CN101939447B - 黄瓜中基因地链接烟草花叶病毒抗性的标记及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分子标记，其基因地链接黄瓜植株(Cucumis sativus L.)基因组中的基因位点，且能鉴别基因位点，该基因组授予对烟草花叶病毒的通常抗性，特别是对两个在商业上重要的致病烟草花叶病毒有抗性，即，黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)。本发明还涉及用于向黄瓜植株(Cucumis sativus L.)、植株、植株部位和果实提供对烟草花叶病毒，特别是对两个商业上重要的致病烟草花叶病毒，即黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)，的抗性的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子标记，其基因地链接黄瓜植株(Cucumis sativus L.)基因组中的基因位点，且能鉴别基因位点，该基因组授予对烟草花叶病毒的通常抗性，特别是对两个在商业上重要的致病烟草花叶病毒有抗性，即，黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)。
本发明还涉及用于向黄瓜植株(Cucumis sativus L.)、植株部位和果实提供对烟草花叶病毒的抗性，特别是对两个商业上重要的致病烟草花叶病毒，即，黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)的抗性的方法。
背景技术
黄瓜植株(即，植株学品种Cucumis sativus的植株)属于葫芦科的葫芦属家族，也包括了像甜瓜和南瓜这样的家族成员。
该植株的可食用果实通常被称为黄瓜。黄瓜通常是圆柱形、绿色皮的果实，包括大约96％的水。已被种植很久的黄瓜植株Cucumis sativus L.是一种世界范围内的重要的园艺作物。黄瓜一般在未成熟的时期收获，且被用在腌菜行业或新鲜市场中。
感染葫芦科的烟草花叶病毒可分为两个亚组：亚组I包括在文献里表示为黄瓜绿斑驳花叶病毒的株系和隔离群(CGMMV，包括株系CV3，CV4，CGMMV-W，CGMMV-SH和CGMMVV-Is)，亚组II包括黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)，Kyuri绿斑驳花叶病毒(KGMMV)，以及与KGMMV密切相关并可能被认为是它的一个株系(Antigus，2001年)的CGMMV的Yodo株系。
黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是一种造成葫芦科严重疾病的烟草花叶病毒属的RNA病毒。
CGMMV株系最先由英国和欧洲报道(Ainsworth，1935年)。该病毒出现在所有组织中(Hollings，1975年)，并且该病毒迅速在工人手中、服装、刀和其他设备上传播，且是种传的。种子的热处理一般用来控制种子的病毒污染(Kim，2003年)。CGMMV还可以通过地表水传播(Drost，1988)。
变黄、长斑、叶片向下卷曲的症状已被报导，但也许最有意义的是中重度的果实长斑和变形的报道。果实的这种长斑和变形能够迅速使受感染的作物滞销。
黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)也许是感染黄瓜作物的最广泛和最有名的烟草花叶病毒。在如荷兰、西班牙(Celix，1996年)、希腊(Varveri，2002年)和印度(Rashmi，2005年)的黄瓜生产区域，CGMMV是一个全球性的问题。产量损失可能为15％(Fletcher，1962年)。已做了寻找对CGMMV在黄瓜中的抗性的尝试(Hsiao，1993年)，并且已发现一些来源亚洲的无症状品种(Kooistra，1968年)。
CFMMV是造成黄瓜植株(Cucumis sativus L)重大经济损失的烟草花叶病毒的另一个家族成员。黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)感染通常在一个相对在前的生长阶段里，首先在果实和顶部叶子上被识别出。叶子症状包括严重的花叶病、脉结病和黄色斑纹。在某些例子中，充分生长的植株显示导致植株倒塌的严重萎蔫症状。在温室里的快速的病毒传播可能导致严重的作物损失。
考虑到在黄瓜植株(Cucumis sativus L.)中由烟草花叶病毒造成的经济损害，特别是CGMMV和CFMMV，包括它们的变种，高度期望的是，提供基因地链接至烟草花叶病毒的基因抗性位点，或质量性状位点(QTLs)，并能够鉴别的基因标记，并且把这种烟草花叶病毒抗性转移到经济上重要的Cucumis sativus L.品种。
发明内容
因此，本发明的目的之一是提供这样的基因标记。
根据第一个方面，本发明提供了一种用于提供烟草花叶病毒抗性的黄瓜植株(Cucumis sativus L.)的方法，包括：
(a)在第一黄瓜植株(Cucumis sativus L.)中鉴别烟草花叶病毒的抗性基因位点；
(b)将鉴别的烟草花叶病毒的抗性基因位点转移进第二黄瓜植株(Cucumis sativus L.)里，从而向所述第二黄瓜植株(Cucumis sativusL.)授予烟草花叶病毒的抗性；
其中烟草花叶病毒的抗性基因位点的特征在于：在一个分子扩增片段长度多态性(AFLP)实验中，利用分子扩增片段长度多态性(AFLP)引物SEQ IDNo：1和SEQ ID No：2，出现241到251bp的核酸扩增片段。
根据本发明，引物SEQ ID No：1包括核酸序列5-GAC TGC GTA CCA ATTCGT-3′，引物SEQ ID No：2包括核酸序列5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACAC-3′。
基因地链接并能够鉴别本烟草花叶病毒的抗性基因位点的分子扩增片段多态性(AFLP)标记也指定为标记E22/M48-F-246(当用引物SEQ ID No：1和2时，核酸AFLP的扩增片段的尺寸：241-251bp，优选地245-247bp，最优选地246bp)。
根据本发明的第一黄瓜植株(Cucumis sativus L.)可以是任何一个对烟草花叶病毒，尤其是对CGMMV和CFMMV具有抗性显型的黄瓜植株(Cucumissativus L.)，该抗性显型通过由如上限定的核酸扩增片段(Marker E22/M48-F-246)的出现鉴别的基因位点来授予。
核酸扩增片段，或分子AFLP标记E22/M48-F-246，从而授予基因位点的抗性的出现，可通过任何适合的分子生物学技术，如凝胶电泳，杂交，亲和层析，荧光等，利用分析核酸扩增产物来建立。
在一个具体的优选实施例中，片段利用在现有技术中指定为分子扩增片断长度多态性(AFLP，Zabeau，1993，and Vos，1995)的核酸扩增和检测技术来扩增和鉴别。
扩增片段长度多态性(AFLP)是一种以聚合酶链反应(PCR)为基础的基因指纹技术，是由Keygene于二十世纪90年代初开发的。AFLP用限制性内切酶来酶切基因DNA，接着把互补的双链接头与限制片段末端结扎。然后限制片段的子集利用补充接头和限制位置片段的引物对来扩增。片段通过放射自显影或荧光方法在聚丙烯酰胺凝胶上被观测到。
这通常产生了许多不同尺寸的核酸扩增片段。通过比较从例如敏感性植株和抗性植株获得的核酸扩增片段，区别核酸扩增片段能够在两种显型之间被鉴别，也能够指定为标记。
在目前情况下，基因地链接并能够鉴别当前抗性位点的指定为AFLP标记E22/M48-F-246的特定的AFLP标记基因是由241-251bp的核酸扩增片段的出现来鉴别的，优选245-247bp，最优选246bp。该标记仅出现在抗性个体中许多未区别的其他AFLP扩增片段中，但在敏感性个体中不出现。
应该注意的是，为了鉴别在第一黄瓜植株(Cucumis sativus L.)里的烟草花叶病毒的抗性基因位点，利用AFLP引物SEQ ID No：1和2进行的黄瓜植株(Cucumis sativus L.)的AFLP分析，能够产生与目前的AFLP标记E22/M48-F-246相差2bp的第二核酸扩增片段。根据本发明，这个更大(2bp)的核酸扩增片段未基因地链接并能够鉴别当前的烟草花叶病毒的抗性基因位点基因。
换言之，当利用AFLP和AFLP引物SEQ ID No：1和2分析时，目前的第一黄瓜植株(Cucumis sativus L.)一定产生标定尺寸的AFLP E22/M48-F-246标记，但另外也产生了较大尺寸(2bp)的第二核酸扩增片段。
只产生AFLP标记E22/M48-F-246或产生AFLP标记E22/M48-F-246，和附加地第二略大(2bp)的片段的两种第一黄瓜植株(Cucumis sativus L.)都包含在本发明中。然而，只产生第二略大(2bp)的片段的第一黄瓜植株(Cucumissativus L.)未包含在本发明中。
考虑到上述情况，第一黄瓜植株(Cucumis sativus L.)的当前选择本身包括了利用分子生物学技术在该植株中检测烟草花叶病毒的抗性基因位点。这是因为基因地链接AFLP标记E22/M48-F-246的当前的烟草花叶病毒的抗性位点不能只利用对传统育种技术普遍的以显型为基础的选择来建立。
换言之，在第一黄瓜植株(Cucumis sativus L.)里鉴别烟草花叶病毒的抗性基因位点不涉及利用单一的传统选择工艺。
在根据本发明在第一黄瓜植株(Cucumis sativus L.)里鉴别烟草花叶病毒的抗性基因位点之后，基因位点被转移进第二黄瓜植株(Cucumis sativus L.)里，从而向所述第二个黄瓜植株(Cucumis sativus L.)授予烟草花叶病毒抗性。
优选地，转移当前的烟草花叶病毒的抗性基因位点包括诸如传统的把第一黄瓜植株(Cucumis sativus L.)与第二黄瓜植株(Cucumis sativus L.)杂交、接下来一个或多个子代与第二黄瓜植株(Cucumis sativus L.)回交的传统育种方法。然而，这种传统育种方法优选地与分子生物学技术共同协作，以便在第二黄瓜植株(Cucumis sativus L.)里建立当前抗性基因位点的保持。
相对于传统育种技术，根据本发明当前的AFLP标记E22/M48-F-246的提供允许在每次回交步骤后合适的烟草花叶病毒的抗性子代的迅速选择，从而避免了繁琐和昂贵的筛选方法，例如在每代上病毒感染和建立一个抗性显型，以便鉴别合适的烟草花叶病毒的抗性子代。
在一个优选的实施例中，第二黄瓜植株(Cucumis sativus L.)是烟草花叶病毒敏感性的商业品种。通过转移当前的抗性基因位点进该植株，而保持其他的商业上有价值的高品质的基因型和显型特征，从而提供了一个有更高经济价值的黄瓜植株(Cucumis sativus L.)。
在一个最优选的实施例中，当前的方法提供了一种具有含有第一黄瓜植株(Cucumis sativus L.)的烟草花叶病毒的抗性基因位点的第二黄瓜植株(Cucumissativus L.)的基因型的黄瓜植株(Cucumis sativus L.)。因此，根据第二方面，本发明还涉及包括含有烟草花叶病毒的抗性基因位点的烟草花叶病毒敏感性黄瓜植株(Cucumis sativus L.)品种的黄瓜植株(Cucumis sativus L.)，其中烟草花叶病毒的抗性基因位点的特征在于：在一个分子扩增片段长度多态性实验里，利用分子扩增片段多态性(AFLP)引物SEQ ID No：1和SEQ ID No：2扩增，出现241-251bp、优选245-247bp、最优选246bp的核酸扩增片段。。
在一个优选实施例里，烟草花叶病毒抗性，从而根据本发明的烟草花叶病毒抗性基因位点，至少授予对黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)的抗性。
根据第三方面，本发明涉及用于提供烟草花叶病毒的抗性黄瓜植株(Cucumis sativus L.)的烟草花叶病毒的抗性基因位点的用途，其中烟草花叶病毒的抗性基因位点特征如上所限定的。
根据本发明的该第三方面，烟草花叶病毒的抗性包括黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)的抗性。
根据第四方面，本发明涉及烟草花叶病毒的抗性基因位点，其特征在于：在分子扩增长度多态性实验中，利用核酸扩增片段长度多态性(ADLP)引物SEQID No：1和SEQ ID No：2的241-251bp核酸扩增片段。
优选地，当前的烟草花叶病毒的抗性基因位点的特征是一个245-247bp的AFLP核酸扩增片段。
最优选地，当前的烟草花叶病毒的抗性基因位点是一个246bp的AFLP核酸扩增片段。
应当注意的是，仅利用扩增片段长度多态性(AFLP)引物SEQ ID No：1和SEQ ID No：2、表示为AFLP核酸扩增片段的基因位点比上述片段略大(2bp)，不包含在本发明中。
根据本发明的该第四方面，烟草花叶病毒的抗性优选地包括黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)的抗性。
具体实施方式
本发明将在下述实施例中被进一步说明。
实施例1：敏感性和抗性的黄瓜植株(Cucumis sativus L.)的鉴别介绍
以下的实验计划用来将黄瓜植株(Cucumis sativus L.)分类为对黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)感染有敏感性或抗性。至少在荷兰，实施分析的最佳时间是从9月到4月。
植株原料
被测试的植株(Cucumis sativus L.)，包括抗性植株与敏感性植株，被播种在中等尺寸的蛭石里，且在24℃下生长，覆盖小尺寸的蛭石。在4到5天后(子叶刚展开)，幼苗被转移到石棉块上，且在2天后，植株被转移到隔离的温室里。
在40个个体的每个块之后，优选地在将其放进隔离的温室4天后，敏感性控制Tyria F1(Enza Zaden的商业F1黄瓜品种，荷兰)作为敏感性控制，并且幼苗被嫁接在子叶上。
病原
CGMMV和CFMMV的隔离种群被准备。简单的说，准备接种体(inoculi)，新鲜的磷酸盐缓冲液(0.1M磷酸盐溶液，pH值为7.7)。从症状最近发展的感染的黄瓜植株(Cucumis sativus L.)上摘取叶子原料。带清楚症状的无茎的嫩叶子组织被采用。近1克的叶子原料被用于5毫升的缓冲液。叶子原料被研磨，从而获得病毒隔离种群。
对于感染，当出现晴朗天气时，如上生长的植株在感染一天前用覆盖物遮荫。在感染一天后，移去覆盖物。但是，在高的光强度的情况下，覆盖物应该再保留一天。在低湿度的情况下，在感染后湿度能通过直接浇湿底盘来增加，以便防止子叶由于感染的伤害而枯萎。温度的要求是夜里18-20℃，白天22-25℃。
植株通过双粗棉布被金刚砂轻轻研磨。海棉被浸到接种体(inoculi)中，在整个子叶的表面擦拭两次。虽然病毒是稳定的，感染时间应该少于1小时。
评估
黄瓜植株的最先的两个叶子没有显示症状(敏感性植株与抗性植株一样)。从第三到第四个叶子的阶段，症状将很容易评价敏感性或抗性。
实施例2：鉴别一个烟草花叶病毒抗性QTL的AFLP标记的鉴别
介绍
在这个例子里，利用由Keygene N.V(瓦黑宁恩，荷兰)实施的一个巨量QTL分析(BQA)，在抗性黄瓜植株(Cucumis sativus L.)中鉴别质量性状位点(QTL)。98个个体的群体作为烟草花叶病毒抗性的标记研发被选择。总共96个的AFLP引物组合在包含显示对烟草花叶病毒抗性的“极端显型”的个体的两个库里被筛选。随后，5个候选标记在12个抗性和12个敏感性个体上被验证。
标记鉴定和验证
获得130个植株的叶子原料：98个个体的Cuc1879-01×OK561群体为测试提供群体，30个供方亲体Cuc1879-01的自交系和群体的父本系。DNA被分离，EcoRI/MseI模板被生成。用引物组合E14/M59的130个植株的测试指纹被生成。
在个体上的BQA和验证
通过在一个包含十个“极端抗性”个体的库和一个包含十个“极端敏感性”个体的库上筛选总共96个引物组合来实施BQA。这个筛选产生下述候选标记的鉴别：
-E14/M58-F-169-P2
-E22/M48-F-248/246(双等位基因)
这些标记随后在24个个体(12个抗性个体和12个敏感性个体)上被验证。依据这个验证，被鉴别的候选标记被证实为链接烟草花叶病毒的抗性。
在群体上候选标记的验证
在筛选96个引物组合和随后的标记确认之后，一个推定的QTL能被鉴别。为了判断被鉴别的QTL是否真正是一个分离的QTL，执行连锁分析。
标记(E14/M58-F-169-P2和双等位基因标记E22/M48-F-248/246)在来自98个个体的群体的46个额外的个体上被筛选。
标记数据集被生成，并与在24个体上的验证的标记数据集合并。根据这一分析，能断定4个标记真正地链接一个QTL。
用WinQTL制图进行标记分析
为了确定显型和基因型之间的相关性，用WinQTL制图软件包分析标记数据集。对于单个标记分析(SMA)，12个中的一个LOD的值被计算。对于区间映射(IM)，通过在显型数据上实施1000置换，95％的可靠阈值被计算，并确定为LOD0.9。解释差异的LOD值和百分比被计算用于该QTL(LOD：9；Exp.Var.：49.5)。
结论
为了鉴别对烟草花叶病毒的抗性的QTL，一个BQA被实施。总共96个引物组合在一个有十个“极端抗性”个体的巨量和一个有十个“极端敏感性”个体的巨量上被筛选。其中之一是双等位基因的候选标记在12个极端抗性和12个极端敏感性个体上以及在群体中的48个其它个体上被验证。通过使用一个BQA途径鉴别了一个QTL区域。该QTL解释了～50％的差异。基于TestPC(～5个标记)，在30个抗性供体Cuc1879-01的自交系里没有异质性被鉴定出。
实施例3：分子标记辅助的烟草花叶病毒抗性的黄瓜植株(Cucumis sativus L.)的鉴别
分子分析
用标准的实验计划，从敏感性和抗性的黄瓜植株(Cucumis sativus L.)中分离基因原料，敏感性即显示如上所述的一个或多个病毒感染症状。
接下来，这个基因原料用适当的限制酶(EcoRI/MseI)消化，再结扎接头之后，用引物对SEQNo：1 5-GAC TGC GTA CCA ATT CGT-3′和SEQIDNo：2 5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACA C-3′或引物对SEQID No：3 5′-GACTGC GTA CCA ATT CAT-3′和SEQID No：4 5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACGT-3′来进行AFLP核酸扩增。
产生的扩增产物通过电泳确定大小。在独立黄瓜植株(Cucumis sativus L.)的基因中的AFLP标记的出现可被检测出是不存在(-)或存在(+)。
具体来说，当AFLP标记E14/M58-F-169(不包含在本发明中，SEQ ID Nos：3和4)出现时，一个约169bp的条带被观察到；当AFLP标记E22/M48-F-248(不包含在本发明中，引物SEQ ID No：3和4)出现时，约248bp的条带被观察到。具有约246bp估计尺寸的AFLP标记E14/M48-F-246(包括在本发明中，引物SEQ ID No：3和4)，基因地与抗性显型相关。
结果被总结在下述的表1中。
表1：在AFLP标记E14/M58-F-169、E22/M48-F-246、E22/M48-F-248和烟草花叶病毒抗性显型之间的相关性
| 独立的黄瓜植株(Cucumis sativus L.) | 显型 | E14/M58-F-169 | E22/M48-F-246 | E22/M48-F-248 |
| TLCG04_4816_10 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_18 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_133 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_23 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_24 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_31 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_43 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_56 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_57 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_61 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_64 | 敏感性 | + | - | + |
| TLCG04_4816_66 | 敏感性 | + | - | + |
| T33169_9 | 抗性 | - | + | - |
| T33168_2 | 抗性 | - | + | - |
| T33168_4 | 抗性 | - | + | - |
| T33168_5 | 抗性 | - | + | - |
| T33168_6 | 抗性 | - | + | - |
| T33168_7 | 抗性 | - | + | - |
| T33168_8 | 抗性 | - | + | - |
| T33168_9 | 抗性 | - | + | - |
| T33169_2 | 抗性 | - | + | - |
| T33169_3 | 抗性 | - | + | - |
| T33169_5 | 抗性 | - | + | - |
| T33169_6 | 抗性 | - | + | - |
表1清楚地显示了所有被测试的黄瓜植株(Cucumis sativus L.)对CGMMV和CFMMV的抗性，其与分子AFLP标记E22/M48-F-246基因地链接。因此，检测这个标记表示烟草花叶病毒抗性基因位点或QTL的出现。
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Claims (2)
1.一种分子标记用于鉴别黄瓜植株(Cucumis sativus L.)基因组中烟草花叶病毒的抗性基因位点的用途，其中所述烟草花叶病毒的抗性基因位点的特征在于：在一个分子扩增片段长度多态性（AFLP）实验中，利用分子扩增片段长度多态性（AFLP）引物SEQ ID No:1和SEQ ID No:2，出现246bp的核酸扩增片段。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述烟草病毒的抗性包括黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）和黄瓜果实斑驳花叶病毒（CFMMV）的抗性。
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