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CN101646690A - 抗il-17a抗体 - Google Patents

抗il-17a抗体 Download PDF

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Abstract

提供抗人IL－17A的工程改造抗体，以及其用途。

Description

抗IL-17A抗体
发明领域
一般地讲，本发明涉及IL-17A特异性结合化合物，例如抗体，及其用途。更具体而言，本发明涉及识别人IL-17A并调节其活性的嵌合抗体和人源化抗体，所述活性尤其为在炎性、自身免疫性和增生性病症中的活性。
发明背景
免疫系统用于保护个体免遭感染性物质如细菌、多细胞生物和病毒的侵袭，以及保护个体免于癌症侵袭。该系统包括几种类型的淋巴样细胞和髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜中性粒细胞。这些淋巴样细胞和髓样细胞经常产生称为细胞因子的信号转导蛋白。免疫应答包括炎症，即，免疫细胞全身性地或在身体的特定部位中累积。免疫细胞响应于感染性物质或外来物质分泌细胞因子，细胞因子又调节免疫细胞增殖、发育、分化或迁移。免疫应答可以产生病理性后果，例如，当它涉及过度炎症时，如在自身免疫性病症中(参见例如Abbas等(编辑)(2000)Cellular and Molecular Immunology，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PA；Oppenheim和Feldmann(编辑)(2001)Cytokine Reference，AcademicPress，San Diego，CA；von Andrian和Mackay(2000)New Engl.J.Med.343：1020-1034；Davidson和Diamond(2001)New Engl.J.Med.345：340-350)。
白介素-17A(IL-17A；也称为细胞因子T-淋巴细胞相关抗原8(CTLA8)，IL-17)是在抗原识别后由记忆T细胞产生的同型二聚化细胞因子。白介素-23(IL-23)促进这类T细胞的发育。McKenzie等(2006)Trends Immunol.27(1)：17-23；Langrish等(2005)J.Exp.Med.201(2)：233-40。IL-17A通过两个受体IL-17RA和IL-17RC用于诱导多种涉及嗜中性粒细胞生物学、炎症和器官破坏的分子的产生。该细胞因子与组织坏死因子(TNF)和/或白介素1β(IL-1β)协同增效，以促进更加促炎的环境。业已提出，用抗体或抗体的抗原结合片段拮抗IL-17A的活性以治疗多种炎性、免疫性和增殖性病症，包括类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、类风湿性关节炎骨质疏松症、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和硬化)、齿龈炎、牙周炎或其它炎性牙周病、炎性肠病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和炎性肠病)、哮喘(包括变应性哮喘)、变态反应、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化、银屑病和癌症。(参见例如US 2003/0166862、WO 2005/108616、WO 2005/051422和WO2006/013107)。
使用抗体作为体内治疗剂的最值得注意的限制是抗体的免疫原性。因为大多数单克隆抗体衍生自啮齿动物，所以在人中重复使用导致产生针对治疗性抗体的免疫应答，例如人抗小鼠抗体或HAMA。此类免疫应答导致最低限度的疗效损失和最大限度的潜在致命性过敏反应。减少啮齿动物抗体免疫原性的最初努力涉及其中小鼠可变区(Fv)与人恒定区融合的嵌合抗体的产生。Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-43。然而，用人可变区和小鼠恒定区的杂合体注射的小鼠产生针对人可变区的强烈抗抗体应答，提示在此类嵌合抗体中保留完整的啮齿动物Fv区仍可在患者中产生不需要的免疫原性。
一般认为，可变结构域的互补决定区(CDR)环包括抗体分子的结合部位。因此，已尝试将啮齿动物CDR环嫁接到人构架上(即人源化)，以进一步最小化啮齿动物序列。Jones等(1986)Nature 321：522；Verhoeyen等(1988)Science 239：1534。然而，CDR环交换仍不能一致地产生具有与来源抗体相同的结合性质的抗体。人源化抗体中的构架残基(FR)-涉及CDR环支持的残基的变化也经常是保持抗原结合亲和力所需的。Kabat等(1991)J.Immunol.147：1709。尽管已报道在许多人源化抗体构建体中使用CDR嫁接和保留构架残基，但难以预测特定序列是否将产生具有所需结合性质且有时具有生物学性质的抗体。参见例如Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029，Gorman等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4181，和Hodgson(1991)Biotechnology(NY)9：421-5。而且，大多数先前研究使用不同的人序列用于动物轻链和重链可变序列，从而使得此类研究的预言性受到怀疑。已使用已知抗体的序列，或者更一般地，使用具有已知X射线晶体结构的抗体如抗体NEW和KOL的序列。参见例如Jones等，出处同上；Verhoeyen等，出处同上；和Gorman等，出处同上。已报道了一些人源化构建体的确切序列信息。
需要IL-17A拮抗剂，例如抗IL-17A单克隆抗体，以用于治疗人病症，例如炎症、自身免疫性疾病和增殖性疾病。这类拮抗剂优选在人类患者中表现出低免疫原性，使得可以重复给予，而没有不利的免疫应答。
发明概述
本发明涉及具有一种或多种所需特性的抗人IL-17A抗体，所述特性包括在人类患者中的高结合亲和力、中和活性、良好的药代动力学和低抗原性。本发明还涉及在疾病治疗中使用本发明的抗体。
因此，在一个实施方案中，本发明提供结合化合物，例如抗体分子或其结合片段，其结合人IL-17A，并抑制人IL-17A的活性。在某些实施方案中，结合化合物包含至少1个抗体轻链可变(VL)结构域和至少1个抗体重链可变(VH)结构域，或者这些结构域的结合片段，其中VL结构域包含至少指定数目(a specified number)的互补决定区(CDR)，其具有选自SEQ ID NO：11-13的序列，VH结构域包含至少指定数目的CDR，其具有选自SEQ ID NO：14-20的序列，其中所述指定数目为1、2或3。指定数目的CDR可以与任何给定结合化合物的轻链和重链可变结构域相同或不同。在又一个实施方案中，VH结构域CDR选自SEQ ID NO：14、17和20。在再一个实施方案中，VH结构域CDR选自SEQ ID NO：14、16和19。在又一个实施方案中，VL和VH结构域的序列分别为SEQ ID NO：5和6的序列。在某些实施方案中，IL-17A结合化合物抑制人IL-17A的活性。
在其它实施方案中，结合化合物包含至少1个VL结构域和至少1个VH结构域，或者这些结构域的结合片段，其中VL结构域包含1、2或3个具有选自SEQ ID NO：26-28的序列的CDR，VH结构域包含1、2或3个具有选自SEQ ID NO：29-31的序列的CDR。在又一个实施方案中，VL和VH结构域的序列分别为SEQ ID NO：22和23的序列。在又一个实施方案中，结合化合物具有与ATCC保藏号为PTA-7739(大鼠30C10，以菌株JL7-30C10.C3于2006年7月20日)的杂交瘤产生的抗体相同的CDR。
在又一个实施方案中，结合化合物包含至少1个VL结构域和至少1个VH结构域，或者这些结构域的结合片段，其中VL结构域包含1、2或3个具有选自SEQ ID NO：48-50的序列的CDR，VH结构域包含1、2或3个具有选自SEQ ID NO：51-53的序列的CDR。
在又一个实施方案中，结合化合物包含至少1个VL结构域和至少1个VH结构域，或者这些结构域的结合片段，其中VL结构域包含1、2或3个具有选自SEQ ID NO：34-36的序列的CDR，VH结构域包含1、2或3个具有选自SEQ ID NO：37-39的序列的CDR，或者VL结构域包含1、2或3个具有选自SEQ ID NO：56-58的序列的CDR，VH结构域包含1、2或3个具有选自SEQ ID NO：59-61的序列的CDR。
在多个其它实施方案中，本发明提供结合人IL-17A的结合化合物，其具有分别与SEQ ID NO：5和6的序列具有至少95％、90％、85％、80％、75％或50％的序列同源性的VL和VH结构域。在其它实施方案中，本发明的结合化合物包含VL和VH结构域，其相对于SEQ ID NO：5和6的序列分别具有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个以上的保守氨基酸取代。在又一个实施方案中，本发明的结合化合物为具有轻链和重链的抗体，其相对于SEQ ID NO：2和4的序列分别具有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个以上的保守氨基酸取代。
在一个实施方案中，结合化合物为抗体或其结合片段，例如抗体片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)2和双体。在一个实施方案中，本发明的结合化合物为抗体hu16C10，其含有具有成熟形式的SEQ ID NO：2的序列(残基1-220)的轻链，以及具有成熟形式的SEQ ID NO：4的序列(残基1-454)的重链。在又一个实施方案中，结合化合物为由ATCC保藏号为PTA-7675的表达载体(在质粒pAIL17AV1中的hu16C10，于2006年6月28日保藏)产生的抗体。
在一个实施方案中，本发明的结合化合物包含重链恒定区，例如人恒定区，例如γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在又一个实施方案中，结合化合物包含轻链恒定区，例如人轻链恒定区，例如λ或κ人轻链区或其变体。
在又一个实施方案中，本发明涉及分离的核酸，例如DNA，其编码本发明的结合化合物，例如结合人IL-17A的抗体(或其结合片段)。在一个实施方案中，分离的核酸编码结合化合物，所述化合物含有至少1个抗体轻链可变(VL)结构域和至少1个抗体重链可变(VH)结构域，或者这些结构域的结合片段，其中VL结构域包含至少指定数目的、具有选自SEQ ID NO：11-13的序列的互补决定区(CDR)，VH结构域包含至少指定数目的、具有选自SEQ ID NO：14-20的序列的CDR，其中所述指定数目为1、2或3。
在又一个实施方案中，分离的核酸分别编码SEQ ID NO：5和6的轻链和重链可变区序列中的一个或两个。在再一个实施方案中，分离的核酸编码抗体16C10，所述抗体含有具有成熟形式的SEQ ID NO：2的序列的轻链和具有成熟形式的SEQ ID NO：4的序列的重链。在某些实施方案中，分离的核酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：62的核苷酸58-717，在其它实施方案中，分离的核酸包含SEQ ID NO：3或SEQID NO：63的核苷酸58-1419。在又一个实施方案中，分离的核酸包含SEQ ID NO：1的序列和SEQ ID NO：3的序列。在又一个实施方案中，分离的核酸包含SEQ ID NO：62的序列和SEQ ID NO：63的序列。在某些实施方案中，分离的核酸编码在单个核酸分子上的轻链和重链这二者，在其它实施方案中，编码在两个或更多个单独的核酸分子上的轻链和重链。
在其它实施方案中，本发明涉及含有本发明的分离核酸的表达载体，其中在用所述载体转染宿主细胞时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。在一个实施方案中，表达载体具有ATCC保藏号PTA-7576(在质粒pAIL17AV1中的hu16C10，于2006年6月28日保藏)。
在又一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的表达载体的宿主细胞。本发明进一步涉及生产本发明的结合化合物的方法，包括在培养基中培养具有编码结合化合物的表达载体的宿主细胞，并由宿主细胞或培养基分离结合化合物。
本发明还涉及结合化合物，例如抗体或其结合片段，其结合人IL-17A上与抗体16C10、4C3、30C10、12E6、23E12或1D10相同的表位；例如，能够交叉阻断本发明的这些抗体中的任一种结合的抗体，或者在由人IL-17A的氨基酸残基74-85(SEQ ID NO.：40)限定的表位中结合的抗体。
本发明还涉及高亲和力的人IL-17A结合化合物，例如其抗体或结合片段，例如以1000、500、100、50、20、10、5、2pM以下(即较高亲和力)的平衡解离常数(Kd)结合的结合化合物。本发明还涉及在生物学活性测定检测时具有有效生物学活性的结合化合物，例如5000、2000、1000、500pM的IC50，在所述测定中，IL-17A刺激以1000pM(1nM)的浓度实现，例如IL-17A刺激的正常人真皮成纤维细胞、包皮成纤维细胞或滑膜细胞的IL-6生产。本发明还涉及在生物学活性测定检测时具有1000、500、200、100、50pM以下的IC50的结合化合物，在所述测定中，IL-17A刺激以100pM的浓度实现，例如Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR增殖测定。一般来说，本发明涉及当IL-17A浓度为例如5、10、50、100、500或1000pM以上时能够在生物学测定中以IL-17A浓度的10X、5X、2X、1X及低至0.5X范围的浓度抑制人IL-17A活性的结合化合物。
本发明还涉及这样的结合化合物：其在给予小鼠而产生50、40、30、20μg/ml以下的结合化合物血清浓度时，能够将IL-17A诱导的向肺的嗜中性粒细胞募集降低50％以上。
在一个实施方案中，结合化合物以比其对人IL-17A的亲和力低不超过5、10或20倍的亲和力(Kd)结合猕猴(cynomolgus monkey)IL-17A。在又一个实施方案中，结合化合物以比其对小鼠或大鼠IL-17A的亲和力高100、500、1000或2000倍的亲和力(Kd)结合人IL-17A。
本发明还涉及用本发明的人IL-17A结合化合物治疗需要治疗的患者(包括人类患者)的方法。这些患者可能患有炎性或自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病、多发性硬化、慢性阻塞性肺病、囊肿性纤维化、系统性硬皮病、同种异体移植排斥、自身免疫性心肌炎或腹膜粘连。这些治疗方法可进一步包括给予一种或多种另外的治疗剂，例如免疫抑制剂或抗炎剂。在一个实施方案中，患者已被诊断为患有IL-17A介导的疾病。在又一个实施方案中，患者已被诊断为患有类风湿性关节炎。在又一个实施方案中，患者已被诊断为患有多发性硬化。
在其它实施方案中，本发明提供治疗方法，其包括给予治疗有效量的抗人IL-17A抗体或结合片段连同一种或多种其它治疗剂。在一个实施方案中，其它治疗剂为抗人IL-23抗体或其结合片段。在多个实施方案中，在给予抗人IL-17A抗体或片段之前、同时或之后给予抗人IL-23抗体或片段。在一个实施方案中，抗IL-17A和抗IL-23抗体在不良免疫事件的急性期当中在有限的时间内一起给予，此后中止用抗IL-17A抗体治疗，但继续用抗IL-23抗体治疗。在其它实施方案中，所述一种或多种其它药物或者治疗剂包括IL-1β、IL-6或TGF-β的拮抗剂，例如抗IL-6或抗TGF-β抗体，或者这些拮抗剂的组合。
本发明还涉及本发明的结合化合物的组合物和制剂，其含有结合化合物和药学上可接受的载体或稀释剂，并可选地含有一种或多种免疫抑制剂或抗炎剂。
附图简述
图1A显示了依据本发明的几种抗人IL-17A抗体的轻链可变结构域的比对。大鼠16C10 VL＝SEQ ID NO：7；人16C10 VL＝SEQ ID NO：5；大鼠4C3 VL＝SEQ ID NO：21；人4C3 VL＝SEQ ID NO：5；大鼠23E12 VL＝SEQ ID NO：45；大鼠30C10 VL＝SEQ ID NO：24；人30C10VL＝SEQ ID NO：22；大鼠12E6 VL＝SEQ ID NO：32；大鼠1D10 VL＝SEQ ID NO：54。CDR被标示出来(并在表3提供)。编号依据Kabat等(1991)“Sequences of Proteins of Immunological Interest″，美国健康和人类服务部，NIH Pub.91-3242，第5版，本文称为“Kabat等(1991)”。
图1B显示了依据本发明的几种抗人IL-17A抗体的重链可变结构域的比对。大鼠16C10 VH＝SEQ ID NO：8；人16C10 VH＝SEQ ID NO：6；大鼠4C3 VH＝SEQ ID NO：8；人4C3 VH＝SEQ ID NO：6；大鼠23E12 VH＝SEQ ID NO：47；大鼠30C10 VH＝SEQ ID NO：25；人30C10VH＝SEQ ID NO：23；大鼠12E6 VH＝SEQ ID NO：33；大鼠1D10 VH＝SEQ ID NO：55。CDR被标示出来(并在表4提供)。编号依据Kabat等(1991)。
图2A显示了依据本发明的人源化抗-IL-17A抗体16C10的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的成熟形式，即残基1-220)。CDR被标示出来。
图2B显示了依据本发明的人源化抗-IL-17A抗体16C10的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的成熟形式，即残基1-454)。CDR被标示出来。
图3A-3D显示了抗-IL-17A抗体治疗对类风湿性关节炎CIA小鼠模型的病理作用。治疗包括给予抗-IL-17A抗体1D10(28、7和2mg/kg)和给予同种型对照(7mg/kg)。
图3A提供了随抗体治疗而变化的目测疾病严重性评分(DSS)，其是目测的脚爪肿胀和发红的检测。评分为：0＝脚爪外观与对照(未治疗的)脚爪相同；1＝给定脚爪上的一个脚趾发炎；2＝给定脚爪的两个脚趾或脚掌发炎；3＝给定脚爪的脚掌和脚趾发炎。
图3B提供了随抗体治疗而变化的软骨损伤(根据组织病理学)。评分为：0＝正常；1＝最小；2＝轻微；3＝中等；4＝严重。
图3C提供了随抗体治疗而变化的骨侵蚀(根据组织病理学)。评分为：0＝正常；1＝最小；2＝轻微；3＝中等；4＝严重。
图3D提供了在目测DSS中被评分为2或3的CIA小鼠的脚爪(即高度发炎的脚爪)的骨侵蚀(根据组织病理学)。rIgG1是同种型对照抗体。评分为：0＝正常；1＝最小；2＝轻微；3＝中等；4＝严重。
图4提供了随多种本发明的抗人IL-17A抗体(1D10、16C10、4C3)和同种型对照的血清浓度变化的在已用人IL-17A鼻内治疗的小鼠的％BAL嗜中性粒细胞(肺的嗜中性粒细胞募集的检测)。实心三角形代表无任何添加的抗IL-17A抗体的对照实验，最左侧的数据点(空心三角形)为未受刺激的对照。
图5A显示了编码人源化抗-IL-17A抗体16C10的轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO：62)。
图5B显示了编码人源化抗-IL-17A抗体16C10的重链的核苷酸序列(SEQ ID NO：63)。
发明详述
I.定义
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
如本文(包括附加权利要求)所使用的，单词的单数形式如“一个”、“一种”和“该”包括其相应的复数含义，除非上下文另有明确说明。
除非上下文另有说明或明确说明，否则“活化”、“刺激”和“处理”在应用于细胞或受体时，可以具有相同含义，例如用配体活化、刺激或处理细胞或受体。“配体”包括天然配体和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白质和衍生自抗体的结合化合物。“配体”还包括小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可以指由内部机制以及由外部因素或环境因素调节的细胞活化。例如，细胞、组织、器官或生物的“应答”包括生物化学或生理学行为的变化，例如在生物区室内的浓度、密度、附着或迁移，基因表达速率，或分化状态，其中所述变化与活化、刺激或处理相关，或与内部机制如遗传编程相关。
分子的“活性”可以描述或指分子与配体或受体的结合，催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性，其它分子活性的调节等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞间相互作用如附着的活性，或维持细胞结构例如细胞膜或细胞骨架的活性。“活性”还可以指比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白]，或[免疫活性]/[mg蛋白]、生物区室中的浓度等。“活性”可以指调节先天或获得性免疫系统的组分。“增殖活性”包括对于例如正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移或血管发生可促进、必需或特异性相关的活性。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。“处理”在应用于人、兽医学或研究受试者或者细胞、组织或器官时，包括IL-17A激动剂或IL-17A拮抗剂与人或动物受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。“细胞的处理”还包括其中IL-17A激动剂或IL-17A拮抗剂例如在流体相或胶体相中接触IL-17A受体的情况，而且包括其中激动剂或拮抗剂不接触细胞或受体的情况。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患者的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
本文指出了人IL-17A蛋白的4种变体。i)本文使用的术语“人IL-17A”和“天然人IL-17A”(“huIL-17A”和“humIL-17A”)是指人IL-17A蛋白登录号NP_002181和AAT22064的成熟形式(即残基24-155)，及其天然变体和多态性。ii)本文使用的术语“rhIL-17A”是指天然人IL-17A的重组衍生物，其中两个另外的氨基酸(LE)附在天然人IL-17A的成熟形式的N-末端。为方便起见，采用该命名法指示多种形式的IL-17A，可能与文献中的用法不匹配。iii)本文使用的术语“FLAG-huIL-17A”是指附加N-末端FLAG
Figure A20078003766200181
肽标签的天然人IL-17A的变体。在某些实验中，FLAG-huIL-17A被生物素化。iv)在本文中指出的R&D Systems人IL-17A是人IL-17A蛋白登录号NP_002181和AAT22064的残基20-155，其具有另外的N-末端甲硫氨酸。表1是本文提及的IL-17A分子的变体N-末端的汇总。
表1
人IL-17A的变体形式
  IL-17A变体   序列(N→C)   SEQ ID NO.：
  huIL-17A(天然的)   GITIPRN...VHHVA   40
  rhIL-17A   LEGITIPRN...VHHVA   41
  FLAG-huIL-17A   DYKDDDDKLGITIPRN...VHHVA   42
  R&D IL-17A   MIVKAGITIPRN...VHHVA   43
除非另有说明，否则在本文所述实验中使用的、使用腺病毒载体产生的任何IL-17A均为rhIL-17A。术语“IL-17A”一般是指天然或重组的人IL-17A，以及人IL-17A的非人同源物。除非另有指示，否则使用IL-17A的同二聚体的分子量(例如对于人IL-17A为30kDa)计算IL-17A的摩尔浓度。
本文所用的术语“抗体”是指表现出所需生物学活性的任何形式的抗体。因此，它以最广义使用，具体地说，包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。本文所用的术语抗体的“IL-17A结合片段”或“结合片段”(“亲本抗体”)包括抗体的片段或衍生物，通常包括亲本抗体的至少部分抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)，其保留亲本抗体的至少某些结合特异性。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；和由抗体片段形成的多特异性抗体。通常，当结合片段或衍生物的IL-17A结合活性基于摩尔表示时，结合片段或衍生物保留该活性的至少10％。优选地，结合片段或衍生物保留亲本抗体的IL-17A结合活性的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％以上。还预期IL-17A结合片段可以包括基本上不改变其生物学活性的保守氨基酸置换(称为抗体的“保守变体”)。术语“结合化合物”是指抗体及其结合片段这二者。
“Fab片段”包含一条轻链和CH1及一条重链的可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fc”区包含含有抗体的CH1与CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段通过两个以上的二硫键和通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”包含一条轻链和含有VH结构域与CH1结构域的一条重链的部分，还包含在CH1与CH2结构域之间的区域，以致于可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”包含两条轻链和含有CH1与CH 2结构域之间的部分恒定区的两条重链，以致于在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链这两者的可变区，但没有恒定区。
术语“单链Fv”或“scFv抗体”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链上。一般地，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun(1994)THEPHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页。另参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4,946,778和5,260,203号。
“域抗体”为仅含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些实例中，两个或更多个VH区与肽接头共价连接，产生二价域抗体。二价域抗体段的两个VH区可靶向相同的或不同的抗原。
“二价抗体”包含2个抗原结合位点。在一些情况下，2个结合部位具有相同抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的(参见下文)。
除非另有说明，否则本文使用的“抗-IL-17A”抗体是指针对人IL-17A或其变体(例如huIL-17A、rhIL-17A、FLAG-huIL-17A和R&DIL-17A)或其任何抗原性片段产生的抗体。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指得自基本上均质抗体群体的抗体，即，除了可以以小量存在的可能天然发生的突变以外，构成群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂一般包括针对不同表位(或对其特异性)的许多抗体。修饰词“单克隆”指得自基本上均质的抗体群体的抗体特征，并且不应被解释为需要通过任何具体方法生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等(1975)Nature 256：495描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。“单克隆抗体”还可以使用例如Clackson等(1991)Nature 352：624-628和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。另参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731。
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，以及此种类抗体的片段，只要它们具有所需生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)。
本文使用的“嵌合抗体”为具有第一抗体的可变结构域和第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。通常，可变结构域得自实验动物的抗体(“亲本抗体”)，例如啮齿动物，恒定结构域序列得自人抗体，以便产生的嵌合抗体相比于亲本啮齿动物抗体不大可能对人类个体引起不利的免疫应答。
本文的单克隆抗体还包括骆驼源化单结构域抗体。参见例如Muyldermans等(2001)Trends Biochem.Sci.26：230；Reichmann等(1999)J.Immunol.Methods 231：25；WO 94/04678；WO 94/25591；美国专利号6,005,079，所述参考文献在此整体引入作为参考。在一个实施方案中，本发明提供了包含修饰的2个VH结构域以至于形成单结构域抗体的单结构域抗体。
本文使用的术语“双体(diabody)”是指具有2个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在相同多肽链中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生2个抗原结合位点。在例如EP 404,097；WO93/11161；和Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中更充分地描述了双体。关于工程改造的抗体变体的综述，一般参见Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。
本文使用的术语“人源化抗体”是指包含来自人以及非人(例如鼠、大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少1个且通常是2个可变结构域，其中所有的或基本上所有的高变环均对应于非人免疫球蛋白的那些，所有的或基本上所有的构架(FR)区都是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体可选地包含至少部分人免疫球蛋白恒定区(Fc)。
本发明的抗体还包括具有修饰的(或阻断的)Fc区以提供改变的效应子功能的抗体。参见例如美国专利号5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此种修饰可用于增强或抑制免疫系统的各种反应，在诊断和治疗中具有可能有益的作用。Fc区的改变包括氨基酸变化(置换、缺失和插入)、糖基化或去糖基化和添加多个Fc。Fc的变化还可以改变治疗抗体的抗体半衰期，使给药频率较少，并因此增加了方便性和减少了材料使用。参见Presta(2005)J.AllergyClin.Immunol.116：731在734-35。
术语“全人抗体”是指只包含人免疫球蛋白序列的抗体。如果全人抗体在小鼠、小鼠细胞或衍生自小鼠细胞的杂交瘤中生产，那么全人抗体可以包含小鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”是指只包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。或者，如果全人抗体在大鼠、大鼠细胞或衍生自大鼠细胞的杂交瘤中生产，那么全人抗体可以包含大鼠碳水化合物链。类似地，“大鼠抗体”是指只包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
本文使用的术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)，和重链可变结构域中的残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)；Kabat等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)和/或来自“高变环”的那些残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(CDRL1)、50-52(CDRL2)和91-96(CDRL3)，和重链可变结构域中的26-32(CDRH1)、53-55(CDRH2)和96-101(CDRH3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。本文使用的术语“构架”或“FR”残基是指除本文定义为CDR残基的高变区残基外的那些可变结构域残基。
“结合物质”是指能够与靶结合的分子、小分子、大分子、抗体或其片段或类似物、或可溶性受体。“结合物质”还可以指能够与靶结合的分子复合物，例如非共价复合物、电离分子以及共价或非共价修饰的分子，例如通过磷酸化、乙酰化、交联、环化或有限分裂修饰的分子。“结合物质”还可以指能够组合稳定剂、赋形剂、盐、缓冲液、溶剂或添加剂结合靶的分子。“结合”可以定义为结合物质与靶的结合，其中在结合物质可以溶解或悬浮于溶液中的情况下，所述结合导致结合物质的正常布朗运动减少。
“保守修饰的变体”或“保守置换或取代”是指用具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破坏生物学活性。本发明的结合化合物的多个实施方案包含的多肽链所具有的序列在与本文公开的特定氨基酸序列如SEQ ID NO：2、4、5或6相比时，含有至多0(无改变)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个以上的保守氨基酸置换。本文使用的表述“至多X个”保守氨基酸置换包括0个置换和直到X个并包括X个置换的任何数目的置换。此种示例性置换优选依照如下表2中所示的那些来进行：
表2
示例性的保守氨基酸置换
原始残基      保守置换
Ala(A)        Gly；Ser
Arg(R)        Lys；His
Asn(N)        Gln；His
Asp(D)        Glu；Asn
Cys(C)        Ser；Ala
Gln(Q)        Asn
Glu(E)        Asp；Gln
Gly(G)        Ala
His(H)        Asn；Gln
Ile(I)        Leu；Val
Leu(L)        Ile；Val
原始残基      保守置换
Lys(K)        Arg；His
Met(M)        Leu；Ile；Tyr
Phe(F)        Tyr；Met；Leu
Pro(P)        Ala
Ser(S)        Thr
Thr(T)        Ser
Trp(W)        Tyr；Phe
Tyr(Y)        Trp；Phe
Val(V)        Ile；Leu
整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由......组成”或其变形表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。作为非限制性例子，基本上由所提及的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，其不显著影响结合化合物的性质。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病征的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性(参见例如颁发给Netti等的美国专利号5,888,530)。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。效果将导致诊断测量或参数改善至少5％、通常至少10％、更通常至少20％、最通常至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、最优选至少60％、理想地至少70％、更理想地至少80％和最理想地至少90％，其中100％被定义为由正常受试者显示的诊断参数(参见例如Maynard等(1996)A Handbook of SOPs for GoodClinical Practice，Interpharm Press，Boca Raton，FL；Dent(2001)GoodLaboratory and Good Clinical Practice，Urch Publ.，London，UK)。
“外源性”指根据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个的位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
“免疫病症”或“免疫障碍”包括例如病理性炎症、炎性病症和自身免疫性病症或疾病。“免疫病症”还指感染、持续感染和增生性病症，例如癌症、肿瘤和血管发生，包括抗免疫系统根除的感染、肿瘤和癌症。“癌性病症”包括例如癌症、癌细胞、肿瘤、血管发生和癌变前病症，例如发育异常。
“炎性障碍”意指这样的障碍或病理疾病：其中所述病理整体或部分起因于例如免疫系统细胞的数目变化、迁移率变化或活化变化。免疫系统的细胞包括例如T细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞、抗原提呈细胞(APC)、树突细胞、小胶质细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞或与免疫学特异性相关的任何其它细胞，例如生产细胞因子的内皮或上皮细胞。
“分离的结合化合物”是指结合化合物的纯化状态，在本文背景下是指基本上没有其它生物分子(例如核酸、蛋白、脂质、碳水化合物)或其它材料(例如细胞碎片和生长培养基)的分子。一般而言，术语“分离的”无意指完全没有这些材料或没有水、缓冲液或盐，除非它们以显著干扰本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。
“分离的核酸分子”是指基因组DNA或RNA、mRNA、cDNA或它们的合成来源或某些组合，它们不与所述分离的多核苷酸天然存在其中的全部或部分多核苷酸结合，或者它们连接至与其天然不连接的多核苷酸。对于本文公开内容的用途，应当理解的是，“包含或含有”特定核苷酸序列的“核酸分子”不包含完整染色体。“含有”特定核酸序列的分离的核酸分子除了包含特定序列之外，还可以包含至多10个乃至至多20个以上的其它蛋白或其部分的编码序列，或者可以包含有效连接的调节序列，其控制所提及的核酸序列的编码区的表达，和/或可以包含载体序列。
表述“控制序列”是指在特定宿主生物中表达有效连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当将核酸置于与另一个核酸序列的功能性关系之中时，它是“有效连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该DNA与多肽的DNA有效连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列有效连接；或者如果核糖体结合位点的位置使得利于翻译，则其与编码序列有效连接。一般地，“有效连接的”意指被连接的DNA序列是邻接的，并且对分泌前导序列而言，是邻接的并在阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必是邻接的。通过在方便的限制位点上连接来实现相连。如果此种位点不存在，那么依照常规实践使用合成寡核苷酸连接物或接头。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
本文使用的术语“种系序列”是指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可使用任何合适来源的未重排的免疫球蛋白。
“抑制剂”和“拮抗剂”或“活化剂”和“激动剂”分别是指例如用于活化例如配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的抑制或活化分子。例如基因、受体、配体或细胞的调节剂是改变基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中活性在其调节性质方面可被活化、抑制或改变。调节剂可以单独起作用，或者其可以使用辅因子，例如蛋白质、金属离子或小分子。抑制剂是减少、阻断、阻止、延迟活化、灭活、脱敏或下调例如基因、蛋白、配体、受体或细胞的化合物。活化剂是增加、活化、促进、增强活化、敏化或上调例如基因、蛋白、配体、受体或细胞的化合物。抑制剂也可以被定义为减少、阻断或灭活组成型活性的化合物。“激动剂”是与靶相互作用以引起或促进靶活化增加的化合物。“拮抗剂”是对抗激动剂的作用的化合物。拮抗剂阻止、减少、抑制或中和激动剂的活性。拮抗剂还可以阻止、抑制或减少靶例如靶受体的组成型活性，即便在没有已确认的激动剂的情况下。
为了检查抑制程度，例如，包含给定的例如蛋白质、基因、细胞或生物的样品或测定用潜在的活化剂或抑制剂处理，并且与不使用抑制剂的对照样品比较。对照样品，即不用拮抗剂处理的样品，被指定100％的相对活性值。当相对于对照的活性值为约90％以下、典型地85％以下、更典型地80％以下、最典型地75％以下、一般地70％以下、更一般地65％以下、最一般地60％以下、典型地55％以下、通常50％以下、更通常45％以下、最通常40％以下、优选35％以下、更优选30％以下、再更优选25％以下和最优选小于25％时，实现抑制。当相对于对照的活性值为约110％、一般至少120％、更一般至少140％、更一般至少160％、通常至少180％、更通常至少2倍、最通常至少2.5倍、经常至少5倍、更经常至少10倍、优选至少20倍、更优选至少40倍和最优选高于40倍时，实现活化。
活化或抑制的终点可以如下进行监测。例如细胞、生理学流体、组织、器官和动物或人受试者的活化、抑制和对处理的应答可以通过终点进行监测。终点可以包括预定量或百分比的例如炎症、致癌性或细胞脱粒或分泌的标记，例如细胞因子、有毒氧或蛋白酶的释放。终点可以包括例如预定量的离子流或运输；细胞迁移；细胞粘附；细胞增殖；转移潜力；细胞分化；和表型变化，例如，涉及炎症、凋亡、转化、细胞周期或转移的基因表达的变化(参见例如Knight(2000)Ann.Clin.Lab.Sci.30：145-158；Hood和Cheresh(2002)Nature Rev.Cancer2：91-100；Timme等，(2003)Curr.Drug Targets 4：251-261；Robbins和Itzkowitz (2002)Med.Clin.North Am.86：1467-1495；Grady和Markowitz(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.3：101-128；Bauer等，(2001)Glia 36：235-243；Stanimirovic和Satoh(2000)Brain Pathol.10：113-126)。
抑制终点一般是对照的75％以下、优选对照的50％以下、更优选对照的25％以下和最优选对照的10％以下。一般地，活化终点为对照的至少150％、优选对照的至少2倍、更优选对照的至少4倍和最优选对照的至少10倍。
“配体”是指例如可以充当受体的激动剂或拮抗剂的小分子、肽、多肽和膜相关或膜结合分子或其复合物。“配体”还包括不是激动剂或拮抗剂但可以结合受体的试剂。此外，“配体”包括这样的膜结合配体：其已例如通过化学方法或重组方法变成可溶形式的膜结合配体。按照惯例，当配体在第一种细胞上为膜结合的时，受体通常存在于第二种细胞上。第二种细胞可以具有与第一种细胞相同或不同的特性。配体或受体可以是完全胞内的，即，它可以位于胞质、核或一些其它胞内区室中。配体或受体可以改变其定位，例如从胞内区室至质膜的外表面。配体和受体的复合物被称为“配体受体复合物”。当配体和受体涉及信号转导途径时，配体存在于信号转导途径的上游位置，而受体存在于信号转导途径的下游位置。
“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD、优选小于1kD和最优选小于约500Da的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。小分子，例如抗体和细胞因子的肽模拟物，以及小分子毒素，已被描述(参见例如Casset等，(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.307：198-205；Muyldermans (2001)J.Biotechnol.74：277-302；Li(2000)Nat.Biotechnol.18：1251-1256；Apostolopoulos等，(2002)Curr.Med.Chem.9：411-420；Monfardini等，(2002)Curr.Pharm.Des.8：2185-2199；Domingues等，(1999)Nat.Struct.Biol.6：652-656；Sato和Sone(2003)Biochem.J.371：603-608；颁发给Stewart等的美国专利号6,326,482)。
“特异性地”或“选择性地”结合在指配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，指决定蛋白质和其它生物产品的异质群体中的蛋白质存在情况的结合反应。因此，在指定条件下，指定配体与特定受体结合，并且不以显著量与样品中存在的其它蛋白质结合。预期方法的抗体或衍生自抗体的抗原结合位点的结合化合物与其抗原或抗原的变体或突变蛋白质结合，亲和力高达任何其它抗原的亲和力的至少2倍、优选至少10倍、更优选至少20倍和最优选至少100倍。在优选的实施方案中，抗体将具有大于约109M-1的亲和力，例如通过Scatchard分析(Munsen等(1980)Analyt.Biochem.107：220-239)测定。
本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成试剂。免疫应答可以是体液或细胞应答。免疫调节剂包括免疫抑制剂或抗炎剂。
本文使用的“免疫抑制剂”、“免疫抑制药物”或“免疫抑制物”是在免疫抑制治疗中用于抑制或阻止免疫系统活性的治疗剂。在临床上，它们用于阻止移植的器官和组织(例如骨髓、心脏、肾、肝)的排斥，和/或用于自身免疫性疾病或最可能是自身免疫起源的疾病(例如类风湿性关节炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、多发性硬化)治疗中。免疫抑制药物可以分类为：糖皮质激素；细胞抑制剂；抗体(生物应答调节剂)；作用于免疫亲和素的药物；其它药物，包括在增生性病症治疗中使用的已知化疗剂。特别地，对于多发性硬化，本发明的抗体可以与称为克帕松(copaxone)的新类型髓鞘质结合蛋白样治疗剂联合给予。
“抗炎剂”或“消炎药”是指类固醇或非类固醇类治疗剂这二者。类固醇也称为皮质类固醇，是极其类似皮质醇的药物，皮质醇是由肾上腺天然生产的激素。类固醇用作某些炎性病症的主要治疗，例如：系统性脉管炎(血管炎症)；和肌炎(肌肉炎症)。类固醇还可以选择性地用于治疗炎性病症，例如：类风湿性关节炎(在身体两侧上的关节中发生的慢性炎症性关节炎)；系统性红斑狼疮(由异常免疫系统功能引起的全身性疾病)；
Figure A20078003766200301
氏综合征(引起眼睛干涩和口干的慢性病症)。
非类固醇消炎药通常缩写为NSAID，是具有止痛、退热和抗炎作用的药物，它们减少疼痛、发热和炎症。术语“非类固醇”用于区别这些药物与类固醇，所述药物(在广泛范围的其它作用中)具有类似的类二十烷酸抑制、抗炎作用。NSAID一般被指示用于下列病症的症状缓解：类风湿性关节炎；骨关节炎；炎性关节病(例如强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、Reiter氏综合征)；急性痛风；痛经；转移性骨痛；头痛和偏头痛；手术后疼痛；归因于炎症和组织损伤的轻度至中度疼痛；发热；和肾绞痛。NSAID包括水杨酸类、芳基链烷酸类、2-芳基丙酸类(profens)、N-芳基邻氨基苯甲酸类(灭酸类)、昔康类(oxicams)、昔布类(coxibs)和磺酰苯胺类(sulphonanilides)。
改变病情的抗风湿药(DMARD)经常可与NSAID组合给予。经常处方的DMARD包括羟化氯喹/氯喹、甲氨蝶呤、金疗法、柳氮磺胺吡啶和咪唑硫嘌呤。
II.人IL-17A特异性抗体
本发明提供工程改造的抗-IL-17A抗体及其治疗多种炎性疾病、免疫性疾病和增殖性疾病的用途，所述疾病包括类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、类风湿性关节炎骨质疏松症、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和硬化)、炎性肠病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和炎性肠病)、哮喘(包括变应性哮喘)、变态反应、COPD、多发性硬化、银屑病和癌症。
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的抗-IL-17A抗体。例如，可以用连接或未连接(例如天然存在的)形式的IL-17A同二聚体或其片段免疫受体动物。可以使用任何合适的免疫接种方法。这类方法可以包括佐剂、其它免疫刺激剂、重复加强免疫接种以及使用一种或多种免疫接种途径。
任何合适形式的IL-17A都可以用作免疫原(抗原)，用于产生对IL-17A特异性的非人抗体，可筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以为全长的成熟人IL-17A，包括连接的天然同二聚体，或其含单个表位或多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或者与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组的或非基因组的(例如cDNA)。可以使用适合的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、质粒和非病毒载体，例如阳离子脂质。
任何合适的方法都可以用于激发具有所需生物学性质的抗体应答，例如抑制IL-17A与其受体结合。在某些实施方案中，在哺乳动物宿主例如小鼠、啮齿动物、灵长类动物、人等中产生抗体。用于制备单克隆抗体的技术描述可见于例如Stites等(编辑)BASIC ANDCLINICAL IMMUNOLOGY(第4版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，以及其中引用的参考文献；Harlow和Lane(1988)ANTIBODIES：ALABORATORY MANUAL CSH Press；Goding(1986)MONOCLONALANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(第2版)Academic Press，NewYork，NY。因此，单克隆抗体可以通过本领域研究人员熟悉的多种技术获得。一般地，来自用所需抗原免疫的动物的脾细胞通常通过与骨髓瘤细胞融合而永生化。参见Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol.6：511-519。永生化的替代方法包括用EB病毒、癌基因或逆转录酶病毒或本领域已知的其它方法转化。参见例如Doyle等(编辑)(1994和周期增刊)CELL AND TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES，JohnWiley and Sons，New York，NY。筛选产生于单一永生化细胞的集落，用于生产对抗原具有所需特异性和亲和力的抗体。这类细胞生产的单克隆抗体的得率可以通过各种技术得到提高，包括注射入脊椎动物宿主的腹膜腔内。
其它合适的技术涉及在噬菌体或相似载体中选择抗体文库。参见例如Huse等，Science 246：1275-1281(1989)；和Ward等，Nature341：544-546(1989)。本发明的抗体可以不经修饰使用，例如作为亲本啮齿动物抗体，或者修饰使用，以利于其在人类患者中作为治疗剂的用途，例如嵌合或人源化抗体。在某些实施方案中，用提供可检测信号的物质共价或非共价标记抗体。多种多样的标记和缀合技术是已知的，并且在科学文献和专利文献中广泛报道。合适的标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性颗粒等。教导此类标记使用的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。另外，可以生产重组免疫球蛋白，参见Cabilly的美国专利号4,816,567；和Queen等(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：10029-10033；或可以在转基因小鼠中制备，参见Mendez等(1997)Nature Genetics15：146-156；还参见Abgenix和Medarex technologies。
针对IL-17A的预定片段的抗体可以通过用IL-17A的预定片段与载体蛋白质的缀合物免疫接种动物来产生。单克隆抗体由分泌所需抗体的细胞制备。可筛选这些抗体与正常或缺陷型IL-17A的结合。这些单克隆抗体通常将以至少约1μM、更通常至少约300、30、10或3nM、优选至少约300、100、30、10、3或1pM的Kd结合。因为Kd值和亲和性逆相关，所以提到以给定Kd“或以下”结合是指以和所提及的数值至少一样高的亲和力结合，即，以至少和所提及值至少一样低的Kd结合。结合亲和力可通过ELISA测定(参见下文的实施例5-6)，或者通过Biacore
Figure A20078003766200331
表面等离子体共振分光光谱法、KinExA或ECL法(参见下文的实施例7)测定。合适的非人抗体还可以使用下文实施例8-11和16-17中描述的生物学测定进行鉴定。
生产本发明的抗人IL-17A抗体的示例性方法描述于实施例2。
III.IL-17A特异性抗体的人源化
任何合适的非人抗体都可以用作本发明的抗-IL-17A抗体的高变区的来源。非人抗体的来源包括但不限于啮齿动物(例如小鼠、大鼠)、兔形目动物(包括兔)、牛和非人灵长类动物。人源化抗体大概是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)：其中受体的高变区残基被来自具有所需特异性和亲和力的非人物种(供体抗体)的高变区残基替换，所述非人物种例如为小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。而且，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中不存在的残基，例如进行修饰，以进一步精修所需生物学活性的抗体性能。关于进一步的细节，参见Jones等(1986)Nature 321：522-525；Reichmann等(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。
重组改造和生产抗体的方法例如已由Boss等(美国专利号4,816,397)、Cabilly等(美国专利号4,816,567)、Law等(欧洲专利申请公开号438310)和Winter(欧洲专利申请公开号239400)描述。
本发明的人源化抗IL-17A抗体的氨基酸序列变体可通过将合适的核苷酸变化引入人源化抗IL-17A抗体DNA内或通过肽合成来制备。可制备缺失、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，前提是最终构建体具有所需特征。氨基酸变化还可以改变人源化抗IL-17A抗体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。
用于鉴定为诱变优选位置的人源化抗IL-17A抗体的残基或区域的一种有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”。Cunningham和Wells(1989)Science 244：1081-1085。鉴定一组靶残基(例如带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并被中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以改变氨基酸与IL-17A的相互作用。随后通过引入其它的氨基酸置换改进显示出对丙氨酸置换的功能敏感性的残基。在一个实施方案中，通过丙氨酸扫描或随机诱变，接着通过所产生的人源化抗IL-17A抗体变体的活性和结合分析，确定于给定靶密码子处突变的作用。
氨基酸序列插入包括长度为1个残基至包含100个以上残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的人源化抗IL-17A抗体或与表位标签融合的抗体。其它变体包括增加抗体的血清半衰期的酶或多肽与N-末端或C-末端的融合体。另一类变体是氨基酸置换变体。这些变体在已去除了人源化抗IL-17A抗体分子中具有至少一个氨基酸残基，并在其位置中插入不同残基。最令人感兴趣的置换诱变位点包括高变环，但也设想了FR改变。涉及抗原结合的高变区残基或FR残基一般以相对保守的方式进行置换。
抗体的其它氨基酸变体改变抗体的最初糖基化模式，例如通过消除一个或多个碳水化合物部分和/或添加一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化一般是N联或O联的。N联是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链附着。其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促附着的识别序列。多肽中存在这些三肽序列中的任一个产生潜在的糖基化位点。O联糖基化包括N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖与羟基氨基酸、最通常为丝氨酸或苏氨酸的附着，尽管还可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
可如下向本发明的抗体添加糖基化位点：插入一个或多个上述三肽序列(对于N联糖基化位点)，或添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O联糖基化位点)。编码人源化IL-17A特异性抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于：从天然来源中分离(对于天然的氨基酸序列变体)，或通过寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变制备。
通常，人源化抗IL-17A抗体的氨基酸序列变体所具有的氨基酸序列与重链或轻链的原始人源化抗体氨基酸序列具有至少50％、优选至少70％、80％、85％、90％和最优选至少95％的氨基酸序列同一性。针对该序列的同一性或同源性在本文中被定义为：在最佳比对序列(即必要时在比对序列和引入空位后，以达到最大的百分比序列同一性)时，并且不将任何保守置换视为序列同一性的组成部分，候选序列中与人源化抗IL-17A残基相同的氨基酸残基的百分比。N末端、C末端或抗体序列内的内部延伸、缺失或插入中无一被认为影响序列同一性或同源性。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE。在一个实施方案中，抗体是IgG抗体。可以使用IgG的任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。还设想了IgG同种型的变体。人源化抗体可以包含来自一个以上的种类或同种型的序列。通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体易于实现必需恒定结构域序列的最优化，以产生所需生物学活性。
同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ或其变体在本发明的化合物和方法中是有用的。
可以使用来自非人抗体的CDR序列的任何适宜部分产生本发明的人源化抗体。CDR序列可以通过置换、插入或缺失进行诱变，尽管这类突变应是最小的，因为需要维持IL-17A结合亲和性和特异性。典型地，至少75％的人源化抗体CDR残基将对应于非人CDR残基的那些残基，更通常90％，最优选大于95％，经常为100％。可以使用来自人抗体的FR序列的任何适宜部分。FR序列可以通过置换、插入或缺失至少一个残基进行诱变，使得FR序列不同于所用的人和非人抗体序列。预期这类突变应是最小的。通常，至少75％的人源化抗体残基将对应人FR残基的那些残基，更通常90％，最优选大于95％。
还设想了嵌合抗体或其片段，只要它们表现出所需生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad Sci.USA81：6851-6855)。如上所述，一般的嵌合抗体包含来自一个物种的抗体的恒定结构域序列，其连接得自不同物种的抗原特异性抗体的可变结构域。
本发明的结合化合物可以包括双特异性抗体。本文使用的术语“双特异性抗体”是指对至少2种不同抗原表位具有结合特异性的抗体，一般是单克隆抗体。在一个实施方案中，表位来自相同抗原。在又一个实施方案中，表位来自2种不同抗原。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，双特异性抗体可以使用2个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达来重组生产。参见例如Milstein等(1983)Nature 305：537-39。或者，双特异性抗体可以使用化学键制备。参见例如Brennan等(1985)Science 229：81。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见例如Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48，Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。
人源化本发明的抗人IL-17A抗体的示例性方法描述于实施例3。
IV.IL-17A特异性抗体的表征
本文描述的方法用于产生与人IL-17A免疫反应的单克隆抗体，如在实施例2和3中更详细地描述。图1A和1B分别显示了本发明的多种抗IL-17A抗体的轻链和重链的可变区的序列比对。指示了CDR区，编号依照Kabat等(1991)。
含有编码人源化16C10轻链和重链的核酸序列的质粒按照布达佩斯公约于2006年6月28日以保藏号PTA-7675保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC-Manassas，Virginia，USA)。表达抗体30C10和23E12的杂交瘤分别以JL7-30C10.C3和JL7-23E12.B10按照布达佩斯公约于2006年7月20日以保藏号PTA-7739和PTA-7740保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC-Manassas，Virginia，USA)。
本发明的多种人源化抗体的轻链和重链CDR分别提供于表3和4。另外，表4提供了用于hu16C10的VH的另外的CDR，其具有可变位置，在该位置，可以使用1个以上的氨基酸。
表3.可变轻链CDR序列
  抗体   CDRL1   CDRL2  CDRL3
  人16C10   KSSQSLLFSENQKNYLA(SEQ ID NO：11)   WTSTRQS(SEQ IDNO：12)  QQSYYTPYT(SEQ IDNO：13)
  人4C3   KSSQSLLFSENQKNYLA(SEQ ID NO：11)   WTSTRQS(SEQ IDNO：12)  QQSYYTPYT(SEQ IDNO：13)
  人23E12   QASEDIYSGLA(SEQ ID NO：48)   GASRLHD(SEQ IDNO：49)  QQGLKYPPT(SEQ IDNO：50)
  人30C10   KSSQSLFWSESHMNYLA   YASTRQS   HHHYDSHT
 (SEQ ID NO：26)   (SEQ IDNO：27)  (SEQ IDNO：28)
  人12E6  RTSQDIGNYLS(SEQ ID NO：34)   GASNLED(SEQ IDNO：35)  LQYDKYPNT(SEQ IDNO：36)
  大鼠1D10  KASQNINKYLD(SEQ ID NO：56)   NADNLHT(SEQ IDNO：57)  LQRESWPYT(SEQ IDNO：58)
表4.可变重链CDR序列
  抗体   CDRH1   CDRH2   CDRH3
 人16C10  GFSLPSHSVS(SEQ ID NO：14)   IIWNQGGTDYNSAFKS(SEQ ID NO：16)   NAYITDYYYENYFMDA(SEQ ID NO：19)
 人16C10可变  GFSLPSHSVS(SEQ ID NO：14)   IIWNX1GGTDYX2SAFKSX1＝N，A，QX2＝N，A，Q(SEQ ID NO：17)   NX3YITDYYYENYFX4DAX3＝M，L，A，K，FX4＝M，F，L(SEQ ID NO：20)
 人4C3  GFSLPSHSVS(SEQ ID NO：14)   HWNQGGTDYNSAFKS(SEQ ID NO：16)   NAYITDYYYENYFMDA(SEQ ID NO：19)
 人23E12  GFSLTNNGVT(SEQ ID NO：51)   EVSSGGSTDYNSALKS(SEQ ID NO：52)   QEVFTGLLDY(SEQ ID NO：53)
 人30C10  GFTFNNYWMT(SEQ ID NO：29)   SVSNTGSSTYYPASVKG(SEQ ID NO：30)   EGAYYLDY(SEQ ID NO：31)
 人12E6  GFTFRDYYMV(SEQ ID NO：37)   SISYEGSSIYYGESVKG(SEQ ID NO：38)   HGFNPFDY(SEQ ID NO：39)
 大鼠1D10  GFSLTNYYVH(SEQ ID NO：59)   GVWNDGDTSYNSVLRS(SEQ ID NO：60)   EGREGFVGYYVMDA(SEQ ID NO：61)
一般而言，人源化抗体的CDR与亲本大鼠抗体的CDR相同，例外的是人16C10和人4C3的CDRH2和CDRH3，其各自具有从对应大鼠CDR的单个氨基酸改变。尽管它们作为独立的克隆获得，但亲本大鼠抗体16C10和4C3在VH区序列方面相同，在VL区中的不同之处仅在于构架置换(在16C10中15位的异亮氨酸在4C3中为缬氨酸)。结果，这两个亲本大鼠抗体的CDR相同，因此它们的人源化形式相同。
分别于SEQ ID NO：5和22提供了抗体16C10/4C3和30C10的人源化VL区的序列。分别于SEQ ID NO：6和23提供了抗体16C10/4C3和30C10的人源化VH区的序列。可通过加入适宜的恒定结构域序列，使用这些人源化可变结构域产生全长嵌合抗体或人源化抗体。其它实施方案包括16C10重链中的CDR氨基酸残基的多种其它改变，例如在表4中所述。关于图1B的残基编号，在表4中(和在SEQ ID NO：17和20中)描述的改变为N54A、N54Q、N60A、N60Q、M96L、M96A、M96K、M96F、M100hF、M100hL。
在本发明的一个实施方案中，通过将人恒定结构域(分别为人κ轻链和人IgG1恒定结构域)附加至人源化VL(SEQ ID NO：5)和VH区(SEQ ID NO：6)的C-末端，产生抗体16C10的嵌合轻链和重链。嵌合16C10轻链和重链的序列提供于SEQ ID NO：9和10。在其它实施方案中，通过将来自嵌合16C10的相同恒定结构域融合至它们各自的人源化VL和VH区(对于30C10为SEQ ID NO：22和23；对于4C3为SEQID NO：5和6)，产生抗体30C10和4C3的嵌合形式。当然，嵌合形式的人源化4C3应与嵌合形式的人源化16C10相同。
在又一个实施方案中，用人种系构架序列置换嵌合形式抗体的构架残基(即，不是CDR组成部分的可变结构域中的那些氨基酸残基)，产生全长人源化抗体，如在实施例3中更详细地描述。产生的抗体仅保留大鼠抗体的CDR序列，恒定结构域和构架序列被人源序列取代。包含信号序列的人源化抗体16C10的全长轻链和重链分别于SEQ IDNO：2和4提供。在其它实施方案中，通过类推对16C10所述的方法，即，将适宜的人构架序列置换入嵌合形式的这些抗体的序列(上文描述)中，产生人源化形式的抗体4C3和23E12。参见实施例3。
在又一个实施方案中，克隆本发明的人源化抗体的全长轻链和重链，以在其N-末端具有信号肽，从而在生产抗体时利于由细胞分泌。在一个实施方案中，将19个氨基酸的信号序列添加至人源化16C10抗体的轻链和重链这二者(SEQ ID NO：2和4的残基-19至-1)。添加信号序列的人源化16C10的全长轻链和重链的DNA序列提供于SEQ IDNO：1和3。可在任何适于本发明的人源化抗体生产的表达载体中克隆和表达这类DNA序列。在其它实施方案中，如对抗体16C10所述，可将信号序列添加至人源化抗体30C10和4C3的轻链和重链。在其它实施方案中，根据预期的抗体生产方法，添加与在SEQ ID NO：1-4中提供的具体信号序列不同的信号序列肽。这类信号序列可得自科学文献，例如Choo等(2005)“SPdb-a signal peptide database，”BMCBioinformatics 6：249。
在其它的实施方案中，可以给本文提供的人源化VL和VH区附加不同的恒定结构域。例如，如果本发明的抗体(或片段)的特定预期用途要求改变的效应子功能，那么可以使用除IgG1外的重链恒定结构域。尽管IgG1抗体提供长半衰期和效应子功能，例如补体活化和抗体依赖性细胞毒性，但此种活性可能不是抗体的所有用途所需要的。在此类情况下可以使用例如IgG4恒定结构域。
V.人源化抗IL-17A的亲和性和生物学活性
可以就体外、体内抑制性生物活性或通过检测结合亲和力筛选具有在本文中鉴定为人源化抗IL-17A抗体所需特征的抗体。为了筛选与由目标抗体结合的人IL-17A上的相同表位结合的抗体(例如阻断细胞因子与其受体结合的那些抗体)，可以实施例如在ANTIBODIES，ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow和DavidLane编辑(1988)中描述的常规交叉阻断测定。或者，可以实施例如在Champe等(1995)J.Biol.Chem.270：1388-1394中描述的表位作图，以确定抗体是否结合目标表位。抗体亲和力(例如对于人IL-17A)可以使用标准方法进行测定，包括在实施例7中描述的那些方法。优选的人源化抗体是以不超过约100nM(1×10-7M)；优选不超过约10nM；更优选不超过约1nM的Kd值结合人IL-17A的那些。在甚至更优选的实施方案中，抗体具有的Kd值不超过约200pM(2×10-10M)、100pM、50pM、20pM、10pM、5pM乃至2pM。
在本发明化合物和方法中有用的抗体及其片段包括但不限于生物学活性抗体和片段。本文使用的术语“生物学活性”是指能够结合所需抗原表位并且直接或间接发挥生物学作用的抗体或抗体片段。通常，这些作用起因于IL-17A不能与其受体结合。本文使用的术语“特异性”是指抗体与靶抗原表位的选择性结合。通过在一组给定条件下比较与IL-17A的结合和与无关抗原或抗原混合物的结合，可以测试抗体的结合特异性。如果抗体与IL-17A结合的亲和力高达其对无关抗原或抗原混合物的亲和力的至少10倍并优选50倍，那么该抗体被视为特异性的。与含有IL-17A(或其片段)的蛋白“特异性结合”的抗体不结合不含IL-17A衍生序列的蛋白，即，本文所用的“特异性”涉及IL-17A特异性，而不涉及可能存在于所研究蛋白中的任何其它序列。例如，本文使用的与FLAG-hIL-17A“特异性结合”的抗体为包含IL-17A和FLAG
Figure A20078003766200411
肽标签的融合蛋白，单独地或与非IL-17A的蛋白融合时不结合FLAG
Figure A20078003766200412
肽标签。
在以下实施例(例如实施例7)中提供的数据表明，人源化抗体16C10(相对于亲本大鼠重链CDR包含N54Q和M96A置换)对结合人IL-17A具有高亲和力，据KinExA分析测定Kd在1-10pM范围内。体外活性测定，例如Ba/F3 hIL-17Rc-GCSFR细胞增殖测定(实施例11)、正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)测定(实施例9)和人类风湿性关节炎(RA)滑膜细胞测定(实施例8)，证实hu16C10是高亲和性抗体，因为观测到的IC50值通常小于或等于测定中存在的hIL-17A浓度(在3个测定中分别为100pM、1000pM和1000pM)的50％。在实验中所用的抗体的二价特征和IL-17A二聚体形成的潜力使得有可能以低于0.5摩尔当量的抗体实现对给定浓度的IL-17A的50％抑制。体内活性测定，例如给予表现出胶原诱导的关节炎的小鼠(实施例16)和BAL嗜中性粒细胞募集测定(实施例17)，证实了本发明的几种抗IL-17A抗体在动物中的活性。体外和体内活性测定还证实，人源化抗体16C10是中和抗体，这由单独的结合实验无法了解。
本发明的几种抗体结合猕猴IL-17A以及人IL-17A的能力是有利的，因为此潜在的治疗性抗体可直接用于对猕猴的毒理学研究，而不必开发单独的猕猴特异性抗体用于这类研究。本发明的几种抗体的高亲和力也是有利的，因为可减少人(和其它)患者需要的剂量，这降低了某些副反应的可能性。另外，高亲和性可减少必需给予患者的量和降低了治疗成本。
检测小鼠和猕猴的hu16C10的血清半衰期。对于猕猴，以0.4mg/kg、4.0mg/kg和40mg/kg给药的剂量范围研究评价静脉内(iv)给药后的半衰期。在42天内定期检测药物的血清浓度。以4mg/kg给药测定猕猴皮下(sc)给药的半衰期，对其也跟踪42天。根据药物浓度对时间图的终点斜率检测，在猕猴中的半衰期为10-19天iv和28天sc。在较高剂量时的某些反常数据点被排除在分析之外。对小鼠的类似的实验显示，hu16C10抗体具有的半衰期为13-25天iv和12-22天sc。
实施例19描述了用于测定由本发明的示例性抗IL-17A抗体(16C10)结合的表位的方法，即人IL-17A的L74-Y85区域中的残基(SEQ ID NO.：40)。因为本文提供的生物学测定证实抗体16C10是高亲和性中和抗体，所以预期结合相同表位的其它抗体也可能是中和抗体，也可能具有高结合亲和性。本文测定的表位通过功能性检测而不是结构测定获得，本文报告的表位在细节上与通过结构方法测定的表位不同。本文报告的表位包含至少某些但不是必须全部的对抗体16C10结合重要的氨基酸残基。由本发明的抗体结合的表位还可以通过其它方法确定，例如交叉阻断实验(参见实施例12)，或通过结构性方法如X-射线晶体结构测定。例如通过筛选针对hIL-17A产生的抗体，或通过用含有表位序列的肽免疫接种动物，可以获得与抗体16C10结合相同表位的其它抗体。
V.抗体生产
关于抗体的重组生产，分离编码其的核酸并插入能复制的载体中，用于进一步克隆(DNA扩增)或用于表达。使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)易于分离并测序编码单克隆抗体的DNA。许多载体是可用的。载体组分一般包括但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。在一个实施方案中，本发明的人源化抗IL-17A抗体的轻链和重链这两者由相同载体例如质粒或腺病毒载体表达。
本发明的抗体可以通过本领域已知的任何方法生产。在一个实施方案中，抗体在培养的哺乳动物或昆虫细胞中表达，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)293细胞、小鼠骨髓瘤NSO细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢(Sf9)细胞。在一个实施方案中，由CHO细胞分泌的抗体被回收并通过标准层析法进行纯化，例如A蛋白、阳离子交换、阴离子交换、疏水作用和羟磷灰石层析。所获抗体被浓缩并贮存于20mM乙酸钠pH 5.5中。
在又一个实施方案中，本发明的抗体根据WO2005/040395中所述方法在酵母中进行生产。简言之，将编码目标抗体的单独轻链或重链的载体引入不同的酵母单倍体细胞内，例如不同交配型的酵母巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)，所述酵母单倍体细胞可选地为互补营养缺陷体。转化的单倍体酵母细胞随后可以进行交配或融合，以产生能够生产重链和轻链这两者的二倍体酵母细胞。二倍体菌株随后能够分泌完全装配的和生物学活性的抗体。2条链的相对表达水平例如可如下优化：使用具有不同拷贝数的载体、使用不同强度的转录启动子或由驱动编码1条或2条链的基因转录的诱导型启动子诱导表达。
在一个实施方案中，将多种不同的抗IL-17A抗体(“原始”抗体)各自的重链和轻链引入酵母单倍体细胞内，以产生表达多条轻链的一种交配型的单倍体酵母菌株文库，和表达多条重链的不同交配型的单倍体酵母菌株文库。这些单倍体菌株文库可以进行交配(或融合为原生质球)，以生产表达包含轻链和重链的各种可能排列的抗体组合文库的一系列二倍体酵母细胞。随后可以筛选抗体组合文库，以确定任一个抗体是否具有优于(例如对IL-17A的更高亲和力)原始抗体的性质。参见例如WO2005/040395。
在又一个实施方案中，本发明的抗体是其中抗体可变结构域的部分以分子量约13kDa的多肽连接的人结构域抗体。参见例如美国专利公开号2004/0110941。就合成的容易性、稳定性和给药途径而言，这样的单结构域、低分子量物质提供了众多优点。
VI.药物组合物和给药
为制备本发明的抗huIL-17A抗体的药物或无菌组合物，使抗体与药学上可接受的载体或赋形剂混合，参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia：National Formulary，Mack Publishing Company，Easton，PA(1984)。
治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与例如冻干粉末、淤浆、水溶液或混悬液形式的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(参见例如Hardman等，(2001)Goodman and Gilman′s ThePharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams和Wilkins，New York，NY；Avis等，(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等，(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman等，(编辑)(1990)Pharmaceutical DosageForms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY)。在一个实施方案中，用乙酸钠溶液pH 5-6将本发明的抗IL-17A抗体稀释至适宜的浓度，并为了渗透压而加入NaCl或蔗糖。可以加入另外的物质，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，以增强稳定性。
单独或与另一种药剂组合给予的抗体组合物的毒性和疗效可以通过细胞培养或实验动物的标准药学程序来测定，例如用于测定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗上有效的剂量)的标准药学程序。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数(LD50/ED50)。优选显示高治疗指数的抗体。由这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人使用的一系列剂量。这类化合物的剂量优选处于包括基本没有或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可根据使用的剂型和给药途径在此范围内变化。
给药方式不是特别重要的。合适的给药途径包括经口、直肠、透粘膜或肠内给药；肠胃外递送，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。给药可以以多种常规方式进行，例如经口摄食、吸入、吹入、局部应用或皮肤、透皮、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。优选静脉内对患者给药。
或者，人们可以以局部而不是全身方式给予抗体，例如，将抗体直接注射到关节炎的关节或特征在于免疫病理学的病原体诱导的病灶内，通常以贮存或持续释放制剂。而且，人们可以给予在靶向药物递送系统中的抗体，例如，在用组织特异性抗体包被的脂质体中，靶向例如关节炎的关节或特征在于免疫病理学的病原体诱导的病灶。脂质体将被靶向受害组织并被受害组织选择性吸收。
给药方案取决于几种因素，包括治疗性抗体的血清或组织周转率、症状水平、治疗性抗体的免疫原性和生物基质中靶细胞的可接近性。优选地，给药方案递送的治疗性抗体足以实现目标病况的改善，同时使不需要的副作用最小。因此，递送的生物制剂的量部分取决于特定治疗性抗体和待治疗病症的严重性。选择合适剂量的治疗性抗体的指引是可获得的(参见例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy，Bios Scientific Pub.Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina(编辑)(1991)Monoclonal Antibodies，Cytokines and Arthritis，Marcel Dekker，NewYork，NY；Bach(编辑)(1993)Monoclonal Antibodies and PeptideTherapy in Autoimmune Diseases，Marcel Dekker，New York，NY；Baert等，(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。
合适剂量的确定由临床医生进行，例如，使用本领域已知或怀疑影响治疗的参数或因素。一般地，剂量以略微小于最佳剂量的量开始，其后通过小增量增加，直至相对于任何负面副作用达到所需或最佳作用。重要的诊断测量包括例如产生的那些炎症症状或产生的炎性细胞因子水平。优选地，将要使用的生物制剂衍生自与治疗靶标的动物相同的物种，从而使针对试剂的炎性、自身免疫性或增生性应答减到最小。对于人类患者，例如，优选嵌合、人源化和全人抗体。
抗体、抗体片段和细胞因子可以通过连续输注提供或通过例如1天1次、1-7次/周、1周1次、2周1次、1月1次、2月1次等剂量给药。剂量可以静脉内、皮下、局部、经口、鼻、直肠、肌内、大脑内、脊柱内或通过吸入提供。每周总剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg以上(参见例如Yang等，(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等，(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等，(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等，(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144)。还可以提供剂量，以在患者血清中实现预定的抗IL-17A抗体目标浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml以上。在其它实施方案中，本发明的人源化抗IL-17A抗体以1周1次、2周1次或“每4周1次”为基础以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/患者皮下或静脉内给予。
本文使用的“抑制”或“治疗”或“处理”包括与障碍相关的症状发展的延缓，和/或此种障碍的症状严重性的降低。该术语进一步包括改善现有的不受控的或有害的症状、预防另外的症状和改善或预防这类症状的潜在原因。因此，该术语指已赋予脊椎动物患者的有益结果，所述患者患有障碍、疾病或症状，或可能发生此种障碍、疾病或症状。
本文使用的术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指本发明的IL-17A结合化合物的量，该量在单独或与另外的治疗剂组合给予细胞、组织或患者时，有效预防或改善疾病或病症的一种或多种症状或此疾病或病症的进程。治疗有效剂量进一步指这样的结合化合物量：其足以使症状改善，例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病症，或治疗、治愈、预防或改善这类病症的比率增加。当应用于单独给予的单个活性成分时，治疗有效剂量是指单独的该成分。当应用于组合时，治疗有效剂量是指产生疗效的活性成分的组合量，无论是组合、顺次还是同时给予。治疗剂的有效量将使诊断测量或参数改善至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％；和最优选至少50％。
与第二种治疗剂(例如细胞因子、另一种治疗性抗体、类固醇、化疗剂或抗生素)共给予的方法在本领域众所周知，参见例如Hardman等，(编辑)(2001)Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第10版，McGraw-Hill，New York，NY；Poole和Peterson(编辑)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A PracticalApproach，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，PA；Chabner和Longo(编辑)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，PA。本发明的药物组合物还可以包括免疫抑制剂或免疫调节剂。可以使用任何合适的免疫抑制剂，包括但不限于抗炎剂、皮质类固醇、环孢菌素、他克莫司(即FK-506)、西罗莫司、干扰素、可溶性细胞因子受体(例如sTNRF和sIL-1R)、中和细胞因子活性的药剂(例如英夫利昔单抗、依那西普)、霉酚酸酯、15-脱氧精胍菌素、沙立度胺、格拉默、硫唑嘌呤、来氟洛米、环磷酰胺、氨甲蝶呤等。药物组合物还可以与其它治疗方式例如光线疗法和放射疗法一起使用。
本发明的IL-17A结合化合物还可以与一种或多种其它细胞因子的拮抗剂(例如抗体)组合使用，所述细胞因子包括但不限于IL-23、IL-1β、IL-6和TGF-β。参见例如Veldhoen(2006)Immunity 24：179-189；Dong(2006)Nat.Rev.Immunol.6(4)：329-333。在多个实施方案中，本发明的IL-17A结合化合物在给予另一种或多种拮抗剂之前、同时或之后给予。在一个实施方案中，本发明的IL-17A结合化合物单独地或与IL-23拮抗剂组合用于治疗急性早期的不利免疫应答(例如MS、克罗恩氏病)。在后一种情况下，IL-17A结合化合物可逐渐减少，并继续用IL-23拮抗剂单独治疗，以保持对不利应答的抑制。或者，可与本发明的IL-17A结合化合物同时、之前或之后给予IL-1β、IL-6和/或TGF-β的拮抗剂。参见Cua和Kastelein(2006)Nat.Immunol.7：557-559；Tato和O’Shea(2006)Nature 441：166-168；Iwakura和Ishigame(2006)J.Clin.Invest.116：1218-1222。
典型的兽医学、实验或研究受试者包括猴、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。
VII.用途
本发明提供使用工程改造的抗IL-17A抗体治疗和诊断炎性障碍和病症以及自身免疫性病症和增生性病症的方法。提供用于诊断、预防或治疗下述疾病的方法：炎性肠病(IBD)、多发性硬化(MS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊肿性纤维化(CF)、银屑病、系统性硬皮病、同种异体移植物排斥、自身免疫性心肌炎和腹膜粘连(参见例如Chung等(2002)J.Exp.Med.195：1471-78)。
银屑病
皮肤用作内环境和外环境之间的重要边界，防止与潜在有害的抗原接触。在抗原/病原体穿透的情况下，诱导炎性反应以消除抗原。该反应产生主要由T细胞、多形核细胞和巨噬细胞组成的皮肤浸润物(参见例如Williams和Kupper(1996)Life Sci.，58：1485-1507)。通常，由病原体触发的该炎性反应处于严密控制之下，将在病原体消除时被终止。
在某些情况下，在没有外部刺激和没有适宜控制的情况下发生该炎性反应，导致皮肤发炎。本发明提供治疗和诊断皮肤炎症的方法。皮肤炎症是以上提及的细胞浸润以及由这些细胞分泌的细胞因子的结果，包括几种炎性疾病，例如瘢痕性类天疱疮、硬皮病、化脓性汗腺炎、中毒性表皮坏死松解症、痤疮、骨炎、移植物抗宿主病(GvHD)、坏疽性脓皮病和白塞氏综合征(参见例如Willams和Griffiths(2002)Clin.Exp.Dermatol.，27：585-590)。最常见形式的皮肤炎症是银屑病。
银屑病的特征在于T细胞介导的角化细胞过度增殖连同炎性浸润。该病具有某些截然不同的重叠临床表型，包括慢性斑块病灶、斑疹和脓疱病灶(参见例如Gudjonsson等(2004)Clin Exp.Immunol.135：1-8)。约10％的银屑病患者发生关节炎。该病具有很强但复杂的遗传倾向性，单卵双胞胎中存在60％的一致性。
典型的银屑病病灶是被浓厚的银色鳞屑覆盖的界限分明的红斑。银屑病组织的炎症和过度增殖与和正常皮肤不同的组织学、抗原性和细胞因子谱相关。与银屑病相关的细胞因子有：TNFα、IL-19、IL-18、IL-15、IL-12、IL-7、IFNγ、IL-17A和IL-23(参见Gudjonsson等，出处同上)。已在银屑病皮肤中检测到IL-17A。
本发明的抗IL-17A抗体可单独地或与其它药剂组合用于预防、治疗、诊断和预测银屑病发作。抗IL-17A抗体在银屑病爆发的预测和治疗中的用途描述于共同转让的美国专利申请公布号2005/0287593和PCT专利公布号WO 2005/108616，这些文献的公开内容整体在此引入作为参考。
类风湿性关节炎(RA)
RA是以滑膜关节炎为特征的一种渐进性系统疾病，侵袭约0.5％的世界人口。Emery(2006)BMJ 332：152-155。关节炎可导致畸形、疼痛、僵硬和肿胀，并最终导致关节的不可逆退化。受侵袭的关节包括膝盖、肘、颈以及手和足部的关节。常规治疗包括使用NSAID减轻症状，之后给予改变病情的抗风湿药(DMARD)，例如金、青霉胺、柳氮磺胺吡啶和甲氨蝶呤。最近的进展包括用TNF-α抑制剂治疗，包括单克隆抗体，例如英夫利昔单抗、阿达木单抗(adalumimab)和戈利木单抗，以及受体融合蛋白，例如依那西普。用这些TNF-α抑制剂治疗急剧降低来自该疾病的结构损伤。
本发明的抗IL-17A抗体可在需要此治疗的患者中使用以治疗RA。实施例16描述了涉及RA的胶原诱导的关节炎(CIA)模型的实验，其数据提供于图3A-3D和表15。结果表明，与稀释剂和同种型对照相比，在用本发明的抗IL-17A抗体治疗的动物中，具有高疾病严重性记分的脚爪的比例下降。
本发明的抗IL-17A抗体还可以与其它RA治疗剂组合，例如甲氨蝶呤、咪唑硫嘌呤、环磷酰胺、类固醇、霉酚酸酯、NSAID或TNF-α抑制剂(抗体或受体片段)。
在一个实施方案中，本发明的抗IL-17A抗体用于治疗先前对单独的DMARD治疗没有充分响应的人类患者。在又一个实施方案中，在病程的早期开始用本发明的抗IL-17A抗体治疗，无需先前失败的DMARD治疗。例如，一旦已明确了抗体治疗的安全性，这样的早期干预就可能是适宜的。
通过测定ACR记分检测临床改善，如在实施例18中更详细的描述。在多个实施方案中，20、50和70的ACR记分是理想终点，这些终点可在治疗过程中的任何适宜的点评价，例如5、10、15、24、40、50或更多周。
多发性硬化(MS)
MS被认为是中枢神经系统(CNS)的自身免疫病，涉及神经纤维的髓磷脂损失，产生斑块或病灶。最常见的形式是复发型MS/缓解型MS，其中发生意义明确的症状发作，之后是部分或完全缓解的阶段。常规治疗选择包括干扰素-β-1a和-1b、米托蒽醌、四肽乙酸格拉默、治疗性α-4-整联蛋白特异性抗体(那他珠单抗)或α-4-整联蛋白的小分子拮抗剂(例如在WO2003/084984中公开的那些)。
在其需要患者中可使用本发明的抗IL-17A抗体治疗MS。抗IL-17A抗体还可以与其它MS治疗剂联合应用，例如干扰素-β、干扰素-α、类固醇或α-4-整联蛋白特异性抗体。
炎性肠病(IBD)
IBD是其中肠发炎导致腹部绞痛和疼痛、腹泻、减重和肠出血的一类疾病(例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)的名称。美国有600,000多人患有IBD。常规治疗选择包括柳氮磺胺吡啶、皮质类固醇(例如强的松)、免疫系统抑制剂如咪唑硫嘌呤和巯基嘌呤或用于克罗恩氏病的抗生素(例如甲硝唑)。治疗性单克隆抗体治疗包括依那西普、那他珠单抗和英夫利昔单抗。
本发明的抗IL-17A抗体可用于需要此治疗的患者以治疗IBD。Yen等(2006)J.Clin.Invest.116：1310-1316；Fujimo等(2003)Gut52：65-70。本发明的抗IL-17A抗体还可以与用于IBD的其它治疗剂如IL-10(参见美国专利号5,368,854、7,052,686)、类固醇和柳氮磺胺吡啶组合。
在其它实施方案中，在治疗上使用不阻断IL-17A与其受体(例如非中和性抗体12E6)结合的本发明抗体，以在需要延长的IL-17A活性的患者中稳定IL-17A。这类患者包括罹患感染或癌症的患者。
对本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可实施本发明的许多修饰和变化。本发明由随附权利要求的条款连同此权利要求授权的等同方案的全部范围限定。本文描述的具体实施方案，包括以下实施例，仅为了举例而提供，其细节不限制本发明的范围。
实施例1
一般方法
分子生物学的标准方法已有描述(Maniatis等，(1982)MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press，San Diego，CA)。标准方法还见于Ausbel等，(2001)Current Protocols in MolecularBiology，第1-4卷，John Wiley and Sons，Inc.New York，NY，其描述了在细菌细胞中克隆和DNA诱变(第1卷)、在哺乳动物细胞和酵母中克隆(第2卷)、复合糖和蛋白质表达(第3卷)，以及生物信息学(第4卷)。
蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶，已有描述(Coligan等，(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产、蛋白糖基化(参见例如Coligan等，(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York；Ausubel等，(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第3卷，John Wiley and Sons，Inc.，NY，NY，第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich，Co.(2001)Products for Life Science Research，St.Louis，MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)Bio Directory，Piscataway，N.J.，第384-391页)。多克隆抗体和单克隆抗体的生产、纯化和片段化已有描述(Coligan等，(2001)Current Protcols inImmunology，第1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Harlow和Lane，出处同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见例如Coligan等，(2001)Current Protcols in Immunology，第4卷，John Wiley，Inc.，New York)。
可以制备单克隆抗体、多克隆抗体和人源化抗体(参见例如Sheperd和Dean(编辑)(2000)Monoclonal Antibodies，Oxford Univ.Press，New York，NY；Kontermann和Dubel(编辑)(2001)AntibodiesEngineering，Springer-Verlag，New York；Harlow和Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第139-243页；Carpenter等，(2000)J.Immunol.165：6205；He等，(1998)J.Immunol.160：1029；Tang等(1999)J.Biol.Chem.274：27371-27378；Baca等(1997)J.Biol.Chem.272：10678-10684；Chothia等(1989)Nature 342：877-883；Foote和Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487-499；美国专利第6,329,511号)。替代人源化的是使用转基因小鼠展示在噬菌体或人抗体文库上的人抗体文库(Vaughan等(1996)Nature Biotechnol.14：309-314；Barbas(1995)NatureMedicine 1：837-839；Mendez等(1997)Nature Genetics 15：146-156；Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21：371-377；Barbas等(2001)Phage Display：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Kay等(1996)PhageDisplay of Peptides and Proteins：A Laboratory Manual，Academic Press，San Diego，CA；de Bruin等(1999)Nature Biotechnol.17：397-399)。
单链抗体和双体已有描述(参见例如Malecki等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：213-218；Conrath等(2001)J.Biol.Chem.276：7346-7350；Desmyter等(2001)J.Biol.Chem.276：26285-26290；Hudson和Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231：177-189；和美国专利第4,946,778号)。双功能抗体已有提供(参见例如Mack等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods248：7-15；Volkel等，(2001)Protein Engineering 14：815-823；Segal等，(2001)J.Immunol.Methods 248：1-6；Brennan等，(1985)Science229：81-83；Raso等，(1997)J.Biol.Chem.272：27623；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Traunecker等，(1991)EMBO J.10：3655-3659；和美国专利第5,932,448、5,532,210和6,129,914号)。
双特异性抗体也已有提供(参见例如Azzoni等(1998)J.Immunol.161：3493；Kita等(1999)J.Immunol.162：6901；Merchant等(2000)J.Biol.Chem.74：9115；Pandey等(2000)J.Biol.Chem.275：38633；Zheng等(2001)J.Biol Chem.276：12999；Propst等(2000)J.Immunol.165：2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17：875)。
抗原纯化对于产生抗体不是必需的。动物可用携带目标抗原的细胞免疫。然后可由已免疫动物分离脾细胞，脾细胞可与骨髓瘤细胞系融合，以产生杂交瘤(参见例如Meyaard等(1997)Immunity 7：283-290；Wright等(2000)Immunity 13：233-242；Preston等，出处同上；Kaithamana等(1999)J.Immunol.163：5157-5164)。
抗体通常将以至少约10-6M、通常至少10-7M、更通常至少10-8M、优选至少约10-9M和更优选至少10-10M以及最优选至少10-11M的Kd结合(参见例如Presta等(2001)Thromb.Haemost.85：379-389；Yang等(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.38：17-23；Carnahan等(2003)Clin.Cancer Res.(增刊)9：3982s-3990s)。
抗体可缀合例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)。抗体对治疗、诊断、试剂盒或其它用途有用，并包括偶联例如染料、放射性同位素、酶或盐如胶体金的抗体(参见例如Le Doussal等(1991)J.Immunol.146：169-175；Gibellini等(1998)J.Immunol.160：3891-3898；Hsing和Bishop(1999)J.Immunol.162：2804-2811；Everts等(2002)J.Immunol.168：883-889)。
用于流式细胞术的方法，包括荧光活化细胞分拣术(FACS)，是可用的(参见例如Owens等，(1994)Flow Cytometry Principles for ClinicalLaboratory Practice，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版；Wiley-Liss，Hoboken，NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ)。适于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体以及适合用作例如诊断试剂的荧光试剂是可用的(Molecular Probes(2003)Catalogue，MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue，St.Louis，MO)。
描述了免疫系统组织学的标准方法(参见例如Muller-Harmelink(编辑)(1986)Human Thymus.Histopathology and Pathology，SpringerVerlag，New York，NY；Hiatt等，(2000)Color Atlas of Histology，Lippincott，Williams和Wilkins，Phila，PA；Louis等，(2002)BasicHistology：Text and Atlas，McGraw-Hill，New York，NY)。
用于测定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可用的(参见例如GenBank，Vector NTI
Figure A20078003766200551
Suite(Informax，Inc，Bethesda，MD)；GCGWisconsin Package(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)；DeCypher
Figure A20078003766200552
(TimeLogic Corp.，Crystal Bay，Nevada)；Menne 等，(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne等，(2000)BioinformaticsApplications Note 16：741-742；Wren等，(2002)Comput.MethodsPrograms Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690)。
实施例2
大鼠抗人IL-17A单克隆抗体
如下获得人IL-17A的单克隆抗体。给8周龄的雌性Lewis大鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，Indiana，USA)注射一系列已由HEK 293细胞中的腺病毒载体表达的重组人IL-17A(rhIL-17A)。注射于第0、14、32、46和83天给予。
第0天的注射是皮下(sc)注射50μg rhIL-17A，同时腹膜内(ip)注射弗氏完全佐剂。第14、32和46天sc注射25μg rhIL-17A同时ip注射弗氏不完全佐剂。第83天的注射为组合型的ip注射20μgrhIL-17A的弗氏不完全佐剂溶液和静脉内(iv)尾静脉注射rhIL-17A的盐水溶液。
于第53天进行血检。于第87天如下进行大鼠脾细胞的融合：使用1.6×108个脾细胞和1.8×108个骨髓瘤细胞，将它们分入30个96孔板中，每孔得到总共1.13×105个细胞。
通过间接rhIL-17A ELISA进行所获单克隆抗体(数千个)的初次筛选(参见实施例5)。对所获抗体的第二次筛选包括由ST2(小鼠基质)细胞中和rhIL-17A诱导的鼠IL-6表达，和中和rhIL-17A诱导的Ba/F3hIL-17Rc：mGCSFR细胞增殖(参见实施例11)。在第一次和第二次筛选后进一步研究了约11个单克隆。进行随后的实验来证实候选抗体能够结合天然huIL-17A，以确保它们应在多种治疗、诊断和/或研究用途中有用。这样的筛选可以使用结合测定(例如间接ELISA或夹心ELISA)、体外活性测定或体内活性测定进行，本文提供了其实例。
实施例3
大鼠抗人IL-17A抗体的人源化
大鼠抗人IL-17A单克隆抗体16C10的人源化基本上如在WO2005/047324和WO 2005/047326中所述进行，所述文献的公开内容整体在此引入作为参考。简而言之，使用人恒定结构域替代亲本(大鼠)恒定结构域，选择与大鼠可变结构域序列同源的人种系序列，并用于为大鼠CDR提供人构架，如在下文更详细的描述。
选择人种系构架序列的程序
以下步骤用于在人源化本发明的抗人IL-17A抗体时选择适宜的种系构架序列。
1)克隆和测序非人VL和VH结构域，并测定氨基酸序列。
重链
2)比较非人VH序列与一组5个人VH种系氨基酸序列；1个代表亚组IGHV1，1个代表IGHV4，3个代表亚组IGHV3。VH亚组列于M.-P.Lefranc(2001)“Nomenclature of the human ImmunoglobulinHeavy(IGH)Genes”，Experimental and Clinical Immunogenetics，18：100-116。如下进行与5个种系序列的比较：
A)依据Kabat等(1991)指定非人VH序列残基数。
B)比对非人VH序列与5个人种系序列中的每一个。因为V基因仅包含VH残基1-94，所以只有这些残基才被考虑比对。
C)描绘序列中的互补决定区(CDR)和构架区(FR)。CDR和FR被定义为在Kabat等(1991)(出处同上)以及Chothia和Lesk(1987)“Canonical Structures for the Hypervariable Regions ofImmunoglobulins”，Journal of Molecular Biology，196：901-917中提供的定义的组合。因此定义为：VH CDR1＝26-35，CDR2＝50-65，CDR3＝95-102。
D)对于以下列出的每个残基位(表1)，非人和人序列在每个残基位的分配记分是相同的：
表1
  残基#   记分   原因
  2   4   影响CDR-H1，3*
  4   3   影响CDR-H1，3
  24   3   影响CDR-H1
  26   4   影响CDR-H1*
  27   4   影响CDR-H1，3*
  29   4   影响CDR-H1*
  34   4   影响CDR-H1*
  35   2   VH/VL界面
  37   2   VH/VL界面
  39   2   VH/VL界面
  44   2   VH/VL界面
  45   2   VH/VL界面
  47   4   VH/VL界面，CDRL3
  48   3   影响CDR-H2
  49   3   影响CDR-H2
  50   2   VH/VL界面
  51   3   影响CDR-H2
  58   2   VH/VL界面
  59   3   影响CDR-H2
  60   2   VH/VL界面
  63   3   影响CDR-H2
  67   3   影响CDR-H2
  69   3   影响CDR-H2
  71   4   影响CDR-H2*
  73   3   影响CDR-H1
  76   3   影响CDR-H1
  78   3   影响CDR-H1
  91   2   VH/VL界面
  93   3  影响CDR-H3
  94   4  影响CDR-H3*
  最大89
*表示影响CDR构象，见C.Chothia等(1989)“Conformations ofImmunoglobulin Hypervariable Regions”，Nature 342：877-883。
E)加入所有残基位记分。受体种系序列是具有最高总记分的序列。对于两个或更多个种系序列具有相同记分的情况，则：
1)在以下的残基位中加入1至其中非人和人序列相同的每个位置的总数：1、3、5-23、25、36、38、40-43、46、66、68、70、72、74、75、77、79-90、92(最大49)。
2)受体种系序列是具有最高总记分的序列。如果两个或更多个种系序列仍具有相同记分，则任一个都可接受为受体。
轻链
III)如果VL序列是VL κ亚类的成员，则比较非人VL序列和一组4个人VLκ种系氨基酸序列。4序列组包括Barbie和Lefranc(1998)“TheHuman Immunoglobulin Kappa Variable(IGKV)Genes and Joining(IGKJ)Segments”，Experimental and Clinical Immunogenetics，15：171-183，和M.-P.Lefranc(2001)“Nomenclature of the HumanImmunoglobulin Kappa(IGK)Genes”，Experimental and ClinicalImmunogenetics，18：161-174中列出的4个已确定的人VL亚组的4个代表。4个亚组还对应于在Kabat等(1991)于103-130页中列出的4个亚组。如下进行与4个种系序列的对比：
A)按照Kabat等(1991)分配非人VL序列残基数。
B)比对非人VL序列和4个人种系序列中的每一个。因为V基因仅包括VL残基1-95，所以只有这些残基才被考虑进行比对。
C)描绘序列中的互补决定区(CDR)和构架区(FR)。CDR和FR被定义为在Kabat等(1991)以及Chothia和Lesk(1987)“CanonicalStructures for the HyPervariable Regions of Immunoglobulins”，Journalof Molecular Biology，196：901-917中提供的定义的组合。因此定义为：VL CDR1＝24-34，CDR2＝50-56，CDR3＝89-97。
D)对于以下列出的每个残基位(表2)，非人和人序列在每个残基位的分配记分是相同的：
表2
  残基#   记分   原因
  2   4   影响CDR-L1，3*
  4   3   影响CDR-L1，3
  25   4   影响CDR-L1*
  29   4   影响CDR-L1，3*
  33   4   影响CDR-L1，3*
  34   2   VL/VH界面
  36   2   VL/VH界面
  38   2   VL/VH界面
  43   2   VL/VH界面
  44   2   VL/VH界面
  46   4   VL/VH界面，CDR-H3
  47   3   影响CDR-L2
  48   4   影响CDR-L2*
  49   2   VL/VH界面
  55   2   VL/VH界面
  58   3   影响CDR-L2
  62   3   影响CDR-L2
  64   4   影响CDR-L2*
  71   4  影响CDR-L1*
  87   2  VL/VH界面
  89   2  VL/VH界面
  90   4  影响CDR-L3*
  91   2  VL/VH界面
  94   2  VL/VH界面
  95   4  影响CDR-L3*
*表示影响CDR构象，见C.Chothia等(1989)“Conformations ofImmunoglobulin Hypervariable Regions”，Nature 342：877-883，1989。
E)加入所有残基位记分。受体种系序列是具有最高总记分的序列。对于其中两个或更多个种系序列具有相同记分的情况，则：
1)在以下的残基位中加入1至其中非人和人序列相同的每个位置的总数：1、3、5-23、35、37、39-42、57、59-61、63、65-70、72-86、88。
2)受体种系序列是具有最高总记分的序列。如果两个或更多个种系序列仍具有相同记分，则任一个都可接受为受体。
如果VL序列是VLλ亚类的成员，则使用在以上提及的文献来源中的人VLλ种系氨基酸序列实施类似步骤。
抗人IL-17A抗体的人源化
关于恒定结构域的修饰，克隆抗体16C10(大鼠抗人IL-17A IgG1)的可变轻链和重链结构域，并分别与人κ轻链(CL结构域)和人IgG1重链(CH1-铰链-CH2-CH3)融合。大鼠可变结构域和人恒定结构域的该组合包括嵌合形式的抗体16C10。该嵌合16C10的轻链和重链的序列分别在SEQ ID NO：9和10中提供。
关于可变结构域的构架区的修饰，将抗体16C10的VH结构域的氨基酸序列与一组5个人VH种系氨基酸序列比较；1个代表亚组IGHV1，1个代表亚组IGHV4，3个代表亚组IGHV3。VH亚组列于M.-P.Lefranc，“Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy(IGH)Genes，”Experimental and Clinical Immunogenetics，18：100-116，2001。抗体16C10对亚组IV中的人重链种系DP-71记分最高。
16C10的VL序列为κ亚类。该序列与4个人VLκ种系氨基酸序列组比较。该4序列组为在V.Barbie和M.-P.Lefranc，“The HumanImmunoglobulin Kappa Variable(IGKV)Genes and Joining(IGKJ)Segments”，Experimental and Clinical Immunogenetics，15：171-183，1998和M.-P.Lefranc，″Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa(IGK)Genes″，Experimental and Clinical Immunogenetics，18：161-174，2001中列出的4个已确定的人VL亚组的4个代表。4个亚组还对应于在Kabat等(1991)于103-130页中列出的4个亚组。抗体16C10对亚组II中的人轻链种系Z-A19记分最高。
一旦确定了所需的种系构架序列，就产生编码全长人源化可变重链和轻链的质粒。置换人构架残基替代亲本大鼠抗体16C10的构架残基可被等同地视为将大鼠16C10CDR嫁接到人构架序列上。产生的抗体在本文被称为“16C10wt”，“wt”指示存在与亲本大鼠16C10相同的CDR，其不同于以下论述的优化的CDR(具有两个单氨基酸改变)。对轻链和重链可变结构域进行密码子优化、合成，并插入恒定结构域上，以提供潜在最佳的表达。可改善已克隆抗体表达的密码子优化仅仅是任选的。
除了置换人恒定结构域和构架序列之外，还在两个CDR残基处修饰人源化16C10wt抗体，以提供更高化学稳定性的最终人源化抗体。两个改变由图1B中所示的“hu16C10”VH序列中的加粗氨基酸残基代表。关于在图1B中使用的Kabat编号，CDR2的残基54由大鼠抗体中的N(天冬酰胺)变为人源化抗体中的Q(谷氨酰胺)，以降低在残基54-55的NG序列处形成异天冬氨酸的可能性。异天冬氨酸形成可削弱或完全废除抗体与其靶抗原的结合。Presta(2005)J.AllergyClin.Immunol.116：731于734。另外，CDR3的残基96由大鼠抗体的M(甲硫氨酸)变为人源化抗体的A(丙氨酸)，以降低甲硫氨酸硫氧化的可能性，这可降低抗原结合亲和性，还有助于最终抗体制剂中的分子异质性。出处同上。这些单残基修饰可表示为N54Q和M96A。本文公开的最终人源化16C10抗体包括这两个与亲本大鼠16C10 CDR相关的置换。
在本发明的又一个实施方案中，改变嵌合(非人源化)16C10抗体，以掺入以上对人源化形式描述的两个单残基修饰，即N54Q和M96A。
人源化抗体16C10(hu 16C10)的轻链和重链的氨基酸序列分别于图2A和2B以及SEQ ID NO：2和4(其包括信号序列)提供。编码hu16C10的轻链和重链的核苷酸序列的一个实施方案示于SEQ ID NO：1和3。编码hu 16C10的轻链和重链的核苷酸序列的又一个实施方案示于图5A(SEQ ID NO：62)和图5B(SEQ ID NO：63)。
为了命名的明了性，重要的是要认识到，Kabat编号系统包括非数字氨基酸残基命名(例如VH残基83a、83b、83c)，以适应多种抗体中的CDR和构架区的长度变化。尽管该编号系统的有利之处在于易于参考含有不同长度的CDR的多种抗体中的对应氨基酸残基，但在与严格的连续编号序列编号(例如序列表)相比时，其可能对特定氨基酸残基产生相矛盾的命名。除非另有说明，否则本文的氨基酸残基命名参考相关序列表，例如参考“Kabat编号”。
关于命名法的另一点说明，SEQ ID NO：2和4(人源化16C10)包括N-末端信号肽序列(每个的前19个残基)，所述氨基酸在成熟形式的抗体中被除去。SEQ ID NO：1、3、62和63包括编码信号序列的57个核苷酸。本文使用的“成熟”形式的蛋白是指没有信号序列的蛋白。
通过与以上对抗体16C10描述的方法类似的方法产生人源化抗体4C3。因为亲本大鼠4C3抗体的差异仅在于轻链构架区中的单个氨基酸残基，这样的构架区在人源化过程中被人种系构架序列替代，所以最终的人源化4C3抗体序列与人源化16C10抗体的序列相同。
人源化抗体30C10也通过与以上对抗体16C10描述的方法类似的方法产生。在测定所用的适宜人构架序列时，亲本大鼠30C10抗体对亚组III中的人重链种系DP-46和亚组II中的人轻链种系Z-A19记分最高，所以那些构架序列置换大鼠构架序列。人源化30C10VL和VH序列分别在SEQ ID NO：22和23中提供。在其它实施方案中，突变大鼠30C10的CDR中的一个或多个甲硫氨酸，以避免人源化30C10抗体中的甲硫氨酸硫氧化的可能性。具体地说，重链残基34(在CDRH1中)和/或轻链残基30f(Kabat编号，参见图1A)被由甲硫氨酸变为另一个氨基酸，例如丙氨酸。随后筛选该抗体，以确保甲硫氨酸置换没有将IL-17A结合亲和性降低至不可接受的水平。
使用本文描述的方法，基于亲本大鼠抗体16C10类推这类抗体的制备，产生含有嵌合的、人源化的和信号序列形式的抗体12E6。亲本大鼠抗体12E6的轻链和重链CDR在SEQ ID NO：34-36和37-39中提供。人恒定结构域和可变结构域构架序列如上所述导入。在一个实施方案中，重链残基34(在CDRH1中)由甲硫氨酸变为另一个氨基酸，例如丙氨酸，以避免人源化12E6抗体中的甲硫氨酸硫氧化的可能性。随后筛选产生的抗体，以确保甲硫氨酸置换没有将IL-17A结合亲和性降低至不可接受的水平。
使用本文描述的方法，基于亲本大鼠抗体16C10类推这类抗体的制备，产生含有嵌合的、人源化的和信号序列形式的抗体23E12。亲本大鼠抗体23E12的轻链和重链可变结构域序列在SEQ ID NO：44和46(DNA)以及45和47(氨基酸)中提供。亲本大鼠抗体23E12的CDR在SEQ ID NO：48-50(轻链)和51-53(重链)中提供。人恒定结构域和可变结构域构架序列如上所述导入亲本大鼠抗体中。
实施例4
全人抗IL-17A抗体
全人抗IL-17A单克隆抗体使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠产生。这些转基因小鼠在本文被称为“HuMAb”小鼠，包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小型基因座(miniloci)，连同失活内源μ和κ链基因座的被靶向突变(Lonberg等(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠表现出小鼠IgM或κ表达降低，并响应于免疫接种，导入的人重链和轻链转基因经历了类别转换和体细胞突变，产生高亲和性人IgG κ单克隆抗体(Lonberg等(1994)，出处同上；综述于Lonberg(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg等(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，和Harding等(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMab小鼠的制备是本领域公知的，例如描述于Taylor等(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen等(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen等(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 113：49-101；Taylor等(1994)International Immunology 6：579-591；Lonberg等(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93；和Fishwild等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；所述文献的内容整体在此引入作为参考。另参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,770,429和5,545,807；以及国际专利申请公开号WO 98/24884；WO94/25585；WO 93/1227；WO 92/22645和WO 92/03918，所述全部文献的内容整体在此引入作为参考。
为产生IL-17A的全人单克隆抗体，用抗原性IL-17A多肽免疫接种HuMab小鼠，如Lonberg等(1994)；Fishwild等(1996)和WO 98/24884所述。优选地，小鼠在初次接种时为6-16周龄。例如，纯化的IL-17A制剂可用于腹膜内免疫HuMab小鼠。还可以用以IL-17A基因稳定转化或转染的完整HEK293细胞免疫小鼠。“抗原性IL-17A多肽”可以指IL-17A多肽的任何片段，其在HuMab小鼠中激发抗IL-17A的免疫应答。
一般而言，在用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)初次免疫接种继之以每隔一周(通常至多为总共6周)用不完全弗氏佐剂中的抗原IP免疫接种时，HuMAb转基因小鼠应答最佳。首先用表达IL-17A的细胞(例如稳定转化的HEK293细胞)免疫小鼠，然后用IL-17A的可溶性片段免疫，之后用两种抗原交替免疫。在免疫程序当中用经眶后取血获得的血浆样品监测免疫应答。例如通过ELISA筛选血浆的抗IL-17A抗体存在情况，具有足够的免疫球蛋白效价的小鼠用于融合。在处死并取出脾之前3天用抗原静脉内加强免疫小鼠。每种抗原可能必需2-3个融合体。每种抗原免疫几只小鼠。例如，可以免疫接种HCO7和HCO12品系的总共12只HuMAb小鼠。
通过本领域公知的方法，例如最初由Kohler等(1975)(Nature256：495-497)开发的杂交瘤技术；三瘤技术(Hering等(1988)Biomed.Biochim.Acta.47：211-216和Hagiwara等(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4：15)；人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)ImmunologyToday 4：72和Cote 等(1983)Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030)；以及EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985)，载于MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)，生产产生单克隆全人抗IL-17A抗体的杂交瘤细胞。优选地，分离小鼠脾细胞，并基于标准方案使PEG与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后，可以筛选所产生的杂交瘤的抗原特异性抗体的产生情况。在一个实施方案中，在50％PEG下使免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)数目的1/6融合。以约2×105个细胞/mL将细胞铺板在平底微量滴定板中，接着在含有20％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％origen、4mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma；在融合后24小时加入HAT)的选择培养基中进行2周温育。2周后在其中HAT被HT替代的培养基中培养。然后通过ELISA筛选各个孔的人抗IL-17A单克隆IgG抗体情况。一旦出现广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天后观察培养基。再铺板分泌抗体的杂交瘤，再筛选，如果对人IgG仍为阳性，则通过限制稀释将抗IL-17A单克隆抗体亚克隆至少2次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
在又一个实施方案中，重组生产本发明的抗IL-17A抗体分子(例如用大肠杆菌/T7表达系统)。在本实施方案中，将编码本发明的抗体分子的核酸(例如VH或VL)插入基于pET的质粒中，并在大肠杆菌/T7系统中表达。有几种方法生产本领域已知的重组抗体，例如美国专利第4,816,567号，该专利在此引入作为参考。抗体分子还可以在CHO或NSO细胞中重组产生。
实施例5
抗IL-17A单克隆抗体的间接ELISA
使用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)评价抗人-IL-17A单克隆抗体与rhIL-17A的结合。简而言之，使固定浓度的rhIL-17A与微量滴定板的孔直接结合。然后将待测定的单克隆抗IL-17A加入包被rhIL-17A的平板，其中抗体被捕获并定量。更详细的方案如下。
用50μl/孔的rhIL-17A(0.5μg/ml)的碳酸盐包被缓冲液包被96孔U-底MaxiSorp平板(“测定平板”)。碳酸盐包被缓冲液为2.9g/LNaHCO3、1.6g/L Na2CO3，pH 9.4。将平板于4℃覆盖温育过夜。以一式双份跨V-底平板的行连续稀释待筛选的单克隆抗体，使得最终体积为60μl/孔(“连续稀释平板”)。用洗板器(SkanWasher，MolecularDevices，Sunnyvale，California，USA)以PBS-Tween洗涤测定平板3次，并吸干。通过加入0.5ml/L Tween 20至1X PBS获得PBS-Tween。将连续稀释平板的每个孔的50μl转移至测定平板，并于25℃温育1小时。用稀释液(PBS-BSA-Tween，其为含1 g/L BSA的PBS-Tween)将二抗稀释1/2000。大鼠单克隆抗体的二抗为山羊抗大鼠IgG(H+L)-HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，Pennsylvania，USA)。嵌合的和人源化的单克隆抗体的二抗为F(ab’)2山羊抗人IgG Fcγ-HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)。如前洗涤测定平板。将稀释后的二抗(100μl/孔)加至测定板的适宜的孔中，将平板于25℃温育45分钟。如前洗涤测定平板。加入ABTS(100μl/孔)(Kirkegaard&Perry Laboratories，Gaithersburg，Maryland，USA)，将平板于25℃温育5-10分钟，此后用读板器(Versamax，MolecularDevices，Sunnyvale，California，USA)于405nm读取吸光度，在读数前振摇5秒。
本发明的多种形式的抗体16C10的间接ELISA结果示于表5。结合以EC50(获得半最大信号必需的抗体浓度)报告。结果表明，用所有形式的16C10都检测到结合。尽管这样的间接ELISA测定可用于快速测定抗IL-17A抗体的存在与不存在，但获得的EC50数可能是测定依赖性的，通常不用于评价对任何给定抗体的绝对结合亲和性。
表5
间接抗IL-17A抗体ELISA
  mAb   rhIL-17A(μg)   EC50(pM)
  大鼠16C10   0.025   274
  嵌合16C10   0.025   157
  人源化16C10wt   0.025   212
实施例6
抗IL-17A单克隆抗体的ELISA
使用ELISA如下评价抗人-IL-17A单克隆抗体与rhIL-17A的结合。简而言之，捕获抗体结合微量滴定板的孔，此后加入固定浓度的rhIL-17A。然后对平板上结合的rhIL-17A滴定待测定的单克隆抗IL-17A，以确定实现半最大结合所需的抗体浓度。更详细的方案如下。
用100μl/孔捕获抗体(大鼠抗hIL-17A 12E6，0.5μg/ml)的碳酸盐包被缓冲液pH 9.5包被96孔微量滴定板(“测定板”)。平板于4℃覆盖温育24-48小时。用洗板器(SkanWasher，Molecular Devices，Sunnyvale，California，USA)洗涤测定板3次，并吸干。然后用200μl/孔ELISA测定缓冲液(20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween-20，2mM EDTA)于25℃在轨道式摇床上封闭板1小时。洗涤平板，在ELISA测定缓冲液中加入100μl/孔的腺病毒衍生的rhIL-17A或大肠杆菌衍生的人IL-17(IL-17A)(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota，USA)(0.1μg/ml)，并在轨道式摇床上于25℃温育2小时。洗涤平板，使用4倍连续稀释液在1000ng/ml至0.0813ng/ml范围内跨1行7个孔连续稀释要筛选的单克隆抗体。在轨道式摇床上于25℃温育平板1.5小时。洗涤平板，加入100μl/孔的二抗(F(ab’)2山羊抗人κ轻链-HRP，1∶20,000稀释度，BioSource，Carlsbad，California，USA)，测定的空白孔除外。洗涤平板2轮(即2个周期，每个周期洗涤3次)，每个周期之间旋转平板。以100μl/孔加入TMB底物(Kirkegaard&Perry Laboratories，Gaithersburg，Maryland，USA)，并在轨道式摇床上温育3-5分钟。加入终止溶液(100μl/孔)，在读板器(Versamax，Molecular Devices，Sunnyvale，California，USA)上以450-570nm读取平板的吸光度。
本发明的多种形式的抗体16C10的ELISA结果示于表6。结合以EC50(获得半最大信号必需的抗体浓度)报告。结果表明，用所有形式的16C10都检测到结合。以偏差范围提供的值代表多个测定的平均值和标准差。
表6
抗IL-17A抗体ELISA
  mAb   人IL-17A   EC50(pM)
  人16C10wt   rhIL-17A   66±14
  人16C10wt   R&D Systems   130±19
  人16C10VH N54A   rhIL-17A   75
  人16C10VH N54Q   rhIL-17A   65
  人16C10VH N60A   rhIL-17A   63
  人16C10VH N60Q   rhIL-17A   74
  人16C10VH M96L   rhIL-17A   66
  人16C10VH M96A   rhIL-17A   60
  人16C10VH M96K   rhIL-17A   68
  人16C10VH M96F   rhIL-17A   125
  人16C10VH M100hF   rhIL-17A   49
  人16C10VH M100hL   rhIL-17A   53
  人16C10(＝VH N54Q/M96A)   rhIL-17A   92
  人16C10(＝VH N54Q/M96A)   R&D Systems   136
  人16C10VH 54Q/M96A/M100hF   rhIL-17A   80
  人16C10VH 54Q/M96A/M100hF   R&D Systems   118
实施例7
抗人IL-17A抗体的结合亲和力
使用电化学发光(ECL)测定检测大鼠和嵌合抗人IL-17A抗体的结合
Origen电化学发光技术由IGEN，Inc.(Gaithersburg，Maryland，USA)开发，用于检测大鼠抗人IL-17A抗体(和1个嵌合抗体)与FLAG-huIL-17A的结合。参见Elecsys
Figure A20078003766200701
immunoassay system，RocheDiagnostics(Indianapolis，Indiana，USA)。电化学发光技术使用稳定的钌金属螯合物(Ori-TAG)，其在三丙胺(TPA)存在下在施加电压时产生电化学发光。微米直径的顺磁珠用作固相，利于快速的测定动力学。珠/复合物通过流动池被引流，并通过施加磁场被捕获在电极上。施加电压，检测产生的电化学发光。
ECL测定如下进行。在96孔微量滴定板中用50μl测定缓冲液对抗人IL-17A mAb进行3倍连续稀释，在第一个孔中产生1-3μg/ml终浓度。将50μl测定缓冲液和50μl的50ng/ml生物素化FLAG-huIL-17A加入每个孔，之后加入OriTag-标记的山羊抗大鼠IgG(H+L)pAb(50μl，450ng/ml)或抗hIgG mAb(50μl，500ng/ml)。最后向每个孔加入50μl的0.1mg/ml Origen链霉抗生物素-Dynabeads。在于25℃温育1小时后，通过Origen M-系列M8/384分析仪处理平板。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，San Diego，California，USA)作图数据，并计算曲线下面积，其是结合的粗略检测。
结果提供于表7(其包括某些一式双份的测定)。显示大鼠16C10与FLAG-huIL-17A结合的两行代表一式双份测定。表中的所有大鼠抗人IL-17A抗体(1D10、16C10、30C10、23E12)都结合FLAG-huIL-17A，嵌合16C10也是如此。全部4种抗体还结合猕猴IL-17A。抗体16C10和30C10在该测定条件下不结合小鼠IL-17A，而抗体1D10和23E12可以结合。
表7
通过ECL测定的抗体结合
  mAb   抗原   峰下面积
  大鼠1D10   FLAG-hu-IL-17A   477474
  大鼠16C10   FLAG-hu-IL-17A   285792
  大鼠16C10   FLAG-hu-IL-17A   374445
  大鼠30C10   FLAG-hu-IL-17A   311752
  大鼠23E12   FLAG-hu-IL-17A   285145
  嵌合16C10   FLAG-hu-IL-17A   345982
  大鼠1D10   猕猴IL-17   136497
  大鼠16C10   猕猴IL-17   151543
  大鼠30C10   猕猴IL-17   123916
  大鼠23E12   猕猴IL-17   111242
  大鼠1D10   小鼠IL-17   252121
  大鼠1D10   小鼠IL-17   384999
  大鼠16C10   小鼠IL-17   未结合
  大鼠16C10   小鼠IL-17   未结合
  大鼠30C10   小鼠IL-17   未结合
  大鼠30C10   小鼠IL-17   未结合
  大鼠23E12   小鼠IL-17   143206
  大鼠23E12   小鼠IL-17   289185
使用KinExA技术测定大鼠和人源化抗人IL-17A抗体的平衡解离常数(Kd)
使用KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments Inc.，Boise，Idaho，USA)测定抗人IL-17A抗体的平衡解离常数(Kd)。KinExA使用动态排除测定法(Kinetic Exclusion Assay method)的原理，其基于抗体、抗原和抗体-抗原复合物的混合物中未复合抗体的浓度测量。参见例如Darling和Brault(2004)Assay Drug Dev.Technol.2(6)：647-57。游离抗体的浓度通过使混合物接触固相固定化的抗原非常短暂的时间段进行测量。在实践中，这通过使溶液相抗原-抗体混合物流经流动池中捕获的抗原包被的颗粒来完成。由该仪器产生的数据使用定制软件进行分析。使用数学理论基于下述假定计算平衡常数：
1.结合遵循关于平衡的可逆结合等式：
kon[Ab][Ag]＝koff[AbAg]，其中Kd＝koff/kon
2.抗体(Ab)和抗原(Ag)1∶1结合，且总抗体等于抗原-抗体复合物(AbAg)加游离抗体。
3.仪器信号与游离抗体浓度线性相关。
对几种大鼠抗人IL-17A抗体、其人源化变体和这些人源化抗体的序列变体进行KinExA分析。IL-17A来源于人(“hu”)、猕猴(“cyno”)或小鼠(“mu”)。相同物种的IL-17A用于每个KinExA测定的固定相和溶液相这二者。用人、猕猴或小鼠IL-17A按照Sapidyne“Protocol forcoating PMMA particles with biotinylated ligands having short ornonexistent linker arms.”包被聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)颗粒(98微米)。所有实验步骤都按照KinExA 3000手册进行。所有操作都一式双份进行。KinExA的条件提供于表8。
表8
KinExA条件
  IL-17A：   人，猕猴   小鼠
  样品体积：   2ml   4ml
  样品流速：   0.25ml/分钟   0.25ml/分钟
  标记体积：   1ml   1ml
  标记流速：   0.25ml/分钟   0.25ml/分钟
  抗体浓度：   0.02-0.1nM   0.1nM
  最高抗原浓度：   4nM   64nM(23E12)4.0nM(1D10)
  最低抗原浓度：   1pM   62pM(23E12)3.9pM(1D10)
制备抗原的2倍连续稀释液，并与恒定浓度的抗体混合。于25℃温育混合物2小时至平衡。
表9显示了KinExA分析的结果。基于抗体的75kDa分子量和IL-17A的15kDa分子量计算KinexA分析的摩尔浓度，以说明抗体上两个结合位点的存在情况和IL-17A的二聚化性质。对于某些抗体，用不同批次的抗体和/或抗原进行重复实验，在此情况下于表9提供了平均值连同标准差。人源化16C10 wt抗体和亲本大鼠16C10抗体于约5-10pM的结合常数相似，表明人源化不显著降低亲本大鼠16C10对人IL-17A的高亲和性。还测定了人源化16C10，其掺入多个氨基酸置换(N54Q、M96A、M100hF)，包括最终的人源化16C10抗体(相比于大鼠16C10具有N54Q和M96A置换)，发现在1-10pM范围内具有相似的高结合常数。结合的人16C10的Fab片段与完整抗体相比保留了高亲和性(16pM)。本发明的其它抗体(大鼠1D10、大鼠23E12、大鼠30C10)还以高亲和性结合FLAG-huIL-17A，并结合猕猴IL-17A。尽管大鼠1D10以10pM亲和性结合小鼠，与其对人和猕猴IL-17A的亲和性类似，但大鼠23E12对小鼠IL-17A(7000pM)具有200-2000的较低亲和性。抗体16C10和30C10不结合小鼠IL-17A(未显示数据)。
表9
通过KinExA测定的Kd值
  mAb   抗原   Kd(pM)
  大鼠16C10   rhIL-17A   6.0
  大鼠16C10   FLAG-huIL-17A   3.6
  hu 16C10wt   rhIL-17A   8.8±3.0
  hu 16C10[＝VH N54Q/M96A]   rhIL-17A   3.9±2.7
  hu 16C10Fab   rhIL-17A   16.1
  hu 16C10VH N54A   rhIL-17A   10.8
  hu 16C10VH N54Q   rhIL-17A   7.0
  hu 16C10VH M96A   rhIL-17A   9.9
  hu 16C10VH N54Q/M96A/M100hF   rhIL-17A   10.0
  大鼠1D10   FLAG-huIL-17A   1.7
  大鼠23E12   FLAG-huIL-17A   2.8
  大鼠30C10   FLAG-huIL-17A   11.0
  大鼠1D10   猕猴IL-17A   9.8
  大鼠23E12   猕猴IL-17A   28.0
  大鼠30C10   猕猴IL-17A   32.6
  大鼠16C10   猕猴IL-17A   1.7
  人16C10   猕猴IL-17A   16.3
  大鼠1D10   小鼠IL-17A   10.3
  大鼠23E12   小鼠IL-17A   7,000
本领域已知的其它方法，例如Biacore
Figure A20078003766200751
表面等离子体共振分光光度法可用于检测本发明抗体的亲和力。尽管对本发明的几种抗体进行了Biacore
Figure A20078003766200752
分析，但结合亲和力一般来说太高，以至于不能精确检测，具体地说，解离速率太慢，以至于不能通过该方法检测。然而，该分析可用于分析低亲和力的抗IL-17A抗体或具有更快解离速率常数的抗IL-17A抗体。
实施例8
抗IL-17A抗体的滑膜细胞测定
如下通过监测在人滑膜细胞的初级培养物中由IL-17A诱导的IL-6和IL-8的表达检测本发明的抗IL-17A抗体阻断IL-17A(或rhIL-17A或天然huIL-17A)的生物学活性的能力。通过胶原酶消化由膝盖置换患者获得的类风湿性关节炎滑膜分离滑膜细胞。滑膜细胞通过在生长培养基(DMEM，10％BCS，1X Pen-Strep(50IU/ml青霉素，55μg/ml链霉素)，1X β-巯基乙醇(50μM)，1X谷氨酰胺(20mM)，25mMHEPES)中连续传代富集，在传代数3时冷冻下来，并储存在液氮中。在准备用于测定时，融化一管细胞，铺板，并使细胞生长至接近汇合。然后使用胰蛋白酶/EDTA以1∶2将细胞传代入更大的烧瓶中。当已扩增足够的细胞时，如下开始实验：胰蛋白酶化细胞，铺板入96孔或48孔板中，并使它们生长至全部汇合。
将IL-17A稀释至120ng/ml，即30ng/ml(1nM)终浓度的4X。IL-17A或者为人的(rhIL-17A和天然huIL-17A)，或者来自非人灵长类动物，在本案中为猕猴(cyno)。将100和300μl等份试样的4X IL-17A母液分别加至空的96孔和48孔平板。
用生长培养基将待测定的抗IL-17A抗体稀释至实验中待测试的4X最大浓度。1∶2连续稀释4X抗IL-17A母液，以覆盖测定的动力学抑制范围。每个连续稀释的抗体样品(全部为4X它们的终浓度)都与4X IL-17A溶液在空平板中1∶1混合，以产生含2X浓度的IL-17A和抗IL-17A抗体这二者的混合物。使这些混合物于37℃在组织培养温育箱中平衡4小时以上。
由粘附的汇合滑膜细胞除去培养基，并代之以100μl(96孔板)或200μl(48孔板)生长培养基。将等体积的2X配体/2X抗体溶液加至滑膜细胞，以产生1X IL-17A(30ng/ml终浓度)和1X抗体。每个孔(数据点)都一式两份操作。活化滑膜细胞(即接触IL-17A/抗体混合物)3天，此时将上清液转移至96孔板，并可选地冷冻，储存于-80℃直至分析。融化含上清液的微量滴定板，使用生长培养基1∶10稀释每种溶液。使用Luminex珠对(bead pair)(Upstate，Charlottesville，Virginia，USA)按照生产商的说明分析上清液的IL-6和IL-8。
结果在表10(IL-6)和11(IL-8)提供。以偏差范围提供的值代表多个测定的平均值和标准差。显示了多种形式的抗体16C10的结果，包括具有原初大鼠CDR的人源化形式的16C10(“hu16C10(wt)”)以及在重链CDR中具有1、2或3个变化的几种变体(一般为“hu16C10X##Z”，其中X为在hu16C10(wt)重链中的残基##处的氨基酸，Z为新氨基酸)。“NHP IL-17A”是非人灵长类动物源的IL-17A，在本案中为猕猴IL-17A。“天然huIL-17A”是指在使用天然信号序列产生前体蛋白时产生的成熟huIL-17A，其与rhIL-17A的不同之处在于没有两个N-末端氨基酸。浓度和IC50值以ng/ml表示，但也可以pM单位表示。例如，30ng/ml rhIL-17A对应于1000pM(MW＝30kDa)，70ng/ml抗IL-17A抗体对应于约470pM(MW＝150kDa)。
表10
通过滑膜细胞IL-6生产检测的抗IL-17A的IC50(ng/ml)
抗体   rhIL-17A(30ng/ml)   NHP IL-17A(30ng/ml)   天然的huIL-17A(10ng/ml)
  大鼠1D10   105±28   65±15   25
  大鼠16C10   63±7   60±10
  人16C10(wt)   80±10   -
  人16C10(N54A)   60   -
  人16C10(N54Q)   60   -
  人16C10(M96A)   60   -
  人16C10(M96K)   60   -
  人16C10(M100hF)   70   -
  人16C10(N54Q/M96A) 70±8 70±0 25
  人16C10(N54Q/M96A/M100hF) 70 -
表11
通过滑膜细胞IL-8生产检测的抗IL-17A的IC50(ng/ml)
抗体   rhIL-17A(30ng/ml)   NHP IL-17A(30ng/ml)   天然的huIL-17A(10ng/ml)
  1D10   59±41   38±13   40
  16C10   38±14   33±8
  人16C10(wt)   42±16   -
  人16C10(N54A)   25   -
  人16C10(N54Q)   25   -
  人16C10(M96A)   25   -
  人16C10(M96K)   25   -
  人16C10(M100hF)   50   -
  人16C10(N54Q/M96A) 38±10 38±13 50
  人16C10(N54Q/M96A/M100hF) 40 -
实施例9
抗IL-17A抗体的NHDF测定
通过监测正常人(成人)皮肤成纤维细胞(NHDF)原初细胞系中由rhIL-17A诱导的IL-6表达检测本发明的抗IL-17A抗体阻断IL-17A的生物学活性的能力。简而言之，将待测定的多种浓度的抗IL-17A抗体与rhIL-17A温育，然后将产生的混合物加入NHDF细胞培养物。此后测定IL-6产生，作为所研究的抗体抑制IL-17A活性的能力的检测。更详细的方案如下。
以40μg/ml的母液开始制备目标抗IL-17A抗体的连续两倍稀释液(一式双份)。制备120ng/ml的rhIL-17A母液。将70μl的rhIL-17A母液与70μl抗IL-17A抗体稀释液在微量滴定板的孔中混合，并于室温温育20分钟。然后将100μl的这些混合物的每一种加入微量滴定板的孔中，所述孔已在前一夜接种1×104个NHDF细胞/孔(100μl)，并使其于37℃温育。NHDF细胞(第4代)得自Cambrex Bio Science(Baltimore，Maryland，USA)。产生的rhIL-17A的终浓度为30ng/ml(1nM)，抗体下行至10μg/ml的两倍间隔范围内。将平板于37℃温育24小时，之后收集上清液，并取出50μl用于IL-6ELISA。
如下进行检测人IL-6的ELISA。试剂一般来自R&D Systems(Minneapolis，Minnesota，USA)。将hIL-6捕获抗体(50μl/孔的4μg/ml溶液)转移至微量滴定板的孔中，密封该板，并于4℃过夜温育。洗涤平板3次，然后用100μl/孔的封闭缓冲液封闭1小时以上。然后再洗涤平板3次。将实验样品(50μl的培养上清液)和对照(IL-6蛋白的连续稀释液)以50μl加至孔中，并温育2小时。洗涤平板3次，加入50μl/孔的生物素化抗IL-6检测抗体(300ng/ml)。将平板于室温温育2小时，洗涤3次，加入100μl/孔的链霉抗生物素蛋白HRP，温育20分钟。再洗涤平板，加入ABTS(BioSource，Carlsbad，California，USA)(100μl/孔)，并温育20分钟。加入终止溶液(100μl/孔)，检测405nm的吸光度。
目标抗IL-17A抗体的IC50为将rhIL-17A诱导的IL-6生产水平降低至在没有加入任何抗IL-17A抗体的情况下观测到的水平的50％所需要的抗体浓度。
结果在表12中提供。
表12
抗IL-17A抗体抑制NHDF细胞中的IL-6生产
  抗体   rhIL-17AIC50(nM)   猕猴IL-17AIC50(nM)
  大鼠4C3   0.5   0.2
  大鼠16C10   0.5   0.2
  大鼠30C10   0.5   0.2
  大鼠6C3   0.8   0.2
  大鼠1D10   1   0.4
  大鼠8G9   1   0.4
  大鼠12B12   1   0.4
  大鼠18H6   1   0.3
  23E12   1   0.3
  29G3   1.5   2
  29H1   1.5   0.5
  12E6   ＞70   ＞70
实施例10
抗IL-17A抗体的包皮成纤维细胞测定
通过监测HS68包皮成纤维细胞系中rhIL-17A诱导的IL-6表达检测本发明的抗IL-17A抗体阻断IL-17A的生物学活性的能力。响应于rhIL-17A的IL-6生产的降低用作本发明的抗IL-17A抗体阻断活性的检测。
分析IL-17RC(IL-17A受体)在一组成纤维细胞系中的表达将人包皮成纤维细胞系HS68(ATCC CRL1635)鉴别为潜在的IL-17A响应性细胞系。这如下证实：用多克隆山羊抗人IL-17R抗体(R&D Systems，Gaithersburg，Maryland，USA)继之以藻红蛋白(PE)-F(ab’)2驴抗山羊IgG(Jackson Immunoresearch，Inc.，West Grove，Pennsylvania，USA)间接免疫荧光染色，并在流式细胞仪(FACScan，Becton-Dickinson，Franklin Lakes，New Jersey，USA)上分析PE免疫荧光信号。作为模型的进一步验证，IL-17A(腺病毒衍生的rhIL-17A和市售可得的大肠杆菌源的IL-17A，R&D Systems)在HS68细胞中以5-10ng/ml的EC50诱导IL-6的剂量响应性诱导，该诱导被与市售的多克隆和单克隆抗IL-17A抗体(R&D Systems)预温育阻断。
IL-17A抑制测定如下进行。用无Ca++和Mg++的Dulbecco PBS洗涤HS68细胞的汇合T-75烧瓶(约2×106个细胞)，然后与5ml细胞解离培养基(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)于37℃在5％CO2培养箱中温育2-5分钟。然后用5ml组织培养(TC)培养基收获细胞，并以1000rpm离心5分钟。TC培养基为Dulbecco改良型Eagle培养基(含谷氨酰胺)、10％热失活胎牛血清(Hyclone)、10mM Hepes、1mM丙酮酸钠、青霉素和链霉素。将细胞重悬浮在2ml TC培养基中，用锥虫蓝1∶1稀释，并计数。在TC培养基中将细胞浓度调整至1×105个细胞/ml，将0.1ml/孔等分入含0.1ml TC培养基的平底平板的孔中。过夜培养细胞，吸出上清液，用0.2ml新鲜TC培养基洗涤细胞。
以2倍或3倍步骤连续稀释待测定的抗IL-17A抗体，产生一系列母液，其可用于在IL-17A抑制测定中产生1-0.001μg/ml的最终抗体浓度。在每个测定中使用大鼠IgG对照以及仅培养基的样品，作为检测HS68细胞中IL-6自然生产的对照。由含有HS68细胞的平板的孔中吸出TC培养基。将等份试样的多种浓度的抗IL-17A抗体(各0.1ml)在孔中与HS68细胞于37°预温育5分钟，之后加入0.1ml的20ng/ml rhIL-17A，产生10ng/ml的rhIL-17A终浓度(约330pM的IL-17A二聚体)。将细胞于37℃温育24小时，收获上清液(50-100μl)，并例如使用Pharmingen的人IL-6ELISA试剂盒(OptEIA-BD Biosciences，Franklin Lakes，New Jersey，USA)测定IL-6。
本发明的几种大鼠抗人IL-17A抗体在包皮成纤维细胞IL-17A抑制测定中的结果在表13提供。
表13
包皮成纤维细胞测定
  抗IL-17A抗体   IC50(pM)
  大鼠16C10   67
  大鼠1D10   65
  大鼠8G9   29
  大鼠29H1   247
  大鼠29G3   63
  大鼠23E12   126
  大鼠6C3   192
  大鼠4C2   107
  大鼠IgG1   未结合
实施例11
Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR增殖测定
通过监测被工程改造为响应于IL-17A刺激增殖的细胞系的rhIL-17A诱导的增殖，检测本发明的抗IL-17A抗体阻断IL-17A的生物学活性的能力。具体地说，修饰Ba/F3细胞系(IL-3依赖性鼠pro-B细胞)，以表达含有与小鼠粒细胞集落刺激因子受体(GCSFR)的跨膜结构域和胞质区融合的人IL-17A受体(hIL-17RC)的胞外结构域的融合蛋白。产生的细胞系在本文被称为Ba/F3hIL-17Rc-mGCSFR。同型二聚化IL-17A与胞外IL-17RC结构域的结合引起hIL-17Rc-mGCFR融合蛋白受体的二聚化，其经由它们的mGCSFR胞质结构域发出Ba/F3细胞增殖的信号。这类细胞响应于IL-17A增殖，提供了针对IL-17A抑制剂如抗IL-17A抗体的便利测定。
Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR增殖测定对IL-17A刺激的敏感性使得有可能在相比于其它测定相对低的rhIL-17A浓度(例如3ng/ml，100pM)进行实验，而仍保持强烈并可易于检测的增殖反应。这意味着在测定中实现相对于rhIL-17A的摩尔过量需要较低浓度的抗IL-17A抗体。在较低抗体浓度进行的实验使得有可能区分高亲和性抗体，要不然其可能是不可区分的(即可更接近于抗体-IL-17A结合曲线中的线性范围进行实验，而不是在平台期)。
抗体和IL-17A在稀释至工作母液浓度之后但在加入实验样品之前通过0.22μm滤器过滤。跨96孔平底组织培养板的行一式双份制备4组样品。如在本实施例中所用的，生长培养基为RPMI 1640w/Glutamax(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)、55μM 2-巯基乙醇、10％配方喂养的小牛血清(Irvine Scientific，Santa Ana，California，USA)、50μg/mL庆大霉素、2μg/mL嘌呤霉素和10ng/mL mIL-3。BioAssay培养基与生长培养基相同，但没有嘌呤霉素和mIL-3。本实施例中的所有连续稀释液都制备到BioAssay培养基中。
制备以下的实验样品(75μl)：1)连续稀释的生长培养基(包含10ng/ml mIL-3)；2)连续稀释的rhIL-17A；3)连续稀释的、与3ng/mlIL-17A混合的本发明的抗IL-17A抗体(在加入细胞后的终浓度)，包括“无抗体”对照；和4)未加入抗体、IL-17A或mIL-3的“仅细胞”的对照。然后加入Ba/F3 hIL-17Rc-mGCSFR细胞(7500个细胞/孔)，使总体积达到100μl/孔，将平板于37℃/5％CO2温育约40小时。加入AlamarBlue
Figure A20078003766200821
指示剂染料(11μl/孔)，将平板于37℃/5％CO2温育6-8小时。然后读取平板于570nm和600nm的吸光度差异。使用非线性拟合/S形曲线剂量-响应/可变斜率测定IC50值。
Ba/F3hIL-17Rc-mGCSFR增殖测定的结果在表14提供。
表14
Ba/F3hIL-17Rc-mGCSFR增殖测定
  mAb   IL-17A   [rhIL-17A](pM)   IC50(pM)
  大鼠16C10   人   100   20±8
  大鼠16C10   人   276   162
  大鼠16C10   猕猴   100   27
  嵌合16C10   人   100   29
  人16C10   人   100   15±2
  人16C10VH N54Q/M96A   人   100   13
  人16C10   人   100   27
  人16C10   人   276   149
  人16C10   猕猴   100   17
  人16C10N54Q/M96A/M100hF   人   100   11
  大鼠1D10   人   276   223
  大鼠1D10   猕猴   100   19
  大鼠29H1   人   28   ≥30
  大鼠4H12   人   28   ≥400
  大鼠29G3   人   28   ≥400
实施例12
抗IL-17A抗体的交叉阻断
本发明的不同的抗IL-17A抗体可结合相同表位、重叠表位或不重叠的表位，包括足够不同的、两个或更多个抗体可同时结合1个IL-17A单体的表位。结合对受体结合关键的IL-17A部分的抗体将阻断受体介导的IL-17A的生物学活性。这类抗体在本文被称为“中和抗体”。结合但不阻断受体结合的抗体被称为非中和抗体。
在对IL-17A和抗IL-17A抗体进行实验时，有用的是能够测定样品中的IL-17A(或抗IL-17A)水平，例如通过夹心ELISA。参见例如实施例6。在一种形式中，IL-17A ELISA涉及用捕获抗体包被微量滴定板的孔、加入可能含有IL-17A的实验样品以及结合检测抗体。捕获抗体和检测抗体必须能够同时结合IL-17A。
类似的测定可用于测定抗IL-17A抗体的水平，其中IL-17A的标准溶液结合捕获抗体包被的孔，之后加入可能含有抗IL-17A抗体的实验样品，并结合第二检测抗体(例如就本发明的IgG人源化抗体而言为抗人IgG抗体)。如在IL-17A夹心ELISA中一样，捕获抗体不能干扰待测定的抗体的结合。
用于本实施例概述的ELISA实验的优选抗体对可通过进行交叉阻断实验测定。在交叉阻断实验中，将第一种抗体包被在微量滴定板的孔上。然后使生物素化的二抗与IL-17A混合，并使其结合，此后向包被的孔加入混合物，并温育。可以多个浓度(即滴定)加入生物素化的二抗，以确保在至少某些样品中抗体相对于同型二聚化IL-17A以2倍(或更大的)摩尔过量存在。然后洗涤平板，通过标准方法测定在孔中是否存在结合的生物素化二抗。
如果两个抗体交叉阻断，则与不含第二抗IL-17A抗体(或含同种型对照)的对照样品相比，在第二抗IL-17A抗体存在下对平板的信号(IL-17A结合)将减少。不交叉阻断的抗体对可一起用于测定，例如夹心ELISA。尽管IL-17A的二聚化性质使其有可能在某些形式(例如在加入检测抗体之前IL-17A结合平板上的捕获抗体的情况)中在ELISA中使用交叉阻断抗体对，但一般优选非交叉阻断抗体对。
成对测试本发明的几种抗IL-17A抗体(克隆4C3、6C3、8G9、12E6、16C10、18H6、23E12、29H1、30C10、1D10、21B12、29G3)的交叉阻断。除29G3/1D10和29G3/21B12以外所有的对都交叉阻断，29G3/1D10和29G3/21B12抗体对因此可用于ELISA。除了鉴别可用于ELISA的抗IL-17A抗体对之外，这些结果表明，由抗体29G3结合的表位在功能上或物理上与由抗体1D10和21B12结合的一个或多个表位截然不同。这些数据还证实，1D10和21B12的表位与16C10的表位重叠但不相同。
这些结合功能不同表位的抗IL-17A抗体对是有用的，例如用于验证抗IL-17A免疫组织化学(IHC)。例如，如果在用两个结合功能不同表位的不同抗IL-17A抗体进行的IHC中组织样品表现出相同的IL-17A表达模式，则甚至更有可能的是，该测定正在检测组织样品中的IL-17A，而不是某些其它的假的交叉反应蛋白。
这些非交叉阻断抗体对还可用于设计ELISA，从而在治疗性抗IL-17A抗体存在下在例如进行抗IL-17A抗体治疗的患者样品中检测IL-17A，其中存在过量的治疗性抗IL-17A抗体应通过抗IL-17A ELISA阻断检测，除非ELISA抗体与治疗性抗体是非交叉阻断的。
实施例13
采用抗IL-17A抗体的基因治疗
本发明的抗IL-17A抗体还可以通过基因治疗给予受试者。在基因治疗方法中，用编码本发明的抗体的核酸转化受试者的细胞。含有该核酸的受试者然后将内源产生抗体分子(内抗体)。例如，Alvarez等使用基因治疗方法将单链抗ErbB2抗体导入受试者中。Alvarez等(2000)Clinical Cancer Research 6：3081-3087。Alvarez等公开的方法可易于修改，用于将编码本发明的抗IL-17A抗体分子的核酸导入受试者中。在一个实施方案中，通过基因治疗导入的抗体分子是全人的单链抗体。
本文描述的基因治疗方法具有以下潜在优势：治疗仅需要进行1次，或者至多有限的次数，只要实现长期的基因表达。这与抗体给予相反，抗体给予必须定期重复，以在患者中保持适宜的治疗剂水平。
可通过本领域已知的任何方法将核酸导入患者的细胞中。在某些实施方案中，核酸作为病毒载体的一部分被导入。可获得载体的病毒的实例包括慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、牛痘病毒、杆状病毒、α病毒、流感病毒和其它具有所需细胞向性的重组病毒。多个公司生产商用的病毒载体，例如Avigen，Inc.(Alameda，CA；AAV载体)；Cell Genesys(Foster City，CA；逆转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)；Clontech(逆转录病毒和杆状病毒载体)；Genovo，Inc.(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV载体)；Genvec(腺病毒载体)；IntroGene(Leiden，Netherlands；腺病毒载体)；Molecular Medicine(逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)；Norgen(腺病毒载体)；Oxford BioMedica(Oxford，United Kingdom；慢病毒载体)；和Transgene(Strasbourg，France；腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒和慢病毒载体)。
构建和使用病毒载体的方法是本领域已知的(参见例如Miller等(1992)BioTechniques 7：980-990)。优选地，病毒载体是复制缺陷型的(不能自主复制)，因此在靶细胞中是非感染性的。优选地，复制缺陷型病毒是最小病毒，仅保留其基因组中对壳体化基因组以产生病毒颗粒必需的序列。最优选完全没有或几乎完全没有病毒基因的缺陷型病毒。使用缺陷型病毒载体允许在特定的局部区域给予细胞，而不考虑载体可感染其它细胞，使得能够组织特异性靶向。参见例如Kanno等(1999)Cancer Gen.Ther.6：147-154；Kaplitt等(1997)J.Neurosci.Meth.71：125-132；和Kaplitt等(1994)J.Neuro-Onc.19：137-142。
腺病毒是真核DNA病毒，可被修饰得足以传递本发明的核酸至多种细胞类型。减毒的腺病毒载体，例如Stratford-Perricaudet等(1992)(J.Clin.Invest.90：626-630)所述的载体，在某些情况下是合乎需要的。业已描述了多个复制缺陷型腺病毒和最小腺病毒载体(PCT公布号WO94/26914、WO94/28938、WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697和WO96/22378)。本发明的复制缺陷型重组腺病毒可通过本领域技术人员已知的任何技术制备(参见Levrero等(1991)Gene101：195；EP 185573；Graham(1984)EMBO J.3：2917；Graham等(1977)J.Gen.Virol.36：59)。
腺相关病毒(AAV)是相对较小尺寸的DNA病毒，其可以稳定且位点特异性的方式整合入它们感染的细胞基因组中。它们能够感染广谱的细胞，而不诱导针对细胞生长、形态或分化的任何作用，且它们似乎不涉及人病理。业已描述了AAV-衍生载体在体外和体内转移基因的用途(参见Donsante等(2001)Gene Ther.8：1343-1346；Larson等(2001)Adv.Exp.Med.Bio.489：45-57；PCT公布号WO91/18088和WO93/09239；美国专利号4,797,368和5,139,941；和EP 488528B1)。
在又一个实施方案中，基因可导入到逆转录病毒中，如在美国专利号5,399,346、4,650,764、4,980,289和5,124,263；Mann等(1983)Cell33：153；Markowitz等(1988)J.Virol.62：1120；EP 453242和EP178220中所述。逆转录病毒是感染分裂细胞的整合病毒。
慢病毒载体可用作在几种组织类型中直接传递和持续表达编码本发明的抗体分子的核酸的物质，所述组织类型包括脑、视网膜、肌肉、肝和血液。载体可在这些组织中有效转导分裂的和未分裂的细胞，并保持抗体分子的长期表达。关于综述，参见Zufferey等(1998)J.Virol.72：9873-80和Kafri等(2001)Curr.Opin.Mol.Ther.3：316-326。慢病毒包装细胞系是可获得的，且是本领域一般已知的，有利于产生高滴度的慢病毒载体用于基因治疗。实例是四环素诱导的VSV-G假型慢病毒包装细胞系，其可在至少3-4天内产生大于106IU/ml滴度的病毒颗粒；参见Kafri等(1999)J.Virol.73：576-584。可根据需要浓缩由可诱导细胞系产生的载体，用于在体外和体内有效地转导未分裂的细胞。
新培斯病毒是α病毒属成员，自从其于1953年开始在世界多个地区被发现以来就一直被广泛研究。已在体外充分研究了基于α病毒、尤其是新培斯病毒的基因转导(参见Straus等(1994)Microbiol.Rev.58：491-562；Bredenbeek等(1993)J.Virol.67；6439-6446；Iijima等(1999)Int.J.Cancer 80：110-118；和Sawai等(1998)Biochim.Biophys.Res.Comm.248：315-323)。α病毒载体的许多特性使它们成为待开发的其它病毒来源的载体系统的理想替代，包括快速工程化表达构建体、生产感染颗粒的高滴度母液、感染非分裂细胞和高水平表达(Strauss等(1994)Microbiol.Rev.58：491-562)。已描述了新培斯病毒用于基因治疗的用途。(Wahlfors等(2000)Gene.Ther.7：472-480和Lundstrom(1999)J.Recep.Sig.Transduct.Res.19(1-4)：673-686)。
在又一个实施方案中，可通过脂转染或用其它转染促进剂(肽、聚合物等)将载体导入细胞中。合成的阳离子脂质可用于制备在体内和体外转染编码标记的基因的脂质体(Felgner等(1987)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 84：7413-7417和Wang等(1987)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA84：7851-7855)。用于转移核酸的脂质化合物和组合物描述于PCT公布号WO 95/18863和WO 96/17823以及美国专利号5,459,127。
还有可能在体内将载体作为裸DNA质粒导入。用于基因治疗的裸DNA载体可通过本领域已知的方法导入目标宿主细胞中，例如电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪或使用DNA载体转运体(参见例如Wilson等(1992)J.Biol.Chem.267：963-967；Williams等(1991)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA88：2726-2730)。还可以使用受体介导的DNA传递法(Wu等(1988)J.Biol.Chem.263：14621-14624)。美国专利号5,580,859和5,589,466公开了在哺乳动物中没有转染促进剂时传递外源DNA序列。还已经描述了相对低压的高效体内DNA转移技术，称为电转移(Vilquin等(2001)Gene Ther.8：1097；Payen等(2001)Exp.Hematol.29：295-300；Mir(2001)Bioelectrochemistry 53：1-10；PCT公布号WO 99/01157、WO 99/01158和WO 99/01175)。
本文概述的基因治疗方法可在体内进行，或者它们可离体进行，其中细胞得自受试者，用基因治疗方法在体外转化，随后再导入受试者中。参见例如Worgall(2005)Pediatr.Nephrol.20(2)：118-24。
实施例14
亲本抗体的CDR的表达盒诱变
使用鸟枪扫描诱变进行本发明的抗人IL-17A抗体(例如16C10)的CDR序列的优化。丙氨酸扫描诱变用于确定CDR中的哪个残基对IL-17A结合最关键(参见实施例19)。一个或多个CDR中的一个或多个残基的密码子被丙氨酸密码子替代，或者丙氨酸密码子被甘氨酸密码子替代，测试所产生抗体的相关活性(例如IL-17A结合亲和性、在竞争测定中对受体阻断的IC50、生物测定，如在本文的多个其它实施例中所提供的)。可通过本领域已知的任何方法进行密码子置换，包括但不限于定点诱变(例如Kunkel，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA(1985)82：488)和PCR诱变。对IL-17A结合至关重要的残基还可以通过检查IL-17A-抗体复合物的结构来确定，例如X-射线晶体结构。在IL-17A接触距离内的抗体CDR残基，或者基本上致力于IL-17A-抗体复合物形成的抗体CDR残基，是进一步优化的候选物。
然后进一步研究对突变最敏感的那些残基，例如通过同源物扫描诱变。在该实施方案中，对目标残基用同源氨基酸进行保守氨基酸置换，以研究具有优良特性的抗体。非保守突变也是可能的，尽管处于完全破坏IL-17A结合的风险之下。
或者，可以使用亲和成熟产生改善的抗体序列，其中CDR中的选定残基被突变，在该位置产生所有可能的氨基酸置换。在又一个实施方案中，少于全部20种可能的天然氨基酸用作置换，以将潜在的序列数降低至更易管理的水平，同时使用选定进行最佳多样化的有限数目的氨基酸在每个位置仍提供化学多样性(例如代表性的疏水、极性-不带电、碱性和酸性氨基酸)，如在WO2005/044853中所述。这样的亲和性成熟可通过在目标位置用任意数量的氨基酸置换进行，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，在包括非标准或修饰氨基酸的情况下甚至更多。
实施例15
与人组织的交叉反应性
如下评价人源化抗人IL-17A抗体hu16C10与人受试者的非靶组织交叉反应的倾向。hu16C10与生物素化二抗预温育，以在接触组织样品前形成前复合物。然后使抗体复合物(含20μg/ml抗体)与组织或其它样品混合，并温育，以允许结合。然后使用ABC免疫过氧化物酶检测(Vector Labs，Burlingame，California，USA)检测结合的二抗。Tuson等(1990)J.Histochem Cytochem.38(7)：923-6。纳入含不相关的人IgG1抗体的样品作为阴性对照。
用抗几种阳性对照靶组织的hu16C10进行免疫组织化学(IHC)染色，包括在UV-树脂载玻片(Adhesive Coated Slides，Instrumedics，Inc.，St.Louis，Missouri，USA)上的rhIL-17A蛋白斑点、用腺病毒编码的IL-17A感染的小鼠肝细胞和人类风湿性关节炎组织。IHC揭示，在全部3个阳性对照中都结合(+++)。
然后对一组人组织(全部中的32个)进行IHC，以评价交叉反应性。所有这些人组织样品都在UV-树脂载玻片上制作切片。每个组织的样品得自3个供体。筛选的人组织为肾上腺、膀胱、小脑、大脑皮层、结肠、输卵管、心肌、肾、肝、肺、淋巴结、乳腺、卵巢、胰腺、副甲状腺、脑垂体、胎盘、前列腺、视网膜、骨骼肌、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、输尿管、子宫和子宫颈(子宫)。IHC在全部32个组织中都是阴性的。
这种交叉反应性缺失在本发明的抗IL-17A抗体的治疗应用中具有几个潜在利益，例如减少因与其它组织的非特异性结合而导致的抗体损失(以及随之发生的疗效下降)，以及减少与结合不希望的组织相关的副作用的可能性。
实施例16
使用抗IL-17A抗体治疗胶原诱导的关节炎
胶原诱导的关节炎(CIA)是关于人类类风湿性关节炎的普遍使用的小鼠模型。将本发明的抗IL-17A抗体1D10(亲本大鼠抗体，而不是其人源化形式)给予表现CIA的小鼠，以评价抗IL-17A疗法治疗类风湿性关节炎的能力。
程序如下。在第0天，用在完全弗氏佐剂中乳化的牛II型胶原在尾根部皮内免疫接种雄性B10.RIII小鼠。在第21天，用在尾根部传递的、在不完全弗氏佐剂中乳化的牛II型胶原皮内免疫接种小鼠。当在免疫组中出现首个严重关节炎的信号时(21天后)，所有余下的免疫小鼠都被随机化为多个治疗组。用800μg、200μg或50μg的抗IL-17A抗体1D10；200μg同种型对照抗体；或稀释剂治疗动物。在免疫小鼠中于疾病发作的第一天皮下给予治疗，然后每周给予4次以上的治疗。在第35天处死小鼠，将脚爪固定在10％中性缓冲的福尔马林中，用于组织加工和制作切片。由病理学家分析脚爪的以下组织病理学参数：反应性滑膜、炎症、血管翳形成、软骨破坏、骨侵蚀和骨形成。每个参数都使用以下疾病记分评级：0＝无疾病；1＝最低限度的；2＝轻微；3＝中等；4＝严重。另外，使用目测疾病严重性记分(DSS)评价脚爪，其以0-3的等级检测肿胀和发红，0是正常脚爪，1是脚爪上的一个脚趾发炎，2是该脚爪的2个脚趾或脚掌发炎，3是脚爪的脚掌和脚趾发炎。记分2和3在本文被称为严重的或高度发炎的脚爪。
结果于图3A-3C提供。每个数据点代表1个脚爪，而不是动物的全部4个脚爪的平均值或所有动物的平均值。依据采用较高的抗IL-17A 1D10测试浓度(28和7mg/kg)的3个病理学检测(目测DSS-脚爪肿胀和发红、软骨损伤和骨侵蚀)，显示出高病理记分的脚爪数减少是统计学显著的。采用最低浓度(2mg/kg)的结果对于骨侵蚀是统计学显著的，目测DSS和软骨损伤下降。在发炎脚爪中观察到软骨降解酶(基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-3、MMP-13)的生产减少的类似利益。
然而，脚爪炎症的目测评价可能低估了CIA小鼠的抗IL-17A治疗的治疗利益，例如降低的骨侵蚀。在其它实验中，使用组织病理学或微计算机断层显像(micro-CT)分析CIA小鼠的高度发炎的脚爪(DSS记分2或3)的骨侵蚀。该研究是可能的，因为即便抗IL-17A治疗的动物的高度发炎脚爪的百分率急剧下降(参见例如图3A)，但仍有大量高度发炎的脚爪，有可能比较所有治疗组的高度发炎脚爪(DSS＝2或3)，包括无抗体对照。图3D显示了稀释剂治疗的、同种型对照(rIgG1)治疗的和抗IL-17A抗体治疗的动物的高度发炎脚爪的骨侵蚀图。依据组织病理学的检测，在与无抗体对照相比时，在用抗IL-17A治疗的动物的脚爪中骨侵蚀显著降低，尽管它们的DSS记分类似。结果提示，即便在其中依据DSS记分检测炎症没有显著改善的脚爪中，也可以用抗IL-17A治疗实现免于骨侵蚀。
当用micro-CT检测CIA小鼠的高度发炎脚爪的关节的骨矿物质密度(BMD)时，获得类似的结果。表15提供了疾病严重性记分为0或3的CIA动物脚爪的BMD，所述CIA动物用本发明的抗IL-17A抗体(1D10)或同种型对照(25D2)治疗。即便对于相同目测疾病严重性的关节，1D10抗体治疗的也仅具有用同种型对照治疗的动物观察到的骨矿物质密度下降的约一半。
表15
CIA小鼠关节的骨密度
  治疗   DSS   BMD(mg/cc)
  25D2   3   95
  25D2   3   108
  1D10   3   288
  1D10   3   299
  1D10   0   502
  1D10   0   480
和骨侵蚀一样，软骨破坏和血管翳形成(形成发炎组织的过度折痕的滑膜衬细胞增殖)在抗hIL-17A(1D10)治疗的CIA小鼠中也降低。组织病理学表明，抗IL-17A抗体治疗不仅减少显示出严重病理的脚爪数，而且在与稀释剂或同种型治疗的对照相比时基于目测检查(DSS记分2和3)表现同等发炎的脚爪的病理学减轻。
采用抗IL-17A抗体的治疗在关节炎症的CIA模型中显著减轻骨侵蚀的观察结果提示，该治疗可用于预防人的RA的其中一种最令人衰弱和不可逆的作用。另外，骨侵蚀即便在高度发炎的脚爪中也降低的观察结果提示，简单目测评价关节炎症在实验室中或最终在临床上不能精确检测疗效。检测骨侵蚀可能是追踪治疗性治疗的作用所必需的。这样的方法包括但不限于标准2-D X-射线检测、计算机化断层成像(CT)、磁共振成像(MRI)、超声(US)和闪烁扫描。参见例如Guermazi等(2004)Semin.Musculoskelet.Radiol.8(4)：269-285。
实施例17
抗IL-17A抗体的BAL嗜中性粒细胞募集测定
在支气管肺泡灌洗(BAL)嗜中性粒细胞募集测定中评价本发明的抗IL-17A抗体在体内阻断IL-17A活性的能力。简而言之，在-4天时，用本发明的抗IL-17A抗体或同种型对照通过每只小鼠皮下注射0、10、30、40、60或100μg抗体治疗5周龄的雌性BALB/cAnN小鼠(TaconicFarms，Germantown，New York，USA)。在-1天时，在低浓度异氟烷麻醉下通过鼻给予1μg rhIL-17A的50μl PBS溶液(或仅PBS的对照)刺激小鼠。
在第0天时，如下测定在BAL液中存在的嗜中性粒细胞水平。用CO2处死小鼠，收集血样，由其测定抗IL-17A抗体的浓度。通过气管切开术将针插入上颈部气管，并通过3次引入和取出0.3ml PBS收集BAL液。离心BAL液(400xg，10分钟，4℃)，将细胞沉淀重悬浮在PBS中。使用锥虫蓝溶液在血球计数器中测定总细胞计数。通过Wright-Giemsa染色(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)按照标准形态学标准使用油浸渍显微镜(原放大倍数×1000)对Cytospin制备物进行差异细胞计数。对200或300个细胞(淋巴细胞、单细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞)进行细胞计数，以确定BAL嗜中性粒细胞百分率。
结果提供于图4。提供了本发明的3种抗IL-17A抗体(1D10、16C10和4C3)以及对照的数据。BAL液中的嗜中性粒细胞百分率为单个实验动物的所有白细胞的百分率，将其作为血清抗体浓度的函数作图，横坐标的左段(“0”-“1”)代表对照，如在图例中所示。对照表明，rhIL-17A刺激诱导显著的嗜中性粒细胞募集，给予同种型对照抗体(以和抗IL-17A抗体相同的水平给药)不使其下降。相比之下，抗IL-17A数据显示，rhIL-17A诱导的嗜中性粒细胞募集剂量依赖性下降，嗜中性粒细胞募集于40-60μg/ml以上的血清抗体浓度时基本上被阻断。
实施例18
使用抗IL-17A抗体治疗类风湿性关节炎(RA)
选择对一种或多种DMARD的响应不足的、诊断为RA的人受试者，用本发明的人源化抗IL-17A抗体进行治疗。受试者维持甲氨蝶呤(10mg/周)，并可选地用强的松治疗2周。受试者还每月皮下给予50或100mg的抗IL-17A抗体。按照标准的临床标准和基于临床反应对特定受试者调整剂量。
对治疗的响应通过确定ACR评分评价，ACR评分基于美国风湿学会(American College of Rheumatology)开发的标准。ACR评分是整合多个临床参数和X光照片评分的复合评分，例如肿胀和脆弱关节数下降、患者总体评价、医生总体评价、疼痛评分、自我评价的失能和急性期反应物(红细胞沉降速率或C-反应蛋白)。参见Felson等(1995)Arthritis&Rheumatology 38；727-735。如果受试者在第24周或治疗时表现出ACR20或以上的评分，则认为受试者已改善。另外，获得多个ACR评分(例如ACR20、ACR50和ACR70)的受试者比例可用于在临床实验中比较治疗和安慰剂组，以评价本发明的人源化抗IL-17A抗体的临床效力。
实施例19
表位测定
如下确定对本发明的抗体(例如大鼠16C10)结合关键的氨基酸残基。
第一组实验基于以下观察结果：大鼠抗体16C10能够结合人IL-17A(hIL-17A)，但不能结合小鼠IL-17A(mIL-17A)或相关的细胞因子人IL-17F。这3种蛋白中的每一种都连接N-末端FLAG
Figure A20078003766200951
肽标签(参见SEQ ID NO.：42的残基1-9)。为了鉴别对16C10结合关键的氨基酸残基，通过混合相关基因的限制性片段以形成杂合多肽，组合FLAG-标记的hIL-17A、mIL-17A和IL-17F的多个肽子序列。在增强的发光接近均相测定(Amplified Luminescent Proximity HomogeneousAssay)(AlphaScreen，Packard BioScience，Wellesley，Massachusetts，USA)中测定这些杂合多肽与抗体16C10的结合，以确定hIL-17A的哪个区段对结合关键。生物素化抗体16C10结合链霉抗生物素蛋白供体珠，杂合多肽结合具有抗FLAG抗体的受体珠(Packard Bio Science)。混合供体珠和受体珠，于680nm发光，并于520-620nm检测发射。在含有结合抗体16C10的杂合多肽的样品中荧光增强表示检测到结合因为受体珠与供体珠保持紧密邻近，并在离开的供体珠的单态氧扩散至受体珠时发射光。
结果表明，抗体16C10结合含有hIL-17A的氨基酸残基50-132、63-132、1-87、1-112和63-87的杂合多肽，表明对16C10结合关键的残基存在于hIL-17A的残基63-87(PSVIWEAKCR HLGCINADGNVDYHM)中。在本实施例中的所有残基编号都参考hIL-17A序列(SEQ ID NO.：40)。例如，用hIL-17A的残基63-87置换的mIL-17A和IL-17F多肽能够结合抗体16C10，而完整的mIL-17A和IL-17F不能。
还将点突变引入hIL-17A中，以确定哪个氨基酸残基对抗体16C10结合关键。在一个实验中，进行丙氨酸扫描诱变，其中引入丙氨酸密码子代替几个残基(45、46、51、52、54、55、56、57、58、60、61、62、67、68、70、72、73、78、80、82、84、85、86、88、93、94、95、100、101、102、105、108、110、111、113、114)处的天然氨基酸。将含有编码突变形式的hIL-17A的基因的哺乳动物表达质粒瞬时转染入人胚胎肾(HEK)293T细胞中。如上文所述通过AlphaScreen分析上清液的FLAG
Figure A20078003766200961
肽标签定量和抗体16C10结合。单个氨基酸丙氨酸置换没有一个显著降低抗体16C10的结合。实施其它点突变，其中人IL-17F或小鼠IL-17A残基在63-87片段中的多个位置被置换，即L74Q、G75R、V83E、Y85H。尽管这些单个点突变没有一个抑制抗体16C10结合，但具有全部4个改变的hIL-17A表现出结合显著降低，证实hIL-17A的63-87片段中的残基，更具体地说是74-85片段(LGCINADGNVDY)中的残基，对16C10结合是重要的。
表16
序列标识
 SEQ ID NO：   描述
  1  含信号序列的人16C10轻链DNA
  2  含信号序列的人16C10轻链氨基酸
  3  含信号序列的人16C10重链DNA
  4  含信号序列的人16C10重链氨基酸
  5  人16C10/4C3轻链可变结构域
  6  人16C10/4C3重链可变结构域
  7  大鼠16C10轻链可变结构域
  8  大鼠16C10/4C3重链可变结构域
  9  嵌合16C10轻链
  10  嵌合16C10重链
  11  大鼠/人16C10/4C3 CDRL1
  12  大鼠/人16C10/4C3 CDRL2
  13  大鼠/人16C10/4C3 CDRL3
  14  大鼠/人16C10/4C3 CDRH1
  15  大鼠16C10/4C3 CDRH2
  16  人16C10/4C3 CDRH2(N54Q)
  17   大鼠16C10 CDRH2(N54N/Q/A)
  18   大鼠16C10/4C3 CDRH3
  19   人16C10/4C3 CDRH3(M96A)
  20   大鼠16C10CDRH3(M96M/A/K，M100hM/F)
  21   大鼠4C3轻链可变结构域
  22   人30C10轻链可变结构域
  23   人30C10重链可变结构域
  24   大鼠30C10轻链可变结构域
  25   大鼠30C10重链可变结构域
  26   大鼠/人30C10 CDRL1
  27   大鼠/人30C10 CDRL2
  28   大鼠/人30C10 CDRL3
  29   大鼠/人30C10 CDRH1
  30   大鼠/人30C10 CDRH2
  31   大鼠/人30C10 CDRH3
  32   大鼠12E6轻链可变结构域
  33   大鼠12E6重链可变结构域
  34   大鼠/人12E6 CDRL1
  35   大鼠/人12E6 CDRL2
  36   大鼠/人12E6 CDRL3
  37   大鼠/人12E6 CDRH1
  38   大鼠/人12E6 CDRH2
  39   大鼠/人12E6 CDRH3
  40   huIL-17A(天然的)
  41   rhIL-17A
  42   FLAG-IL-17A
  43   R&D IL-17A
  44   含信号序列的大鼠23E12轻链可变结构域DNA
  45  含信号序列的大鼠23E12轻链可变结构域氨基酸
  46  含信号序列的大鼠23E12重链可变结构域DNA
  47  含信号序列的大鼠23E12重链可变结构域氨基酸
  48  大鼠/人23E12CDRL1
  49  大鼠/人23E12CDRL2
  50  大鼠/人23E12CDRL3
  51  大鼠/人23E12CDRH1
  52  大鼠/人23E12CDRH2
  53  大鼠/人23E12CDRH3
  54  大鼠1D10轻链可变结构域
  55  大鼠1D10重链可变结构域
  56  大鼠1D10CDRL1
  57  大鼠1D10CDRL2
  58  大鼠1D10CDRL3
  59  大鼠1D10CDRH1
  60  大鼠1D10CDRH2
  61  大鼠1D10CDRH3
  62  含信号序列的人16C10轻链DNA
  63  含信号序列的人16C10重链DNA
上述出版物或文件的引用并不意味着承认前述中的任何一种是有关的现有技术，也不意味着它构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。本文提及的所有参考文献都在此引入作为参考，其程度如同每个单独的出版物、专利申请或专利明确地和单独地被指出引入作为参考一样。
序列表
<110>Presta，Leonard G.
Bowman，Edward P.
<120>抗IL-17A抗体
<130>BP06474
<150>US 60/837,197
<151>2006-08-11
<160>63
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>720
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>具有信号序列的人源化16C10抗体轻链
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(717)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<220>
<221>成熟肽
<222>(58)..(717)
<400>1
atg gct cca gtg cag ctg ctg ggg ctg ctg gtg ctg ttc ctg cca gcc   48
Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala
                -15                 -10                 -5
atg aga tgt gat atc gtg atg acc cag tct cca ctg tcc ctg cct gtg    96
Met Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
        -1  1               5                   10
aca ccc gga gag cca gcc agc atc agc tgc aag agc agc cag agc ctg    144
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
    15                  20                  25
ctg ttc agc gag aac cag aag aac tac ctg gcc tgg tat ctg cag aaa    192
Leu Phe Ser Glu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys
30                  35                  40                  45
cca ggg cag agc cct cag ctg ctg atc tat tgg acc agc acc cgg cag    240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Gln
                50                  55                  60
agc ggg gtg cca gac agg ttc agc ggc agc gga tct ggg aca gat ttc    288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
            65                  70                  75
act ctg aag atc agc cgg gtg gag gcc gaa gat gtg ggc gtg tac tac    336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
        80                  85                  90
tgt cag cag agc tat tac aca ccc tac acc ttt gga cag ggg acc aag    384
Cys Gln Gln Ser Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
    95                  100                 105
gtg gaa atc aaa cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg    432
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
110                 115                 120                 125
cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg    480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
                130                 135                 140
ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat    528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
            145                 150                 155
aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac    576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
        160                 165                 170
agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa    624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
    175                 180                 185
gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag    672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
190                 195                 200                 205
ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt taa    720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
                210                 215                 220
<210>2
<211>239
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建体
<400>2
Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala
                -15                 -10                 -5
Met Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
        -1  1                   5                   10
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
    15                  20                  25
Leu Phe Ser Glu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys
30                  35                  40                  45
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Gln
                50                  55                  60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
            65                  70                  75
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
        80                  85                  90
Cys Gln Gln Ser Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
    95                  100                 105
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
110                 115                 120                 125
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
                130                 135                 140
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
            145                 150                 155
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
        160                 165                 170
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
    175                 180                 185
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
190                 195                 200                 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
                210                 215                 220
<210>3
<211>1422
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>具有信号序列的人源化16C10抗体重链
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1419)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<220>
<221>成熟肽
<222>(58)..(1419)
<400>3
atg gct gtg ctg ggg ctg ctg ttc tgc ctg gtg aca ttc cca agc tgt    48
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
                -15                 -10                 -5
gtg ctg tcc cag gtg cag ctg cag gag tct gga cca ggc ctg gtg aag    96
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
        -1  1                   5                   10
cct agc gag acc ctg agc ctg acc tgt acc gtg tct gga ttc agc ctg    144
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
    15                  20                  25
ccc agc cac agc gtg agc tgg atc aga cag cct cca ggc aag gga ctg    192
Pro Ser His Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
30                  35                  40                  45
gag tgg atc ggc atc att tgg aat caa ggc ggc act gac tat aac agc    240
Glu Trp Ile Gly Ile Ile Trp Asn Gln Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser
                50                  55                  60
gcc ttc aag agc cgc gtg acc atc tcc gtg gac acc tcc aag aac cag    288
Ala Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
            65                  70                  75
ttc agc ctg aag ctg agc agc gtg acc gct gcc gac acc gct gtg tat    336
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
        80                  85                  90
tac tgt gcc aga aat gca tac atc acc gac tac tat tac gag aac tac    384
Tyr Cys Ala Arg Asn Ala Tyr Ile Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Asn Tyr
    95                  100                 105
ttc atg gat gcc tgg gga cag ggc acc ctg gtg acc gtg agc tcc gct    432
Phe Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
110                 115                 120                 125
agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc    480
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
                130                 135                 140
acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc    528
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
            145                 150                 155
ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc    576
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
        160                 165                 170
gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc    624
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
    175                 180                 185
agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac    672
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
190                 195                 200                 205
atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa    720
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
                210                 215                 220
gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca    768
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
            225                 230                 235
gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa    816
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
        240                 245                 250
ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg    864
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
    255                 260                 265
gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac    912
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
270                 275                 280                 285
gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag    960
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
                290                 295                 300
cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac    1008
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
            305                 310                 315
cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa    1056
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
        320                 325                 330
gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag    1104
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
    335                 340                 345
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg    1152
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
350                 355                 360                 365
acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc    1200
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
                370                 375                 380
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac    1248
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
            385                 390                 395
tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc    1296
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
        400                 405                 410
tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc    1344
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
    415                 420                 425
ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag    1392
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
430                 435                 440                 445
aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga                            1422
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                450
<210>4
<211>473
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成构建体
<400>4
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
                -15                 -10                 -5
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
        -1  1                   5                   10
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
    15                  20                  25
Pro Ser His Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
30                  35                  40                  45
Glu Trp Ile Gly Ile Ile Trp Asn Gln Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser
                50                  55                  60
Ala Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
            65                  70                  75
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
        80                  85                  90
Tyr Cys Ala Arg Asn Ala Tyr Ile Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Asn Tyr
    95                  100                 105
Phe Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
110                 115                 120                 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
                130                 135                 140
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
            145                 150                 155
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
        160                 165                 170
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
    175                 180                 185
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
190                 195                 200                 205
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
                210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
            225                 230                 235
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
        240                 245                 250
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
    255                 260                 265
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
270                 275                 280                 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
                290                 295                 300
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
            305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
        320                 325                 330
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
    335                 340                 345
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
350                 355                 360                 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
                370                 375                 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
            385                 390                 395
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
        400                 405                 410
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
    415                 420                 425
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
430                 435                 440                 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                450
<210>5
<211>114
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人源化的16C10和4C3轻链可变结构域
<400>5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Ser
            20                  25                  30
Glu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Ser Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys Arg
<210>6
<211>124
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人源化的16C10和4C3重链可变结构域
<400>6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Pro Ser His
            20                  25                  30
Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Trp Asn Gln Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asn Ala Tyr Ile Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Asn Tyr Phe Met Asp
            100                 105                 110
Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>7
<211>114
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ile Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Val Thr Leu Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Ser
            20                  25                  30
Glu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Met Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Ser Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
            100                 105                 110
Lys Arg
<210>8
<211>124
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>8
Gln Val Glu Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Pro Ser His
            20                  25                  30
Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Trp Asn Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asn Met Tyr Ile Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Asn Tyr Phe Met Asp
            100                 105                 110
Ala Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>9
<211>220
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>嵌合16C10轻链
<400>9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ile Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Val Thr Leu Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Ser
            20                  25                  30
Glu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Met Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Ser Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
            100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
        115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
                165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
            180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220
<210>10
<211>454
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>嵌合16C10重链
<400>10
Gln Val Glu Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Pro Ser His
            20                  25                  30
Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Trp Asn Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asn Met Tyr Ile Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Asn Tyr Phe Met Asp
            100                 105                 110
Ala Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
        115                 120                 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
    130                 135                 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145                 150                 155                 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
                165                 170                 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
            180                 185                 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
        195                 200                 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
    210                 215                 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
                245                 250                 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
            260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
        275                 280                 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
    290                 295                 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305                 310                 315                 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
                325                 330                 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
            340                 345                 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
        355                 360                 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
    370                 375                 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385                 390                 395                 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
                405                 410                 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
            420                 425                 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450
<210>11
<211>17
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>11
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Ser Glu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>12
Trp Thr Ser Thr Arg Gln Ser
1               5
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>13
Gln Gln Ser Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr
1               5
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>14
Gly Phe Ser Leu Pro Ser His Ser Val Ser
1               5                   10
<210>15
<211>16
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>15
Ile Ile Trp Asn Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>16
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人源化的16C10 CDRH2(N54Q)
<400>16
Ile Ile Trp Asn Gln Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>17
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>大鼠16C10 CDRH2(N54N/Q/A)
<220>
<221>变体
<222>(5)..(5)
<223>Xaa可以为Ala、Asn或Gln
<400>17
Ile Ile Trp Asn Xaa Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>18
<211>16
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>18
Asn Met Tyr Ile Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Asn Tyr Phe Met Asp Ala
1               5                   10                  15
<210>19
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人源化的16C10 CDRH3(M96A)
<400>19
Asn Ala Tyr Ile Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Asn Tyr Phe Met Asp Ala
1               5                   10                  15
<210>20
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>大鼠16C10 CDRH3(M96M/L/A/K/F，M100hM/L/F)
<220>
<221>变体
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以为Met、Leu、Ala、Lys或Phe
<220>
<221>变体
<222>(14)..(14)
<223>Xaa可以为Met、Leu或Phe
<400>20
Asn Xaa Tyr Ile Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Asn Tyr Phe Xaa Asp Ala
1               5                   10                  15
<210>21
<211>114
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>大鼠4C3轻链可变结构域
<400>21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Val Thr Leu Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Ser
            20                  25                  30
Glu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Met Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Ser Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
            100                 105                 110
Lys Arg
<210>22
<211>113
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人源化的30C10轻链可变结构域
<400>22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Trp Ser
            20                  25                  30
Glu Ser His Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His His
                85                  90                  95
His Tyr Asp Ser His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg
<210>23
<211>117
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人源化的30C10重链可变结构域
<400>23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ser Val Ser Asn Thr Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Ala Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>24
<211>113
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Trp Ser
            20                  25                  30
Glu Ser His Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His His
                85                  90                  95
His Tyr Asp Ser His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
Arg
<210>25
<211>117
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Gln Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ser Val Ser Asn Thr Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Ala Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Glu Gly Ala Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
       115
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>26
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Trp Ser Glu Ser His Met Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210>27
<211>7
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>27
Tyr Ala Ser Thr Arg Gln Ser
1               5
<210>28
<211>8
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>28
His His His Tyr Asp Ser His Thr
1               5
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>29
Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Trp Met Thr
1               5                   10
<210>30
<211>17
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>30
Ser Val Ser Asn Thr Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Ala Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>31
<211>8
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>31
Glu Gly Ala Tyr Tyr Leu Asp Tyr
1               5
<210>32
<211>108
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu Met Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Lys Tyr Pro Asn
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
            100                 105
<210>33
<211>117
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>33
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Gly Glu Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Gly Phe Asn Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Val Met
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>34
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr Leu Ser
1               5                   10
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>35
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp
1               5
<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>36
Leu Gln Tyr Asp Lys Tyr Pro Asn Thr
1               5
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>37
Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr Tyr Met Val
1               5                   10
<210>38
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>大鼠/人源化的12E6 CDRH2
<400>38
Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Gly Glu Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>39
<211>8
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>39
His Gly Phe Asn Pro Phe Asp Tyr
1               5
<210>40
<211>132
<212>PRT
<213>人
<400>40
Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys
1               5                   10                  15
Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn
            20                  25                  30
Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr
        35                  40                  45
Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser
    50                  55                  60
Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp
65                  70                  75                  80
Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile
                85                  90                  95
Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu
            100                 105                 110
Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val
        115                 120                 125
His His Val Ala
    130
<210>41
<211>134
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重组人IL-17A
<400>41
Leu Glu Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu
1               5                   10                  15
Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn
            20                  25                  30
Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg
        35                  40                  45
Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr
    50                  55                  60
Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn
65                  70                  75                  80
Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln
                85                  90                  95
Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe
            100                 105                 110
Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro
        115                 120                 125
Ile Val His His Val Ala
    130
<210>42
<211>141
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>FLAG-标记的人IL-17A
<400>42
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn
1               5                   10                  15
Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met
            20                  25                  30
Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg
        35                  40                  45
Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg
    50                  55                  60
Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys
65                  70                  75                  80
Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met
                85                  90                  95
Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro
            100                 105                 110
Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val
        115                 120                 125
Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala
    130                 135                 140
<210>43
<211>137
<212>PRT
<213>人
<400>43
Met Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro
1               5                   10                  15
Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn
            20                  25                  30
Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr
        35                  40                  45
Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro
    50                  55                  60
Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly
65                  70                  75                  80
Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro
                85                  90                  95
Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro
            100                 105                 110
Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys
        115                 120                 125
Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala
    130                 135
<210>44
<211>384
<212>DNA
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(384)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(60)
<220>
<221>成熟肽
<222>(61)..(384)
<400>44
atg ggc gtg ccc act cag ctc ctg ggg ttg ttg ctg ctg tgg att aca    48
Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr
-20                 -15                 -10                 -5
gat gtc ata tgt gac atc cag atg aca cag tct cca gct tcc ctg tct    96
Asp Val Ile Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
            -1  1                   5                   10
gca tct ctg gga gaa act gtc acc atc caa tgt caa gca agt gag gac    144
Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Thr Ile Gln Cys Gln Ala Ser Glu Asp
        15                  20                  25
att tac agt ggt tta gcg tgg tat cat cag aag cca ggg aag tct cct    192
Ile Tyr Ser Gly Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro
    30                  35                  40
caa ctc ctg atc ctt ggt gct agt agg tta cac gac ggc gtc cca tca    240
Gln Leu Leu Ile Leu Gly Ala Ser Arg Leu His Asp Gly Val Pro Ser
45                  50                  55                  60
cga ttc agt ggc agt gga tct ggc ata gag tat tct ctc aag atc aac    288
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ile Glu Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
                65                  70                  75
aac atg caa act gaa gat gaa ggg att tat ttc tgt caa cag ggt tta    336
Asn Met Gln Thr Glu Asp Glu Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Leu
            80                  85                  90
aag tat cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ttg aaa cgg    384
Lys Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
        95                  100                 105
<210>45
<211>128
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>45
Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr
-20                 -15                 -10                 -5
Asp Val Ile Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
            -1  1                   5                   10
Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Thr Ile Gln Cys Gln Ala Ser Glu Asp
        15                  20                  25
Ile Tyr Ser Gly Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro
    30                  35                  40
Gln Leu Leu Ile Leu Gly Ala Ser Arg Leu His Asp Gly Val Pro Ser
45                  50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ile Glu Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
                65                  70                  75
Asn Met Gln Thr Glu Asp Glu Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Leu
            80                  85                  90
Lys Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
        95                  100                 105
<210>46
<211>411
<212>DNA
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(411)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<220>
<221>成熟肽
<222>(58)..(411)
<400>46
atg gct gtc ctg gtg ctg ttg ctc tgc ctg gtg aca ttc cca aga tgt    48
Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Arg Cys
                -15                 -10                 -5
gtc ctg tcc cag gtg cag ttg aag gag tca gga cct ggt ctg gtg cag    96
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln
        -1  1                   5                   10
ccc tca cag acc ctg tct ctc acc tgc act gtc ttt gga ttc tca ttg    144
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Phe Gly Phe Ser Leu
    15                  20                  25
acc aac aat ggt gtg acc tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt ctg    192
Thr Asn Asn Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
30                  35                  40                  45
gag tgg att gca gaa gta tca agc ggt ggc agc aca gat tat aat tca    240
Glu Trp Ile Ala Glu Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser
                50                  55                  60
gcc ctc aaa tcc cga ctg agc atc agt agg gac acc tcc aag agc caa    288
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln
            65                  70                  75
gtt ttc tta aga atg aac agt ctg cag act gaa gac aca gcc att tac    336
Val Phe Leu Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
        80                  85                  90
ttc tgt gcc aga cag gag gta ttt acc gga tta ttg gat tat tgg ggc    384
Phe Cys Ala Arg Gln Glu Val Phe Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly
    95                  100                 105
caa gga gtc atg gtc aca gtc tcc tcg                                411
Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
110                 115
<210>47
<211>137
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>47
Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Arg Cys
                -15                 -10                 -5
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln
        -1  1               5                   10
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Phe Gly Phe Ser Leu
    15                  20                  25
Thr Asn Asn Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
30                  35                  40                  45
Glu Trp Ile Ala Glu Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser
                50                  55                  60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln
            65                  70                  75
Val Phe Leu Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
        80                  85                  90
Phe Cys Ala Arg Gln Glu Val Phe Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly
    95                  100                 105
Gln Gly ValMet Val Thr Val Ser Ser
110                115
<210>48
<211>11
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>48
Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Leu Ala
1               5                   10
<210>49
<211>7
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>49
Gly Ala Ser Arg Leu His Asp
1               5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>50
Gln Gln Gly Leu Lys Tyr Pro Pro Thr
1               5
<210>51
<211>10
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>51
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn Gly Val Thr
1               5                   10
<210>52
<211>16
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>52
Glu Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>53
<211>10
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>53
Gln Glu Val Phe Thr Gly Leu Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>54
<211>108
<212>PRT
<213>鼠(Rattus sp.)
<400>54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Asp Trp Phe Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Asp Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Phe Ser Asp Phe Ile Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Arg Glu Ser Trp Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
            100                 105
<210>55
<211>122
<212>PRT
<213>鼠(Rattus sp.)
<400>55
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Tyr Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Val Trp Asn Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Arg
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Leu Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Glu Gly Arg Glu Gly Phe Val Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp
            100                 105                 110
Gly Pro Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>56
<211>11
<212>PRT
<213>鼠(Rattus sp.)
<400>56
Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Tyr Leu Asp
1               5                   10
<210>57
<211>7
<212>PRT
<213>鼠(Rattus sp.)
<400>57
Asn Ala Asp Asn Leu His Thr
1               5
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>鼠(Rattus sp.)
<400>58
Leu Gln Arg Glu Ser Trp Pro Tyr Thr
1               5
<210>59
<211>10
<212>PRT
<213>鼠(Rattus sp.)
<400>59
Ser Leu Thr Asn Tyr Tyr Val His Trp Val
1               5                   10
<210>60
<211>16
<212>PRT
<213>鼠(Rattus sp.)
<400>60
Gly Val Trp Asn Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Arg Ser
1               5                   10                  15
<210>61
<211>14
<212>PRT
<213>鼠(Rattus sp.)
<400>61
Glu Gly Arg Glu Gly Phe Val Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala
1               5                   10
<210>62
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有信号序列的人源化16C10抗体轻链
<400>62
atggcccccg tgcagctgct gggcctgctg gtgctgttcc tgcccgccat gagatgcgac     60
atcgtgatga cccagagccc cctgagcctg cccgtgaccc caggcgagcc cgccagcatc     120
agctgcaaga gcagccagag cctgctgttc agcgagaacc agaagaacta cctggcctgg     180
tatctgcaga agcccggcca gtccccccag ctgctgatct actggaccag caccaggcag     240
agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc     300
agcagggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgcc agcagagcta ctacaccccc     360
tacaccttcg gccagggcac caaggtggag atcaagcgta cggtggctgc ccccagcgtg     420
ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg     480
ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag     540
agcggcaaca gccaggaaag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg     600
agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag     660
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgctag    720
<210>63
<211>1422
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>具有信号序列的人源化16C10抗体重链
<400>63
atggccgtgc tgggcctgct gttctgcctg gtgaccttcc ccagctgcgt gctgtcccag    60
gtgcagctgc aggaaagcgg cccaggcctg gtgaagccca gcgagaccct gagcctgacc    120
tgcaccgtga gcggcttcag cctgcccagc cacagcgtga gctggatcag gcagccccca    180
ggcaagggcc tggaatggat cggcatcatc tggaaccagg gcggcaccga ctacaacagc    240
gccttcaaga gcagggtgac catcagcgtg gacaccagca agaaccagtt cagcctgaag    300
ctgtccagcg tgacagccgc cgacaccgcc gtgtactact gcgccaggaa cgcctacatc    360
accgactact actacgagaa ctacttcatg gacgcctggg gccagggcac cctggtgacc    420
gtgagcagcg ctagcaccaa gggcccaagc gtgttccccc tggcccccag cagcaagagc    480
acctccggcg gcacagccgc cctgggctgt ctggtgaagg actacttccc cgagcccgtg    540
accgtgtcct ggaacagcgg agccctgacc agcggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg    600
cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgacag tgcccagcag cagcctgggc    660
acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag    720
gtggagccca agagctgcga caagacccac acctgccccc cctgccctgc cccagagctg    780
ctgggcggac ccagcgtgtt cctgttcccc cccaagccca aggacaccct gatgatcagc    840
aggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaggaccc agaggtgaag    900
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc cagagaggaa    960
cagtacaaca gcacctacag ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg    1020
aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaggccc tgccagcccc catcgagaaa    1080
accatcagca aggccaaggg ccagccacgg gagccccagg tgtacaccct gccccccagc    1140
cgggacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc    1200
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc    1260
cccccagtgc tggacagcga cggcagcttc ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag    1320
agcaggtggc agcagggcaa cgtgttcagc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac    1380
cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc cccggcaagt ga                       1422

Claims (45)

1.一种结合人IL-17A的结合化合物，其包含：
至少1个抗体轻链可变区或其结合片段，其具有至少指定数目的选自SEQ ID NO：11-13的CDR序列；和
至少1个抗体重链可变区或其结合片段，其具有至少指定数目的选自SEQ ID NO：14-20的CDR序列；
其中所述指定数目为1。
2.权利要求1的结合化合物，其中所述指定数目为2。
3.权利要求1的结合化合物，其中所述指定数目为3。
4.权利要求3的结合化合物，其中所述轻链可变区含有SEQ IDNO：11-13的CDR序列；和
其中所述重链可变区含有SEQ ID NO：14、17和20的CDR序列。
5.权利要求3的结合化合物，其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO：11-13的CDR序列；和
其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：14、16和19的CDR序列。
6.权利要求3的结合化合物，其中所述轻链可变区包含具有至多10个保守取代的SEQ ID NO：5的序列，其中所述重链可变区包含具有至多10个保守氨基酸取代的SEQ ID NO：6的序列。
7.权利要求6的结合化合物，其中所述结合化合物为抗体，其包含：
含有SEQ ID NO：5的轻链可变区；和
含有SEQ ID NO：6的重链可变区。
8.权利要求3的结合化合物，其中所述轻链基本上由具有至多10个保守取代的SEQ ID NO：2的氨基酸1-220组成，所述重链基本上由具有至多10个保守取代的SEQ ID NO：4的氨基酸1-454组成。
9.权利要求8的结合化合物，其中所述轻链基本上由SEQ ID NO：2的氨基酸1-220组成，所述重链基本上由SEQ ID NO：4的氨基酸1-454组成。
10.权利要求9的结合化合物，其中所述轻链由SEQ ID NO：2的氨基酸1-220组成，所述重链基本上由SEQ ID NO：4的氨基酸1-454组成。
11.一种结合人IL-17A的结合化合物，其中该结合化合物包含与SEQ ID NO：5具有至少90％同源性的轻链可变区和与SEQ ID NO：6具有至少90％同源性的重链可变区。
12.一种分离的核酸，所述核酸编码权利要求3的结合化合物的至少1个轻链可变区和重链可变区。
13.权利要求12的核酸，其中轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO：5，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
14.权利要求13的核酸，其包含SEQ ID NO：1和3的序列或SEQID NO：62和63的序列。
15.一种包含权利要求14的核酸的表达载体，其中在用所述载体转染宿主细胞时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。
16.权利要求15的表达载体，其中所述表达载体的ATCC保藏号为PTA-7675。
17.一种包含权利要求16的载体的宿主细胞。
18.一种生产多肽的方法，其包括：
在表达核酸序列的条件下在培养基中培养权利要求17的宿主细胞，由此产生含有所述轻链可变区和重链可变区的多肽；和
由宿主细胞或培养基回收所述多肽。
19.一种抗人IL-17A抗体hu16C10，其中抗体序列由权利要求16的表达载体编码。
20.一种能够在交叉阻断测定中交叉阻断权利要求10的结合化合物与人IL-17A的结合的抗体。
21.一种结合人IL-17A上的与权利要求19的抗体16C10结合的表位相同的表位的抗体。
22.一种在包含SEQ ID NO.：40的人IL-17A蛋白序列的氨基酸残基74-85的表位处结合人IL-17A的抗体。
23.一种结合人IL-17A的结合化合物，其包含：
包含SEQ ID NO：26-28的CDR序列的轻链可变区；和
包含SEQ ID NO：29-31的CDR序列的重链可变区。
24.权利要求23的结合化合物，其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO：22的序列，重链可变区包含SEQ ID NO：23的序列。
25.权利要求23的结合化合物，其中所述结合化合物为单克隆抗体。
26.一种结合人IL-17A的结合化合物，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：48-50的CDR序列的轻链可变区和包含SEQID NO：51-53的CDR序列的重链可变区；或
(b)包含SEQ ID NO：56-58的CDR序列的轻链可变区和包含SEQID NO：59-61的CDR序列的重链可变区。
27.权利要求26的结合化合物，其中所述结合化合物为人源化单克隆抗体。
28.一种结合人IL-17A的结合化合物，其中所述结合化合物还具有至少1种以下特性：
a)所述结合化合物以100pM以下的平衡解离常数(Kd)结合人IL-17A；
b)在人IL-17A-刺激的正常人皮肤成纤维细胞中抑制IL-6产生的测定中，所述结合化合物具有5nM以下的IC50，其中人IL-17A刺激用1nM人IL-17A实现；
c)在人IL-17A生物学活性的体外测定中，所述结合化合物具有500pM以下的IC50，其中所述体外测定检测100pM人IL-17A的生物学活性；
d)所述结合化合物在以50μg/ml的血清浓度给予小鼠时，能够将IL-17A诱导的向肺的嗜中性粒细胞募集降低50％以上，根据BAL嗜中性粒细胞的百分率检测；
e)所述结合化合物以比对人IL-17A的亲和力低不超过20倍的亲和力(Kd)结合猕猴IL-17A，其中所述结合化合物还抑制猕猴IL-17A活性；和
f)所述结合化合物以比对小鼠或大鼠IL-17A的亲和力高至少1000倍的亲和力(Kd)结合人IL-17A。
29.权利要求28的结合化合物，其中所述结合化合物具有至少1种以下特性：
a)所述结合化合物以20pM以下的平衡解离常数(Kd)结合人IL-17A；
b)在人IL-17A-刺激的正常人皮肤成纤维细胞中抑制IL-6产生的测定中，所述结合化合物具有1nM以下的IC50，其中人IL-17A刺激用1nM人IL-17A实现；和
c)在人IL-17A生物学活性的体外测定中，所述结合化合物具有100pM以下的IC50，其中体外测定检测100pM人IL-17A的生物学活性。
30.权利要求28的结合化合物，其中所述结合化合物为人源化或全人单克隆抗体。
31.一种治疗人类患者的方法，包括给予其需要的患者治疗有效量的结合化合物，所述结合化合物结合人IL-17A并中和人IL-17A活性，其中所述结合化合物包含抗体轻链可变区和抗体重链可变区，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：5，所述重链可变区包含SEQ IDNO：6。
32.权利要求31的方法，其中所述结合化合物为单克隆抗体。
33.权利要求32的方法，其中所述人类患者患有炎症或自身免疫性疾病。
34.权利要求33的方法，其中所述人类患者患有类风湿性关节炎。
35.权利要求33的方法，其中所述人类患者患有炎性肠病。
36.权利要求31的方法，其还包括给予另一种免疫抑制剂或抗炎剂。
37.一种组合物，含有：
结合人IL-17A并中和人IL-17A活性的结合化合物，其中所述结合化合物含有抗体轻链可变区和抗体重链可变区，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：5，所述重链可变区包含SEQ ID NO：6；和
药学上可接受的载体或稀释剂。
38.权利要求37的组合物，其还包括另一种免疫抑制剂或抗炎剂。
39.权利要求5的结合化合物，其进一步包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。
40.权利要求39的结合化合物，其包含γ1人重链恒定区或其变体。
41.权利要求39的结合化合物，其包含γ4人重链恒定区或其变体。
42.权利要求5的结合化合物，其进一步包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含κ人轻链恒定区。
43.权利要求5的结合化合物，其中所述结合化合物为选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)2和双体的抗体片段。
44.权利要求6的结合化合物，其中所述结合化合物为选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)2和双体的抗体片段。
45.权利要求1、11、23、26或28中任一项的结合化合物，其中所述结合化合物抑制人IL-17A活性。
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