CN101928346B

CN101928346B - 一种抗人组织激肽释放酶单克隆抗体及其制备

Info

Publication number: CN101928346B
Application number: CN 200910063377
Authority: CN
Inventors: 汪道文; 张琴
Original assignee: Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Current assignee: Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2029-07-31
Also published as: CN101928346A

Abstract

一种抗人组织激肽释放酶单克隆抗体及其制备，本发明所述的抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞株HTK CCTCC-200928产生的。所述抗体是针对人组织及肽释放酶尾端的一段12肽的特异性单克隆抗体细胞株；是由杂交瘤细胞株HTK在小鼠体内诱生腹水并纯化而成的；本发明所述的方法，如下步骤：1)将人工合成的人组织激肽释放酶尾端的12肽分别与KLH和BSA交联作为免疫原和包被原；2)免疫小鼠；3)筛选出血清效价最高的小鼠；4)取脾与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞株；5)筛选出杂交瘤细胞株HTK；6)扩大培养杂交瘤细胞，并将其注入小鼠腹腔内诱生腹水；7)纯化腹水后即为抗人组织激肽释放酶单克隆抗体。本发明提供的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体是一种特异性强、效价高。

Description

一种抗人组织激肽释放酶单克隆抗体及其制备

技术领域

本发明涉及一种抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体及其制备方法，属于免疫化学技术领域。

背景技术

人组织激肽释放酶是一个大的多基因家族，由15个成员成。人和动物组织激肽释放酶中只有一种酶能有效地使激肽原释放生物活性物激肽。在人体内该酶称为胰/肾激肽释放酶，新的统一命名KLK1编码hk1蛋白。hk1能水解低分子量激肽原使之生成激肽，而激肽与血管平滑肌细胞膜上的舒缓激肽B2受体结合后，可使血管平滑肌NO增多，进而通过cGMP第二信使途径舒张血管，达到降压的目的。遗传高血压及自发性高血压病人都可见激肽释放酶含量下降。近年来的研究结果表明，hK1除具有降血压作用外，对肾脏损伤的修复也具有明显的治疗作用，还可降低胶原密度、心肌细胞体积和左心室内径，并能增大毛细血管密度，从而有利于心脏重塑。因此，hK1的在心血管疾病诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。

鉴于HK1在心血管疾病诊断和治疗方面的应用前景，国外已有关于HK1含量检测的ELISA试剂盒，但是其操作过程繁琐并且价格昂贵难于获得。目前，国内尚无此类的高效检测试剂盒。而建立具有高灵敏度、高特异性的人组织激肽释放酶含量测定ELISA试剂盒，需要制备特异性强，效价高并可以大量生产的抗人组织激肽释放酶的抗体。本发明利用表位设计软件设计了一段位于KLK1尾端的特异性12肽序列并采用单抗制备技术制备了高效价、高特异性并方便大量生产的抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体。此抗体为针对KLK1的一段特异性表位的单克隆抗体，国内外均无针对此表位的单克隆抗体，为研制高效性的人组织激肽释放酶含量检测的ELISA试剂盒打下了坚实基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性强、效价高、只针对一段特异性表位并可大量生产抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供一种抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体在制备人组织激肽释放酶含量检测的ELISA试剂盒中的应用。

本发明的还一目的是提供一种分泌特异性抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞株HTK。

本发明所述的抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体，由杂交瘤细胞株HTKCCTCC-200928产生的。

本发明所述抗体是针对人组织及肽释放酶尾端的一段12肽的特异性单克隆抗体细胞株；

是由杂交瘤细胞株HTK在小鼠体内诱生腹水并纯化而成的；

具有较高的亲和力，较强的特异性；

可用于Western bloing及ELISA试剂盒的制备；

其采用的多肽序列：Cys-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser。

本发明所述的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将人工合成的人组织激肽释放酶尾端的12肽分别与KLH和BSA交联作为免疫原和包被原；

2)免疫小鼠；

3)筛选出血清效价最高的小鼠；

4)取脾与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞株；

5)筛选出杂交瘤细胞株HTK；

6)扩大培养杂交瘤细胞，并将其注入小鼠腹腔内诱生腹水；

7)纯化腹水后即为抗人组织激肽释放酶单克隆抗体。

本发明所述的杂交瘤细胞株HTK CCTCCNO：C200928，已于2009年4月27日保藏在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

本发明所利用的合成肽为人组织激肽释放酶尾端的一段由12个氨基酸组成的多肽，其本身不具有抗原性，只具有免疫原性，不能直接刺激动物产生抗体，必须与大分子蛋白偶联制备成人工抗原，才能刺激机体产生特异性抗体。

本发明所述的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：先将合成肽分别与血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白偶联制备免疫原(12P-KLH)和包被原(12P-BSA)，然后通过小鼠免疫，细胞融合，筛选出杂交瘤细胞株，再进行培养，纯化成单克隆抗体。

其中，本发明所述的免疫原，是采用戊二醛交联法将合成肽(12P)和载体雪蓝蛋白(KLH)偶联成的。用该免疫原免疫Blab/c小鼠，小鼠血清效价能达到1∶25,600。

所述的人组织及肽释放酶包被原，是用戊二醛法将合成肽(12P)和牛血清白蛋白(BSA)偶联而成的。

本发明通过12P-KLH免疫原对小鼠进行免疫，取得免疫小鼠血清，再建立间接ELISA和间接竞争ELISA法来测定免疫小鼠的血清效价及抗体的特异性，并用Western Blot来确定小鼠是否有特异性抗体产生。

选取免疫反应强的小鼠，利用细胞融合技术，将免疫小鼠的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞株，筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株HTK。

最后将杂交瘤细胞株制备成腹水，纯化腹水得到小鼠抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体。

本发明抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体可用于制备人组织激肽释放酶检测的ELISA试剂盒。

本发明提供的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体是一种特异性强、效价高、只针对一段特异性表位即可大量生产抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体并且在HK1含量检测的ELISA试剂盒应用上操作简便且成本低。

附图说明

图1为受免疫小鼠血清的标准曲线

图2为筛选出的杂交瘤细胞株的标准曲线

图3为小鼠腹水的标准曲线。

图4为抗体经亲和层析纯化后的SDA-PAGE。

图5为人组织激肽释放酶的Western Blot。

具体实施方式

以下实例用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

免疫原(12P-KLH)和包被原(12P-BSA)的制备

12P为一段由12个氨基酸组成的多肽，靠近人组织激肽释放酶的尾端，其本身不具有免疫原性，只有反应原性，不能直接刺激动物产生抗体，必须与大分子蛋白偶联制备成人工抗原，才能诱导机体产生特异性抗体。本研究采用戊二醛法将12P分别与KLH和BSA相偶联，合成了免疫原与包被原。

1.1材料

12肽(NH2-Cys-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser-COOH)，西安美联公司；血蓝蛋白(KLH)，戊二醛，sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)，甘氨酸，武汉凌飞生物有限公司。

1.2人组织激肽释放酶免疫原的合成

首先准确称取10mg/ml多肽溶于PBS，取其中700ul置于10ml试管中，加入1ml血蓝蛋白(KLH)。然后缓慢加入0.3％戊二醛，室温下振摇2小时直至反应液变为黄色，加入1mmol/l甘氨酸125ul终止反应。30分钟后将所有反应液体装入透析袋内，并将透析袋置于2升PBS中，在4℃充分透析，隔日更换PBS继续透析4小时。分装透析液，-20℃保存。

1.3人组织激肽释放酶包被原的合成

首先准确称取10mg/ml多肽溶于PBS，取其中700ul置于10ml试管中，加入1ml牛血清白蛋白(BSA)。然后缓慢加入0.3％戊二醛，室温下振摇2小时直至反应液变为黄色，加入1mmol/l甘氨酸125ul终止反应。30分钟后将所有反应液体装入透析袋内，并将透析袋置于2升PBS中，在4℃充分透析，隔日更换PBS继续透析4小时。分装透析液，-20℃保存。

实施例2

抗人组织激肽释放酶单克隆抗体制备

2.1材料

12肽(NH2-Cys-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser-COOH)，西安美联公司；血蓝蛋白(KLH)，戊二醛，弗氏完全佐剂(FCA)，氏完全佐剂(FICA)；TMB，HAT(50×)，HT(50×)，碳酸氢钠，DMSO，sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)，甘氨酸，HRP标记羊抗小鼠IgG，PEG4000，RPMI1640，武汉凌飞生物有限公司；抗体亲和层析试剂盒，PIERCE公司；氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钾，液体石蜡，吐温-20，天津欧密科化学试剂有限公司；胎牛血清，HYCLONE公司。

Balb/c小鼠(雌性，6周龄)，华中科技大学同济医学院实验中心；SP2/0本实验室保存。

试剂配制：

(1)包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)：

Na CO3 1.59克

NaHCO3 2.93克

加蒸馏水至1000ml

(2)洗涤缓冲液(PH7.4PBS)：0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O 2.9克

NaCl 8.0克

KCl 0.2克

Tween-20 0.05％ 0.5ml加蒸馏水至1000ml

(3)稀释液：

牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100ml

(4)终止液(2M H2SO4)：

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

(5)底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸)：

0.2M Na2 HPO4(28.4克/L)25.7ml

0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml

加蒸馏水50ml。

(6)TMB(四甲基联苯胺)使用液：

TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml

底物缓冲液(PH5.5) 10ml

0.75％H2O2 32μl

2.2试验方法

2.2.1动物免疫

首次免疫时，取12P-KLH免疫原与等量弗氏完全佐剂充分乳化，按100ug/只的剂量对8只Balb/c小鼠进行背部皮内多点注射，2周后，将12P-KLH免疫原与等量弗氏不完全佐剂充分乳化，并用同样的方法免疫小鼠，以后每隔两周免疫一次，共免疫5次。

2.2.2ELISA检测方法的建立

在小鼠第三次免疫后的第7天，尾部采血，室温静止1h，然后4℃放置2h，3000rpm离心10min分离血清，分装，-20℃保存，建立间接ELISA和间接竞争ELISA法测定血清效价及特异性，直至血清效价足够高为止。

2.2.2.1间接ELISA方法的建立

1.包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将包被原稀释至10μg/ml。在每个酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2.封闭：每空加入200ul1％BSA-PBS，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

3.加样：加系列稀释的待检抗体0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔)。

4.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG(1∶8000)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

5.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10分钟。

6.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

7.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(具体结果见表1)。

2.2.2.2间接竞争ELISA方法的建立

1.包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将包被原稀释至10μg/ml。在酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

3.加样：在酶标板相邻两列分别加入系列稀释的待检抗体50ul/孔，然后其中一列分别加入10ug/ml包被原，而另一列加入50ul抗体稀释液

6.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

7.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：抑制孔的颜色越浅，反应孔颜色越深，说明有特异性抗体产生。反之，则无。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若抑制孔O·D值小说明有特异性抗体产生。同时可以根据竞争抑制率大小判定抗体特异性。

竞争抑制率＝1-B/BO(其中B为抑制孔的OD值，BO为对照孔的OD值)。(具体结果见表2)。

2.2.3杂交瘤细胞的制备及筛选

选取一只免疫反应强的小鼠，于融合前三天不加佐剂的抗原冲击免疫，利用细胞融合技术，用50％PEG作为融合剂，将免疫脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合。

2.2.3.1细胞融合流程

1.取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

2.同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

3.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。

4.弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

5.轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

6.在室温下融合：

①30秒内加入预热的1ml50％PEG(Merek，分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。

②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml， 3ml，4ml，5ml和10ml。

7.离心，800rpm，6分钟。

8.弃上清，先用6ml左右20％胎牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

9.根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

10.将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO₂孵箱培养。

一般一块96孔板含有1×10⁷脾细胞。

2.2.3.2杂交瘤细胞的筛选

1.融合24小时后，加HAT选择培养液。HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

2.有限稀释法克隆化

①制备饲养细胞悬液(同融合前准备)。

②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10³/ml。

③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。

⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。

注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

3.采用间接ELISA法挑选单克隆抗体，经过四次亚克隆，筛选出8株单克隆抗体，其亚克隆阳性率100％

2.2.4单克隆抗体的制备

采用体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体，石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种3～5×106杂交瘤细胞2F8。10～20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含1～10mg单抗。

2.2.5利用间接ELISA法，间接竞争ELISA法，抗体的亲和力及特异性。

2.2.4单克隆抗体亲和层析纯化

按照PIERCE公司IgG亲和层析纯化试剂盒纯化筛选出的单克隆抗体(纯化后的SDS-PAGE)

2.2.5Western Blot检测纯化后抗体的特异性。

2.3结果

2.3.1间接ELISA检测小鼠血清效价

免疫小鼠血清效价达到1∶25600，见表1。

血清稀释度	OD值
		1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1∶1600 1∶3200 1∶6400 1∶12800 1∶25600 空白阴性1∶100	2.568 2.054 1.857 1.554 1.341 1.161 0.996 0.826 0.679 0.086 0.117

阴性1∶200 阴性1∶400

0.108 0.092

表1小鼠血清效价(OD值)

2.3.2间接竞争ELISA检测小鼠血清效价及特异性

免疫小鼠血清效价达到1∶25600，见表2(效价孔)。效价孔是指该孔中不加12P标准品，可用于测定血清效价。在间接ELISA法中，加入10ug/ml12P-BSA标准品作竞争ELISA时，OD值显著下降，说明抗血清是针对12P-BSA的，见表2(抑制孔)。根据竞争抑制率＝1-B/BO(其中B为抑制孔的OD值，BO为对照孔的OD值)。可以得到当血清稀释到1∶1600时，其竞争抑制率为0.757.

表2小鼠血清效价及特异性(OD值)

2.3.3杂交瘤细胞的建立

经过四次亚克隆，筛选到8株能稳定分泌抗人组织激肽释放酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株，对其中一株命名为2F8。

改小鼠杂交瘤细胞株已于2007年5月11日保藏在华中科技大学同济医学院心血管实验室。

2.3.3杂交瘤细胞上清效价的测定

将细胞上清作倍比稀释后用间接ELISA检测，其效价达1∶1000以上(结果见附图2)。

2.3.4腹水的效价的测定

将腹水作倍比稀释后用间接ELISA检测，其效价达1∶25600以上(结果见附图3)。

2.3.5腹水的交叉反应测定

将人组织激肽释放酶上其他表位的多肽与BSA交联后作为包被原作间接ELISA法，未发现有交叉反应。

2.3.6腹水特异性测定

腹水效价达到1∶25600，见表3(效价孔)。效价孔是指该孔中不加12P-BSA标准品，可用于测定血清效价。在间接ELISA法中，加入10ug/ml12P标准品作竞争ELISA时，OD值显著下降，说明抗血清是针对12P-BSA的，见表3(抑制孔)。根据竞争抑制率＝1-B/BO(其中B为抑制孔的OD值，BO为对照孔的OD值)。可以得到当血清稀释到1∶1600时，其竞争抑制率为0.88。

表3小鼠腹水效价及特异性(OD值)

血清稀释度	效价孔(BO)	抑制孔(B)
			1∶400 1∶800 1∶1600 1∶3200 1∶6400 1∶12800 1∶25600 空白阴性1∶1600	2.548 2.155 1.856 1.578 1.221 1.032 0.857 0.100 0.145	0.327 0.212 0.188 0.133 0.191 0.133 0.145 0.113 0.116

2.3.7单克隆抗体的亲和纯化

利用亲和层析法纯化了腹水中的单克隆抗体，并做了SDS-PAGE检测其纯化效果，结果见附图5。

2.3.8纯化后的单克隆抗体针对人组织激肽释放酶的特异性检测

将HK-3.1的质粒转染TC-1细胞，收获蛋白作为阳性对照，而未转染的TC-1细胞收获的蛋白作为阴性对照来做Western Blot。当纯化后的抗体稀释到1∶8000时，可以看到阳性对照有明显条带。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上可作一些修改或改进，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，在不偏离本发明的基础上所做出的修改或改进是本发明要求保护的范围。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属同济医院

<120>一种抗人组织激肽释放酶单克隆抗体及其制备

<140>

<141>

<160>1

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<223>根据蛋白的结合表位而设计

<400>1

Cys Lys Trp Ile Glu Asp Thr Ile Ala Glu Asn Ser

1 5 10

Claims

1.一种抗人组织激肽释放酶单克隆抗体，其特征为：

所述抗体是针对人组织激肽释放酶尾端的一段12肽，由杂交瘤细胞株HTK分泌的特异性单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C200928；

是由杂交瘤细胞株HTK在小鼠体内诱生腹水并纯化而成的；

具有较高的亲和力，较强的特异性；

可用于Western blotting及ELISA试剂盒的制备；

其采用的多肽序列：NH2-Cys-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser-COOH。