CN101808658A

CN101808658A - 细胞穿透肽及其与具有治疗作用的生物分子相融合的用途

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Publication number: CN101808658A
Application number: CN200880109545A
Authority: CN
Inventors: I·D·C·托伦斯马德拉索; M·古埃拉巴莱斯皮; M·格拉纳迪罗罗德里格斯; O·雷伊斯阿考斯塔; B·E·阿塞韦多卡斯特罗
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2008-07-31
Publication date: 2010-08-18
Anticipated expiration: 2028-07-31
Also published as: ZA201001337B; EP2186526A1; WO2009021468A1; AR068329A1; BRPI0814452A2; EP2186526B1; KR101515445B1; CA2694735A1; ES2610408T3; KR20100045498A; CA2694735C; CU23674A1; US20120135021A1; CN101808658B; US8673313B2

Abstract

本发明涉及新的细胞穿透肽(CPP)，特别是鲎抗脂多糖因子(LALF)这种蛋白质的区域32-51及其类似物的用途。本发明涉及包含与具有治疗特性的生物分子相联合的这些肽的组合物。本发明在于包含生物分子(其中包括人乳头瘤病毒(HPV)抗原)与这些CPP的共价融合物的组合物，其用于诱导针对HPV和针对展现出HPV抗原的细胞(包括与HPV相关的肿瘤)的强有力的细胞免疫应答。作为用于人治疗用途的疫苗，所提及的组合物可应用于制药工业中。

Description

细胞穿透肽及其与具有治疗作用的生物分子相融合的用途

技术领域

本发明涉及免疫学、细胞生物学和癌症领域。具体而言，本发明的方法和组合物牵涉不同来源的生物分子与细胞穿透肽(cellpenetrating peptide，CPP)的融合物，以用于诱导强有力的治疗作用。

现有技术

在最近十年期间，几种蛋白质，例如HIV-1 Tat、果蝇触足同源异型蛋白和HSV-1 VP22，已显示通过称为蛋白质转导(proteintransduction)的过程穿越细胞膜并到达细胞核，而同时保留其生物学活性(Prochiantz，A.(2000)Messenger proteins：homeoproteins，TAT and others.Curr.Opin.Cell Biol.12：400-406)。事实上，发现衍生自蛋白质转导结构域的短肽(细胞穿透肽或CPP)可以内化到大多数细胞类型中。这些CPP已成功地用于生物分子的细胞内递送(Schwarze，S.R.等人(2000)Protein transduction：unrestricted delivery into all cells ？.Trends Cell Biol.10：290-295)。广泛范围的生物分子例如抗原性肽、核酸、寡核苷酸、全长蛋白质、纳米颗粒和脂质体已如此进行了递送。大多数药物难以吸收到细胞中，并且这被认为是在将它们开发作为治疗剂中的主要限制。因此，治疗剂与CPP的融合可以成为改善其药理学特性的选择策略。

已从蛋白质中鉴定出了几种CPP，包括人免疫缺陷病毒的Tat蛋白(Frankel，A.D.和Pabo，C.O.(1988)Cellular uptake of theTat protein from human immunodeficiency virus.Cell55：1189-1193)、单纯疱疹病毒的VP22蛋白(Elliott，G.和O’Hare，P.(1997)Intercellular trafficking and protein delivery by aherpesvirus structural protein.Cell 88：223-233)和成纤维细胞生长因子(Rojas M等人，(1998)Genetic engineering of proteinwith cell.membrane permeability.Nat Biotechnol.16：370-375)。Tat肽已被用于在体外和在体内将蛋白质转导到细胞中(Lindgren，M等人，(2000)Cell-penetrating peptides.Trends Pharmacol.Sci.21：99-103)。在将肿瘤抗原递送到细胞内之中使用这些CPP可以延长肽对T细胞的有效呈递，从而导致产生强有力的针对癌症的免疫应答。

全世界大约1％的女性患有宫颈癌。根据世界卫生组织，在世界范围内宫颈癌每年折磨500,000名或更多的女性，并且特别是在欠发达国家中，宫颈癌是女性死亡的主要原因。

HPVs目前公认为宫颈癌的主要原因。研究还暗示，HPVs可能在肛门、外阴、阴道的癌症以及某些口咽癌症(包括软腭、舌底部和扁桃体的喉的中间部分)中起作用(Division of STD Prevention.Prevention of genital HPV infection and sequelae：Report of anexternal consultants′meeting.Atlanta，GA：Centers for DiseaseControl and Prevention，1999)。

HPV是具有超过100种病毒的群体。超过30种类型通常是性传播的。某些类型的HPV称为“低危”病毒，因为它们很少发展成癌症。更可能导致癌症发展的HPV类型称为“高危的”。高危和低危类型的HPV可以引起异常细胞的生长，但一般仅高危类型的HPV可能导致癌症。性传播的高危HPVs包括类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、69和可能的少数其他类型。这些高危类型的HPV引起通常扁平且几乎不可见的肿瘤。

生殖器疣(在学术上称为尖锐湿疣)最通常与2种低危HPV类型即HPV-6和HPV-11相关。

乳头瘤病毒是小的(50-60nm)无包膜DNA病毒，其具有7800至7900碱基对的双链、环状DNA基因组。该基因组包含3个主要区域：编码晚期基因的区域，编码早期基因的区域，和非编码区(Park T.W.等人，(1995)Molecular biology of cervical cancer and itsprecursors.Cancer 76：1902-1913)。晚期基因区域具有2个分开的开放读码框，其编码病毒衣壳蛋白L1(主要)和L2(次要)。早期基因区域包括6个开放读码框，命名为E1、E2、E4、E5、E6和E7。E6和E7蛋白是对于病毒复制以及对于宿主细胞永生化和转化来说关键的癌蛋白。

通常用于治疗由HPV产生的损害的方法包括冷冻破坏法(破坏组织的冷冻)、LEEP(电环切除术(loop electrosurgical excisionprocedure)，使用热线环来去除组织)和常规外科手术。类似的治疗可以用于外生殖器疣。此外，某些药物可以用于治疗外生殖器疣(Centers for Disease Control and Prevention.Sexuallytransmitted diseases treatment guidelines 2002.Centers forDisease Control and Prevention.Morbidity and Mortality WeeklyReport 2002；51(RR-6)：1-78)。

近来，美国食品与药物管理局(FDA)批准了用于预防类型16和18(引起大多数(70％)宫颈癌的2种“高危”HPVs)感染，以及类型6和11(其引起大多数(90％)生殖器疣)感染的预防性疫苗(KoutskyLA，Ault KA，Wheeler CM等人，A controlled trial of a humanpapillomavirus type 16vaccine.New England Journal of Medicine2002；347(21)：1645-1651)。

已提出了几种治疗性疫苗用于治疗与HPV相关的损害。例如，专利US 6,306,397(CSL Limited)描述了用于产生细胞免疫应答的HPVE6/E7的变体；WO 93/20844(Cancer Research Campaign Technology)讨论了基于E7蛋白的针对HPV的疫苗的使用。专利WO 92/10513(TheUniversity of Queensland)；US 5,547,846(BehringwerkeAktiengeellschaft)和US 6,013,258(Zycos Inc.)描述了构成针对HPV的疫苗的抗原性组分的肽。专利US 6,524,825(StressgenBiotechnologies)提出了E7与热休克蛋白(Hsp)的融合物作为用于治疗由HPV产生的损害的疫苗的用途。

用这些疫苗的临床试验的结果，如使用不同肿瘤抗原的其他治疗性疫苗的结果一样，仅遇到有限的成功(Dallal R.M.和Lotze M.T.(2000)The dendritic cell and human cancer vaccines Curr OpinImmunol 12：583-588)，因为针对肿瘤的的反应性T细胞应答是非常弱的。因此，在癌症疫苗中的主要挑战是如何打破耐受性，以及通过操纵抗原和递送系统来产生强的长效抗肿瘤免疫。

与现有技术相比，本发明提出了新的CPP家族以及包含与该新的CPP家族在基因上相融合的HPV抗原的组合物的使用，其增强针对HPV抗原和针对展现出HPV抗原的细胞(包括与HPV相关的肿瘤)的抗肿瘤性细胞免疫应答。

发明阐述

本发明通过提供新的CPP家族而解决了上述问题，所述CPP可以用作用于融合生物分子的平台并达到药物有效地内在化到细胞中。所述新的CPP家族包括相应于LALF蛋白的区域32-51的肽(SEQ ID NO.1)以及其类似肽，所述类似肽具有在不同位置处用丙氨酸进行的氨基酸点置换：L-2(SEQ ID NO.2，在位置2处进行置换)、L-8(SEQ IDNO.3，在位置8处进行置换)、L-12(SEQ ID NO.4，在位置12处进行置换)和L-20(SEQ ID NO.5，在位置20处进行置换)。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了包含与先前提及的CPP家族在基因上相融合的HPV抗原的药物组合物，其加强针对HPV抗原的免疫应答，其中HPV的蛋白质抗原与该CPP家族共价融合。该基因融合物保证了将HPV抗原递送至细胞，从而确保了负载物蛋白质的加工以及使抗原表位向T细胞呈递延长的时间，这导致强有力的抗肿瘤性细胞免疫应答。

所述免疫应答可以是细胞应答，特别是针对HPV蛋白质抗原的由细胞介导的、细胞溶解性应答。所述组合物可以在治疗上使用。在治疗应用中，在受试者中诱导免疫应答是指产生这样的应答，所述应答在量级或质量方面超过先前通过与HPV蛋白质抗原相接触而引发的应答，所述HPV蛋白质抗原由病毒或者由受感染的受试者或者由受试者的经转化的细胞所展现。

在具体的实施方案中，所述药物组合物用于产生针对表达且展现HPV蛋白质抗原的肿瘤细胞的免疫应答。在这些实施方案中，被该组合物所靶向的优选的HPV蛋白质抗原是已知在与HPV相关的肿瘤中一贯表达的E6和E7病毒早期蛋白。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含在核苷酸水平上与LALFCPP相融合的HPV E6或E7蛋白质抗原，从而允许表达和纯化包含E6/E7抗原和LALF CPP序列的蛋白质。该融合蛋白可以与佐剂相混合。

所述组合物还可以在治疗上在先前被HPV感染的受试者中使用，以阻止进一步的病毒增殖或者去除由于HPV感染而增殖的受试者细胞(包括表达且展现HPV抗原或者呈递该抗原的部分的肿瘤)。

当在本文中提及HPV蛋白质抗原作为由本发明的药物组合物所诱导的免疫应答的靶时，“HPV蛋白质抗原”应理解为包括在HPV的表面上或者在受试者的受感染细胞上展现的完整HPV蛋白质或HPV蛋白质的多肽部分，以及由于HPV蛋白质的加工和呈递(例如通过典型的I或II类MHC途径)而由受感染细胞所展示的肽。

克隆了许多不同类型的HPV的基因组序列，并且通过DNA序列分析进行表征。包含完全或部分的HPV基因组的细菌载体可从各种来源获得，包括例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)。可以通过先前为了这个目的而建立的本领域众所周知的方法来分离可用于实践本发明的另外类型的HPV并进行分型。

在将本发明应用于与HPV相关的癌症的治疗性处理中特别重要的是，观察到HPV E6和E7蛋白在宫颈癌中一贯地表达(Zur Hausen H.(1987)Papillomaviruses in human cancer.Appl Pathol 5：19-24；Pater M.M.，Pater A.(1985)Human papillomavirus types 16 and18 sequences in carcinoma cell lines of the cervix.Virology145：313-318)。

最后，在动物模型中的研究证明，用E7蛋白进行免疫接种保护了小鼠不受用活化的c-Ha-ras基因和HPV E6/E7基因转化的肺细胞的攻击(Lin K.Y.等人，(1996)Treatment of established tumors witha novel vaccine that enhances major histocompatibility classII presentation of tumor antigen.Cancer Res.56：21-26)。

考虑到下列情况，E6和E7是用于免疫干预或预防的优选的靶，并因此是待用于预防或治疗与HPV相关的癌症的本发明药物组合物的优选的HPV蛋白质抗原：这些蛋白质通常在由于HPV感染而出现的癌症中表达，相同的蛋白质也是最可能在癌症的发展和维持中起主要作用的癌基因，并且免疫应答可以针对这些蛋白质。

本文所描述的药物组合物可以用于增强针对HPV或者表达HPV抗原的经HPV感染或转化的细胞的免疫应答，特别是由细胞介导的、细胞溶解性应答。这些组合物可以以各种方式施用给受试者。施用途径包括皮内、经皮、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、硬膜外和鼻内途径。可以使用任何其他合适的施用途径，例如输注或快速浓注，或者通过上皮或粘膜皮肤覆盖物吸收。另外，本文所描述的组合物可以包含佐剂和与佐剂一起施用。此外，所述组合物可以离体用作用于刺激获自受试者的白细胞的手段，以在体外引发、扩展和繁殖HPV蛋白质抗原特异性免疫细胞，所述免疫细胞随后被再引入受试者中。

有效量是这样的量，即使得当施用时，它诱导针对它所编码的HPV蛋白质抗原的免疫应答。此外，施用给受试者的药物组合物的量可以依赖于各种因素而改变，所述因素包括HPV的抗原或蛋白质抗原，受试者的尺寸、年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食以及其总体免疫应答性。

附图简述：

图1。荧光显微镜检术图像，其显示了LALF CPP穿透入细胞中的能力

1-LALF，在J774中于37℃10分钟

2-LALF，在J774中于37℃20分钟

3-LALF，在J774中于37℃30分钟

4-LALF，在J774中于4℃10分钟

5-LALF，在J774中于4℃20分钟

6-LALF，在J774中于4℃30分钟

7-LALF，在CaSki中于37℃30分钟

8-LALF，在CaSki中于37℃1小时

9-LALF，在CaSki中于37℃2小时

10-LALF，在HeLa中于37℃30分钟

11-LALF，在HeLa中于37℃1小时

12-LALF，在HeLa中于37℃2小时

13-LALF，在TC-1中于37℃30分钟

14-LALF，在TC-1中于37℃1小时

15-LALF，在TC-1中于37℃2小时

16-L-2，在Hep-2中于37℃30分钟

17-L-2，在Hep-2中于37℃1小时

18-L-2，在Hep-2中于37℃2小时

19-L-20，在Hep-2中于37℃30分钟

20-L-20，在Hep-2中于37℃1小时

21-L-20，在Hep-2中于37℃2小时

22-J774细胞(阴性对照)

23-无关肽，在J774中于37℃2小时

图2。荧光共聚焦显微镜检术图像，其显示了L-2和L-20穿透入细胞中的能力

1a和1b。未处理的细胞(阴性对照)

2a和2b。用L-2肽处理10分钟的细胞。

3a和3b。用L-20肽处理10分钟的细胞。

4a和4b。用L-2肽处理30分钟的细胞。

5a和5b。用L-20肽处理30分钟的细胞。

6a和6b。用L-2肽处理1小时的细胞。

7a和7b。用L-20肽处理1小时的细胞。

8a和8b。用L-2肽处理18小时的细胞。

9a和9b。用L-20肽处理18小时的细胞。

图3。构建体pPEPE7M-7的示意性图示

图4。荧光显微镜检术图像，其显示了LALF-E7使负载物蛋白质(E7)内在化入细胞中的能力

1-LALF-E7，在J774中于37℃30分钟

2-LALF-E7，在J774中于37℃1小时

3-LALF-E7，在J774中于37℃2小时

4-E7，在J774中于37℃2小时

5-PBS，在J774中于37℃2小时

6-CasKi

图5。Western印迹，其显示了LALF-E7融合蛋白在细胞中的内在化

1-J774

2-J774+E7

3-J774+LALF-E7

4-LALF-E7

图6。荧光显微镜检术图像，其显示了LALF-GFP使负载物蛋白质(GFP)内在化入细胞中的能力

1-LALF-GFP

2-生物素化的LALF

3-GFP

4-PBS

图7。图表，其显示了用LALF-E7进行的治疗对于在动物中由TC-1细胞建立的肿瘤的体积的影响。

图8。图表，其显示了用LALF-E7进行的治疗对于在动物中由TC-1细胞建立的肿瘤的体积的影响依赖于该共价融合物。

图9。图表，其显示了斑点形成效应细胞(SFC)计数/10⁶的用不同制备物进行免疫接种的3只小鼠的脾细胞汇集物。

实施例

实施例1.LALF CPP或其类似物向具有不同组织学来源的细胞中的内在化

在这次实施中使用不同的细胞系(表1)。在22mm无菌盖玻片上，细胞在37℃和5％CO₂下在具有10％灭活的胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640中生长过夜。然后，添加25或50μM LALF CPP或者其生物素化的类似物L-2和L-20，并且于37℃和于4℃温育不同的时间(10分钟、20分钟、30分钟、1小时和2小时)。用PBS轻轻地洗涤细胞，并且在室温下用4％低聚甲醛固定20分钟。用PBS进行3次洗涤。在室温下用0.5％Tritón X-100实施细胞的渗透化15分钟。用PBS进行3次洗涤。在室温下用在PBS中的1％FBS封闭1小时。用PBS进行3次洗涤。在暗室中与在PBS中的1∶50000链霉抗生物素蛋白-荧光素一起温育45分钟。用PBS充分洗涤。用水性封固剂将盖玻片封固在载玻片。使用具有合适滤波器的荧光显微镜进行检查。

表1

LALF CPP或其类似物向具有不同组织学来源的细胞中的内在化

细胞	CPP肽(μM)	温度(℃)	时间
细胞	CPP肽(μM)	温度(℃)	时间	J774	25μMLALF50μMLALF	37℃，4℃	10分钟，20分钟，30分钟，1小时，2小时
CasKi	50μMLALF	37℃	30分钟，1小时，2小时	J774	25μMLALF50μMLALF	37℃，4℃	10分钟，20分钟，30分钟，1小时，2小时
CasKi	50μMLALF	37℃	30分钟，1小时，2小时	HeLa	50μMLALF	37℃	30分钟，1小时，2小时
TC-1	50μMLALF	37℃	30分钟，1小时，2小时	HeLa	50μMLALF	37℃	30分钟，1小时，2小时
TC-1	50μMLALF	37℃	30分钟，1小时，2小时	Hep2	50μMLALF50μML-250μML-20	37℃	30分钟，1小时，2小时

作为阴性对照，使用生物素化的无关肽和没有肽的细胞。

所获得的结果(图1)显示，在不同类型的细胞中和在短的温育时间(30分钟)下，LALF CPP及其类似物发生内在化。此外，在J774细胞中可以显示，以10分钟的温育和在4℃的温度下，LALF CPP能够穿透到细胞的内部，这确证了这些肽作为CPP的特征，CPP的用于内在化的途径不依赖于胞吞作用。

当使用类似物L-8和L-12时，这些结果是类似的。

实施例2.类似物L-2和L-20向小鼠脾细胞中的内在化

为了获得脾细胞，通过颈部脱位来处死C57BL/6小鼠，并且无菌地取出脾脏。将从脾脏提取的动物的细胞悬浮液合并成汇集物，并且轻轻地进行均质化。洗涤脾细胞，并且用0.83％NH₄Cl溶液裂解红细胞。然后，进行洗涤，并最后将脾细胞分开到不同的管中，所述管具有在补充有7％胎牛血清(FBS)的10mL新鲜RPMI 1640培养基中重悬浮的总共20×10⁶个细胞。每个制备物与0.8mg生物素化的肽L-2(278μM)和L-20(280μM)一起温育不同的时间：10分钟、30分钟、1小时和18小时。温育在37℃和5％CO₂下进行。将细胞封固在载玻片上，固定，并进行渗透化。细胞用碘化丙锭进行处理以对细胞核进行染色，并用链霉抗生物素蛋白-荧光素进行处理以检测在细胞内部的肽。由通过共聚焦显微镜检术所进行的观察而获得的结果(图2)显示，肽L-2和L-20在短的温育时间(30分钟)下内在化。

当使用LALF CPP以及类似物L-8和L-12时，这些结果是类似的。

实施例3.LALF CPP或类似物与E7的重组融合蛋白的克隆和表达

为了获得LALF CPP与E7蛋白的重组融合物，分开地化学合成该融合物的每一组分的DNA的两条链。LALF CPP的DNA片段(SEQ ID NO.6)在5′和3′末端处分别具有开放的NcoI和HindIII限制位点。HPV 16E7基因的DNA序列在5′和3′末端处分别具有开放的HindIII和BamHI限制位点。在编码E7的第一个半胱氨酸的三联体中还包含碱基T被碱基G的置换，以便去除E7与Rb蛋白的结合位点(SEQ ID NO.7)。使用T4连接酶将这两个合成片段插入到事先用Nco I和BamHI消化的载体pM238(Yero D.等人，(2006)Bicistronic expression plasmidfor the rapid production of recombinant fused proteins inEscherichia coli.Biotechnol Appl Biochem.44：27-34)中。该载体包含大肠杆菌(E.coli)色氨酸启动子和T4噬菌体的终止信号(T4终止子)，这允许它用于在大肠杆菌中表达蛋白质。还包含有在紧接插入片段的3′末端处的并且在DNA编码区中引入的6组氨酸序列，这允许随后通过金属亲和层析来纯化蛋白质。

将连接反应物转化到大肠杆菌感受态细胞的制备物中。通过用5种限制酶进行的分析来检查所获得的菌落。此外，通过双链的测序来检查阳性克隆，其中为此使用与E7杂交的具27个碱基的寡核苷酸(SEQID NO.8)，由此确认了正确的融合物(SEQ ID NO.9和10)和在与Rb蛋白的结合位点处半胱氨酸被甘氨酸置换。所选择出的克隆(图3)命名为pPEPE7M-7。

当不使用LALF CPP而使用其类似物L-2、L-8、L-12和L-20中的任一种时，这些结果是类似的。

实施例4.LALF CPP或其类似物与E7的重组融合蛋白的发酵和纯化

将pPEPE7M-7质粒转化到大肠杆菌菌株BL-21中。在37℃下并伴随250r pm的搅拌，在由M9盐制备并且补充有0.1mM CaCl₂、0.1mMMgCl₂、1％葡萄糖、1％酪蛋白水解物、0.5％胰蛋白胨和100μg/mL氨苄青霉素的基本培养基中，使经转化的细菌经历发酵过程24小时。在从发酵开始9小时并且当培养物达到大约1的在620nm处的光密度时，添40μg/mL吲哚丙烯酸以诱导重组蛋白质的表达。所述诱导维持15小时。通过于4℃以10,000rpm离心20分钟来实现细胞的沉降。

将5克生物量重悬浮在25mL缓冲液(50mM NaH₂PO₄，0.3M NaCl，pH 8)中，并经历通过超声波的细胞破裂(0.5个循环，70的振幅/1分钟)。该破裂过程进重复5次。将破碎的细胞匀浆，并且于4℃以10,000rpm离心30分钟。去除该次离心的上清液，并且收集包含重组蛋白质的不溶性级分以用于其随后的纯化。

用30mL缓冲液(50mM Tris-HCl，3mM EDTA，0.8M NaCl，0.01M MgCl₂，0.1％NP40)洗涤3克所述不溶性级分，并且在Polytron中以9,500rpm的转速匀浆1分钟。使匀浆产物于4℃以10,000rpm离心20分钟。去除该次离心的上清液，并且使不溶性级分重悬浮在相同体积的缓冲液中。相同的过程重复2次。立即使匀浆产物于4℃以10,000rpm离心20分钟。去除上清液，并且使不溶性级分重悬浮在30mL缓冲液(50mM NaH₂PO₄，0.3M NaCl，pH 8)，并且如上所描述的进行匀浆。使匀浆产物于4℃以10,000rpm离心20分钟。为了从不溶性级分中提取出蛋白质，将1克不溶性级分重悬浮在100mL的在缓冲液(50mM NaH₂PO₄，0.3M NaCl，pH 8)中的4M尿素之中。用Polytron以9,500rpm的转速匀浆1分钟。然后，使提取物于4℃以10,000rpm离心20分钟。在可溶性级分中发现有目的蛋白，将其施加到Ni-NTA柱(His-Select^TM Nickel Affinity Gel，Sigma)上，所述Ni-NTA柱用在缓冲液(50mM NaH₂PO₄，0.3M NaCl，pH 8)和5mM咪唑中的4M尿素进行平衡。用相同的但具有40mM咪唑的平衡溶液洗涤柱，并用250mM咪唑洗脱出蛋白质。洗出液经历使用1×Tris缓冲液(pH 8.4)的透析过程，其中使用孔径为10μm的膜。最后，经由通过0.22μm滤器进行过滤来对蛋白质实施灭菌。

实施例5.通过荧光显微镜检术证明，LALF CPP或其类似物使负载物蛋白质E7内在化到细胞中

在22mm无菌盖玻片上，J774细胞在37℃和5％CO₂下在具有10％灭活的胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640中生长过夜。然后，不同盖玻片独立地与1.66μM LALF-E7融合蛋白、1.66μM E7蛋白和PBS(作为阴性对照)一起于37℃温育30分钟、1小时和2小时。作为阳性对照，还培养了在相同实验条件下维持的CasKi细胞(表达HPV16的人细胞)。在温育后，用PBS轻轻地洗涤细胞，并且在室温下用4％低聚甲醛固定20分钟。用PBS进行3次洗涤。在室温下用0.5％Tritón X-100实施细胞的渗透化15分钟。用PBS进行3次洗涤。然后，在室温下用在PBS中的1％FBS封闭1小时，随后用PBS进行3次洗涤。在室温下，将所述样品与在山羊中获得的并在PBS中稀释(1∶50)的抗-HPV 16E7的IgG多克隆抗体(Santa Cruz)一起温育1小时。然后，在用PBS进行3次洗涤后，在室温下，所述样品在暗室中与在PBS中稀释(1∶50)的、缀合至荧光素的、在驴中获得的抗-山羊IgG抗体(Santa Cruz)一起温育45分钟。最后，在用PBS进行多次洗涤后，用水性封固剂来准备盖玻片，并且使用具有合适滤波器的荧光显微镜进行检查。

所获得的结果(图4)显示，仅在J774细胞与LALF-E7融合物一起进行温育的情况下才出现发荧光的细胞，这类似于在作为阳性对照的CasKi细胞中所获得的结果。在J774与E7以及与PBS进行温育的情况下没有观察到发荧光的细胞。这些结果证明，仅在与LALF相融合的情况下，E7蛋白才达到其内在化到细胞中。

实施例6.通过Western印迹证明，LALF CPP或其类似物使负载物蛋白质E7内在化到细胞中

在22mm无菌盖玻片上，J774细胞在37℃和5％CO₂下在具有10％灭活的胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640中生长过夜。然后，分开成5×10⁶个细胞的3个等分试样。将它们分别与25μM LALF-E7融合蛋白、25μM E7蛋白和PBS一起于37℃温育4小时。然后，细胞以1000rpm离心10分钟。用PBS将粒状沉淀洗涤3次。然后，将细胞重悬浮在100μL RIPA缓冲液(Promega)中，并且经历3个循环的“涡旋振荡10秒和在冰上2分钟”。破碎的细胞12000rpm离心15分钟以分开细胞提取物。测定细胞提取物的蛋白质浓度，并且将10μg总蛋白质施加在15％聚丙烯酰胺电泳凝胶中。然后，将凝胶转移至硝酸纤维素膜，并且使膜在封闭后在室温下与在山羊中获得的并在PBS中稀释(1∶100)的抗-HPV 16E7的IgG多克隆抗体(Santa Cruz)一起温育2小时。用PBS进行3次洗涤。然后，在室温下，使膜在暗室中与在PBS中稀释(1∶5000)的缀合至过氧化物酶的抗-山羊IgG抗体(Sigma)一起温育45分钟。在进行多次洗涤后，使用AmershamPharmacia Biotech的ECL系统来进行揭示。如在图5中所观察的，在细胞与蛋白质的短的体外温育时间后，能够从J774细胞内部中提取出足够量的融合蛋白(LALF-E7)，所述融合蛋白被抗-E7抗体所识别。但是，在其中施加了与E7蛋白和PBS一起温育的细胞的提取物的泳道中未检测到任何识别。

实施例7.通过荧光显微镜检术证明，LALF CPP或其类似物使负载物蛋白质GFP内在化到细胞中

将由LALF-GFP(GFP表示绿色荧光蛋白)重组融合物开始在大肠杆菌中获得的蛋白质用于验证，LALF CPP或其类似物能够使货物蛋白质内在化。

使用具有SEQ ID NO.11和12的寡核苷酸，采用聚合酶链反应从Clontech的质粒pEGFP-N1获得GFP(GenBank登录号U55762)。

这两个寡核苷酸都具有用于进行克隆的限制位点(Hind III-有义，和BamHI-反义)。

为了获得重组融合物，以与实施例III中类似的方式，用T4连接酶将LALF合成片段和通过PCR获得的GFP基因插入到载体pM238中。用SEQ ID NO.13和14来鉴定重组克隆。

在获得经纯化的重组蛋白质LALF-GFP后，实施与实施例V类似的实验，但是在该情况下，将J774细胞与LALF-GFP、生物素化的LALF、GFP和PBS一起进行温育。

所获得的结果(图6)显示，当J774细胞与LALF-GFP融合物一起温育时出现发荧光的细胞，非常类似于用生物素化的LALF而获得的结果。对于J774与GFP以及与PBS一起温育，未观察到发荧光的细胞。这些结果证明，仅当它与LALF相融合时，负载物蛋白质(在该情况下为GFP)才达到其内在化到细胞中。

实施例8.用LALF CPP或其类似物与E7的融合物来治疗在小鼠中建立的肿瘤

为了观察从用重组的LALF-E7融合蛋白进行治疗开始的所建立的肿瘤的消退并评价所述消退的强度，使用表达HPV-16的E7蛋白的TC-1肿瘤细胞系。如Lin等人，(1996)Treatment of establishedtumors with a novel vaccine that enhances majorhistocompatibility class II presentation of tumor antigen.Cancer Res.56：21-26中所描述的，通过用HPV-16的E 6和E 7基因以及活化的人c-Ha-ras基因对细胞进行永生化和转化，从C57BL/6小鼠的肺细胞原代培养物衍生得到所述表达HPV-16的E7蛋白的TC-1肿瘤细胞系。为了肿瘤的接种，使由Dr.T.-C.Wu(The Johns HopkinsMedical Institutions，Baltimore，Md.)提供的TC-1细胞于37℃在RPMI 1640培养基中生长至60-70％的汇合，所述RPMI 1640培养基补充有10％胎牛血清、非必需氨基酸、谷氨酰胺、丙酮酸盐、庆大霉素、β-巯基乙醇和0.4mg/mL遗传霉素。通过胰蛋白酶消化来收获细胞，并且以2.5×10⁵个细胞/mL重悬浮在Hank′s缓冲液中。

在右后腿中以0.2mL的体积用2×10⁵个TC-1细胞以皮下方式对C57BL/6小鼠进行接种。到10天，当所有动物已发展出可触知的肿瘤时，将动物任意分配成4个治疗组。每个组包括10只动物。每14天进行2次免疫接种。组1用重组蛋白质LALF-E7进行免疫接种；组2用重组的E7蛋白进行免疫接种；组3用合成肽LALF进行免疫接种；和组4用PBS进行免疫接种。以0.2mL的体积，在小鼠的胁腹中以皮下方式进行免疫接种。

通过肿瘤体积来追踪在不同组中的肿瘤动力学，所述肿瘤体积通过使用数字测径器并获取在2个垂直方向的测量来测定。使用公式(长度×宽度²)/2，从该测量来计算肿瘤体积(mm³)。在肿瘤接种30天时每个组的平均体积+/-标准差呈现在图7中。

结果证明，用LALF-E7进行的治疗导致所建立的肿瘤的生长的完全抑制。相比于通过使用E7、LALF和PBS的其他治疗而获得对于肿瘤生长的效应而言，由于使用LALF-E7的治疗而引起的在肿瘤体积减少方面的效应是在统计学上显著的(p＜0.01)。

实施例9.用LALF CPP或其类似物与E7的融合物(LALF-E 7)以及LALF CPP或其类似物与E7的混合物(LALF+E7)来治疗在小鼠中建立的肿瘤

为了研究LALF-E7的抗肿瘤效应是否与这两个分子的共价结合相关，进行了其中小鼠接受LALF和E7治疗的实验，所述LALF和E7在其使用前之时以等摩尔量相混合，这允许与接受LALF-E7融合蛋白的小鼠进行比较。

在该次实施中，在右后腿中用2×10⁵个TC-1细胞以皮下方式对C57BL/6小鼠进行接种。到10天，当所有动物已发展出可触知的肿瘤时，将动物任意分配成5个治疗组。每个组包括10只动物。

每14天进行2次免疫接种。组1用LALF-E7融合蛋白进行免疫接种；组2用混合物LALF+E7进行免疫接种；组3用LALF进行免疫接种；组4用E 7进行免疫接种；和组5用PBS进行免疫接种。以0.2mL的体积，在小鼠的胁腹中以皮下方式进行免疫接种。通过肿瘤体积来追踪在不同组中的肿瘤动力学，所述肿瘤体积如先前在实施例8中所描述的来进行测定和计算。在肿瘤接种30天时每个组的平均体积+/-标准差呈现在图8中。

所获得的结果证明，仅对于用LALF-E7共价融合物治疗小鼠的情况才观察到在肿瘤体积减少方面的效应，LALF-E7共价融合物的结果相比于由于用LALF+E7的混合物、LALF、E7和PBS进行治疗而导致的体积而言是在统计学上显著的(p＜0.01)。

实施例10.药物制剂诱导细胞免疫应答的能力的比较

为了评估针对HPV-16的E7抗原的细胞免疫应答，具有出生6至8周的3只雌性C57BL/6小鼠的4个组接受2个剂量的免疫原。

组1用30μg重组蛋白质LALF-E7进行免疫接种；组2用30μg重组蛋白质E 7进行免疫接种；组3用8μg合成肽LALF进行免疫接种；和组4用PBS进行免疫接种。用0.2mL的体积且不用佐剂，在动物的胁腹中以皮下方式进行免疫接种。每14天施用2个剂量。在第二次免疫接种后7天，通过颈部脱位来处死小鼠，并且无菌地取出脾细胞，以用于随后在抗-干扰素γ(抗-IFN-γ)ELISPOT测定法中对其进行分析。将每组动物的细胞悬浮液合并成汇集物，并且轻轻地进行均质化。洗涤脾细胞，并且用0.83％NH₄Cl溶液裂解红细胞。然后，进行洗涤，并最后重悬浮在补充有10％胎牛血清(FBS)和10U/mL人IL-2(hIL-2)的新鲜RPMI 1640培养基中。将不表达HPV-16E7的表位的EL4小鼠细胞(H-2^b)用作靶细胞，其事先用肽⁴⁹RAHYNIVTF⁵⁷以10μM的浓度进行脉冲，所述肽相应于C57BL/6小鼠的CTL表位，H-2^b(Feltkamp M.C.等人，(1993)Vaccination with cytotoxic Tlymphocyte epitope containing peptide protects against a tumorinduced by human papillomavirus type 16-transformed cells.Eur.J.Immunol.23：2242-2249)。然后，将所述细胞悬浮在补充有10％FBS和hIL-2的RPMI 1640中，其用作抗原呈递细胞。还包括未经脉冲的EL4细胞以用于测定分泌IFN-γ的细胞的背景。

如先前所描述的(Vazquez-Blomquist D.等人，(2002)Inductionof a strong HIV-specific CD8+T cell response in mice using afowlpox virus vector expressing an HIV-1 multi-CTL-epitopepolypeptide.Viral Immunol.5(2)：337-356)，进行用于测定IFN-γ的分泌的测定法。用100μL 5μg/mL捕获Ab覆盖其底部盖有硝酸纤维素纸的96孔平板，并且于4℃温育过夜。在用PBS洗涤3次后，平板于37℃用补充有10％FBS的RPMI 1640封闭1小时。脾细胞(10⁶个，2×10⁵个，和4×10⁴个细胞/孔)和EL4靶细胞(10⁵/孔)分别以0.2mL的终体积进行添加，并且一式两份地在37℃和5％CO₂下共温育17小时。在温育后，进行标准的ELISPOT测定法(Vazquez-BlomquistD.等人，(2002)Induction of to strong HIV-specific CD8+T cellresponse in mice using to fowlpox virus vector expressing anHIV-1 multi-CTL-epitope polypeptide.Viral Immunol.5(2)：337-356)。为了测定在体外经再刺激的淋巴细胞，将每种条件的2.8×10⁷个脾细胞与用所述肽加载的EL4靶细胞和与hIL-2一起于37℃在具有5％CO₂的湿润气氛中温育7天。在这个时间后，计数存活的细胞，并用于在相同条件下的ELISPOT的测定。

结果表示为斑点形成细胞(Spot Forming Cells，SFC)的数目/10⁶个脾细胞。由借助于体视镜的斑点计数来获得SFC的数目，以及通过使它们的数目与每个孔中经温育的细胞的数目相关联来获得频率。

为阴性对照(不含肽的EL4)的两倍加上10SFC的那些值被认为是阳性的。

如图9中所显示的，相对于其余的免疫接种组而言，在用LALF-E7进行免疫接种的组中，分泌γ-IFN的效应细胞(SFC)的数目高至大约8倍。这些结果证明，在用LALF-E7治疗的动物中存在有CD8淋巴细胞的有效应答。

序列表

<110>Center for Genetic Engineering and Biotechnology

<120>细胞穿透肽及其与具有治疗作用的生物分子相融合的用途

<130>patent

<140>

<141>

<160>14

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：LALF CPP

<400>1

His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys

1 5 10 15

Gly Lys Phe Trp

20

<210>2

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：类似物L-2

<400>2

His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys

1 5 10 15

Gly Lys Phe Trp

20

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：类似物L-8

<400>3

His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys

1 5 10 15

Gly Lys Phe Trp

20

<210>4

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：类似物L-12

<400>4

His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys

1 5 10 15

Gly Lys Phe Trp

20

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：类似物L-20

<400>5

His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys

1 5 10 15

Gly Lys Phe Ala

20

<210>6

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的LALF CPP基因

<400>6

catggcggaa ttccattatc gtatcaaacc gacctttcgt cgtctgaaat ggaaatataa 60

aggcaaattt tggaa 75

<210>7

<211>299

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的HPV 16 E7基因

<400>7

agcttcacat ggagatacac ctacattgca tgaatatatg ttagatttgc aaccagagac 60

aactgatctc tacggttatg agcaattaaa tgacagctca gaggaggagg atgaaataga 120

tggtccagct ggacaagcag aaccggacag agcccattac aatattgtaa ccttttgttg 180

caagtgtgac tctacgcttc ggttgtgcgt acaaagcaca cacgtagaca ttcgtacttt 240

ggaagacctg ttaatgggca cactaggaat tgtgtgcccc atctgttctc agaaaccag 299

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于测序的Oligo

<400>8

ttatggtttc tgagaacaga tggggca 27

<210>9

<211>405

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：LALF CPP-E7基因融合物

<400>9

atggcggaat tccattatcg tatcaaaccg acctttcgtc gtctgaaatg gaaatataaa 60

ggcaaatttt ggaaagcttc acatggagat acacctacat tgcatgaata tatgttagat 120

ttgcaaccag agacaactga tctctacggt tatgagcaat taaatgacag ctcagaggag 180

gaggatgaaa tagatggtcc agctggacaa gcagaaccgg acagagccca ttacaatatt 240

gtaacctttt gttgcaagtg tgactctacg cttcggttgt gcgtacaaag cacacacgta 300

gacattcgta ctttggaaga cctgttaatg ggcacactag gaattgtgtg ccccatctgt 360

tctcagaaac caggatcccg ggcacaccat caccatcacc attaa 405

<210>10

<211>134

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：LALF CPP-E7蛋白质融合物

<400>10

Met Ala Glu Phe His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys

1 5 10 15

Trp Lys Tyr Lys Gly Lys Phe Trp Lys Ala Ser His Gly Asp Thr Pro

20 25 30

Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu

35 40 45

Tyr Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile

50 55 60

Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile

65 70 75 80

Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln

85 90 95

Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr

100 105 110

Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Gly Ser Arg Ala

115 120 125

His His His His His His

130

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Oligo引物PCR-GFP

<400>11

ccaagcttca gtgagcaagg gcgaggagct 30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Oligo引物PCR-GFP

<400>12

cgggatccct tgtacagctc gtccatgccg 30

<210>13

<211>828

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：LALF CPP-GFP基因融合物

<400>13

atggcggaat tccattatcg tatcaaaccg acctttcgtc gtctgaaatg gaaatataaa 60

ggcaaatttt ggaaagcttc agtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 120

atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 180

gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 240

cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 300

taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 360

caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 420

ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 480

ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 540

gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 600

ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 660

ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 720

aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 780

gacgagctgt acaagggatc ccgggcacac catcaccatc accattaa 828

<210>14

<211>275

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：LALF CPP-GFP蛋白质融合物

<400>14

Met Ala Glu Phe His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys

1 5 10 15

Trp Lys Tyr Lys Gly Lys Phe Trp Lys Ala Ser Val Ser Lys Gly Glu

20 25 30

Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp

35 40 45

Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala

50 55 60

Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu

65 70 75 80

Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln

85 90 95

Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys

100 105 110

Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys

115 120 125

Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp

130 135 140

Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp

145 150 155 160

Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn

165 170 175

Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe

180 185 190

Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His

195 200 205

Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp

210 215 220

Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu

225 230 235 240

Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile

245 250 255

Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Ser Arg Ala His His His

260 265 270

His His His

275

Claims

1.包含细胞穿透肽的组合物，其中所述肽可以是LALF，其类似物L-2、L-8、L-12和L-20或者经修饰的LALF，该肽与生物分子相联合。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述细胞穿透肽与所述生物分子的联合通过共价结合或者缀合来实现。

3.根据权利要求1和2的组合物，其中所述细胞穿透肽与抗原相联合。

4.根据权利要求3的组合物，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或肿瘤抗原。

5.根据权利要求4的组合物，其中所述抗原是HPV抗原。

6.根据权利要求5的组合物，其中所述HPV抗原是E6和E7蛋白。

7.根据权利要求2的组合物，其中与抗原相联合的细胞穿透肽与佐剂相混合。

8.根据权利要求7的组合物，其中所述佐剂是不完全佐剂、完全佐剂或具有多肽性质的佐剂。

9.根据权利要求1和6的细胞穿透肽，其特征在于，涉及LALF肽与HPV 16的E7蛋白的融合物，该融合物具有SEQ ID NO.10。

10.根据前述权利要求的药物组合物的用途，所述用途为用于通过以有效量施用给人来诱导针对HPV蛋白质抗原的免疫应答。

11.治疗表达HPV蛋白质抗原的肿瘤的方法，其包括给人施用有效量的前述权利要求的组合物，以增强针对HPV的细胞免疫应答。