CN101892235B - 用于诱导白血病细胞分化的小分子rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于诱导白血病细胞分化的小分子RNA，及其在在诱导肿瘤细胞系K562红系分化中的应用。所述小分子RNA不仅具有siRNA的廉价、无毒副作用、持续时间长、转染效率高等有利效果，而且与现有人白血病细胞红系分化siRNA诱导剂相比作用强、对肿瘤细胞分化的多种指标有效。

Description

用于诱导白血病细胞分化的小分子RNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种双链RNA分子及其应用，特别是一种能够诱导白血病细胞红系分化双链RNA分子及其应用。 

背景技术

根据肿瘤干细胞理论(例如见C.T.Jordan，M.L.Guzman，M.Noble，Cancer Stem Cells，N.Engl.J.Med.355(2006)1253-1261)及肿瘤细胞分化障碍异常的研究进展，近年来提出了肿瘤治疗的新思路：肿瘤诱导分化治疗，即，利用分化诱导剂使肿瘤细胞向正常细胞方向分化，减轻或逆转肿瘤细胞的恶性表型，从而治疗肿瘤(例如见M.Leszczyniecka等，Differentiation therapy of human cancer：basic science and clinicalapplications，Pharmacol.Therapeut.90(2001)105-156)。其中维甲酸和砷剂诱导分化治疗早幼粒细胞性白血病，对初诊患者的临床缓解率可达90％(例如见C.Massard等Tumour stem cell-targeted treatment：eliminationor differentiation，Annal.Oncology 17(2006)1620-1624)。 

尽管实验研究已发现不少诱导分化剂，但现有的诱导分化剂主要是维甲类、二甲基亚砜等小分子化合物及一些细胞因子(例如见D.Zhang等，A critical role for the co-repressor N-CoR in erythroid differentiation andheme synthesis，Cell Res.17(2007)804-814；F.Wolter等，Resveratrolenhances the differentiation induced by Butyrate in Caco-2 colon cancer cells，J.Nutr.132(2002)2082-2086；B.Zochodne等，Epo regulates erythroidproliferation and differentiation through distinct signaling pathways：implication for erythropoiesis and Friend virus-induced erythroleukemia，Oncogene 19(2000)2296-2304)。 

其中，小分子化合物对人体多有一定的毒性，存在容易复发和产生 耐药性的问题，例如全反式维甲酸可引起维甲酸综合症，严重者可危及生命(例如见P.Montesinos等，Differentiation syndrome in patients withacute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid andanthracycline chemotherapy：characteristics，outcome，and prognostic factors，Blood 113(2009)775-783)；又例如临床化疗中常用的抗癌药物阿糖孢苷，具有很强的骨髓抑制作用(例如见M.C.Cha等，Low dose docosahexaenoicacid protects normal colonic epithelial cells from araC toxicity，BMCPharmacol.23(2005)7)。 

除小分子化合物类药物外，一些细胞因子可诱导肿瘤细胞的分化(例如见B.Zochodne等，Epo regulates erythroid proliferation and differentiationthrough distinct signaling pathways：implication for erythropoiesis and Friendvirus-induced erythroleukemia，Oncogene 19(2000)2296-2304)，但细胞因子价格非常昂贵，极大地限制了其在临床上的应用。 

此外，一些基因也可诱导肿瘤细胞的分化(例如见D.C.Tomlinson等，FGFR1 promotes proliferation and survival via activation of the MAPKpathway in bladder cancer，Cancer Res.69(2009)4613-4620；J.H.Schulte等，Lysine-specific demethylase 1 is strongly expressed in poorlydifferentiated neuroblastoma：implications for therapy，Cancer Res.69(2009)2065-2071)，但由于基因治疗存在的基因转染效率差、持续时间短、基因整合位点随机等问题尚未解决，因而基因治疗手段短期内还很难在临床普及。 

近年来得到广泛研究的小片段干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和非编码微RNA(microRNA，miRNA)因其对序列同源的靶基因表达的特异性高效抑制作用已成为基因表达抑制技术的重要成员，并开辟了利用小分子RNA制备核酸药物的新领域(例如见S.M.Elbashir等，Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells，Nature 411(2001)494-498.)。 

与传统的化合物类药物和基因治疗相比，利用小分子RNA制药具有以下优点：小分子RNA以序列互补的方式识别靶基因并抑制其表达，因 而可以推论能够作用于靶基因从而发挥生物学效应的小RNA(有效小RNA)的数量比传统的化合物类药物更多；可利用基因工程技术及文库技术对小分子RNA进行大规模高通量筛选；与外源大分子基因需依靠细胞内表达不同，小分子RNA可由化学合成、体外转录、细胞内表达等多种方式获得，且成本较低；与表达外源大分子基因不同，小分子RNA的分子小，易于导入细胞发挥作用；对小分子RNA易于进行基因工程改造及化学修饰，可提高其作用的特异性、有效性、稳定性、靶向细胞特异性等。因此小分子RNA在核酸制药和基因治疗中显示出巨大的应用潜力。 

目前已报道的与K562细胞系或与其相应的红白血病细胞分化有关的siRNA都是针对已知基因序列设计的，包括针对3种基因PU.1、CAT1、BP1的siRNA。其中，PU.1siRNA仅对小鼠红白血病细胞系MEL有红系分化中作用(例如见M.Papetti等，Reprogramming Leukemia Cells toTerminal Differentiation and Growth Arrest by RNA Interference of PU.1，Mol.Cancer Res.5(2007)1053-1062；R.Blaybel等，Downregulation of theSpi-1/PU.1 oncogene induces the expression of TRIM 10/HERF 1，a key factorrequired for terminal erythroid cell differentiation and survival，Cell Res.18(2008)834-845)，该细胞系是从Friend病毒诱导产生的小鼠红白血病细胞中分离出的细胞系，由于该小鼠红白血病的发生、发展及表现与人类红白血病有较大差异，因此其对人类白血病治疗的效果尚难预计。 

此外，已报道的CAT1 siRNA仅有影响K562的细胞生长速度的效果(例如见T.MAEDA等，Changes of Differentiation and Proliferation in K562Cells with Various Levels of Knockdown of Cationic Amino Acid Transporter1，Drag Metab.Pharmacokinet.23(2008)181-187)。 

BP1 siRNA仅对K562细胞有升高β-珠蛋白表达量的效果(例如见O.P.Zoueva等，Inhibition of beta protein 1expression enhances beta-globinpromoter activity and beta-globin mRNA levels in the human erythroleukemia(K562)cell line，Exp.Hematol.32(2004)700-708)。 

同时，由于已知可作为疾病靶标的基因十分有限，因而针对已知基因序列设计siRNA的可能性被限制在很窄的范围内。 

因此，需要提供这样的siRNA肿瘤诱导分化分子：不仅能具有siRNA的廉价、无毒副作用、持续时间长、转染效率高等有利效果，而且与现有siRNA诱导剂相比作用强、对肿瘤细胞的多种指标有效。 

发明内容

为了解决现有分化诱导剂存在的上述问题，扩展可用于治疗白血病等肿瘤的siRNA序列，本发明人利用基因工程技术从大容量随机siRNA文库(见本发明人的WO2004/001044和M.Chen等A universal plasmidlibrary encoding all permutations of small interfering RNA，Proc.Natl.Acad.Sci.102(2005)2356-2361，其全部内容以援引方式并入本文)中筛选出可诱导人慢性髓样白血病K562细胞系向红细胞方向分化(红系分化)的siRNA。 

<1>本发明提供了一种双链RNA分子，其双链互补序列分别是含有以下序列的序列： 

SEQ NO.1：5’ACAUGUACAUAGGGAUAUC3’；和 

SEQ NO.2：5’GAUAUCCCUAUGUACAUGU3’， 

其中在SEQ NO.1和SEQ NO.2的5’端和/或3’端延伸有1～3个任意核苷酸。 

<2>本发明的另一方案是一种双链RNA分子，其双链互补序列分别是以下的序列： 

SEQ NO.1：5’ACAUGUACAUAGGGAUAUC3’；和 

SEQ NO.2：5’GAUAUCCCUAUGUACAUGU3’。 

<3>本发明还提供了如上<1>或<2>所述的双链RNA分子在制备诱导肿瘤细胞系K562红系分化的药物中的应用。 

<4>本发明的双链RNA分子能够使肿瘤细胞系K562的CD235表达增加、ε-珠蛋白表达增加、γ-珠蛋白表达增加、β-珠蛋白表达增加、GATA-2表达降低、和/或细胞增殖速度减慢。 

<5>本发明还涉及如<1>或<2>所述的双链RNA分子在制备治疗人慢性髓样白血病的药物中的应用。 

<6>本发明还提供了编码如<1>或<2>所述的双链RNA分子的DNA分子。 

<7>本发明还提供了包含如<5>所述DNA分子的核酸载体。 

<8>本发明还提供了如<5>所述的DNA分子和/或如<6>所述的核酸载体在制备诱导肿瘤细胞系K562红系分化的药物中的应用。 

<9>本发明的DNA分子和/或核酸载体能够使肿瘤细胞系K562的CD235表达增加、ε-珠蛋白表达增加、γ-珠蛋白表达增加、β-珠蛋白表达增加、GATA-2表达降低、和/或细胞增殖速度减慢。 

<10>本发明还提供了如<5>所述DNA分子或如<6>所述的核酸载体在制备治疗人慢性髓样白血病的药物中的应用。 

令人惊讶的是，本发明的可诱导人慢性髓性白血病K562细胞向红细胞方向分化(红系分化)的clone-67 siRNA的序列目前尚未有报道。本发明的clone-67siRNA具有诱导人慢性髓性白血病K562细胞向红细胞方向分化(红系分化)的作用，使K562细胞分化程度增高，减慢其增殖速度，从而减轻其恶性表型。 

本发明的clone-67siRNA是从大容量随机siRNA文库中筛选出来的，不与已知的任何基因具有同源性，因此不同于现有的治疗白血病或诱导白血病细胞体外分化的siRNA。 

附图说明

下面将结合附图对本发明进行具体描述，附图中： 

图1显示经随机挑选的12个siRNA转染的K562细胞的CD235阳性细胞比例； 

图2显示clone-67siRNA转染增加K562细胞的CD235表达； 

图3显示clone-67siRNA转染增加K562细胞的ε-珠蛋白、γ-珠蛋白和β-珠蛋白表达量； 

图4显示clone-67siRNA转染后K562细胞的GATA-2和GATA-1表达量的改变； 

图5.转染clone-67siRNA后K562细胞的增殖速度。 

具体实施方式

本发明使用的大容量随机siRNA文库是本发明人建立的大容量随机siRNA文库(见WO2004/001044；和M.Chen等，A universal plasmid libraryencoding all permutations of small interfering RNA，Proc.Natl.Acad.Sci.102(2005)2356-2361，其全部内容以援引方式并入本文)，该siRNA文库中有大约3x10⁷个不同的siRNA序列。 

本发明使用的K562细胞系(购自ATCC，货号CCL-243)是从人慢性髓样白血病患者的肿瘤细胞中分离出的一个细胞系，属于红白血病细胞系，是研究白血病细胞分化的常用细胞模型。K562细胞向红细胞方向分化(红系分化)后会出现一系列的特征性改变：例如CD235、珠蛋白表达增高，并且随着分化进程的推进，GATA-2的表达逐渐降低，而GATA-1的表达逐渐增加；K562细胞向红细胞方向分化(红系分化)后随着分化进程的推进，细胞增殖速度逐渐减慢，进入终末分化后最终将退出细胞周期不再增殖。 

本文中的术语“红系分化”是指分化程度低的肿瘤细胞经过一系列相关基因表达的调控过程，向具有红细胞性质的无恶性的高分化细胞转变的过程。红系分化是本领域中常用于评价细胞分化程度和药物对肿瘤细胞分化调控效果的指标之一。 

CD235在造血前体细胞中不表达，而K562细胞向红细胞方向分化(红系分化)后会出现的特征性改变之一是CD235开始表达并逐渐增加，成熟红细胞保持高水平的CD235量。 

血红蛋白的产生是红系分化的重要标志之一，血红蛋白由血红素及珠蛋白组成，组成血红蛋白的主要是α-珠蛋白和β-珠蛋白，β-珠蛋白分5种：ε-珠蛋白、γ(A和G)-珠蛋白，δ-珠蛋白及β-珠蛋白。K562细胞向红细胞方向分化(红系分化)后会出现的特征性改变之一是某些种类的珠蛋白的表达增加。 

GATA-2和GATA-1是红系分化过程中重要的转录因子。K562细胞向红细胞方向分化(红系分化)后随着分化进程的推进，GATA-2的表达逐 渐降低，而GATA-1的表达逐渐增加。 

利用实施例1中的筛选方法从上述大容量随机siRNA文库中以K562细胞为对象筛选出CD235阳性的细胞，对这些阳性细胞中所含的siRNA编码序列进行测序，可得知引起CD235表达增高的siRNA的序列，再进一步对这些siRNA导入K562细胞后的作用进行鉴定。 

以上述方法，我们从随机siRNA文库中筛选到一个可诱导K562细胞向红细胞方向分化(红系分化)的siRNA：clone-67，它的两条互补链的DNA编码序列分别为(方向为从5’到3’)：ACATGTACATAGGGATATC和GATATCCCTATGTACATGT。 

不过，本发明并不限于clone-67的序列本身，本发明还包括clone-67siRNA的序列为基础，在其序列两端各添加1～3个任意核苷酸的序列，这是因为siRNA的作用机制是对同源序列的调控，已表明siRNA的作用效果主要取决于其中间的核心序列，而靠近两侧的碱基序列对其作用效果的影响较小(例如见Q.Du等，A systematic analysis of the silencingeffects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites，Nucleic Acids Res.33(2005)1671-1677.)，且在siRNA的两侧添加1～3个核苷酸不但不会减弱该siRNA的作用效果，还会增强siRNA的效果(例如见S.D.Rose等，Functional polarity is introduced by Dicer processing ofshort substrate RNAs，Nucleic Acids Res.33(2005)4140-4156.及D-H Kim等，Synthetic dsRNA Dicer sustrates enhance RNAi potency and efficacy，Nature Biotech.23(2005)222-226.)。 

实施例 

实施例1：12个阳性siRNA的筛选 

K562细胞用添加10％胎牛血清(购自Sigma，货号12003C)的IMDM培养基(购自Thermo-Fisher，货号SH30228.01B)在37℃5％二氧化碳的细胞培养箱(购自三洋)中培养(除非另外指出，以下各实施例中K562细胞培养方式与此相同)，将包含3x10⁷个不同siRNA编码序列的随机siRNA文库混合质粒用Lipofectamine 2000(购自Invitrogen，货号11668-019)转染入6.7x10⁷个K562细胞，转染后48小时，向培养液中加入G418(购自 Merck，货号345810；终浓度800ug/ml)杀死未被转染的细胞；14天后，将细胞浓度调整为1x10⁷个细胞/ml，按照每10⁶个细胞加入抗体1ug的比例用抗CD235抗体(购自R&D，货号MAB1228)在4℃标记细胞半小时，再加入 

Pan Mouse IgG(购自Invitrogen，货号110-41)磁珠，按照磁珠说明书的方法(即，用10ml试剂盒中的溶液1洗细胞一次，将细胞重悬于溶液1中，浓度1x10⁷个细胞/ml，加入磁珠1ml，4℃半小时，加一倍体积溶液1，磁珠吸2分钟，弃上清，用溶液1洗磁珠3次，弃上清，得到CD235阳性的细胞)筛选出CD235阳性的细胞。 

提取以上筛选出的CD235阳性细胞中的DNA，PCR扩增出其中的siRNA编码序列，克隆入pCUH载体，连接产物转化大肠杆菌，从转化子中随机挑取100个测序，再从测序得到的siRNA编码序列中随机挑取12个进行单独验证(实施例2中详述)，即分别将这12个siRNA按照其编码序列化学合成与其相对应的双链siRNA(由Invitrogen合成)，以排除载体可能对细胞产生的非特异性影响，以验证每个siRNA诱导红系分化的作用。 

实施例2：12个siRNA使K562细胞的CD235表达不同程度增加 

除12个随机合成的siRNA之外，设立一个阴性对照组(Con)：转染时只加转染试剂HiPerFect Transfection Reagent，不加siRNA组。 

以实施例1的方法培养K562细胞，并在细胞达到(汇合度约60％时)时，用HiPerFect Transfection Reagent(购自Qiagen，Cat#301704)将这些siRNA双链分别单独瞬时转染K562细胞，每次转染时siRNA的浓度为25nM，第一次转染后60小时进行第二次转染，以第二次转染后48小时72小时收集细胞，用于检测红系分化的指标，从而鉴定这些siRNA诱导红系分化的作用。 

检测分别以12个siRNA瞬时转染的K562细胞的CD235表达：各组细胞两次转染后72小时收集细胞，用FITC标记的抗CD235抗体(购自BD Pharmingen，货号559943)4℃染色1小时，PBS(磷酸盐缓冲液)洗细胞3次后用Accuri公司的Accuri C6流式细胞仪检测CD235的表达。 

测试结果如图1所示，图1是各siRNA转染后CD235阳性细胞比例 的流式细胞仪检测图，从中可以看出，12个siRNA中有6个瞬时转染K562细胞后72小时可使CD235阳性细胞百分比较阴性对照(Con)增加到1.5倍以上，其中clone-67siRNA使阳性细胞百分比升高的程度最高，因此预计clone-67siRNA对K562细胞具有最强的诱导红系分化能力，选取该clone-67进行以下多个红系分化指标的检测。 

实施例3：clone-67siRNA使K562细胞的CD235表达增加 

CD235细胞的培养方式和转染方式同实施例2，除实施例2中获得的clone-67siRNA之外，所有鉴定实验均设立两个阴性对照组(除非另外指出，以下各实施例中的阴性对照与此相同)：转染时只加转染试剂HiPerFect Transfection Reagent，不加siRNA组(Con组)；转染不作用于任何基因的阴性对照Allstars negative control siRNA(购自Qiagen，Cat#1027280)组(Allstars组)。 

检测以clone-67siRNA、Con和Allstars瞬时转染的K562细胞的CD235表达：各组细胞两次转染后72小时收集细胞，用FITC标记的抗CD235抗体(购自BD Pharmingen，货号559943)4℃染色1小时，PBS(磷酸盐缓冲液)洗细胞3次后用Accuri公司的Accuri C6流式细胞仪检测CD235的表达。测试样品制备和测定方法：100ulPBS缓冲液中5x10⁵个细胞，加0.5ug抗体，流式细胞仪在525nm处用仪器设定程序Protocol：525nm.PRO收集20000个细胞进行分析。以上实验均独立重复3次以上。 

测试结果如图2和表1所示，图2A是CD235表达量的流式细胞仪检测图，其中左图是Con的细胞流式分析，中间图是Allstars的细胞流式分析，右图是clone-67siRNA的细胞流式分析，图2B是上述3个分析结果的叠加图，图2C是显示上述3组的CD235阳性细胞的百分比的柱状图。图中的平均值±标准差是3次独立重复实验的平均值和标准差。**代表显著性t检验p＜0.01。从中可以看出与Con阴性对照相比，clone-67siRNA瞬时转染K562细胞后72小时可使CD235阳性细胞百分比从平均16.57％增加到平均61.46％，统计学分析有显著差异，且细胞的CD235表达强度显著增加，而Allstars阴性对照对K562细胞的CD235表达无明 显改变。 

表1.CD235阳性细胞的百分比 

实施例4：clone-67siRNA使K562细胞的ε-珠蛋白、γ-珠蛋白和β-珠蛋白的表达增加 

CD235细胞的培养方式和转染方式同实施例2，检测以clone-67siRNA、Con和Allstars瞬时转染的K562细胞的ε-珠蛋白、γ-珠蛋白和β-珠蛋白的相对表达：以Taqman荧光定量PCR法检测珠蛋白相对于内参基因β-肌动蛋白的表达量，Taqman引物及探针(表2)由ABI公司的PrimerExpress 2.0软件设计。引物由Invitrogen公司合成，探针由Takara公司合成。 

以Trizol(购自Invitrogen，货号15596-026)提取细胞总RNA，提取方法为：按每3.5cm直径的培养皿面积加Trizol 1ml，充分混匀裂解细胞，室温放置5分钟，每1ml Trizol加0.2ml氯仿，剧烈混匀，室温放置3分钟，4℃下12000g离心15分钟，取上层液相，按每1ml Trizol量加0.5ml异丙醇，充分混匀，室温放置10分钟，4℃下12000g离心10分钟，吸弃上清，用75％乙醇洗RNA沉淀一次，将RNA沉淀晾干，用无RNase水溶解，紫外定量。取3ug总RNA用 

II Reverse Transcriptase(购自Invitrogen)按照说明书的方法反转录为cDNA，反应体积为20ul，从产物中取出1ul用iQ Multiplex Powermix(购自Bio-Rad)在Biorad公司的iQ5荧光定量PCR仪上进行二重荧光定量PCR反应(仪器参数)，荧光定量PCR反应参数：第一步95℃3分钟，第二步95℃15秒，第三步57℃55秒，第二、第三步重复40个循环。珠蛋白的表达量先以内参基因β-肌动蛋白为标准进行标准化，转染clone-67siRNA组的标准化珠蛋白表达量再进一步以Con组的标准化珠蛋白表达量(设定为1.0)为标准进行标准化，结果表示为珠蛋白的相对表达倍数。以上实验均独立重复3次，结果表示为3次实验数据的平均值±标准差。 

表2用于定量PCR实验的Taqman引物和探针序列 

引物及探针序列均为5’→3’ 

测试结果如图3所示，A显示了上述3组的ε-珠蛋白的相对表达量，B显示了上述3组的γ-珠蛋白的相对表达量，C显示了上述3组的β-珠蛋白的相对表达量，均表示为均值±标准差(n＝3)。**代表显著性t检验p＜0.01。由图可知与Con阴性对照相比，clone-67siRNA瞬时转染K562细胞后72小时可使细胞的ε-珠蛋白、γ-珠蛋白和β-珠蛋白的表达分别增加1.9、1.6及2倍，统计学分析有显著差异。Allstars阴性对照对K562细胞的珠蛋白表达无明显改变。 

实施例5：clone-67siRNA使K562细胞的GATA-2表达降低 

CD235细胞的培养方式和转染方式同实施例2，检测以clone-67siRNA、Con和Allstars瞬时转染的K562细胞的GATA-2和GATA-1表达。按照标准Western法进行检测，其中抗GATA-2和GATA-1多克隆抗体及抗β-肌动蛋白单克隆抗体均购自Santa Cruz(货号sc-9008及sc-13053)。二抗为Goat anti-rabbit IgG-HRP和goat anti-mouse IgG-HRP(均购自SantaCruz，货号sc-2004及sc-2005)。显色试剂盒为ECL Plus Western BlottingDetection Reagents(购自Amersham&Phamacia，货号RPN2132)。具体实验步骤为：常规聚丙稀酰胺凝胶电泳，电泳结束后利用转膜仪(购自Bio-Rad，货号170-3940)按转膜仪说明书将电泳蛋白转至PVDF膜上，用脱脂奶封闭液室温封闭膜1小时，用孵育液将一抗1∶400稀释，将膜浸入一抗稀释液中，4℃过夜，用TBS洗液室温洗膜3次，每次15分钟，用 孵育液将二抗1∶4000稀释，将膜浸入二抗稀释液中，室温1小时，用TBS洗液室温洗膜3次，每次15分钟，将膜取出，按ECL Plus Western BlottingDetection Reagents试剂盒说明书，用试剂盒中的ECL试剂覆盖膜，室温放置1分钟后，曝光X光片。以上Western blot所用的封闭液、孵育液及TBS洗液的具体配方按照分子生物学教科书配置。以上实验均独立重复3次。 

检测结果如图4所示，A显示对GATA-2的表达量的影响，B显示对GATA-1的表达量的影响。从图中可知，与Con阴性对照相比，clone-67siRNA瞬时转染K562细胞后72小时可使细胞的GATA-2表达降低，而GATA-1的表达无明显改变，Allstars阴性对照对K562细胞的GATA-2和GATA-1表达均无明显改变。 

实施例6：clone-67siRNA使K562细胞在软琼脂和液体培养基中的增殖速度减慢 

CD235细胞的培养方式和转染方式同实施例2，软琼脂集落生长实验：按照CytoSelect^TM 96-Well Cell Transformation Assay kit(购自CellBiolabs)的说明书进行实验。每组(每组3个孔)细胞均按3000个/孔的密度接种于96孔板上，37℃5％CO2条件下培养8天后对集落中的细胞数用FLUOstar多功能微板测试仪(购自BMG)在485/520nm(激发/发射)波长处进行定量检测。 

液体培养基中细胞增殖速度的检测：按照CellTiter 96 aqueousone-solution cell proliferation assay kit(购自Promega)的说明书进行实验，用FLUOstar多功能微板测试仪(每组3个孔)(购自BMG)在492nm处测量吸光值。以上实验均独立重复3次。 

实验结果如图5所示，A是各组细胞在软琼脂上的增殖速度，B是各组细胞在液体培养基中的增殖速度。从中可以看出，与Con阴性对照相比，clone-67siRNA瞬时转染K562细胞48小时后细胞在软琼脂上的增殖速度减慢，统计学分析有差异；在液体培养基中的增殖速度也减慢，统计学分析有显著差异。结果表示为3次实验数据的平均值±标准差。**代表显著性t检验p＜0.01，*代表显著性t检验p＜0.05。 

本领域技术人员将意识到，根据以上描述中公开内容和具体实施方式可以容易地设计其它等同实施方式的基础，从而实现与本发明相同的目的，例如以clone-67siRNA的序列为基础，进行在其序列两端各添加1～3个任意核苷酸也会取得同样的诱导分化效果，这是因为siRNA的作用机制是对同源序列的调控，已表明siRNA的作用效果主要取决于其中间的核心序列，而靠近两侧的碱基序列对其作用效果的影响较小，且在siRNA的两侧添加1～3个核苷酸不但不会减弱该siRNA的作用效果，还会增强siRNA的效果。本领域技术人员还会意识到，这种等同实施方式不背离所附权利要求书中阐明的本发明精神和范围。 

Claims (9)

1.一种双链RNA分子，其双链互补序列分别是以下的序列：

SEQ NO.1：5’ACAUGUACAUAGGGAUAUC3’；和

SEQ NO.2：5’GAUAUCCCUAUGUACAUGU3’。

2.如权利要求1所述的双链RNA分子在制备诱导肿瘤细胞系K562红系分化的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其中所述双链RNA分子使肿瘤细胞系K562的CD235表达增加、ε-珠蛋白表达增加、γ-珠蛋白表达增加、β-珠蛋白表达增加、GATA-2表达降低、和/或细胞增殖速度减慢。

4.如权利要求1所述的双链RNA分子在制备治疗人慢性髓样白血病的药物中的应用。

5.编码如权利要求1所述的双链RNA分子的DNA分子。

6.包含如权利要求5所述的DNA分子的核酸载体。

7.如权利要求5所述的DNA分子和/或如权利要求6所述的核酸载体在制备诱导肿瘤细胞系K562红系分化的药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其中所述DNA分子和/或所述核酸载体使肿瘤细胞系K562的CD235表达增加、ε-珠蛋白表达增加、γ-珠蛋白表达增加、β-珠蛋白表达增加、GATA-2表达降低、和/或细胞增殖速度减慢。

9.如权利要求5所述的DNA分子和/或如权利要求6所述的核酸载体在制备治疗人慢性髓样白血病的药物中的应用。

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