CN101899394B

CN101899394B - 外循环动物细胞培养生物反应器

Info

Publication number: CN101899394B
Application number: CN 201010242025
Authority: CN
Inventors: 罗火生
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2030-07-29
Also published as: CN101899394A

Abstract

本发明涉及外循环动物细胞培养生物反应器，包括罐体及外循环管路、加热器、蠕动泵和控制系统，所述罐体包括大罐和小罐；小罐套置于大罐的内部，并分别通过管道D、A、G与所述大罐卡套固定，所述外循环管路包括罐外循环管路、罐体外上部通过三通与所述罐外循环管路相连接的管道A和管道B、罐体外下部通过三通与所述罐外循环管路相连接的管道E和管道D；所述罐外循环管路穿过所述蠕动泵；所述管道D在其最低位连接排污管。本发明充分发挥了动物细胞大规模培养技术的特点，具有灭菌彻底，操作简单，细胞培养污染率低，质量好，收率高的显著特点，具有良好的功能性、经济性，可广泛适用于动物细胞微载体悬浮培养以及动物细胞悬浮培养。

Description

外循环动物细胞培养生物反应器

技术领域

本发明涉及采用悬浮方法进行动物细胞培养的装置，尤其涉及一种外循环动物细胞培养生物反应器。

背景技术

生物反应器，指以活细胞或酶为生物催化剂进行细胞增殖或生化反应提供适宜环境的设备，它是生物反应过程中的关键设备。生物反应器的结构、操作方式和操作条件的选定对生物化工产品的质量、收率(转化率)和能耗有密切关系。

随着生物技术的不断发展，大规模动物细胞生物反应器培养技术正逐步取代玻璃瓶静置培养和旋转培养技术，因为它能及时地给细胞和病毒提供最佳的生存环境，从而最高效率的提高产品的产量和质量，应该说这是动物细胞培养史上的一次质的飞跃，也是生物制药技术的重大突破，它不仅简化了工艺，更重要的是它可以生产出高质量的产品，目前市场上有很多种生物反应器，包括国产的和进口的，各有优势和缺陷，有的甚至存在不可避免的硬伤，从而限制了它优势的最大发挥。

下面将对现有的几种动物细胞培养生物反应器就搅拌方式、监控系统、灭菌方式、通气模式、排污模式等方面的设计进行比较分析，请详见下表：

发明内容

鉴于现有动物细胞培养生物反应器所存在的上述问题，及其对于细胞培养的质量、收率所造成的影响，本发明旨在公开一种外循环动物细胞培养生物反应器，以有效保证细胞培养的效果，体现良好的经济性和功能性。

本发明的技术解决方案是这样实现的：

一种外循环动物细胞培养生物反应器，包括罐体及外循环管路、加热器、蠕动泵和控制系统，其特征在于：

所述罐体包括大罐和小罐；所述大罐包括大罐罐体、水浴夹层和罐盖，所述罐盖上设有通气口；所述小罐包括上下封头和中间罐体，所述上下封头分别与中间罐体密封连接；通过设置于所述小罐内部上下封头与中间罐体连接处并垂直于所述小罐的中轴线的上下不锈钢网板，将所述小罐分为上中下三个空间；

所述小罐套置于所述大罐的内部，并分别通过管道D、A、G与所述大罐卡套固定，即：管道D一端固定和连通至小罐的下封头内的最低位置，其另一端自大罐的底部接至大罐外并通过三通分别与罐外循环管路的I段及管道E相连通，所述管道E的另一端自大罐体下部接入大罐内；管道A一端固定于小罐的上封头的最高位置并自此连通至小罐内，其另一端自大罐体壁的上部接出罐体外，并通过三通与罐外循环管路的II段及管道B连通，管道B在该端口处安装有隔膜阀，所述管道B的另一端自大罐体壁中上部接至大罐内；管道G的一端固定于小罐的上封头并依次穿过小罐的上封头和上网板接至所述小罐的中间罐体，其另一端接通至大罐罐体外；

所述外循环管路包括罐外循环管路、罐体外上部通过三通与所述罐外循环管路的II段相连接的管道A和管道B、罐体外下部通过三通与所述罐外循环管路的I段相连接的管道E和管道D；所述罐外循环管路穿过所述蠕动泵；所述蠕动泵采用无极变速；

所述罐外循环管路上还分别连接了液体补充管路、气体补充管路、收液管路；

所述管道D在其最低位连接排污管。

进一步的，所述罐外循环管路的II段上还连接了pH控制和溶氧控制的监测探头，所述大罐罐体内放置有温度控制的监测探头，上述监测探头通过导线与控制柜相连接，所述控制柜包括显示器、溶氧控制器、pH控制器、温度控制器、数据记录仪。

进一步的，所述管道E自大罐体下部沿大罐体壁切向接入大罐内。

更进一步的，所述上下封头分别与中间罐体通过外置的卡箍密封连接。

与现有技术相比，本发明所述的外循环动物细胞培养生物反应器的设计充分体现了动物细胞大规模培养技术的特点，管道布局简洁；具有良好的功能性、可靠性、方便性，现具体描述如下：

(1)搅拌方式和密封：通过蠕动泵利用液体自下而上的循环对培养液和细胞进行搅拌，完全密闭的回路使液体的PH、温度、溶氧等达到充分均匀，对细胞的剪切力趋于零；同时解决了其它形式的搅拌对罐体的密封要求的问题；

(2)通气模式：深层直接通气，气泡完全不与细胞接触，因而无需销泡装置，即可完全避免气泡对于细胞的伤害；

(3)灭菌方式：结构设计合理，管道布局简洁，在湿热灭菌柜里进行灭菌，操作简单，没有灭菌死角，也无需按压力容器维护管理，更具安全性；同时大大缩短了生产准备周期；

(4)排污模式：通过处于最低端的排放管路可以随时排放掉脱落、凋亡的细胞和破碎的微载体，降低了污染率；

(5)监控系统：PH、温度和溶氧等监控探头安装在外循环回路上，因外循环使液体混合充分均匀，因此监测数据更客观、准确和更具代表性。

综上，本发明结构设计科学，管道布局简洁，使细胞和培养液巧妙的隔离，而且能及时给细胞和病毒提供最佳的生存环境，从结构上规避了现有设备中存在的许多硬伤和缺陷，充分发挥了动物细胞大规模培养技术的特点，具有灭菌彻底，操作简单，细胞培养污染率低，质量好，收率高的显著特点，具有良好的功能性、经济性，可广泛适用于动物细胞微载体悬浮培养以及动物细胞悬浮培养。

附图说明

图1是本发明实施例的结构示意图；

图2是图1的俯视图。

具体实施方式

现结合附图，对本发明作进一步的具体描述。

所述外循环动物细胞培养生物反应器，包括罐体及外循环管路、加热器、蠕动泵和控制系统，其中加热器、蠕动泵及控制系统采用现有的成型设备，而罐体结构及外循环管路则作了较大的创新，如图1和图2所示：

所述罐体包括大罐1和小罐2；所述大罐1包括大罐罐体11、水浴夹层12和罐盖13，所述水浴夹层12的一侧下部设置热水进罐管道F，对侧的上部设置热水出罐管道C，所述热水进罐管道F和热水出罐管道C分别与加热器的循环管路相连接，所述罐盖13上设有通气口连接通气管道H、K；所述小罐2包括上下封头21，23和中间罐体22，通过外置的卡箍24，25将所述上下封头分别与中间罐体22密封连接；通过设置于所述小罐2内部上下封头与中间罐体连接处并垂直于所述小罐的中轴线的上下不锈钢网板26，27，将所述小罐2分为上中下三个空间；

所述小罐2套置于所述大罐1的内部，并分别通过管道D、A、G与所述大罐2卡套固定，即：管道D一端通过卡套固定和连通至小罐的下封头23内的最低位置，其另一端自大罐1的底部接至大罐外并通过三通分别与罐外循环管路的I段及管道E相连通，所述管道E的另一端自大罐体下部沿大罐体壁的切向接入大罐1内；管道A一端通过卡套固定和并自小罐的上封头21的最高位置连通至小罐2内，其另一端自大罐罐体壁的上部接出罐体外，并通过三通与罐外循环管路的II段及管道B连通，管道B在该端口处安装有隔膜阀6，所述管道B的另一端自大罐体壁中上部接至大罐1内；管道G的一端通过卡套固定小罐的上封头21并依次穿过小罐的上封头21和上网板26接至所述小罐的中间罐体22，其另一端接通至罐体外；

所述外循环管路包括罐外循环管路、罐体外上部通过三通与所述罐外循环管路相连接的管道A和管道B、罐体外下部通过三通与所述罐外循环管路相连接的管道E和管道D；所述罐外循环管路穿过所述蠕动泵；

将前述进入蠕动泵前与管道A和管道B通过三通相连接的所述罐外循环管路称之为罐外循环管路的II段；将对应的另一段即自所述蠕动泵中出来与管道E和管道D通过三通相连接的所述罐外循环管路称之为罐外循环管路的I段；所述罐外循环管路的II段上还分别连接了自控探头、液体补充管路71、气体补充管路72、收液管路73，所述自控探头包括pH控制的监测探头31和溶氧控制的监测探头32，大罐罐体内放置有温度控制的监测探头33，上述监测探头通过导线与控制柜相连接。

所述管道D在其最低位连接排污管5。

所述罐体的材质为316L不锈钢，所述水浴夹层选用304不锈钢，带保温层。罐体顶部配备灯镜和视镜，用于反应器内部观察。

进行罐体组装时，所述小罐的上下封头21、23跟中间罐体22分别用卡箍24、25连接，通过不锈钢网板26、27把中间罐体22跟上下两封头21、23隔离开来，下封头23通过卡套的方式跟管道D连接，上封头通过卡套跟管道A、G连接，内置小罐2固定好后，盖上大罐的罐盖13，整个罐体组装完毕。

罐体管道的连接，包括管道C、F分别跟加热器连接形成大罐的水浴加热回路；管道A、B(连接隔膜阀6)通过不锈钢三通连接罐外循环管路的II段，所述管路的II段上还分别接入液体补充管路、气体补充管路、收液管路以及包括pH控制和溶氧控制的监测探头；管道E、D通过不锈钢三通连接罐外循环管路的I段；所述罐外循环管路穿过所述蠕动泵；管道H、K接在大罐的罐盖13的通气口上，管道G为内置小罐2连接罐体外部的通道。

灭菌处理：

上述罐体组装及管道连接完成后，直接把整个大罐放到湿热灭菌柜里进行灭菌处理备用，这样就不需要做很复杂的在线清洗和在线清洗验证，更重要的是不会因为在线灭菌而留下灭菌死角，从而大大降低了污染率，也不需要按压力容器来使用管理。上述灭菌处理环节所需时间大约1天，操作简单，灭菌彻底；而现有设备的在线蒸气灭菌处理环节所需时间平均约7天，操作复杂，容易留下灭菌死角，造成污染，并且必须按压力容器维护管理。

搅拌控制：

通过蠕动泵实现液体循环搅拌。微载体和细胞，通过管道G送入小罐的中间罐体22中，并通过网板26、27使微载体和细胞与大罐的液体隔离；在蠕动泵的作用下，小罐中的液体是自下而上流动，大罐中的液体转动产生涡流，实现液体充分搅拌，液体温度、pH值、溶氧等参数完全一致，循环泵采用无极变速，运行平稳。

控制系统：

反应器控制功能由控制柜实现，包括显示屏、溶氧控制器、PH控制器、温度控制器、数据记录仪。其中，

温度控制：

采用水浴夹层对反应器进行温度控制。水浴夹层配备水浴加热器，水浴加热器提高了反应器温度控制的灵敏性和稳定性。反应器温度控制系统采用基于罐体温度的PID控制方式，温度补偿功能使控温更加稳定，温度控制精度±0.3℃。

pH控制：

采用独立模块控制方式，pH控制器单独设置。使用PID控制模式实现自动控制，具有自适应PID控制调整功能，可自动设定最佳的PID参数。pH控制与二氧化碳通气控制阀，以及酸、碱蠕动泵相关联，通过控制二氧化碳、酸液、碱液的开关，实现pH的自动控制。当pH低于设定值时，控制器启动碱液蠕动泵，补碱提高pH至设定值；当pH高于设定值时，控制器启动二氧化碳气体电磁阀，以及酸液蠕动泵，降低pH至设定值。二氧化碳流量可通过转子流量计调节，酸液、碱液蠕动泵流量可通过泵调速阀进行调节，进一步提高了pH控制的灵敏度，pH控制响应偏差±0.01。

溶氧控制：

采用独立模块控制方式，溶氧控制器单独设置。使用PID控制模式实现自动控制，具有自适应PID控制调整功能，可自动设定最佳的PID参数。溶氧控制与氧气通气控制阀关联，通过控制阀开关，实现溶氧的自动控制。当溶氧低于设定值时，控制器启动控制阀，向反应器中通氧气提高溶氧至设定值。氧气流量可通过转子流量计调节，进一步提高了溶氧控制的灵敏度，溶氧响应偏差0.5％。

工艺管路系统：

其中，气体系统包括压缩空气气体管路、氧气气体管路、二氧化碳气体管路，气体减压阀，气动隔膜阀自动控制，分别通过气体补充管路与罐外循环管路连接，并在蠕动泵的作用下输入罐体内。

液体系统包括液体补充管路和收液管路，分别与罐外循环管路连接，并在蠕动泵作用下将料液补加进入罐体内或从罐体内收液。

工艺实施流程

细胞培养：

按无菌要求连接好所有管道，通过蠕动泵4向大罐中注入细胞培养液25L左右，然后水浴预热至25-28℃，细胞和微载体通过管道G直接注入内置小罐，此时整个罐内总的液体为30L-32L。关掉管道B和E，低速启动蠕动泵4，让细胞在内置小罐里循环若干小时直到细胞充分贴附于微载体上(也可以在罐外让细胞贴附好后注入内置小罐里)，同时让温度慢慢升到37℃±0.3℃，循环若干小时后通过管道D把未贴附的细胞排出罐外，然后打开管道B和E，使大罐中的液体也参与小罐循环，小罐中液体循环的过程也是对罐内细胞充分搅拌的过程，缓缓流动的液体不会对细胞造成伤害，并且液体是自下而上流动，不仅没有死角，而且搅拌很均匀。根据溶氧和pH探头检测的数据，可以先关掉管道A、D，通过蠕动泵注入氧气和碳酸氢钠到大罐循环，这样气体和碳酸氢钠不直接跟细胞接触，可以避免气泡和局部PH太高对细胞造成伤害，调好后，打开管道A、D进行循环，从而让大小罐内的理化指标一致。

细胞的清洗：

通过管道E、D把罐内液体放掉，然后由蠕动泵注满洗液循环，若干时间后再通过管道E、D把罐内液体放掉，视具体情况可以多次重复清洗。

病毒培养：

通过蠕动泵向大罐中注入病毒培养液25L左右，毒种通过管道G直接注入内置小罐，此时整个罐内总的液体为30L-32L。关掉管道B和E，低速启动蠕动泵，让液体在内置小罐里循环若干小时使病毒充分感染细胞，让温度保持在35℃±0.3℃，循环若干小时后通过管道D把脱落的细胞排出罐外，然后打开管道B和E，使大罐中的液体也参与小罐循环，根据溶氧和PH探头检测的数据，可以先关掉管道A、D，通过蠕动泵注入氧气和碳酸氢钠到大罐循环，这样气体和碳酸氢钠不直接跟细胞接触，可以避免气泡和局部PH太高对细胞造成伤害，调好后，打开管道A、D进行循环，从而让大小罐内的理化指标一致。培养若干小时后，根据不同制品收获感染了病毒的细胞(一次性收获)，或通过管道E、D收集病毒培养液(根据细胞维持情况可以多次重复收获病毒培养液)，这样就完成一个生产周期。

本发明可提供工作体积30-150L的外循环动物细胞培养生物反应器。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种外循环动物细胞培养生物反应器，包括罐体及外循环管路、加热器、蠕动泵和控制系统，其特征在于：

所述小罐套置于所述大罐的内部，并分别通过管道D、A、G与所述大罐卡套固定,即：管道D一端固定和连通至小罐的下封头内的最低位置，其另一端自大罐的底部接至大罐外并通过三通分别与罐外循环管路的I段及管道E相连通，所述管道E的另一端自大罐体下部接入大罐内；管道A一端固定于小罐的上封头的最高位置并自此连通至小罐内，其另一端自大罐体壁的上部接出罐体外，并通过三通与罐外循环管路的II段及管道B连通，管道B在该端口处安装有隔膜阀，所述管道B的另一端自大罐体壁中上部接至大罐内；管道G的一端固定于小罐的上封头并依次穿过小罐的上封头和上网板接至所述小罐的中间罐体，其另一端接通至大罐罐体外；

所述外循环管路包括罐外循环管路、罐体外上部通过三通与所述罐外循环管路相连接的管道A和管道B、罐体外下部通过三通与所述罐外循环管路相连接的管道E和管道D；所述罐外循环管路穿过所述蠕动泵；所述蠕动泵采用无极变速；

所述管道D在其最低位连接排污管；

所述罐外循环管路的II段上还连接了pH控制和溶氧控制的监测探头，所述大罐罐体内放置有温度控制的监测探头，上述监测探头通过导线与控制柜相连接，所述控制柜包括显示器、溶氧控制器、pH控制器、温度控制器、数据记录仪。

2.根据权利要求1所述的外循环动物细胞培养生物反应器，其特征在于：

所述管道E自大罐体下部沿大罐体壁切向接入大罐内。

3.根据权利要求2所述的外循环动物细胞培养生物反应器，其特征在于：

所述上下封头分别与中间罐体通过外置的卡箍密封连接。