CN101791540A - 层析颗粒介质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及层析颗粒介质的制备方法，特别是利用二步聚合反应制备层析颗粒的方法。该方法包括介质单体混合物中的介质单体及交联剂溶解于被悬浮在连续相中的液体液滴中，并聚合成颗粒。该颗粒内含有大量拥有至少一个未反应或如双键的自由反应基团的交联剂。所述的颗粒被悬浮在功能单体的溶液中，颗粒上自由反应基团与功能单体反应形成具有功能基团的层析颗粒。

Description

层析颗粒介质的制备方法

本申请是申请号为200410038843.7，申请日为2004年4月30日，发明名称为“层析颗粒介质的制备方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及制备层析分离介质的方法，特别是制备层析颗粒的聚合反应方法。

背景技术

用于层析技术的多聚物颗粒可通过双相悬浮聚合反应合成。如美国专利4,340,483，48711824和6,423,666。具体方法是在双相悬浮系统的连续相中，悬浮液相形成的液滴为单体混合物，其由一种或多种可聚合的单体及交联剂组成并在液滴中聚合。如单体混合物由水溶性的单体及水溶性的交联剂组成时，至少部分与水不溶的有机液体被用作悬浮反应的连续相。相反，为悬浮相为非溶于水的单体及非溶于水的交联剂组成的混合物。水则作为悬浮聚合反应的连续相。而可聚合的单体可带有各种特殊的功能基团，如可离子化的化学基团可用作离子交换树脂，带不同长度的烃链(碳氢链)用于疏水作应和反相层析树脂。可聚合的单体也可带有反应基团，并在填充颗粒形成后衍生成各种特性，如美国专利U.S.Pat.No.4,340,483所使用的甘氨酰甲基丙烯酸甲脂中的环氧基团。多聚物颗粒的硬度决定于交联剂在单体混合物中的相对浓度。为美国专利U.S.Pat.No.4,340,483所描述交联剂占总单体混合物的克分子比可从0.3到0.97。对于像蛋白，核酸等类大分子很难扩散到用此方法合成的多聚物内。故大分子只能与多聚物表面的功能基团结合。因此，用以上方法合成的多聚物层析介质常表现出低载量，低溶质扩散性，低生产率。

发明内容

为了克服现有技术的不足之处，本发明提供了一种利用二步聚合反应法制备层析颗粒介质的方法。

第一步，介质单体混合物中的介质单体和交联剂在双相悬浮系统中聚合成颗粒。交联剂相对于介质单体混合物的相对克分子比为0.5到1.0。由于在介质单体混合物中含有大量的交联剂，而且由于立体构象的限制，大部分交联剂中只有其中一个反应基团(如双键)能参与聚合反应，而留下第二个没反应的自由的反应基团。多聚物颗粒被收集并清洗。

第二步，上述带有大量自由反应基团的(如双键)颗粒悬浮在带功能基团的单体溶液中并通过聚合反应使多聚物的自由反应基团与功能单体一起聚合，所使用的功能单体的一端可共价地连接着各种不同的功能基团。功能单体即可为水溶性或非水溶性单体。由于功能单体为小分子化合物，容易扩散进多聚物的内部并与其没反应或自由的反应基团一起聚合。

本发明方法最大的优势是可通过控制起始剂的浓度及聚合反应的温度有效地控制功能单体的聚合反应，而且水溶性及非水溶性的单体均可用于第二步的聚合反应。经第二步聚合反应后，功能单体聚合成长链状，高密度的功能基团并共价性地连接在多聚物表面形成一层厚的结合层，为溶质的结合提供大量的结合位点，从而提高了层析介质的载量和生产率。

因此，一方面，本发明还提供了一种制备具通透性孔的层析分离介质的方法，该方法包括：(a)形成由水溶液液滴及有机连续相组成的悬浮系统，所述的水溶液由介质单体混合物溶于水组成，所述的介质单体混合物由水溶性的可聚合的化合物与水溶性至少拥有二个反应基团的交联剂组成，所述的介质单体混合物在水溶液中的重量百分比浓度为2％至50％。交联剂占总介质单体混合物的克分子比为0.5至1.0，所述的有机连续相为至少部分不混溶于水的有机溶剂；(b)所述的液滴由可聚合的化合物和交联剂组成，并通过聚合反应形成带通透性孔的固体多孔颗粒，所述的交联剂至少带一个自由反应基团；(c)清洗固体多孔颗粒以去除有机溶剂和未聚合的水溶性可聚合化合物以及水溶性交联剂；(d)使功能单体与固体多孔颗粒中至少一个交联剂上自由反应基团反应。在具体应用中，反应基团是双键。

在另一方面，本发明提供了一种制备具通透性孔的层析分离介质的方法，该法包括：(a)形成由有机溶液液滴及水为连续相组成的悬浮系统，有机溶液由介质单体混合物溶于至少部分不混溶于水的有机溶剂成，所述的介质单体混合物由非水溶性的可聚合的化合物与非水溶性至少拥有二个反应基团的交联剂组成，介质单体混合物在有机溶液中的重量百分比浓度为2％至50％，交联剂占总介质单位混合物的克分子比为0.5至1.0；(b)所述的液滴由可聚合的化合物和交联剂组成，并通过聚合反应形成具通透性孔的固体多孔颗粒，交联剂拥有至少一个自由反基团；(c)清洗固体多孔颗粒以去除水及未聚合的非水溶性可聚合化合物以及非水溶性交联剂；(d)使功能单体与固体多孔颗粒中至少一个交联剂上自由反应基团反应。

优选地，本发明提供了一种制备具通透性孔的层析分离介质的方法，其包括以下步骤：(a)形成由水溶液液滴-有机连续相组成的悬浮系统，该水溶液由介质单体混合物溶于水组成，介质单体混合物包括水溶性的可聚合化合物与水溶性至少拥有二个双键的交联剂，介质单体混合物在水溶液中的重量百分比浓度为2％到50％，交联剂占总介质单体混合物的克分子比为0.5至1.0，有机连续相为至少部分不混溶于水的有机溶剂；(b)液滴由可聚合的化合物和交联剂的水溶液组成，并通过聚合反应形成带通透性孔的固体多孔颗粒，其中该交联剂在经过聚合反应形成的固体多孔颗粒后，至少带有一个自由双键；(c)清洗固体多孔颗粒以除去有机溶剂，未聚合的水溶性可聚合化合物以及水溶性交联剂；(d)使溶于水的功能单体与固体多孔颗粒中至少一个交联剂上的自由双键反应。

本方法具体实施方案中，交联剂的反应基团为双键，在一些实施例中，颗粒内通透性孔的平均直径是0.1微米或小于0.1微米，在另一些实施例中，颗粒内通透性孔的平均直径为0.1微米至0.5微米，或大于0.5微米，在一些实施例中，交联剂占介质单体混合物的克分子比为大约0.7到0.9。

具体实施方式

除非另外说明，下面使用的所有科技术语和本领域内的通用术语具有同样的意义。本文中所引用的所有专利、文章等都可以在参考文献中找到全文。如果本文中的术语和所引用的文章中不一样，以本申请的术语为准。

本发明的颗粒经二步聚合反应方法合成。本发明的颗粒为不溶于水及许多有机溶剂的固体，并作为层析柱中的填充材料用作层析分离介质仍保持固体状态。本颗粒可像其他层析柱内的固体颗粒填充材料一样使用。

聚合反应步骤的第一步需要一个双相悬浮体系：包括有机相和水相，如有机相为连续相，水相则被分散在有机相中，溶于水相中的水溶性可聚合的化合物及水溶性交联剂混合物经聚合后形成颗粒。如水相为连续相，有机相则被分散在水相中，溶于有机相中的非水溶性可聚合化合物及非水溶性交联剂混合物经聚合后形成颗粒。

如上描述，介质单体混合物既可为由水溶性可聚合化合物和水溶性交联剂组成的混合物，或为由非水溶性可聚合化合物和非水溶性交联剂组成的混合物，介质单体混合物的重量百分比浓度为2％至大约50％，在一些实施例中，介质单体混合物的重要百分比浓度为约20％至约40％。交联剂占介质单体混合物的克分子比可以为0.5至1.0，优选为0.7至0.9，更优选为0.75至0.85(如0.75)。

可聚合化合物通常是单体其聚合后形成颗粒的多聚物介质，形成多聚物颗粒使用的可聚合化合物包括乙烯基，烯丙基和异丁烯基化合物，水溶性的化合物包括乙烯乙脂，乙烯醇，乙烯丙二醇，乙烯吡咯啉酮，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，羟乙基甲基丙烯酸酯，羟丙基甲基丙烯酸酯，羟丙基丙烯酰胺，非水溶性化合物包括苯乙烯，羟基苯乙烯，羟甲基苯乙烯，羟基酚基，甲基丙烯酰胺，丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸酯。

可用于本发明的交联剂拥有至少二个反应基团(如二个双键)，并与可聚合化学物反应中直到交联作用。任何双功能交联剂均可使用。水溶性的交联剂为双丙烯酰胺，如N，N’-亚甲双丙烯酰胺和哌嗪双丙烯酰胺，非水溶性的交联剂为双丙烯脂，异丁烯脂或双乙烯基类，如丙烯基甲基丙烯酸酯，双丙烯基醚亚乙基双丙烯酸酯，亚乙基双甲丙烯酸酯，1，3-二丙烯氧基-2-丙醇和二乙烯基苯。

经聚合反应及交联后所形成颗粒中孔的直径决定于多聚物的疏水性及介质单体溶剂的极性。在一些具体表现，孔的平均直径为0.1微米或小于0.1微米。孔的大小也可通过在介质单体溶剂中加入孔诱发剂进一步控制。

当使用孔诱性剂时，用的量并不苛刻，其最佳使用量可根据使用的诱发剂而改变。在每个实例中，其最佳用量本领域技术人员能很容易地在通过常规实验来决定。适用于水相中介质单体混合物的孔诱发剂包括(但不局限于)乙二醇，聚乙二醇，聚氧乙烯，多糖类如葡聚糖，和极性溶剂。极性溶剂包括常用于化学合成或高分子化学和一些已知技术。极性溶剂可以是醇，酮，四氢呋喃，二甲基甲酰胺，二乙基砜，甲基吡咯啉酮以及它们的混合物。适用于有机相中介质单体混合物的孔诱发剂包括(但不局限于)甲苯，己烷，四氯乙烯或它们的混合物。这类孔诱发剂也可用作有机相中介质单体混合物的有机溶剂。

用于水溶性介质单体及交联剂悬浮聚合反应的有机连续相中的有机溶液为至少部分不混溶于水的有机溶液，并对水相中的介质单体混合物不起化学作用。任何符合上述性质的广泛的有机溶液均可使用。此类溶液包括开链碳化合物溶液，芳香族溶液及其他化学类型，其中石蜡族(链烷)和异链烷烃类溶液最佳。同样，任何至少部分不混溶于水并能溶解非水溶性单体混合物的有机溶剂均可用于以水为连续相的有机悬浮相，此类有机溶剂如甲苯，乙烷，四氯乙烯或它们的混合物。

为使悬浮系统稳定，可在连续相中加入悬浮剂或乳化剂，任何能溶于连续相中非离子形悬浮剂或乳化剂均可使用，如山梨聚糖的衍生物，乙氧基烷基酸类和聚乙氧基醚类。

聚合反应与常规的悬浮聚合反应步骤一样，单体以分散形式悬浮于连续相中，聚合反应的起始剂或催化剂溶于介质单体混合相中，现有技术中公知的聚合反应起始剂均可用于发明，如能产生自由基的起始剂，起始剂的浓度(占介质单体混合液的百分比浓度)为约0.1％至约2％，最好是0.8至1.2％，适用于水溶性单体的起始剂包括(但不局限于)过硫酸铵/四甲基乙二胺(TEMED)，2.2’-偶氮基双(2-氨丙基)盐酸盐，2，2’-偶氮双(N，N’-二亚甲基异丁基胺)，4.4’-偶氮双(4-氰基戊酸)，适用于非水溶性单体的引发剂包括(但不局限于)，2，2’-偶氮双(2.4-二甲基戊腈)，2，2’-偶氮双异丁腈，二甲基2，2’-偶氮双异丁脂，1，1’-偶氮双(1-环己烷羰基腈)，和2，2’-偶氮双(2-甲基丁腈)。

介质单体混合相与连续相分别配制，然后经搅拌混合直至平衡，悬浮相液滴的大小可通过控制搅拌的方法，力度和乳化剂的用量。本发明中，液滴的大小并没有限制，例如悬浮液滴可以为20微米至200微米。一旦悬浮系统形成后，通过增加温度及吹入氮气至聚合反应完成。

聚合反应完成后，颗粒经收集，清洗以去除悬浮溶剂及没参加反应的化合物。

本发明的第二步，以上带大量没参与反应或自由反应基团(如双键)被悬浮在功能单体溶液当中，功能单体以共价键形式连接着不同的功能基团，功能单体既可为水溶性或非水溶性单体。

功能单体可为已知的，用于层析分离技术上作为吸附剂任何单体(如亲和，疏水相互作用，离子交换等。)此类单体包括(但不限于)非离子型单体，离子型单体，亲水单体，疏水单体和易反应单体。易反应单体是指单体上拥有特殊的功能基团可通过与其它分子发生化学反应并使其不可逆地连接到多聚物链上，用于本发明的功能单体包括链烃化合物，芳香族化合物或杂环化合物，但它们必须拥有可聚合反应的基团(如双键)。举例如，丙烯基，烯丙基，乙烯基化合物或类似化合物。

更明确地说，阴离子型的单体用作形成阴离子性的吸附剂(如阳离子交换介质)。用于阳离子交换介质的功能基团(如连接在乙烯基单体上的)包括羧基(如丙烯酸)，磺酸基，(如：丙烯酰胺基甲基丙磺酸，乙烯磺酸，和烯丙氧羟丙基磺酸)或磷酸基团(如，N-磷酸乙基丙烯酰胺)。

阳离子型的单体用作形成阳离子性的吸附剂包括以下功能基团，如氨基(如二乙氨乙基异丁烯酰胺，三甲氨乙基异丁烯酰胺，二烯丙基二甲基氯化胺，和烯丙基二甲氨)。

疏水型单体用于形成疏水作应吸附剂包括辛基丙烯酰胺，辛基异丁烯酰胺，苯基丙烯酰胺和丁基丙烯酰胺。

活性单体用于亲和层析上形成预活化基团(这些预活性基团可进一步与新需配基结合)。包括脱水甘油丙烯酸酯，脱水甘油甲基丙烯酸酯，丙烯基脱水甘油醚，丙烯醛，丙烯酰胺基丁醛，二甲基乙缩醛，丙烯酸酐，丙烯酰氯N-丙烯酰琥珀酰亚胺和丙烯氯甲酸酯。

功能单体在溶剂中的重量百分比浓度为2％至80％。在具体应用中可以是20％至60％，溶剂可为水，水和有机溶液混合液或有机溶液，聚合反应所用的引发剂或催化剂加入到单体溶液中，起始剂的浓度可从0.2％至5％。前面所讨论过的引发剂均可用于功能单体与多聚物颗粒中保留的反应基团(如没参加聚合反应的双键)发生聚合反应。多聚物颗粒与功能单体溶液混合并通过搅拌使悬浮液稳定。颗粒在功能单体溶液中的体积百分比为10％至80％，最好是30％至60％(V/V)悬浮液经加温并吹进氮气至聚合反应完成。

实施例

以下将通过实施例进一步非限定性地说明本发明。

实施例一用水溶性单体及水溶性交联剂制备层析颗粒

用水溶性单体及水溶性交联剂制备层析颗粒描述如下

第一步，制备带双键的基础颗粒

用以下化合物配制水溶液，

水                    22.5毫升

甲基吡咯啉酮           7.5毫升

N，N’-亚甲基双丙烯酰胺  4.5克

羟丙基异丁烯酯         1.5毫升

4.4’-偶氮双(4-氰戊酸)  30毫克

(水溶液用65℃溶解所有单体后加入起始剂)

亚甲基双丙烯酰胺和羟丙基异丁烯酯的总和占总溶液的重量百分比为21.0％。交联剂占总单体的克分子比为0.75。溶液与由200毫升isoparH和2毫升sp-80组成的有机溶液混合。在65℃下用250rpm搅拌10分钟吹入氮气。聚合反应可在15分钟内发生，温度因反应的放热而在25分钟内增加至75℃。20分钟后停止吹入氮气，并保持搅拌二小时，合成的颗粒经回收，甲醇清洗及55℃干燥。

第二步，制备用于阳离子交换介质的层析颗粒。

用来自第一步的基础颗粒制备阳离子交换介质，其由以下化合物组成

水                        100毫升

丙烯酸钠                  8克

干燥基础颗粒              4克(水合状态约为25毫升)

过硫酸铵                  500毫克

NNN’N’-四甲基乙二胺     1毫升

丙烯酸钠占总溶液的重量百分比浓度为8％，基础颗粒占总溶液的重量百分比为4％，溶液在室温下用80rpm搅拌15分钟，吹入氮气，聚合反应大约在5分钟内开始，并在10分钟内温度升至30℃，15分钟后停止氮气并继续搅拌2小时，反应后的颗粒回收并清洗。

制备用于疏水反应介质的层析颗粒。

用来自第一步的基础颗粒制备疏水反应介质，由以下化合物组成

甲基吡咯啉酮            100毫升

丁基丙烯酰胺            4克

干燥基础颗粒            4克

2.2’-偶氮双(2-甲基丁腈)400毫克

丁基丙烯酰胺占总溶液的重量百分比浓度为4％，基础颗粒占总溶液的重量百分比为4％，溶液在85℃下用80rpm搅拌15分钟，吹入氮气。聚合反应大约在5分钟内开始，并在10分钟内温度到达89℃，15分钟后停止氮气并继续搅拌2小时，反应后的颗粒回收并清洗。

实施例二用非水溶性单体及非水溶性交联剂制备层析颗粒。

用非水溶性单体及非水溶性交联剂制备层析颗粒描述如下

第一步，制备带双键的基础颗粒

用以下化合物配制有机溶液：

甲苯                10毫升

二乙烯基苯          7毫升

苯乙烯              2.4毫升

2.2’-偶氮双异丁腈  40毫克

二乙烯基苯和苯乙烯的总和占总溶液的重量百分比为43％，交联剂占总单体的克分子比为0.75。溶液与由150毫升水，7克PA-18(聚乙烯醇)和2毫升油酸钠组成的水溶液混合，在65℃下用300rpm搅拌10分钟，吹入氮气20分钟，并保持搅拌6小时，合成的颗粒经回收，甲醇清洗并55℃干燥。

第二步，制备具环氧基活性基团的层析颗粒。

用来自第一步的基础颗粒制备具环氧基活性基团的介质，由以下化合物组成：

甲基吡咯啉酮            100毫升

缩水甘油醚              10毫升

干燥基础颗粒            6克

2.2’-偶氮双(2-甲基丁腈)400毫克

缩水甘油醚占总溶液的重量百分比浓度为10％，基础颗粒占总溶液的重量百分比为6％，溶液在85℃下用80rpm搅拌15分钟，吹入氮气。聚合反应在15分钟内开始。30分钟后停止氮气并继续搅拌2小时，反应后的颗粒回收并清洗。

制备用于阴离子交换介质的层析颗粒。

用来自第一步的基础颗粒制备阴离子交换介质，由以下化合物组成：

甲基吡咯啉酮            50毫升

水                      50毫升

二乙氨乙基异丁烯酰胺    10毫升

干燥基础颗粒            6克

4’4-偶氮双(4-氰基戊酸) 400毫克

二乙氨乙基异丁烯酰胺占总溶液的重量百分比浓度为9％，基础颗粒占总溶液的重量百分比为6％，溶液在85℃下用80rpm搅拌15分钟吹入氮气。聚合反应在15分钟开始，30分钟后停止氮气并继续搅拌2小时，反应后的颗粒回收并清洗。

Claims (20)

1.一种制备具通透性孔的层析分离介质的方法，其包括以下步骤：

a)形成由水溶液液滴-有机连续相组成的悬浮系统，该水溶液由介质单体混合物溶于水组成，介质单体混合物包括水溶性的可聚合化合物与水溶性至少拥有二个双键的交联剂，介质单体混合物在水溶液中的重量百分比浓度为2％到50％，交联剂占总介质单体混合物的克分子比为0.5至1.0，有机连续相为至少部分不混溶于水的有机溶剂；

b)液滴由可聚合的化合物和交联剂的水溶液组成，并通过聚合反应形成带通透性孔的固体多孔颗粒，其中该交联剂在经过聚合反应形成的固体多孔颗粒后，至少带有一个自由双键；

c)清洗固体多孔颗粒以除去有机溶剂，未聚合的水溶性可聚合化合物以及水溶性交联剂；

d)使溶于水的功能单体与固体多孔颗粒中至少一个交联剂上的自由双键反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其中固体多孔颗粒内通透性孔的平均直径为小于等于0.1微米。

3.根据权利要求1所述的方法，其中介质单体混合物含有孔诱发剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其中孔诱发剂选自乙二醇，聚乙二醇，聚氧乙烯或多糖。

5.根据权利要求1所述的方法，其中交联剂占总介质单体混合物的克分子比为0.7至0.9。

6.根据权利要求1所述的方法，其中介质单体混合物在水溶液中的重量百分比浓度为20％至40％。

7.根据权利要求1所述的方法，其中可聚合化合物为乙烯基，烯丙基，丙烯基和异丁烯基化合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中可聚合化合物选自乙烯乙脂，乙烯醇，乙烯丙二醇，乙烯吡咯啉酮，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，羟乙基甲基丙烯酸酯，羟丙基甲基丙烯酸酯，羟丙基丙烯酰胺。

9.根据权利要求1所述的方法，其中交联剂是双丙烯酰胺。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述交联剂是N，N’-亚甲双丙烯酰胺或哌嗪双丙烯酰胺。

11.根据权利要求1所述的方法，其中有机溶剂是直链烷烃液体和支链烷烃液体。

12.根据权利要求1所述的方法，其中有机溶剂中还包含溶于有机溶剂的乳化剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中乳化剂选自山梨聚糖的衍生物，乙氧烷基酚和聚乙氧基醚。

14.根据权利要求1所述的方法，其中介质单体混合物还包含一种聚合反应起始剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中聚合反应起始剂包括过硫酸铵/四甲基乙二胺，2，2’-偶氮双(2-氨基丙烷)盐酸盐，2，2’-偶氮双(N，N’-二亚甲基异丁基丙烯酰胺)和4，4’-偶氮双(4-氰基戊酸)。

16.根据权利要求1所述的方法，其中功能单体含有阴离子功能基团，其包括羧基，磺酸基和磷酸基。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，阴离子功能基团是丙烯酸。

18.根据权利要求1所述的方法，其中功能单体含有阳离子功能基团，其包括二乙氨乙基异丁烯酰胺，三甲氨乙基异丁烯酰胺，二烯丙基二甲基氯化胺和烯丙基二甲氨。

19.根据权利要求1所述的方法，其中功能单体溶于溶液中，溶液还含有一种聚合反应起始剂。

20.根据权利要求1所述的方法制备的颗粒状层析分离介质。