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CN101868729A - 利用标记物组合钙防卫蛋白和血红蛋白/触珠蛋白复合物从粪便样品评价结肠直肠癌的方法 - Google Patents

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CN101868729A CN200880116821A CN200880116821A CN101868729A CN 101868729 A CN101868729 A CN 101868729A CN 200880116821 A CN200880116821 A CN 200880116821A CN 200880116821 A CN200880116821 A CN 200880116821A CN 101868729 A CN101868729 A CN 101868729A
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Abstract

本发明涉及帮助评价结肠直肠癌的方法。所述方法特别用于在体外评价结肠直肠癌的存在与否。所述方法例如通过分析生化标记物来实施，包括测量粪便样品中血红蛋白/触珠蛋白复合物以及钙防卫蛋白的浓度，并将所测得的浓度与结肠直肠癌的存在与否相关联。基于本发明的方法，为了进一步提高结肠直肠癌的测定，可以与所述血红蛋白/触珠蛋白复合物以及钙防卫蛋白一起测定粪便样品中的一种或多种其它标记物的水平，并将其与结肠直肠癌的存在与否相关联。本发明还涉及在结肠直肠癌的早期诊断中，采用包括血红蛋白/触珠蛋白复合物以及钙防卫蛋白的标记物组，并且教导了用于实施本发明方法的试剂盒。

Description

利用标记物组合钙防卫蛋白和血红蛋白/触珠蛋白复合物从粪便样品评价结肠直肠癌的方法
本发明涉及帮助评价结肠直肠癌的方法。所述方法特别用于在体外评价结肠直肠癌的存在与否。所述方法例如通过分析生化标记物来实施，包括测量粪便样品中血红蛋白/触珠蛋白复合物以及钙防卫蛋白的浓度，并将所测得的浓度与结肠直肠癌的存在与否相关联。基于本发明的方法，为了进一步改进结肠直肠癌的测定，可以与所述血红蛋白/触珠蛋白复合物以及钙防卫蛋白一起测定粪便样品中的一种或多种其它标记物的水平，并将其与结肠直肠癌的存在与否相关联。本发明还涉及在结肠直肠癌的早期诊断中采用包括血红蛋白/触珠蛋白复合物以及钙防卫蛋白的标记物组，并且教导了用于实施本发明方法的试剂盒。
背景技术
癌症仍然是公共健康的主要挑战，尽管在检测和治疗已经取得了进步。在各种类型的癌症中，结肠直肠癌(＝CRC)是西方人中最为常见的癌症之一。
癌症的分期是所述疾病在范围、阶段、和严重程度方面的分类。其将癌症患者进行分组，使得能够归纳出预后和治疗选择。
当今，TNM系统是最广泛使用的癌症解剖学范围的分类。它代表了一种国际上接受的、统一的分类系统。其中有三个基本的变量：T(原发肿瘤的范围)，N(区域淋巴结的状态)以及M(远处转移的存在与否)。所述TNM标准公布于UICC(International Union Against Cancer)，Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(编辑)，TNM Classification of Malignant Tumours，第五版，1997。
尤其重要的是将CRC早期诊断转化成更好的预后。结肠直肠的恶性肿瘤是由良性肿瘤，即腺瘤引发的。因而，最好的预后能使得患者在腺瘤阶段就被诊断出。早在Tis、N0、M0或T1-3、N0、M0期被诊断的患者，如果加以适当治疗，则相比较于当远处转移已经发生才被诊断出的患者的仅10％的5年存活率来说，诊断后存活5年的机会高于90％。
人们在寻找用于评价CRC存在与否的方法，其尤其适用于在癌变前(腺瘤)状态下或者在毫不存在转移(近处或远处都没有)的肿瘤阶段，即在UICC I、II或III类下，灵敏地检测CRC。
癌症被检测/诊断越早；总体存活率越好。这对于CRC是特别符合的。在肿瘤的发展阶段中的预后是不良的。在诊断后五年内超过三分之一的患者将死于进行性疾病，相应于约40％的五年存活率。当前的治疗仅仅治愈一部分患者，对于在疾病的早期阶段诊断的那些患者明显具有最好的效果。
对于作为公众健康难题的CRC，重要的是开发对于结肠直肠癌的更有效的筛选和预防措施。
当前对于结肠直肠癌可用的最早期的检测过程涉及使用便血测试或内窥镜操作。然而，在检测出便血之前一般必须有显著的肿瘤大小。对于根据粪便样品的CRC检测，当前的技术已经很长时间是基于愈创木脂的粪便潜隐血测试。
作为根据粪便的CRC筛选测定，愈创木脂测试是当前最广泛使用的。然而，愈创木脂测试具有不良的灵敏度和不良的特异性。基于愈创木脂的粪便潜隐血测试的灵敏度是～26％，其意味着具有恶性病变的74％的患者将仍未被测出(Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55)。
前癌性和癌性病变的可视化是早期检测的最好方法，但是结肠镜检查是侵入性的，具有显著的费用、风险和并发症(Silvis，S.E.，等人，JAMA235(1976)928-930；Geenen，J.E.，等人，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235；Anderson，W.F.，等人，J.Natl.Cancer Institute 94(2002)1126-1133)。
在各种疾病的诊断中，大便或粪便样品常规地用于测试寄生虫、脂肪、潜血、病毒、细菌以及其它微生物和化学物质的存在。
粪便采集是非侵入性的，因而理论上理想地用于测试儿科或老年患者、用于远离就诊地点的测试、用于频繁复查以及用于测定很可能存在于消化道中的分析物的存在。
根据本发明的诊断方法是基于来自个体的粪便样品。所述粪便样品经过提取，从这些处理后的粪便中通过特异性组合试剂来分别特定地测量血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白。
然而，由于多种原因，应用免疫测定技术来分析粪便样品被证明有困难。
分析物不是分布在整个粪便样本中，而倾向于更集中在早先与肠细胞或者甚至癌细胞接触的粪便样本的外表面。这就是为什么EP 0 817 968提出使用截面粪便样品用于进一步的分析的原因。EP 0 817 968的焦点在于粪便样本中包含的DNA的诊断。
粪便操作是令人不快的和生物危险的。处理粪便的过程已经证明是为难的和经常是复杂的，需要几个操作步骤，例如过滤或离心。称重、提取、离心和保存样品是困难的，除非是在配备有适合的设备和熟练技术人员的临床实验室中。
粪便样品中的分析物通常是不稳定的；认为这对于多肽或蛋白质是特别实际的。已知粪便的组分干扰了固相的免疫测定。在固相上固定的免疫反应物可能被粪便组分吸附。可能发生非特异性反应。
为了提高免疫测定技术用于测量粪便样品中的蛋白质分析物的商业使用，必需解决许多难题。例如，分析物必需尽可能高效地溶解，粪便中分析物的不稳定性必需被处理，来自粪便组分的干扰必需尽可能降低，粪便的广泛操作、设备污染和检测设备需求必需被最小化。需要避免使用昂贵的设备和仪器的简单制备步骤来扩展免疫测定测试过程的用途，或至少是医院和临床实验室环境外的地点的这种免疫测定的采样过程。在蛋白质如血红蛋白/触珠蛋白复合物以及钙防卫蛋白的检测中有益的粪便样品稀释剂的实例在下文中进一步给出。
WO 02/18931公开了制备粪便样本用于诊断测定的方法。描述了基于提取缓冲液的改进的提取过程，所述提取缓冲液基本上包含缓冲物质、洗涤剂，优选的两性离子洗涤剂以及阻断剂。
通过使用近来开发的取样装置，粪便样本的操作变得方便。例如，在EP 1 366 715和EP 1 214 447中描述了适合的粪便采样装置。
尽管自1990年代早期以来已经描述了包含在粪便样本中的蛋白质的免疫学测定，这种测定仍未在临床例程中广泛使用。例如，US 5,198,365描述了通过血红蛋白的特异性免疫学测量，有可能检测粪便样品中血液的存在。
对检测粪便中CRC的愈创木脂测试法的另一种替代方法近期被公开，其在于在脱落到粪便中的结肠细胞中通过免疫组织化学法来检测结肠直肠癌特异性抗原，“微小染色体维持蛋白2”(MCM2)。由于研究规模小，基于结肠直肠癌检测诊断值的结论是初步的。然而，该测试对于检测右侧的结肠癌似乎只有有限的灵敏度(Davies，R.J.等.，Lancet 359(2002)1917-1919)。
US 5,455,160中描述了钙防卫蛋白是一种对粪便样品CRC检测的替代性生物标记物，相应地其记载于Roseth，A.G.等人的科学文献中(Scan d.J.Gastroentero.l 27(1992)793-798；Scand.J.Gastroenterol.28(1993)1073-1076)。尽管钙防卫蛋白是炎症疾病的标记物，但其作为粪便CRC检测标记物的潜能记载于许多出版物中(Johne，B.等.，Scand.J.Gastroenterol.36(2001)291-296；Limburg，P.J.等.，Am.J.Gastroenterol.98(2003)2299-2305；Hoff，G.等，Gut 53(2004)1329-1333)。尽管钙防卫蛋白的灵敏度和特异性相比免疫血红蛋白-触珠蛋白复合物较低，但对于诊断标记物而言钙防卫蛋白相比血红蛋白或血红蛋白-触珠蛋白复合物也具有一些较优的性质。它均匀地分布在粪便中，在室温下稳定，这使得邮寄所述样品到实验室具有可行性，并且它看似不会干扰食物成分或药物化合物(Ton，H.等，Clin.Chim.Acta 292(2000)41-54)。然而。升高浓度的钙防卫蛋白，S100A8和S100A9的异质二聚体，在患有克罗恩病或炎症性肠病的患者粪便样品中也同样测得。这些结果与钙防卫蛋白在炎症中较为普遍的角色一致(Ryckman，C.等，J.Immunol.170(2003)3233-3242)。因此，在胃肠病学中利用钙防卫蛋白并不局限于检测CRC，而是延及其他的疾病，尤其是炎症性肠病，如Poullis，A等的综述(J.Gastroenterol.Hepatol.18(2003)756-762)。因而钙防卫蛋白看上去不是CRC的特异性标记物。
最近Sieg，A.等人在Int.J.Colorectal Dis.14(1999)267-271中调查了愈创木脂测试的替代性诊断法的灵敏度和特异性。尤其比较了来自粪便样品的血红蛋白和血红蛋白-触珠蛋白复合物的测量结果。已经注意到，血红蛋白测定在检测结肠直肠肿瘤时具有不令人满意的灵敏度。而对在进展癌期的癌症进行了检测，其灵敏度是大约87％的早期肿瘤没有以足够的灵敏度被检测到。所述血红蛋白-触珠蛋白复合物测定在CRC早期检测中更加灵敏。然而，这种更加灵敏的检测却伴随有差的特异性。在筛查测定中差的特异性不幸地转化为了大量不必要的二次检查，如结肠镜检查，差准确度的测定也不能满足普遍接受的筛查测定的需要。
显然需要提高对结肠直肠癌的早期测定和评价。
本发明的任务是查明是否能够改进CRC评价，例如通过免疫学方法来检测粪便样本中的分析物。
已经发现并确立了通过生化标记物来体外评价结肠直肠癌存在与否的方法，包括测量粪便样品中至少血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的组合的浓度，其能够帮助克服上面提到的至少一些缺点。这些发现是令人惊讶的，因为两种单独的标记物看上去都有特异性方面的问题，并且还由于血红蛋白(通常作为CRC较高特异性标记物)和钙防卫蛋白的组合与目前确定的标记物组合相比，在95％特异性以及98％特异性下都表现出较低的灵敏度。
发明内容
本发明涉及通过生化标记物来体外评价结肠直肠癌存在与否的方法，包括分别测量粪便样品中至少血红蛋白/触珠蛋白复合物的多肽浓度和钙防卫蛋白的多肽浓度，并且将所测定的血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的浓度与结肠直肠癌的存在与否相关联。
进一步，本发明公开了将标记物组，包括至少所述标记物钙防卫蛋白和血红蛋白/触珠蛋白复合物，用于诊断结肠直肠癌。
本发明还公开了用于实施根据本发明方法的试剂盒，包括分别特异性地检测所述血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白所需的试剂，以及任选的用于实施各自测定的辅助试剂。
具体实施方式
在第一种实施方案中，本发明涉及通过生化标记物来体外评价结肠直肠癌存在与否的方法，包括测量粪便样品中至少(a)血红蛋白/触珠蛋白复合物和(b)钙防卫蛋白的浓度，以及(c)将步骤(a)和(b)中测定的浓度与结肠直肠癌的存在与否相关联。
术语“评价”用于表明，根据本发明的方法不是单独地而是与其他变量一起，例如结肠镜检查的确认结果，帮助医生来确立其结肠直肠癌(CRC)的诊断结果或者得出其治疗相关的结论。在优选实施方案中，该评价会涉及CRC的存在与否。如技术人员将明白那样，对于给定疾病而言，没有单个生化标记物、也没有标记物的组合具有100％特异性的同时具有100％灵敏度的诊断能力，而确切的说生化标记物是用来以某种可能性或预测值来评价疾病存在与否的。优选地，根据本发明的方法有助于评价CRC的存在与否。
如技术人员将明白那样，将标记物水平与CRC的存在与否相关联的步骤可以以不同的方式实施和实现。一般来说，选择参照群体并确立正常范围。通过应用适当的参照群体，仅用常规性实验就可以确立粪便样品中血红蛋白/触珠蛋白复合物以及钙防卫蛋白的正常范围。通常认为所述正常范围在某种程度上但是是在有限程度上依赖于确立它的参照群体。理想而优选的参照群体数量要大，例如几百到几千人，并且在年龄、性别和任选的其它感兴趣变量方面相匹配。就绝对值而言的正常范围，例如给定的浓度，还依赖于所采用的测定法以及在生成所述测定时所使用的标准化。
样品部分中血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的给定水平通过来自相同粪便样品的等分测得并用给定的测定步骤确立。
根据本发明的“标记物”总是涉及上述生物分子的多肽形式，即，不是这种标记物的DNA或mRNA编码。
在根据本发明的方法中，至少分别测定了存在于粪便样品中的生物标记物血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的每一种的浓度，测量值在数学上相组合，所述标记物组合的组合值与CRC的存在与否相关联。
如技术人员将明白那样，有许多方式来使用两种或更多种标记物的测量结果来改进检查中的诊断问题。在一种十分简单但通常仍然很有效的方法中，如果样品对被检标记物的至少一种呈阳性，则认为是阳性结果。这种情况可以是，例如当诊断传染性疾病如AIDS时的情况。但是，常常是评价标记物的组合。在根据本发明的方法中，对标记物组的标记物的测量值，例如，对血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的测量值，在数学上进行组合，并将组合值与被诊断的问题相关联。
标记物值可以通过现有数学方法的任何适当的状态进行组合。用于将标记物组合关联到疾病上的公知数学方法采用例如以下方法：判别分析(DA)(即，线性、二次方程、正则化DA)、Kernel算法(即SVM)、非参数算法(即k近邻分类法)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的算法(即逻辑回归、CART、随机森林算法、Boosting/Bagging算法)、广义线性模型(即逻辑回归)、基于主成分的算法(即SIMCA)、广义加法模型、基于模糊逻辑的算法、基于神经网络和遗传算法的方法。技术人员在选择适当方法来评估本发明的标记物组合方面没有任何问题。优选地，用于将本发明的标记物组合与例如CRC的存在与否相关联的方法选自DA(即，线性、二次方程、正则化DA)、Kernel算法(即SVM)、非参数算法(即k近邻分类法)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的算法(即逻辑回归、CART、随机森林算法、Boosting算法)或广义线性模型(即逻辑回归)。这些统计学方法的相关详细内容在以下参考文献中找到：Ruczinski，I.等，J.ofComputational and Graphical Statistics 12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.ofthe American Statistical Association 84(1989)165-175；Hastie，T.等.，TheElements of Statistical Learning，Springer Verlag(2001)；Breiman，L.等.，Classification and regression trees，California，Wadsworth(1984)；Breiman，L.，Machine Learning 45(2001)5-32；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluation ofMedical Tests for Classification and Prediction，Oxford Statistical Science Series，28(2003)；和Duda，R.O.等.，Pattern Classification，Wiley Interscience，2ndedition(2001)。
针对生物标记物的基础组合利用优化的多元截取值用以区分状态A和状态B，例如CRC的存在与CRC的不存在，是本发明的优选实施方案。在此类分析中，标记物不再独立，而是形成了标记物组。可以确认的是，将血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的测量值组合在一起，与健康对照相比较确能提高CRC的诊断准确度。如果分析中只包含来自CRC早期(UICC I至II期)患者的样品，这变得尤为明显。后面的发现尤其重要，因为早期CRC的患者很可能最为获益于正确而早期的恶性病变检测结果。
诊断方法的准确度通过其接受者工作特性(ROC)得以最好的描述(尤其参见Zweig，M.H.和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图是在整个观察到的数据范围内从连续变化的决策阈值取得的全部的成对灵敏度/特异性的曲线图。
实验室测试的临床表现依赖于其诊断准确度，或者将受试者正确分类到临床相关亚组中的能力。诊断准确度测量的是所述测试正确区分被检受试者的两种不同情况的能力。这种情况是例如健康与疾病或者良性与恶性疾病。
在每种情况下，通过在决策阈值的完整范围上标绘出灵敏度对比1-特异性，ROC标绘图描绘了两种分布之间的重叠。在Y轴上是灵敏度，或者真阳性分数[定义为(真阳性测试结果的数量)/(真阳性的数量+假阴性测试结果的数量)]。这也被称作疾病或状况存在下的阳性。它单独地从受影响的亚群中计算。在X轴上是假阳性分数，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数量)/(真阴性的数量+假阳性结果的数量)]。它是特异性的指数，完全从未受影响的亚群中计算。因为使用来自两个不同亚群的测试结果完全独立地计算真阳性和假阳性分数，ROC标绘图独立于样品中的疾病发病率。在ROC标绘图上的每个点代表了相应于特定的决策阈值的灵敏度/1-特异性配对。具有理想辨别力(在结果的两个分布中没有重叠)的测试具有穿过左上角的ROC标绘线，其中真阳性分数是1.0，或100％(理想的灵敏度)、假阳性分数是0(理想的特异性)。没有辨别力的测试的理论标绘图(两个组的结果相同的分布)是从左下角到右上角的45°对角线。大多数标绘图落入这两个极端之间。(如果ROC标绘图完整落在45°对角线之下，通过将“阳性”的指标从“大于”逆转成“低于”来容易地补救，反之亦然。)定性地，标绘图越靠近左上角，试验的总体精确度越高。
定量实验室测试的诊断精确性的一个方便的目标是通过单个数字表示它的性能。最常见的全局度量是ROC标绘图下的面积(曲线下面积＝AUC)。按照惯例，这个面积永远≥0.5(如果不是，人们可以反转决策规则使它这样)。值在1.0(两个组的测试值的理想分离)和0.5(在测试值的两个组之间没有明显的分布差异)之间。该面积不是仅取决于标绘图的特定部分，例如最靠近对角线的点或在90％特异性的灵敏度，而是取决于整个标绘图。这是ROC标绘图如何接近理想标绘图(面积＝1.0)的定量的、描述性的表述。
在优选的实施方案中，本发明涉及用于提高结肠直肠癌的诊断准确度的方法，即，患CRC的患者与对照，即没患CRC的患者，这是通过如下进行的：通过测量样品中至少血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的浓度并将所测定的浓度与CRC的存在与否相关联。这使得相比基于任何一种单独标记物的分类方法有所改进，即更多的患者能够在患有CRC与健康对照之间进行正确分类。包括血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的所述CRC标记物组当然还可以用于评价患有CRC患者的疾病严重程度。
如技术人员将明白那样，可以使用一种或多种其它的生物标记物来进一步提高对CRC的评价。为了说明这种使用血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白作为标记物组中的评价CRC的关键标记物的其它潜能，术语“至少”被用于所附的权利要求中。换句话说，在CRC评价中，所测得的一种或多种其它标记物的水平可以与血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的测量值相组合。
与血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白一起使用的一种或多种其它标记物可以考虑作为CRC标记物组的一部分，即适于进一步改进CRC评价的一系列标记物。CRC标记物组中的标记物总数优选小于20种标记物，更优选小于15种标记物，还优选小于10种标记物，8种或更少的标记物甚至更为优选。优选CRC标记物组总共包含3、4、5或6种标记物。
因而在优选的实施方案中，本发明涉及通过生化标记物来体外评价结肠直肠癌存在与否的方法，包括测量样品中血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的浓度和另外的一种或多种其它标记物的浓度，以及将所述血红蛋白/触珠蛋白复合物、钙防卫蛋白、和所述一种或多种其它标记物的浓度与结肠直肠癌的存在与否相关联。
优选地，所述一种或多种其它标记物选自以下物质构成的组：CEA、CYFRA 21-1、CA19-9、CA72-4、NNMT、PROC和SAHH。
对“CYFRA 21-1”的测定特别测量了存在于循环中细胞角蛋白19的可溶片段。对CYFRA 21-1的测量典型是基于两种单克隆抗体(Bodenmueller，H.等，Int.J.Biol.Markers 9(1994)75-81)。在德国RocheDiagnostics的CYFRA 21-1测定中，使用了所述两种特异性单克隆抗体(KS19.1和BM 19.21)，并测量了分子量大约为30000道尔顿的细胞角蛋白19的可溶片段。
测得的碳水化合物抗原19-9(CA 19-9)值通过使用单克隆抗体1116-NS-19-9来定义。测量了分子量大约为10000道尔顿的糖酯上的1116-NS-19-9反应决定因子。该粘蛋白对应于Lewis-a血型决定因子半抗原，并且是多个粘膜细胞的成分。(Koprowski，H.等.，Somatic Cell Genet.5(1979)957-972)。CA 19-9可以通过例如，用Roche的11776193号产品按照生产说明书在Elecsys
Figure GPA00001139257800101
分析仪上测得。
CA72-4测定利用两种单克隆抗体决定了血清中粘蛋白样肿瘤相关糖蛋白TAG72。所述单克隆B72.3是针对乳腺癌转移的富膜提取物培养得到的(Colcher，D.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.78(1981)3199-3203)。所述单克隆CC49对高度纯化的TAG 72具有特异性。CA72-4可以用Roche的11776258号产品按照生产说明书在Elecsys分析仪上测得。
癌胚抗原(CEA)是单体糖蛋白(分子量大约180.000道尔顿)，其可变碳水化合物成分为大约45-60％(Gold，P.和Freedman S.O.，J.Exp.Med.121(1965)439-462)。高CEA浓度通常存在于结肠直肠腺癌的情况下(Fateh-Moghadam，A.和Stieber，P.，Sensible use of tumor markers，BoehringerMannheim，Cat.No.1536869(Engl.)，1320947(German)，ISBN 3-926725-07-9German/English，Juergen Hartmann Verlag GmbH，Marloffstein-Rathsberg(1993))。CEA轻到中度的升高(很少＞10ng/mL)发生在20-50％的肠道、胰腺、肝脏和肺的良性疾病中(例如肝硬化、慢性肝炎、胰腺炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肺气肿)(Fateh-Moghadam，A.，和Stieber，P.，supra)。吸烟者也具有升高的CEA值。CEA确定的主要指标是结肠直肠癌的和后续治疗管理。
蛋白质烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT；Swiss-PROT：P40261)具有29.6kDa的表观分子量和5.56的等电点。最近发现(WO 2004/057336)NNMT在CRC的评价中很有用。WO 2004/057336中描述的免疫测定被用来测量本研究中的样品(CRC，健康对照和非恶性结肠病)。
蛋白质吡咯琳-5-羧酸盐还原酶(PROC；Swiss-PROT：P32322)在文献中也称为PYCR1。PROC催化NAD(P)H依赖型吡咯琳-5-羧酸盐转化成脯氨酸。Merrill，M.J.等，J.Biol.Chem.264(1989)9352-9358研究了人红细胞吡咯琳-5-羧酸盐还原酶的性质。其结论是除了在吡咯琳生物合成中催化必要的和最终的单向步骤的传统角色之外，所述酶在一些细胞类型包括人红细胞的NADP(+)生成中扮演了生理角色。PROC近来被确认为CRC的标记物(WO 2005/095978)。
蛋白质SAHH(S-腺苷高半胱氨酸水解酶；SWISS-PROT：P23526)近来被确认为结肠直肠癌的标记物(WO 2005/015221)。对应克隆的人cDNA编码48kDa的蛋白质。SAHH催化以下可逆反应：S-腺苷-L-高半胱氨酸+H2O腺苷+L-高半胱氨酸(Cantoni，G.L.，Annu.Rev.Biochem.44(1975)435-451)。Hershfield和Francke(Hershfield，M.S.和Francke，U.，Science 216(1982)739-742)将对应的基因定位到染色体20上，之后Coulter-Karis和Hershfield(Coulter-Karis，D.E.和Hershfield，M.S.，Ann.Hum.Genet.53(1989)169-175)测了cDNA的全长序列。近年来，SAHH的结构已经被解析出(Turner，M.A.等.，Cell.Biochem.Biophys.33(2000)101-125)。
如技术人员将明白那样，可以使用一种或多种其他的标记物来进一步提高诊断准确度，或在需要时，以特异性为代价提高诊断灵敏度或者反之。在一些诊断领域，例如HIV感染的检测中，灵敏度是最为重要的。所需要的高灵敏度可以以特异性为代价获得，这导致了假阳性情况数量的增加。在另一些情况下，例如作为简单的实例，当评价血型抗原时，特异性则是极为重要的。
根据本发明的方法看上去适用于筛查无症状个体中CRC的存在与否。这样，特异性以及灵敏度都是极为重要的。普遍认为，用于筛查低发病率疾病如CRC的方法，特异性必须至少为90％，甚至优选为95％，还甚至优选为98％或99％。换句话说，在后一情况下，假阳性分数应当分别为2％或更少，或1％或更小。这意味着在这样高的特异性水平下，不会因疏忽引起过多的昂贵后续检查(由于假阳性结果)。优选地，根据本发明的通过生化标记物来体外评价结肠直肠癌存在与否的方法具有至少90％的特异性，甚至更优选为至少95％。还优选的是，所述特异性分别为至少98％或至少99％。
根据本发明通过测量粪便样品中至少血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白来体外评价结肠直肠癌的存在与否的方法，在95％和98％的固定特异性水平下，具有提高的CRC检测灵敏度。
另一个优选的实施方案涉及在CRC诊断中使用标记物组，所述组包括血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白。进一步优选的是使用包括血红蛋白/触珠蛋白复合物、钙防卫蛋白、和至少一种其它多肽标记物的标记物组，所述其它多肽标记物选自以下物质构成的组：CEA、CYFRA 21-1、CA19-9、CA72-4、NNMT、PROC和SAHH。
在优选的实施方案中，根据本发明的通过生化标记物来体外评价结肠直肠癌存在与否的方法采用了在下面将详细说明的针对粪便样品的特别新型稀释剂，所述方法包括测量粪便样品中至少血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的浓度。
优选的粪便样品稀释剂至少包括缓冲液、蛋白酶抑制剂和分析物释放试剂，但不限于例如清洁剂或离液剂。所述缓冲液在一些优选实施方案中另外包括阻断剂和/或防腐剂。
技术人员熟悉合适的缓冲液系统。优选所述缓冲液或缓冲液系统选自以下物质构成的组：磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基氨基乙烷(Tris)缓冲盐水(TBS)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)和3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)。优选所述缓冲液具有20到200mM之间的摩尔浓度。
粪便样品稀释剂的pH值优选调节到pH6.5到pH8.5的pH值，更优选为pH7.0到pH8.0的pH值，进一步优选为pH7.2到pH7.7的pH值。对技术人员来说，选择缓冲液成分的适当浓度以确保稀释和混合所述粪便样本与粪便样品稀释剂之后获得预期的pH值没有任何困难。
所述粪便样品稀释剂包括蛋白酶抑制剂。蛋白酶的数量一直在增加，而相应的蛋白酶抑制剂也如此。
一类重要的蛋白酶是所谓的丝氨酸蛋白酶，在其活性位点具有氨基酸丝氨酸。公知的丝氨酸蛋白酶实例有胰岛素、糜蛋白酶、激肽释放酶以及尿激酶。技术人员熟知某些蛋白酶抑制剂对于丝氨酸蛋白酶具有活性。这种蛋白酶及其活性谱的抑制潜能例如记载于来自提供商如Serva、Heidelberg或Roche Diagnostics GmbH，Mannheim的数据表单。优选所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自以下物质构成的组：AEBSF-HCl(如Serva Cat.No.12745)，APMSF-HCl(如Serva Cat.No.12320)，抑肽酶(如Roche Diagnostics，Cat.No.10 981 532 001)，胰凝乳蛋白酶抑制剂(如Roche Diagnostics，Cat.No.11 004 638 001)，PefablocSC(如Roche Diagnostics，Cat.No.11 585916 001)，和PMSF(如Roche Diagnostics，Cat.No.10 837 091 001)。
另一类重要的蛋白酶是所谓的半胱氨酸蛋白酶，在其活性位点具有氨基酸半胱氨酸。公知的半胱氨酸蛋白酶实例有木瓜蛋白酶和钙蛋白酶。本领域技术人员熟知某些蛋白酶抑制剂对于半胱氨酸蛋白酶具有活性。这些抑制剂中的一些也对丝氨酸蛋白酶具有活性，例如PMSF可用作半胱氨酸蛋白酶的抑制剂以及丝氨酸蛋白酶的抑制剂。这种蛋白酶及其活性谱的抑制潜能例如记载于来自提供商如Serva、Heidelberg或Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim的数据表单。优选所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂选自以下物质构成的组：亮抑酶肽(如Roche Diagnostics，Cat.No.11 034 626 001)，PMSF(见上)，和E-64(如Roche Diagnostics，Cat.No.10 874 523 001)。
另一类重要的蛋白酶是所谓的金属蛋白酶。金属蛋白酶的特征在于在活性中心含有金属离子如Zn2+，Ca2+或Mn2+。公知的金属蛋白酶实例有消化酶类，如羧肽酶A和B以及嗜热菌蛋白酶。本领域技术人员熟知某些蛋白酶抑制剂对于金属蛋白酶具有活性。金属蛋白酶最容易被结合到所述金属离子并与其形成金属螯合复合物的物质所钝化。优选，使用乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二(氨基乙醚)四乙酸(EGTA)和/或1，2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸(CDTA)来钝化所述金属蛋白酶。金属蛋白酶的其它适当抑制剂有膦酰二肽(＝N-(α-鼠李糖吡喃氧羟基氧膦基)-L-亮氨酰-L色氨酸，二钠盐，如Roche Diagnostics Cat.No.10 874 531 001)以及苯丁抑制素(如Roche Diagnostics Cat.No.10 874 515 001)。这些蛋白酶抑制剂及其活性谱的抑制潜能例如记载于来自提供商如Serva、Heidelberg或Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim的数据表单。优选的金属蛋白酶抑制剂为EDTA、EGTA和/或苯丁抑制素。
另一类重要的蛋白酶被称为天冬氨(酸)蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶的特征在于在活性中心具有天冬氨酸残基。公知的天冬氨酸蛋白酶实例有胃蛋白酶、组织蛋白酶D、凝乳酶和肾素。技术人员熟知某些蛋白酶抑制剂对于天冬氨酸蛋白酶具有活性。优选所述天冬氨酸蛋白酶抑制剂为α2-巨球蛋白(如Roche Diagnostics Cat.No.10 602 442 001)和抑胃酶肽(如RocheDiagnostics Cat.No.11 359 053 001)。
对于某些应用而言，可以通过使用粪便样品稀释剂来将根据本发明的方法加以应用，所述粪便样品稀释剂仅包括一种蛋白酶抑制剂，其通过例如阻断某类蛋白酶来保护所述目的多肽。
优选地，所述粪便样品稀释剂包括至少两种不同的蛋白酶抑制剂，其活性针对两类选自以下组的蛋白酶：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。还优选这些酶种类的至少三种被适当的抑制剂混合液所抑制。优选所述粪便样品稀释剂包含蛋白酶抑制剂混合液，其由分别针对丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶具有活性的蛋白酶抑制剂组成。
优选最多20种不同的蛋白酶抑制剂用于组成蛋白酶抑制剂混合液作为粪便样品稀释剂。还优选使用不超过15种不同的蛋白酶抑制。优选10或更少种不同的蛋白酶抑制剂包含在粪便稀释剂中，这足以获得足够的蛋白酶抑制效果从而稳定粪便样品中的蛋白质类分析物。
优选所述蛋白酶抑制剂选自以下物质构成的组：抑酶肽(aprotinin)、胰凝乳蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽、EDTA、EGTA、CDTA、抑胃酶肽A、苯甲基磺酰氟(PMSF)和Pefabloc
Figure GPA00001139257800141
SC。优选所述蛋白酶抑制剂混合液含有胰凝乳蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽、CDTA、抑胃酶肽A、PMSF和Pefabloc
Figure GPA00001139257800142
SC，还优选使用含有抑酶肽(aprotinin)、亮抑酶肽、EDTA和Pefabloc
Figure GPA00001139257800143
SC的蛋白酶抑制剂混合液。
优选的粪便样品稀释剂还包括清洁剂和/或离液剂。清洁剂通常分为阴离子清洁剂、阳离子清洁剂、两性离子清洁剂、非离子清洁剂。理想的用于根据本发明的粪便样品稀释剂的清洁剂和/或离液剂必须能够将目标分析物从样品中释放出来，同时其应当使得分析物稳定化。令人惊讶的是，这种严格的要求可以通过使用不同的清洁剂或离液剂来实现。优选用于根据本发明的粪便样品稀释剂的所述分析物释放剂选自以下组的非离子清洁剂，如Brij 35
Figure GPA00001139257800144
、Tween 20
Figure GPA00001139257800145
、Thesit
Figure GPA00001139257800146
、Triton X100
Figure GPA00001139257800147
和Nonidet P40和/或选自以下组的离液剂，如尿素、SCN、盐酸胍(guadinium hydrochlride)等等。用粪便样品作为样品的大多数方法都需要将粪便样本直接转移到所述测试系统中，例如传移到愈创木脂测试的测试区域中。该程序降低了其患者的依从率(compliance rate)。
处理步骤越少以及粪便样品的取样和提取越强，则越好。
一些近来的研究集中于帮助取样和处理粪便样品的装置。EP1366715公开了特殊的采集管用于采集粪便样品。该提取管主要包括(a)容器主体，其内部中空，顶部开口，并且能够接收缓冲液，(b)具有用于采集粪便样品的螺纹状小棒的顶帽，当顶帽盖在容器主体顶端时，所述螺旋状小棒轴向突出在所述容器主体内，以及(c)在所述容器主体内的中间位置设置的分区隔断，用以在所述容器主体内分离出上部腔室和下部腔室，所述分区隔断具有适于允许所述螺旋状小棒通过的轴向孔，以便将多余的粪便保持在所述上部腔室中并允许所述小棒的螺旋部分通到所述底部腔室中。该提取管进一步具有在底部开口的容器主体，其具有可移施加在所述容器主体底端的底帽，这样所述提取管能够直接用作主取样管被插入自动分析仪的样品支架板中(在去掉所述底帽并翻转所述容器主体之后)。简单的说，EP1366715中公开的管允许方便地处理定量的粪便样品并具有这样的优点，即在适当提取之后，所述管可以被直接放到自动分析仪的样品支架中。读者可以在上述说明的专利中找到该粪便取样管的详细内容，其全部内容这里通过引用结合进来。
在WO 03/068398中描述了尖端的粪便取样装置，其也适于方便地取样和处理粪便样品。在该WO申请中公开的装置特征明确被参考，这里通过引用包含其全文。在WO 03/069343中，推荐提取粪便样品，例如用根据WO 03/068398的装置使用包含10mM CHAPS(＝3-[(3-氯酰氨基丙基)-二甲氨基]-1-丙磺酸盐)的提取缓冲液来采集，所述缓冲液是两性离子清洁剂。
为了制备免疫测定试验的粪便样品组合物，制备在粪便样品稀释剂中最多10wt.％，优选0.1wt.％到最多10wt.％，更优选0.5到5wt.％的粪便样品。优选地，所述粪便样品与稀释剂的混合在适当的取样管中直接制备，所述取样管事先预装有如上所述的粪便样品稀释剂。
所述粪便样品优选新鲜采集，并直接加到所述粪便样品稀释剂中。无需中间的存放、运输和/或处理过程。
血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的水平分别通过适当的测试方法测得。在临床常规检查中，这种方法在多数情况下采用针对靶抗原的抗体，即所谓的免疫测定。可以实施包括乳胶凝集法、竞争法和夹心免疫测定的多种免疫测定方法来检测粪便样品中的蛋白质类分析物，如果这种粪便样品是例如上面详细描述的那样制备的话。
优选使用的免疫测定是非均匀免疫测定。还优选所述蛋白质类分析物的检测利用竞争性免疫测定的帮助或者利用所谓的夹心免疫测定的帮助来实现。
对于技术人员来说，建立能够检测粪便样品提取物中存在的靶抗原或靶分析物的免疫测定没有问题。
例如，这种检测可以以夹心类型的免疫测定来实施。典型地，将第一抗分析物抗体直接或间接结合到固相上。换句话说，所述结合到靶抗原上的第一抗体用作捕获抗体。为确定例如在人粪便样品的提取物中的靶分析物，将所述提取物在适当的条件下温育足以使所述捕获抗体与分析物结合的时间。为了检测靶抗原，使用针对所述靶抗原的第二或检测抗体，其结合到不同于所述捕获抗体识别的表位的表位上。与该第二抗体的温育可以在与所述第一抗体的温育之前、之后或同时进行。
优选所述检测抗体以有助于直接或间接检测的方式标记。
用于直接检测，所述标记基团可以选自任何已知的可检测标记物基团，例如染料、发光标记基团例如化学发光基团，例如吖啶鎓酯类(acridiniumester)或二氧杂环丁烷(dioxetane)，或者荧光染料，例如荧光素、香豆素、罗丹明、噁嗪、试卤灵、花青及其衍生物。标记基团的其它实例有发光金属复合物，如钌或铕络合物、酶类、例如用于ELISA或用于CEDIA(克隆酶供体免疫测定，例如EP 0061888)，以及放射性同位素。
间接检测系统包括，例如检测剂，如标记有生物亲和结合对(bioaffinebinding pair)的第一成员的检测抗体。合适的结合对的实例有半抗原或抗原/抗体、生物素或生物素类似物如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/亲和素或连亲和素、糖/外源凝集素、核酸或核酸类似物/互补核酸以及受体/配体，例如类固醇激素受体/类固醇激素。优选地第一结合对成员包括半抗原、抗原和激素。尤其优选的是半抗原如地高辛和生物素及其类似物。这种结合对的第二成员例如，抗体、链亲和素等等，通常被标记以允许直接检测到，例如用上面提到的标记物。
免疫测定是本领域技术人员公知的。用于实施这种测定的方法以及实践应用和程序总结于相关教科书中。相关教科书的实例有Tijssen，P.，Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates，In：Practice and theory of enzyme immunoassays，Burdon，R.H.和v.Knippenberg，P.H.(eds.)，Elsevier，Amsterdam(1990)，pp.221-278)，以及Methods inEnzymology，Colowick，S.P.和Caplan，N.O.(eds.)，Academic Press)解决免疫检测方法的各卷中，尤其是第70，73，74，84，92和121卷。
基于上述粪便样品稀释剂，可以以非常方便的方式处理粪便样品。优选所述标记物血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的至少一种从收集在如上所述的粪便样品稀释剂中的粪便样品测得。优选两种分析物都从收集在如上所述的粪便样品稀释剂中的粪便样品测得。还优选在检测钙防卫蛋白或血红蛋白/触珠蛋白复合物中或在检测这两种分析物中，使用这种粪便样品稀释剂的优选组合物。
本发明还涉及用于实施本发明方法的试剂盒，包括分别特异性测量所述血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白所需的试剂。
而在另一个优选的实施方案中，所述试剂盒包括用于实施测量血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白所需的试剂，和此外预装有合适粪便样品稀释剂的粪便取样装置。
提供以下实施例来帮助理解本发明，其真正的范围在所附的权利要求中列出。应当明白，在不背离本发明精神的情况下，所述程序中可以有所改变。
实施例1
粪便样本的处理
为了提高粪便样品中不同目的分析物的测量，使用“优化的提取缓冲液”。为处理所述粪便样品，通过加入蛋白酶抑制剂混合液(Mini CompleteEDTA-free，Roche，Germany)到下面的缓冲液中来新鲜制备所述提取缓冲液：
TRIS      0.10mol/l，pH 8.0
柠檬酸    0.10mol/l
尿素      1.0mol/l
CaCl2     0.01mol/l
BSA       0.50％
解冻所述粪便样品并转移50-100mg每份样品到粪便样品制备试剂盒中(cat.-no.：10745804 Roche，Germany)。按照粪便样品的重量加入优化的提取缓冲液，以予以50倍稀释。将所述样品在轨道摇床上强力混合30分钟，转移到10ml试管(Sarstedt，Germany)中，并在1200g下离心10分钟。用5μm的截止过滤器(Ultrafree
Figure GPA00001139257800181
-CL，Millipore，Germany)过滤上清液，等分并存放在-70℃下用于进一步分析。这些粪便提取物对于本研究中关注的所有生物标记物适用。
实施例2
粪便提取物中分析物的稳定性
在利用实施例1所述提取方法制备的粪便提取物中，钙防卫蛋白似乎比血红蛋白-触珠蛋白更加稳定。当粪便提取物在室温下存放了1或3天时，钙防卫蛋白的平均回收率比血红蛋白-触珠蛋白的平均回收率要高并且表现出较低的分散性。在20份用于评价稳定性的样品中，5份血红蛋白-触珠蛋白为阴性。
表1：温度应激(temperature stress)下的平均回收率
  N   样品的浓度范围   1天后的回收率RT   3天后的回收率RT
  钙防卫蛋白   20   18-6250μg/g   96％(±10％)   94％(±19％)
  血红蛋白-触珠蛋白   15   0.2-4790μg/g   78％(±33％)   72％(±30％)
实施例3
结肠直肠癌中的临床实用性研究
通过分析来自于典型特征患者群体的粪便样品来评价所述临床实用性。对于每位患者，测量来自于相同排便动作的两份粪便样品并分析其浓度。为了提高测定的灵敏度，两个成对样品之一中测得的最大浓度用于进一步的分析。还按照Zweig等人(如上所述)的ROC分析来评价钙防卫蛋白和血红蛋白-触珠蛋白及其组合的诊断值。
研究群体
所有的分析物都在大研究群体中测量(患者特征，参见：表2)。大量的临床典型特征粪便样品预期性地收集在多中心研究的框架中。用于对照集合的患者(进行了结肠镜检)在肠胃病科室中招募并代表平均风险的筛查群体。具有炎症性肠道疾病和任何种类腺瘤的患者被排除在对照集合之外。由于结肠直肠癌患者在筛查群体中的低患病率，来自于癌症患者的样品在不同的手术科室中采集。结肠直肠癌的诊断通过医生确诊，其也为每位癌症患者提供病理分期结果。为了排除任何可能通过基于愈创木脂的FOBT预筛查而由患者的常见诊断工作引入的偏差，所有由于可见的直肠出血或由于阳性FOBT而初步检测过的CRC患者被排除在该集合外。因为这些会导致偏向血红蛋白的优点。
从252名对照个体中获得粪便样品。其中132名通过结肠镜检被确诊为GI健康型，而剩下的对照样品涵盖了几种相关的GI疾病。所述CRC群体包括了101份来自UICC I-IV期(表3)的CRC样品。对16名CRC患者，不清楚具体的分期。
表2：研究群体中的患者特征
  总数   年龄(岁)   性别(女/男)
  对照   252   63.0+/-8.0   151/101
  -健康对照(无任何肠道疾病的证据)   132   62.3+/-6.8   81/51
  -痔疮   28   60.1+/-7.1   13/15
  -憩室病   73   64.7+/-9.5   46/27
  -Hyplastic息肉   14   67.9+/-9.9   8/6
  -其他GI疾病   5   59.2+/-6.7   3/2
  CRC   101   68.4+/-11.5   48/53
表3：CRC UICC分期分布
  样品组   N
  CRC   101
  UICC 0/I期   23
  UICC II期   27
  UICC III期   12
  UICC IV期   23
  无分期   16
钙防卫蛋白、血红蛋白-触珠蛋白和其他粪便标记物的组合
评估了钙防卫蛋白和来自粪便提取物的其他生物标记物的组合。所述标记物钙防卫蛋白、血红蛋白、血红蛋白和触珠蛋白的异质复合体和CEA通过商用ELISA来测量。用于测量血红蛋白、血红蛋白/触珠蛋白和钙防卫蛋白的测定法由德国R-Biopharm处获得。钙防卫蛋白ELISA由挪威Calpro SA生产，并在德国之外以PhiCalTM测试的形式销售。用于测量CEA的测定从德国Roche Diagnostics获得。尽管一些测定意在测量粪便提取物，但对于CEA来说粪便不是通常使用的样品材料。因而，必须调整所述测定以便在提取的粪便样本中测量。所述样品(粪便提取物)预先被稀释20倍用于CEA测定，但其它方面所述测定可按照生产商的推荐来进行。
测试时，如果标记物组合提高CRC的诊断，则可通过贝叶斯逻辑回归(BLR)来组合所述标记物。在BLR算法中，为了评估标记物的组合，使用高斯优先并将其在Alexander Genkin，David D.Lewis和David Madigan的BBR-软件中实现(Large-scale Bayesian logistic regression for textcategorization，Technometrics)。使用下列设置：无自动特征选择、优先变量固定在0.05、无阈值协调、并通过归一化处理来进行输入标准化。对于数值处理，默认设置收敛阈值0.0005、1000迭代和无精确模式保持不变。利用基本算法得出的结果通过在Monte-Carlo交叉验证设计下的100次运行来评估。在每次运行中，分别选择所有情况和对照的三分之二以作为训练集，通过Matlab
Figure GPA00001139257800211
R2006a内置randsample函数，以19022007初始值作为默认随机数生成器来实现。将所述基本算法用于训练集上以生成诊断规则。有关估计的后续情况概率方面的阈值在训练集的对照上确定，以分别达到95％或98％的特异性。然后将该诊断规则用于其它三分之一的数据以估计给定阈值下的灵敏度和特异性。
为了避免任何偏向血红蛋白或血红蛋白/触珠蛋白，只有未做过在先FOBT预筛查的CRC患者用于此评估。对于筛查测定，不仅ROC曲线的AUC是相关的。在筛查设置中非常重要的要求是在高特异性下的足够好的灵敏度。高特异性是关键的，因为低特异性会引起大量假阳性结果并伴随对患者不必要的后续步骤和痛苦。表4总结了评估的AUC值以及分别在预设特异性95％和98％下的灵敏度。当一些测得的单个标记物通过BLR组合时，通过曲线下95％面积的钙防卫蛋白与血红蛋白-触珠蛋白的组合获得最高AUC值。另一方面，CRC检测中的总灵敏度可以通过血红蛋白-触珠蛋白与钙防卫蛋白在两种特异性水平95％和98％下的组合来提高。在两种情况下，钙防卫蛋白与血红蛋白-触珠蛋白组合的灵敏度惊人地高于钙防卫蛋白与血红蛋白的组合。这些标记物组合能够在检测CRC时被认为非常重要，尤其是早期CRC检测时。
表4：用于CRC检测的标记物组合
  标记物组合   Hb-Hp   钙防卫蛋白   钙防卫蛋白+Hb-Hp   钙防卫蛋白+Hb   钙防卫蛋白+CEA
  AUC％   92   90   95   94   89
  95％特异性下的灵敏度   82％   62％   85％   82％   64％
  98％特异性下的灵敏度   73％   55％   76％   73％   52％

Claims (5)

1.通过生化标记物来体外评价结肠直肠癌存在与否的方法，包括测量粪便样品中至少下列物质的浓度：
a)血红蛋白-触珠蛋白复合物，和
b)钙防卫蛋白，以及
c)将步骤a)和b)中测定的浓度与结肠直肠癌的存在与否相关联。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括测量至少一种选自以下物质构成的组的其他多肽标记物：CEA、CYFRA 21-1、CA19-9、CA72-4、NNMT、PROC和SAHH。
3.包括至少血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白的标记物组在结肠直肠癌诊断中的用途。
4.根据权利要求3的用途，包括血红蛋白/触珠蛋白复合物、钙防卫蛋白和至少一种选自以下物质构成的组的其他标记物：CEA、CYFRA21-1、CA19-9、CA72-4、NNMT、PROC和SAHH。
5.用于实施根据权利要求1的方法的试剂盒，包括分别特异性地检测所述血红蛋白/触珠蛋白复合物和钙防卫蛋白所需的试剂，以及任选的用于实施所述测量的辅助试剂。
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