CN101628296A

CN101628296A - 一种利用拮抗微生物菌剂修复沙门氏菌污染土壤的方法

Info

Publication number: CN101628296A
Application number: CN200910181881A
Authority: CN
Inventors: 尹睿; 宋德显; 林先贵
Original assignee: Institute of Soil Science of CAS
Current assignee: Institute of Soil Science of CAS
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2010-01-20

Abstract

一种利用拮抗微生物菌剂原位修复沙门氏菌污染土壤的微生物生态学方法，方法步骤为：利用无菌滤纸片平板法从被沙门氏菌污染的土壤中分离得到适宜于土壤环境、对沙门氏菌有抑制或杀灭作用的拮抗细菌；拮抗微生物菌株经过如下流程进行发酵：种子液接种→一级培养→二级培养接种→二级扩大培养，得到拮抗细菌菌液；拮抗细菌菌液喷施于沙门氏菌污染土壤，喷施后耙匀。本方法首次提出运用微生物生态学原理，利用自土壤中分离筛选的沙门氏菌拮抗菌的抑制或杀灭作用对沙门氏菌污染土壤进行原位微生物修复，既避免了物理修复对土壤结构和土壤生物的损害，又避免了化学修复可能导致的二次污染，是一种低成本、环境友好的修复途径。

Description

一种利用拮抗微生物菌剂修复沙门氏菌污染土壤的方法

一、技术领域

本发明属于土壤污染修复技术中微生物修复领域，特别涉及一种土壤微生物污染中利用拮抗微生物菌剂修复沙门氏菌污染土壤的微生物生态修复方法。

二、背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是引起肠道细菌性感染和细菌性食物中毒的重要病原体。在全球范围内，近年来沙门氏菌中毒事件急剧上升，其中许多中毒事件是由于食用了沙门氏菌污染食物和饮用了沙门氏菌污染水而引起的，因而人们对导致食物和水体污染的土壤病原菌污染更加关注。研究表明，大量的未经妥善处理的人、畜、禽粪便施入土壤以及生活、养殖污水排放到土壤环境是增加沙门氏菌污染土壤风险的主要因素，人、畜、禽粪便作为有机肥施加到土壤中不但能够增加沙门氏菌的在土壤中的存活时间，同时土壤中大量存在的沙门氏菌能够增加畜禽养殖业的风险。在4-6℃范围内，土壤中大多数病原菌可存活30天左右，但是沙门氏菌存活时间相对较长。在众多病原菌中，沙门氏菌在20-30℃的土壤中，要比其它病原菌存活时间要长得多。Islam等研究发现沙门氏菌随污灌或畜禽粪便不当使用进入土壤后，203-231天后在土壤样品中仍然可以检测到存活的沙门氏菌，在沙门氏菌污染土壤上播种小萝卜84天和播种红萝卜203天后仍能检测土壤中沙门氏菌的存在。也有文献报道夏季随着畜禽粪便施加到土壤中的沙门氏菌可存活近300天，存活土壤中的沙门氏菌也可随地表径流进入到地表水体中，污染地表水。土壤中的沙门氏菌污染能通过造成食物污染和水源污染而引起人体肠道感染，进而影响公共卫生安全。因此，抑制或杀灭土壤环境中沙门氏菌、修复污染土壤、降低土壤环境中沙门氏菌存活数量，对于减少沙门氏菌感染性疾病的爆发和蔓延具有重要意义。但是国内外尚未有有关对于沙门氏菌污染土壤进行微生物修复的报道。

三、发明内容

发明目的：本发明针对上述技术缺陷，提供一种利用拮抗微生物菌剂修复沙门氏菌污染土壤的方法，该方法运用微生物生态学原理，利用自土壤中分离筛选的沙门氏菌拮抗菌的抑制或杀灭作用对沙门氏菌污染土壤进行原位微生物修复，既避免了物理修复对土壤结构和土壤生物的损害，又避免了化学修复可能导致的二次污染。

技术方案：本发明的技术解决方案为：一种利用拮抗微生物菌剂原位修复沙门氏菌污染土壤的微生物生态学方法，方法步骤为：利用无菌滤纸片平板法从被沙门氏菌污染的土壤中分离得到适宜于土壤环境、对沙门氏菌有抑制或杀灭作用的拮抗细菌；拮抗微生物菌株经过如下流程进行发酵：种子液接种→一级培养→二级培养接种→二级扩大培养，得到拮抗细菌菌液；拮抗细菌菌液喷施于沙门氏菌污染土壤，喷施后耙匀。

沙门氏菌污染土壤拮抗微生物原位修复方法，方法步骤为：在LB细菌培养基平板上，首先均匀涂布病原菌接种液，然后用灭过菌圆形滤纸片分别蘸取目标拮抗细菌培养液，贴在涂过病原菌的平板上，于培养箱中28℃条件下培养1-3天，挑选具有明显抑菌圈菌株，对该菌进行记录，保存；拮抗微生物复合菌剂制备：用无菌接种环将斜面保存菌种，接种至三角瓶无菌液体培养基中摇匀即成菌悬液，30℃，200r/min培养24h，培养得到一级种子液；将一级种子液按其与发酵培养基体积比1∶10的接种量接种到发酵瓶中二级扩大培养48h得到发酵液；利用微生物复合菌剂对沙门氏菌污染土壤进行微生物修复，分对照和添加拮抗微生物复合菌剂2个处理布置土培试验，置于自然条件下培养，添加拮抗微生物复合菌剂处理和对照均设4个重复，定期采取土样测定土壤中沙门氏菌存活数量，监测污染土壤中沙门氏菌的数量动态变化；根据温室土培微生物菌剂修复效果，应用微生物修复方法于田间沙门氏菌污染土壤进行拮抗微生物复合菌剂微生物原位修复，将发酵培养拮抗微生物菌液施加到沙门氏菌污染田间土壤中，每个对照和处理设3个重复，于施加拮抗微生物复合菌剂后定期采集污染土壤0-10cm表层土样，采用五点采样法，监测污染土壤中的沙门氏菌的数量动态变化，以监测是否达到治理沙门氏菌污染土壤的效果。

有益效果：筛选适应于土壤环境的高效沙门氏菌拮抗细菌；拮抗细菌经过发酵培养配制成拮抗微生物复合菌剂；拮抗微生物菌剂喷施于沙门氏菌污染土壤，发挥其抑制或杀灭土壤中的沙门氏菌，从而减少土壤环境中存活的沙门氏菌数量，降低沙门氏菌污染土壤所带来的生态环境风险。传统上消除病原菌都采用物理或化学的手段，但在污染土壤修复中这两种途径都有局限性。本方法首次提出运用微生物生态学原理，利用自土壤中分离筛选的沙门氏菌拮抗菌的抑制或杀灭作用对沙门氏菌污染土壤进行原位微生物修复，既避免了物理修复对土壤结构和土壤生物的损害，又避免了化学修复可能导致的二次污染，是一种低成本、环境友好的修复途径，可维持土壤微生物多样性和种群平衡，保护土壤生态功能。

四、附图说明

图1为无菌滤纸片平板法筛选沙门氏菌拮抗菌示意图。从图中可以看出：用无菌滤纸片平板法从土壤中筛选出对沙门氏菌有拮抗或抑制作用的拮抗细菌，在平板上所筛选到的拮抗细菌对供试沙门氏菌病原菌表现出较好的拮抗或抑制作用，经反复筛选选取抑菌圈较大且效果稳定的菌株用于制备菌剂。

图2为制备的拮抗细菌菌剂应用实例效果。该应用实例是在温室培养的沙门氏菌污染土壤中应用的，从图中可以看出：在喷施菌剂后的前三天，不喷施对照和喷施复合菌剂处理之间沙门氏菌存活数量没有显著差异，但是7天后，喷施微生物复合菌剂的土壤中沙门氏菌数量显著下降，低于对照2-3个数量级，说明加入的复合菌剂在土壤环境中对沙门氏菌表现出较好的拮抗或杀灭作用。

图3和图4均为在田间应用复合菌剂修复沙门氏菌污染土壤的应用效果实例。图3为在轻度沙门氏菌污染土壤上的应用效果，图4为在高度沙门氏菌污染土壤的应用效果。从图中可以看出：沙门氏菌污染土壤在喷施拮抗微生物复合菌剂10天后，喷施的拮抗微生物复合菌剂表现出了对沙门氏菌明显的抑制作用，30天后喷施拮抗微生物复合菌剂的土壤中沙门氏菌数量比对照下降10倍以上，而40天后喷施拮抗微生物复合菌剂的土壤中沙门氏菌数量比对照下降100倍以上，表明在田间喷施拮抗细菌菌剂可以起到抑制沙门氏菌繁殖、减少其存活数量的作用。这种利用拮抗微生物菌剂原位修复病原菌污染土壤的微生物生态学修复方法具有成本低、效果比较好、发挥效用时间长、环境友好的优点，有实际的应用价值，能够有效降低病原菌污染土壤潜在的生态环境风险，达到保护公共卫生安全目的。

五、具体实施方式

实施例1：

1、拮抗细菌菌株的分离和筛选

1.1培养基

沙门氏菌鉴别培养基：氯化镁孔雀绿增菌培养基，HE琼脂培养基

细菌培养基：LB(Luria-Bertani)培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0，121℃灭菌20min；固体培养基添加琼脂粉1.2-1.5％。

1.2供试沙门氏菌菌株

标准菌株：肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。

自然环境中分离的沙门氏菌菌株：分离自畜禽粪便污染的土壤样品。

1.3分离筛选方法：

细菌菌株分离：分别称取5g土壤鲜样到50ml无菌水中，振荡45分钟，然后分级稀释(10^-3-10^-8)涂布在细菌LB培养基。待菌落长出后，挑选单菌落接种于预先装有LB液体培养基的96孔板，28℃培养24h。

沙门氏菌拮抗细菌的初筛，采用无菌滤纸片平板法：在LB细菌培养基平板上，首先均匀涂布病原菌接种液于平板，然后将灭过菌的直径6mm圆形滤纸片在96孔微孔板中培养的菌液中浸透，最后将滤纸片贴在涂过病原菌的平板上，28℃培养1-3天，检查滤纸片周围的抑菌圈情况。如有明显抑菌圈，说明该菌对病原菌有拮抗作用。选取对病原菌生长有抑制作用的不同形态菌落，并记录，拍照，分离纯化，编号后4℃保存。

高效拮抗细菌的复筛：利用同样的方法对初筛得到的拮抗菌株进行反复的复筛，最后选取对所有供试沙门氏菌均有明显拮抗作用，且抑菌圈较大抑菌效果稳定的菌株制备菌剂。

2、拮抗微生物复合菌剂制备：

拮抗微生物菌剂制备流程：种子液接种→一级培养→二级培养接种→二级扩大培养→菌液混合→复合菌剂

具体步骤为：用无菌接种环将若干斜面保存菌种接种至三角瓶无菌液体培养基中摇匀即成菌悬液，30℃，200r/min培养24h，培养得到一级种子液；将一级种子液按其与发酵培养基体积比1∶10的量接种到发酵瓶中二级扩大培养48h得到发酵液，将不同菌株的二级发酵液按体积等比例混合配制复合微生物菌液，如只有一株的发酵液，则不必配制。菌液尽量在低温环境中保藏。

3、菌剂应用案例1：温室土培试验

试验方法：取过20目筛的风干土，按风干土质量2％的量添加新鲜猪粪，混匀成为沙门氏菌污染土壤；土壤分装于盆钵中，然后喷施制备的拮抗微生物菌剂(单一菌剂或复合菌剂均可)100ml/kg土(菌剂含菌数量级10¹⁰个/ml)，再加自来水调节含水量为田间最大持水量的60％，置于温室中自然条件下培养。采集第0d、1d、3d、5d和7d的土壤，测定存活的沙门氏菌数量。采用MPN法(most probable number，稀释培养计数法)经氯化镁孔雀绿选择性培养基增菌，然后用HE选择性培养基检验，反应阳性者为含沙门氏菌，查MPN表确定沙门氏菌存活数量。

4、菌剂应用案例2：沙门氏菌污染土壤田间原位修复试验

田间试验选择于菜地，根据新鲜猪粪施加量的多少将土壤沙门氏菌污染程度分为轻度污染和高度污染。轻度污染土壤施用猪粪的量为20吨/公顷，高度污染土壤施用量为40吨/公顷，新鲜猪粪加到土壤后耙匀，然后将制备的复合菌剂喷施到土壤中，喷施量为1500ml/m²，如果大气温度较低，可以采用覆盖农膜的方法来使土壤保温，于施加菌剂后第0、5、10、15、20、30、40天采集田间小区土壤0-10cm表层土样，采用五点采样法，立即检测土壤中的沙门氏菌存活数量。

由拮抗细菌菌株的分离、筛选和微生物菌剂应用案例可以得出以下结论：

本发明利用无菌滤纸片平板法筛选到了对沙门氏菌有效拮抗的细菌菌株，利用这些拮抗菌株发酵培养配制成的微生物菌剂添加到沙门氏菌污染土壤中，能够显著降低污染土壤中沙门氏菌数量高达2-3个数量级，抑制效应随着土壤沙门氏病原菌污染程度的增高而提高，从而极大地降低了沙门氏菌污染土壤所带来的生态环境风险，达到降低沙门氏菌污染潜在危害和保障公共卫生安全的目的。结果证明利用拮抗微生物菌剂应用于病原菌沙门氏菌污染土壤的原位微生物修复方法，既避免了物理修复对土壤结构和土壤生物的损害，又避免了化学修复可能导致的二次污染，具有修复成本低、环境友好、可维持土壤微生物多样性和种群平衡，保护土壤生态功能的优点，是一种具有治理沙门氏菌污染土壤实际应用价值的微生物修复方法。

Claims

1.一种利用拮抗微生物菌剂原位修复沙门氏菌污染土壤的微生物生态学方法，其特征在于方法步骤为：

a.利用无菌滤纸片平板法从被沙门氏菌污染的土壤中分离得到适宜于土壤环境、对沙门氏菌有抑制或杀灭作用的拮抗细菌；

b.拮抗微生物菌株经过如下流程进行发酵：种子液接种→一级培养→二级培养接种→二级扩大培养，得到拮抗细菌菌液；

c.拮抗细菌菌液喷施于沙门氏菌污染土壤，喷施后耙匀。

2.根据权利要求1所述的沙门氏菌污染土壤拮抗微生物原位修复方法，其特征在于方法步骤为：

a.在LB细菌培养基平板上，首先均匀涂布病原菌接种液，然后用灭过菌圆形滤纸片分别蘸取目标拮抗细菌培养液，贴在涂过病原菌的平板上，于培养箱中28℃条件下培养1-3天，挑选具有明显抑菌圈菌株，对该菌进行记录，保存；

b.拮抗微生物复合菌剂制备：用无菌接种环将斜面保存菌种，接种至三角瓶无菌液体培养基中摇匀即成菌悬液，30℃，200r/min培养24h，培养得到一级种子液；将一级种子液按其与发酵培养基体积比1∶10的接种量接种到发酵瓶中二级扩大培养48h得到发酵液；

c.利用微生物复合菌剂对沙门氏菌污染土壤进行微生物修复，分对照和添加拮抗微生物复合菌剂2个处理布置土培试验，置于自然条件下培养，添加拮抗微生物复合菌剂处理和对照均设4个重复，定期采取土样测定土壤中沙门氏菌存活数量，监测污染土壤中沙门氏菌的数量动态变化；

d.根据温室土培微生物菌剂修复效果，应用微生物修复方法于田间沙门氏菌污染土壤进行拮抗微生物复合菌剂微生物原位修复，将发酵培养拮抗微生物菌液施加到沙门氏菌污染田间土壤中，每个对照和处理设3个重复，于施加拮抗微生物复合菌剂后定期采集污染土壤0-10cm表层土样，采用五点采样法，监测污染土壤中的沙门氏菌的数量动态变化，以监测是否达到治理沙门氏菌污染土壤的效果。