CN101768559B - 副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株及其抑菌组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株及其抑菌组合物和用途。本发明SG96菌株微生物的保藏编号为CGMCC2697。本发明菌株可以抑制大肠杆菌(Escherichia coli)及沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等病原菌的生长，甚至有杀菌效果；本发明还公开了包含该副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的抑菌组合物，该组合物可以制备成动物饮水添加物、动物饲料添加物、动物用及人类用医疗组合物、食品添加物、饮料添加物、食品、饮品、健康食品等形式。

Description

副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株及其抑菌组合物和用途

技术领域

本发明涉及一种副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei)SG96菌株，特别是涉及一种可以抑制大肠杆菌(Escherichiacoli)及沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等病原菌的副干酪乳杆菌副干酪亚种微生物株，以及含有该副干酪乳杆菌副干酪亚种的抑菌组合物及该组合物的用途，属于微生物领域。

背景技术

近几十年来，由于人口快速增加、物质生活水准大幅提升，人们对肉品的需求量大增，为了满足市场需求，许多经济动物的饲养逐渐具规模，尤其是落后国家对于食物进口的能力较低，因而大量高密度或大面积饲养经济动物，导致许多疾病在动物间快速散播。为了改善经济动物生病问题或让经济动物快速生长，长期以来的作法是在饲料中添加抗生素或对动物施打抗生素，结果导致大量耐药菌株的产生。

1960年代末期，抗生素的出现，使人类在治疗细菌性感染的领域上获得空前胜利，许多原本致命的传染病不再可怕。然而近几年，具抗药性细菌的出现，人类对传染性疾病的忧心与恐惧又再度升高，因为抗生素已经不再是控制病情的万灵丹，具抗药性细菌散播速度更是超出我们的想象。细菌耐药性带来的不仅是疗效的下降甚至无效，而且已经严重影响到人类的健康。四十年前全世界每年死于感染性疾病的人数约为700万，而到了现在，医学科学取得了很大的进步，每年死于感染性疾病的人数却上升到2,000万。当人们长期食用含有抗生素残留的肉、蛋、奶等畜禽食品时，这些抗生素残留会对人体产生有害作用，并在人体中蓄积，导致抗药性菌株不断的发生。

肉品安全的问题最近十年来最受到消费者、农渔畜牧生产者及政府所关注，消费者对肉品安全的持续高度关注，起因于过去几年国内外发生数起令人惊恐的肉品安全事件，例如英国发生的狂牛症、东南亚与中国大陆发生H5N1禽流感等事件。为了顾及肉品食用的安全性，世界各国对抗生素残留引起不良后果问题也相当重视。为了延缓具抗药性菌株问题的发生，1990年中期，一些欧洲国家开始在医疗上及农业上约束、管制抗生素使用，希冀以此方式来降低抗药性菌株产生的速率。欧盟从1995年开始，陆续禁用某些抗生素用于饲料中，并且收到良好的成效，例如，哥本哈根的丹麦兽医实验室研究人员表示，当禁用安巴素(avoparcin)的抗生素后，丹麦嫩鸡消化道中的肠球菌(Enterococcus faecium)对安巴素的抗药性，从1995年的73％降至为2000年的6％。德国与荷兰在同时期的五年内禁用安巴素后，亦显示于动物及人体中的抗药性菌株均减少了，所以，欧盟已于2006年1月开始禁止添加抗生素于饲料中。

在饲料中添加抗生素的目的是促进生长，减少粗饲料，可以提高畜禽的生长效率，但是由于畜禽的生长周期缩短，营养物质的沉淀必然减少，使得畜禽产品特有的风味和品质下降；更为严重的是药物的残留对人类的健康，特别是对儿童在生长期的健康造成严重的危害。因此，于经济动物的饲料中禁用抗生素或逐渐减少抗生素使用种类、用量为世界之潮流。但当抗生素逐步禁用后，也会衍生许多问题，为使畜牧业能正常生产，业者现已能接受利用益生菌剂(Probiotics)作为抗生素代用品的观念，进而采用作为饲料添加剂(Feed additives)。

益生菌主要是乳酸菌，因为乳酸菌可以维持和恢复畜禽消化道的菌群平衡，消除畜禽的应激状态(stress)，提高畜禽的免疫抗病能力，降低发病率。提倡使用乳酸菌发酵的青贮饲料和液体发酵饲料，因为乳酸菌发酵饲料既可以有效的保持饲料的营养成分，提高消化利用率，又可以在发酵过程中消除可致病的肠道病原菌和某些引起人畜共患病的微生物。乳酸菌已被公认为是抗生素非常理想的替代品。

益生菌在畜禽体内的有益作用包括：

1.维持和恢复畜禽消化道内以乳酸菌群为优势菌群的菌群平衡。消除畜禽处于应激状态(stress，如断奶、更换饲料、高温、寒冷、运输、惊吓、疾病等)而造成的消化道内环境失调。抑制有害菌的异常增殖及致病菌的入侵和定殖，预防和治疗腹泻、下痢等消化道疾病，减少或消除体内毒素的产生。对于微生物体系尚未建立的幼畜、雏禽，补充乳酸菌的作用尤其显着。

2.产生非特异性免疫调节因子，提高畜禽免疫抗病能力，降低疾病感染率和死亡率。有效替代抗生素和化学药物，减少药物残留的机率，提升人类的食物品质。

3.补充营养成分，促进畜禽生长。产生消化酶，增强消化吸收能力，显着提高养殖业的产量和效益。

4.减少畜禽粪便中臭味物质，改善养殖场的环境。

5.显着提高奶、肉、蛋的产量，增加了养殖业的效益。

食品安全问题已经引起世界各国政府的高度重视。目前各国政府正积极推广绿色畜牧业，在政策、财力、物力上支援绿色产品的发展。建立绿色养殖的示范基地，扶植绿色畜牧产品的品牌，让绿色产品的经营者能够得到实惠，让消费者能够得到高品质、无公害的安全、绿色畜禽食品，造福于人类。

发明内容

本发明目的之一即在于提供一种副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株，该菌株与现有的副干酪乳杆菌BCRC910220(Lactobacillus paracasei)、以及副干酪乳杆菌副干酪亚种BCRC14001、BCRC16100(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)的种系关系具有明显差异，为新的副干酪乳杆菌副干酪亚种微生物株。

本发明目的之二在于提供一种含有上述新的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96之抑菌组合物，该组合物具有可抑制大肠杆菌(Escherichia coli)及沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等病原菌生长的效果。

本发明目的之三在于将含有上述新的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96的抑菌组合物用作动物饲料或饮水的添加物，以增进动物抵抗病原菌的能力；该抑菌组合物更可进一步作为人类食品、饮品添加物或食品，以增进人体抵抗病原菌的能力。

可达成上述发明目的的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96、含有该SG96菌株的抑菌组合物及其用途，包括有：一新的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株，该菌株筛选自猪只肠道排泄物，经过革兰氏染色分析、API50CHL分析、16S rDNA定序分析、谱系分析后确认为一新颖的副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)微生物株，该副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏编号为CGMCC2697，保藏日期为2008年10月9日。

将本发明所筛选到的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株，分别进行滤纸片琼脂扩散法(disc-agar diffusion)分析以及与病原菌混合培养试验分析，结果显示，本发明SG96菌株可以抑制大肠杆菌(E.coli)及沙门氏菌(S.typhimurium)等病原菌的生长，甚至有杀菌效果。

将本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株配制成水溶液喂食未离乳猪仔，结果显示本发明SG96菌株可明显促进未离乳仔猪体重增加、改善仔猪饲料之换肉率，并具有良好的抗下痢效果，且成效优于一般使用的抗生素，证明本发明SG96菌株具有增进动物抵抗病原菌的能力。

含有本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的抗菌组合物，除可配制为水溶液做为动物饮用水之外，亦可搭配常规的饲料添加物制成技术，以制备成其它形式，包括动物饲料添加物、动物用及人类用医疗组合物、食品添加物、饮料添加物、食品、饮品、健康食品等，经由口服方式为动物及人类所摄取。于一较佳实施例中，该抗菌组合物可制成乳酸锭剂、粉末或颗粒状，并可添加于动物饲料或食品中(如：1吨的饲料添加1公斤粉状或颗粒状的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株(10⁷CFU/g)；或可单独或与其他乳酸菌将乳品发酵制成优酪乳或优格等乳制品。

本发明所提供的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96、含有该SG96菌株的抑菌组合物及其用途，与其他现有技术相互比较时主要具有下述优点：

1.本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株经过革兰氏染色分析、API50CHL分析、16S rDNA定序分析、谱系分析后，确认与现有的副干酪乳杆菌BCRC910220、以及副干酪乳杆菌副干酪亚种BCRC14001、BCRC16100的种系关系具有明显差异，为一新的副干酪乳杆菌副干酪亚种。

2.将本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株，分别进行滤纸片琼脂扩散法分析以及与病原菌混合培养试验分析，结果显示，本发明SG96菌株不但可以抑制大肠杆菌及沙门氏菌等病原菌的生长，且其抑菌作用较抗生素streptomycin的抑菌作用强，甚至有杀菌效果。

3.将本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株配制成水溶液喂食未离乳猪仔，结果显示本发明SG96菌株可明显促进未离乳仔猪体重增加、改善仔猪饲料的换肉率，并具有良好的抗下痢效果，且成效优于一般使用的抗生素，证明本发明SG96菌株具有增进动物抵抗病原菌的能力。

附图说明

图1A为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的革兰氏染色结果；图1B为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的型态图；

图2为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株16S rDNA片段以PCR放大后的琼脂凝胶电泳图；

图3为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株SG96、BCRC910220、BCRC14001、BCRC16100的16S rDNA序列比对图；

图4为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株SG96、BCRC910220、BCRC14001、BCRC16100及其他副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株的种系谱系分析图；

图5为以滤纸片琼脂扩散法分析本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株对于大肠杆菌的抑制作用；

图6为以滤纸片琼脂扩散法分析本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株对于沙门氏菌的抑制作用；

图7为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株10⁸菌数与病原菌混合培养试验的结果；

图8为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株10⁷菌数与病原菌混合培养试验的结果；

图9为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株10⁶菌数与病原菌混合培养试验的结果；

图10为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株10⁵菌数与病原菌混合培养试验的结果；

图11为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株10⁴菌数与病原菌混合培养试验的结果；

图12为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株对未离乳仔猪体重变化的影响；以及

图13为本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株对未离乳仔猪下痢的影响。

具体实施方式

下面的说明部份及图式意图，仅具示范说明性而非限制性。本发明其他具体实例可由谙于此技者从阅览本说明部份而明白。

实施例一本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的筛选与分离

收集猪只肠道排泄物，置入MRS肉汤培养基(Difco^TM，REF288130)中，在37℃厌氧环境下培养24小时后，将该培养物涂布在MRS琼脂平板(Difco^TM，REF288210)上，然后在37℃培养3天。培养后，收集在琼脂培养基上出现的菌落，共获得1000多株产酸菌，再以滤纸片琼脂扩散法(disc-agar diffusion)筛选出具有抑制大肠杆菌(E.coli)(BCRC 11634)及沙门氏菌(S.typhimurium)(BCRC 129407)的乳酸菌，再从其中挑选出活性最佳的机能性副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)SG96，此菌种培养特征如下：在MRS琼脂平板上长成直径为2-3mm的灰色菌落，最佳培养温度在37℃。所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏编号为CGMCC2697，保藏日期为2008年10月9日。

实施例二本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的革兰氏染色

利用革兰氏染色法检测本发明菌株的特征。结果如图1A所示，本发明的菌株为革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)，无芽胞厌氧菌(non-sporinganaerobes)，及无运动性菌(non-mobility)，为乳杆菌的典型特征。

本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的菌学特征如下所示：

(a)形态学特征：

(1)细胞形状及大小：当细胞置于MRS肉汤培养基中，在37℃厌氧环境下培养24小时后，可于显微镜下观察到呈现杆状的杆菌(如图1B所示)。

(2)活动力：无运动性

(3)鞭毛：无

(4)孢子形成：无孢子形成

(5)革兰氏染色：阳性

(b)培养特征：

(1)培养基：MRS肉汤培养基，pH＝6.25

(2)培养条件：37℃厌氧环境

(c)生理学特征：

(1)过氧化氢酶：阴性

(2)氧化酶：阴性

(3)API50CHL测试：请参阅实施例三所示。

实施例三本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的16SrDNA定序分析

1.DNA萃取

利用FavorPrep^TM Blood Genomic DNA Extraction Mimi Kit纯化DNA，将该菌培养隔夜，取200μL菌液加20μL proteinase K(proteinase K使用前加110μL ddH₂O振荡混合5min使浓度为11mg/mL，冰存于-20℃备用)，加200μL FABG缓冲液，振荡混合5秒，60℃加热15分钟后短暂离心。加200μL95％酒精，振荡混合10秒，短暂离心，加入FABG管柱(FABG column)中，而且FABG column放入CollectionTube中，10,000rpm离心2分钟。将离心后之FABG column取出，将下清液倒出后以卫生纸吸干后，将FABG column放回Collection Tube中，加500μL W1缓冲液(第一次取用时须加入8mL95％酒精)，10,000rpm离心2分钟，将离心后之FABG column取出，将下清液倒出后以卫生纸吸干，将FABG column放回Collection Tube中。加入750μL WB(第一次取用时须加入40mL 95％酒精)，10,000rpm离心2分钟，将下清液倒出后以卫生纸吸干，将FABG column放回Collection Tube中，10,000rpm离心6分钟。再将离心后之FABG column放入1.5ml离心管中，加入Elution缓冲液150μL，静置3分钟，10,000rpm离心4分钟，此即为纯化的DNA，置于-20℃备用。

2.16S rDNA PCR片段放大

取本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的DNA，以及副干酪乳杆菌GMNL-32菌株的DNA(该菌株保藏编号为BCRC910220，该菌株已获得中国台湾发明专利I284149，为具有治疗过敏相关功能的副干酪乳杆菌菌株)，进行16SrDNA(ribosomal DNA)片段放大，所用引子(primers)为根据E.coli 16S rDNA基因第8-27位碱基和1510-1492位碱基序列设计的原核生物16S rDNA PCR通用引子(William G.Weisburg，Susan M.Barns，Dale A.Pelletier，and DavidJ.Lane.16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study.J.Bacteriol.1991 January；173(2)：697-703)，引子序列如下所示：

正向引子fD1：

5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQIDNo：1)

反向引子rP1：

5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQIDNo：2)

该16S rDNA PCR片段扩增程序如下：(1)95℃下5分钟；(2)94℃下1分钟；(3)60℃下30秒；(4)72℃下1.5分钟；(5)72℃下10分钟，步骤(2)至(4)重复30个循环。

另外，取副干酪乳杆菌副干酪亚种BCRC14001(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)，

以及副干酪乳杆菌副干酪亚种BCRC16100(Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei)的DNA进行16S rDNA片段扩增，所用引子根据副干酪乳杆菌16S rRNA V1区域，以及乳杆菌16S rRNA保守(conserved)序列而来(Ward，L.J.H.，and Timmins，M.J.1999.Differentiation of Lactobacilluscasei，Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus bypolymerase chain reaction.Lett.Appl.Microbiol.29：90-92.)，引子序列如下所示：

正向引子：

5′-CACCGAGATTCAACATGG-3′(SEQIDNo：3)

反向引子：

5′-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′(SEQIDNo：4)

该16S rDNA PCR片段扩增程序如下：(1)95℃下5分钟；(2)94℃下1分钟；(3)60℃下30秒；(4)72℃下1.5分钟；(5)72℃下10分钟，步骤(2)至(4)重复30个循环。

3.16S rDNA PCR片段定序、比对

将本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的16S rDNA的PCR产物进行琼脂凝胶电泳，结果如图2所示；由图2得知，该PCR产物片段约为1,500bp(标准品片段之长度由上至下依序为3k，2k，1.5k，1K，900，800，700，600，500，400，300，200，100bp)，并进行定序工作，副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的16S rDNA的序列如SEQIDNo：5所示；将序列对照复合序列比对资料集(NCBI blastn，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行序列比对，结果如图3所示，序列比对结果为98％精确度副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。

实施例四本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的API50CHL分析

利用API50CHL试剂检验本发明乳酸菌菌株的碳水化合物代谢性能，API50CHL试剂可用来鉴定菌株在属或种上的差异，经检测，API50CHL分析结果如表一所示，显示本发明的菌株与副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillusparacasei subsp.paracasei 1)的碳水化合物代谢活性具有98％相似性，因此以API50CHL分析进一步确认本发明的菌株归类于副干酪乳酸杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)。

表一API50 CHL分析结果

实施例五本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96谱系分析

将NCBI Nucleotide资料库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中所公布的45株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、副干酪乳酸杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的序列，与BCRC资料库中所公布的两株BCRC 14001、BCRC16100的序列，以及中国台湾专利和美国专利核准各一株GMNL-32(BCRC910220)与CSK01的序列，利用EMBL-EBI ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)进行谱系分析比较，谱系分析结果如图4所示，SG96仅与其中五株菌种属同一族群，但又可与该五株分歧出另一支独立的品系，此代表SG96在分类系统上具有独特性，因此确实证明SG96为一新颖副干酪乳酸杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)微生物株。

实施例六本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株对大肠杆菌与沙门氏菌的抑制作用

1.滤纸片琼脂扩散法(disc-agar diffusion)

将大肠杆菌(保藏编号BCRC11634)及沙门氏菌(保藏编号BCRC12947)分别取一白金耳的菌量接种于TSA培养基(Soybean-Casein Digest Agar Medium，Difco^TM，REF236950)斜面，经过35-37℃培养17-24小时，使菌株达到生长平稳期，并使用分光光度计进行浊度测定，调整适当菌体浊度(约600nm的浊度80％，80％T)。分别吸取此二种病原菌菌液0.5ml至温度约为48℃之平板固体培养基中，再倒入培养皿中，放置1小时待凝固后，取直径8mm无菌滤纸锭沾取副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的菌液，轻放无菌滤纸锭于上述培养皿上，于35-37℃下培养17-24小时观察结果，测量抑制圈直径，同时用抗生素链霉素(streptomycin)15g/mL做正对照组(positive control)。

结果如图5、图6所示，本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株对大肠杆菌(BCRC11634)的抑制圈直径为11.8mm(如图5所示)，而抗生素streptomycin的抑制圈直径为11.0mm，显示本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株有较强的抑制作用。而本发明菌株对沙门氏菌(BCRC12947)的抑制图直径为12.5mm(如图6所示)，而抗生素streptomycin的抑制圈直径为11.2mm，显示本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株有较强的抑制作用。

2.副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株与病原菌混合培养试验

在此实验中选用大肠杆菌(BCRC11634)及沙门氏菌(BCRC12947)作为病原菌。将病原菌与副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株混合培养(以TSA培养基于37℃进行培养)，并于培养期间取样，取样样品经系列稀释适当倍数后分别取100μL进行涂盘于MRS及TSA培养皿上，MRS培养皿置于35-37℃厌氧环境下培养，静置培养24-48小时，TSA培养皿置于35-37℃好氧环境下培养，静置培养24小时，待菌落生成后分别计数副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株的菌数(MRS培养皿)与病原菌菌数(TSA培养皿)。

如图7所示，取副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株10⁸菌数(CFU/ml)分别与大肠杆菌(BCRC11634)及沙门氏菌(BCRC12947)混合培养，结果为大肠杆菌在8小时内菌数由10⁸减少至10¹，沙门氏菌在6小时内菌数由10⁸减少至10¹，可见本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株抑制效果强，甚至有杀菌效果。

如图8所示，取本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株10⁷菌数分别与大肠杆菌(BCRC11634)及沙门氏菌(BCRC12947)混合培养，大肠杆菌在22小时内菌数由10⁸减少至0，沙门氏菌在16小时内菌数由10⁸减少至0。

如图9所示，取本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株10⁶菌数分别与大肠杆菌(BCRC11634)及沙门氏菌(BCRC12947)混合培养，大肠杆菌在24小时内菌数由10⁸减少至10²，沙门氏菌在18小时内菌数由10⁸减少至0。

如图10所示，取本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株10⁵菌数分别与大肠杆菌(BCRC11634)及沙门氏菌(BCRC12947)混合培养，32小时后大肠杆菌菌数由10⁸减少至0，而沙门氏菌在24小时内菌数由10⁸减少至0。

如图11所示，取本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株10⁴菌数分别与大肠杆菌(BCRC11634)及沙门氏菌(BCRC12947)混合培养，38小时后大肠杆菌菌数由10⁸减少至0，而沙门氏菌在24小时内菌数由10⁸减少至0。

实施例七动物试验

1.本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株对初生未离乳仔猪体重的影响

各农户挑选由同一母猪同期生产的初生未离乳仔猪，将其分成两组进行喂饲，一组为每日仅施予含1×10⁷CFU/mL的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株水溶液，另一组为对照组，喂饲抗生素(OTC，oxytetracycline)，喂饲时间为21天，纪录每周仔猪的体重变化，并以T-test进行统计分析。结果如图12，喂饲本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株两周后，其体重增加率比喂饲对照组显着(p＜0.05)，其体重平均每周增加0.7-0.8公斤；喂饲本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株三周后，仔猪总增加体重亦比对照组多，显示喂饲本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株可明显促进未离乳仔猪体重增加，及改善仔猪饲料的换肉率。

2.本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株减少初生未离乳仔猪下痢的效果

由于初生未离乳仔猪常见下痢，该下痢状况通常因母猪哺乳或环境因素所造成，仔猪常因下痢情况严重而早夭，若能早期改善下痢，将有裨于仔猪正常生长。

各农户挑选由同一母猪同期生产的未离乳猪仔，将其分成两组进行喂饲，一组为每日仅施予含1×10⁷CFU/mL的SG96乳酸菌水溶液，另一组为对照组，喂饲抗生素(OTC，oxytetracycline)，喂饲时间为21天，纪录每周仔猪下痢状况，予以评分，下痢分数评分根据Underdahl等人所发表的文献标准而订(Underdahl NR，Torres-Medina A，Dosten AR.1982.Effect of Streptococcus faeciumC-68 in control of Escherichia coli-induced diarrhea in gnotobioticpigs.Am.J.Vet.Res.1982.12：2227-2232)，评分说明：

0分＝正常；

1分＝软便、肛门周围干燥；

2分＝肛门周围潮湿；

3分＝水痢；

4分＝标准1-3+食欲不佳、体重减轻和消瘦

并以T-test进行统计分析。结果如图13，喂饲本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株可达到减少下痢的效果，其功效于第二周时与对照组效果相似。经喂饲三周后，喂饲本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株减少下痢效果比对照组(喂饲抗生素组)佳，且有显着差异(p＜0.05)，表示本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株具有良好的抗下痢效果，且成效优于一般酪农户使用的抗生素，能让仔猪不产生抗生素残留的问题。

虽然已经就特别具体实例及应用说明过本发明，不过本领域普通技术人员从本说明书所公开的范围可以产生附加的具体实例，及修改而不违离所主张的本发明旨意或超过本发明所主张的范围。因此，要了解者本文的图式及说明部份经提出作为例子以帮助本发明的理解且不应该视为要限制其范围。

上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

PB20080475序列表

序列表

<110>生展生物科技股份有限公司(SyngenbiotechCO.，LTD.)

<120>副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株及其抑菌组合物和用途

<160>5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引子

<400>1

agagtttgat cctggctcag 20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引子

<400>2

acggttacct tgttacgact t 21

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引子

<400>3

caccgagatt caacatgg  18

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引子

<400>4

cccactgctg cctcccgtag gagt 24

<210>5

<211>1007

<212>DNA

<213>副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株(Lactobacillu sparacaseisubsp.paracasei SG96 strain)

<400>5

ggggcgcgtg ctatacatgc aagtcgaacg agttctcgtt gatgatcggt gcttgcaccg     60

agattcaaca tggaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag    120

tgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcatag atccaagaac cgcatggttc    180

ttggctgaaa gatggcgtaa gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta ttagctagtt    240

ggtgaggtaa tggctcacca aggcgatgat acgtagccga actgagaggt tgatcggcca    300

cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca    360

atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggctttcg ggtcgtaaaa    420

ctctgttgtt ggagaagaat ggtcggcaga gtaactgttg tcggcgtgac ggtatccaac    480

cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta    540

tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc    600

tcggcttaac cgaggaagcg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg    660

gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg    720

gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat    780

accctggtag tccatgccgt aaacgatgaa tgctaggtgg ttgggagggt ttccgccctt    840

cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggga gtacgaccgc aaggttgaac    900

tcaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttattc gaagcaacgc    960

gagagcttac cagtcttgac atcttttgat cactgagaga tcagttt                 1007

Claims (9)

1.副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)SG96菌株，其微生物保藏号为：CGMCC No.2697。

2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株在制备抑制大肠杆菌(Escherichia coli)生长的药物或试剂中的用途。

3.权利要求1所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株在制备抑制沙门氏菌(Salmonella typhimurium)生长的药物或试剂中的用途。

4.权利要求1所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株在制备抑制下痢的药物或试剂中的用途。

5.一种组合物，其特征在于由有效量的权利要求1所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种SG96菌株和载体或辅料组成。

6.权利要求5所述的组合物在制备抑制大肠杆菌(Escherichia coli)生长的药物或试剂中的用途。

7.权利要求5所述的组合物在制备抑制沙门氏菌(Salmonella typhimurium)生长的药物或试剂中的用途。

8.权利要求5所述的组合物在制备抑制下痢的药物或试剂中的用途。

9.如权利要求5所述的组合物，其特征在于该组合物制备成动物饮水添加物、动物饲料添加物、动物用医疗组合物、人类用医疗组合物、人类食品添加物或人类食品。

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