使用上清液。简言之，向Sf9细胞6孔板的单个孔添加100ul相应的病毒，之后将板于28℃放置在黑暗中。4-7天后可收获上清液并固定细胞层。

然后对选定的M2ae1内部PCV2 ORF2杆状病毒进行有限稀释扩增收获和Sf9细胞固定。简言之，在生物安全橱中自转染Sf9细胞无菌收获上清液，并转移至2.0ml冷冻管，之后向孔中剩余的Sf9细胞添加1ml冷的丙酮∶甲醇(50∶50)。将这于室温温育10分钟，除去固定剂，并让板在通风橱中风干，之后将板保存于4℃或更冷，供最终的IFA用。

结果

使用上文所述方法，证实了M2ae1片段的存在，而且它的免疫原性或抗原性是可检测的。

实施例6

此实施例证明A型流感病毒M2ae1区能作为氨基尾插至PCV2 ORF2VLP。

具有3′-KpnI的M2ae1 24聚物

M2ae1 24聚物的氨基酸序列为MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO.6)。使用果蝇属的最佳密码子选择将M2ae 124聚物氨基酸序列逆翻译成核苷酸序列。使用特异性的寡核苷酸引物，实施PCR以添加3′-KpnI限制酶位点至M2ae1编码区。

将KpnI限制性位点引入到PCV2ORF2编码区的5′端上

使用特异性的寡核苷酸引物，实施PCR以添加KpnI限制酶位点至PCV2ORF2基因的5′端(见图7)。

将氨基M2ae1连接到PCV2 ORF2的5′端上

使用标准分子生物学方法，将M2ae1-KpnI区克隆入PCV2 ORF2基因(SEQ ID NO.12)的5′端KpnI位点。然后将氨基M2ae1 PCV2 ORF2区克隆入杆状病毒转移载体pVL1393。然后使用Qiagen Mini-Prep质粒试剂盒纯化所得氨基M2ae1PCV2ORF2/pVL1393质粒，用于后续转染。

含有具有M2ae1尾的PCV2 ORF2的重组杆状病毒的生成

使用ESCORT转染试剂(Sigma)将氨基M2ae1 PCV2 ORF2/pVL1393质粒和线性化杆状病毒DNA(Sigma)共转染入Sf9昆虫细胞，28℃5小时。除去转染培养基，然后温和清洗转染细胞，补充培养基，并于27℃温育。5天后，收获含有所生成的重组杆状病毒的细胞上清液，并保存于4℃。用丙酮甲醇固定剩余的转染Sf9细胞，并用于使用抗A型流感病毒M2单克隆抗体14C2进行的免疫荧光测定法(IFA)以验证转染Sf9细胞中M2ae1区的表达。

使用所收获的PCV2ORF2氨基M2ae1杆状病毒DB上清液来生成病毒原种材料。

PCV2ORF2氨基M2ae1的免疫学检测

先前通过IFA证实了受到PCV2ORF2氨基M2ae1杆状病毒DB感染的Sf9细胞中M2ae1表达的验证。然而，作为进一步证实M2ae1与PCV2 ORF2一起表达的手段，对自受到杆状病毒感染的昆虫细胞培养物收获的PCV2 ORF2氨基M2ae1上清液实施免疫印迹。

简言之，将自受到杆状病毒感染的昆虫细胞培养物收获的上清液印迹到PVDF膜上，并测试免疫印迹中PCV2 ORF2和/或M2ae1抗原的存在。用于PCV2 ORF2免疫印迹检测的一抗是抗PCV2 ORF2单克隆抗体6C4-2-4A3-5D10和纯化的猪抗PCV2 ORF2 IgG。用于M2ae1免疫印迹检测的一抗是抗M2单克隆抗体14C2(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)和猪抗M2aeC5血清。用于免疫印迹的相应二抗是HRP标记的山羊抗小鼠偶联物和山羊抗猪偶联物。使用Opti-4CN底物(BioRad)来进行免疫印迹的比色法检测。免疫印迹揭示了ORF2和M2ae1的存在。

Claims

1.一种免疫原性组合物，其包含：

来自PCV2的氨基酸区段，所述PCV2氨基酸区段由SEQ ID NO.10的序列组成；和

在所述PCV2氨基酸区段的氨基或羧基端附着至所述PCV2氨基酸区段的外来氨基酸区段，所述外来氨基酸区段来自除PCV2之外的生物体，其中

-所述附着在所述PCV2氨基酸区段的羧基端且所述外来氨基酸区段为SEQ ID NO.1的序列；或

-所述附着在所述PCV2氨基酸区段的氨基端且所述外来氨基酸区段为SEQ ID NO.6的序列。

2.权利要求1的组合物，所述外来氨基酸区段与所述PCV2氨基酸区段可分开地检测。

3.权利要求2的组合物，所述外来氨基酸区段是通过对所述外来氨基酸区段特异性的测定法可检测的。

4.权利要求3的组合物，所述测定法包含单克隆抗体。

5.权利要求1的组合物，所述组合物在接受其施用的动物中诱导免疫学应答。

6.权利要求5的组合物，所述免疫学应答是对所述外来氨基酸区段特异性的。

7.权利要求5的组合物，所述免疫学应答足以降低感染的临床、病理学、和／或组织病理学病征的发生率或减轻感染的临床、病理学、和／或组织病理学病征的严重性。

8.权利要求1的组合物，所述外来氨基酸区段衍生自选自下组的生物体：微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)和猪流感病毒。

9.权利要求8的组合物，所述外来氨基酸区段由选自下组的序列组成：SEQ ID NO.1和6。

10.权利要求8的组合物，所述组合物降低由微小隐孢子虫、猪流感病毒、及其组合引起的感染的发生率或严重性。

11.权利要求1的组合物，其进一步包含选自下组的成分：佐剂、药学可接受载体、保护剂、稳定剂、及其组合。

12.一种表达载体，其包含：

载体DNA；和

自第一生物体物种衍生的DNA，所述第一生物体物种是PCV2，所述DNA来自PCV2ORF2；和

自第二生物体物种衍生的DNA，其中所述第一和第二物种彼此不同且不同于衍生载体DNA的生物体物种，

且其中所述自PCV2衍生的DNA编码来自PCV2的氨基酸区段，所述PCV2氨基酸区段由SEQ ID NO.10的序列组成；且

所述自第二生物体物种衍生的DNA编码在所述PCV2氨基酸区段的氨基或羧基端附着至所述PCV2氨基酸区段的外来氨基酸区段，所述外来氨基酸区段来自除PCV2之外的生物体，其中

13.权利要求12的表达载体，所述载体DNA来自杆状病毒。

14.权利要求12的表达载体，所述PCV2ORF2DNA具有SEQ ID NO.7的序列。

15.权利要求12的表达载体，所述来自第二生物体物种的DNA编码在接受其施用的动物中诱导免疫学应答的氨基酸区段。

16.权利要求15的表达载体，所述免疫学应答降低由所述第一生物体物种、所述第二生物体物种、及其组合引起的感染的临床、病理学、或组织病理学病征的发生率或严重性。

17.权利要求12的表达载体，所述来自第二物种的DNA选自下组：微小隐孢子虫和猪流感病毒。

18.一种生成抗原的方法，包括下述步骤：组合编码所述抗原的DNA与PCV2DNA以生成组合DNA插入物；并在表达系统中表达所述组合DNA插入物，其中

所述PCV2DNA编码来自PCV2的氨基酸区段，所述PCV2氨基酸区段由SEQ ID NO.10的序列组成；且

所述DNA编码在所述PCV2氨基酸区段的氨基或羧基端附着至所述PCV2氨基酸区段的外来氨基酸区段，所述外来氨基酸区段来自除PCV2之外的生物体，其中

19.权利要求18的方法，所述除PCV2之外的生物体物种选自下组：微小隐孢子虫和猪流感病毒。

20.权利要求18的方法，所述PCV2DNA具有SEQ ID NO.7的序列。

21.权利要求18的方法，所述表达系统包含杆状病毒表达系统。

22.通过权利要求18的方法表达的抗原在制备疫苗或免疫原性组合物中的用途。