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CN101535480A - 诊断方法和标记物 - Google Patents

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CN101535480A
CN101535480A CNA2007800294658A CN200780029465A CN101535480A CN 101535480 A CN101535480 A CN 101535480A CN A2007800294658 A CNA2007800294658 A CN A2007800294658A CN 200780029465 A CN200780029465 A CN 200780029465A CN 101535480 A CN101535480 A CN 101535480A
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seq
acid molecule
polypeptide
sequence
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CNA2007800294658A
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斯蒂芬·J·阿辛德
乔-安·斯坦顿
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University of Otago
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Abstract

本发明涉及检测、监测和治疗前列腺癌(PRC)或前列腺上皮内瘤(PIN)或它们的倾向的方法。所述方法中所用的是新型癌标记物PSPU43、以及生物分析法和试剂盒。

Description

诊断方法和标记物
技术领域
本发明涉及检测、诊断、监测和治疗前列腺癌(PRC)、前列腺上皮内瘤(prostatic intraepithelial neoplasia，PIN)或其发病倾向(predisposition to same)的方法；还涉及用于所述方法的标记物。
发明背景
前列腺癌是在欧洲和北美洲男性最常诊断出的癌症。在那些地区，前列腺癌为男性仅次于肺癌的第二大死因(Frankel等，2003)。该病在世界其它部分，如日本也逐渐增多，并可表明在东方国家接纳了西方饮食。
前列腺癌是上年纪的男性的疾病。40％的60岁男性有局限性的(localised)前列腺肿瘤，且超过75％的85岁以上男性患有前列腺癌。此种癌症是通常作为潜伏性疾病存在而无其它疾病症状，并从诊断到死亡最长可达10年。该病通常的进展为，从前列腺内清晰可辨的团块(mass)到破坏和侵入前列腺的侧缘，之后转移至局部淋巴结，和/或转移至骨髓。
前列腺上皮内瘤(PIN)是特定类型的损害，据认为它是前列腺癌的前兆(precursor)(McNeal and Bostwick，1986)。如果诊断得早，现在用雄激素去势疗法(androgen ablation therapy)治疗患者。去势疗法有不良副作用如性欲和能力丧失。随着该疾病发的发展，它变为雄激素非依赖性。在此阶段，手术(根治性前列腺切除术(radical prostatectomy))是主要选择。这可挽救所述患者的性命，但手术的常见后果是失禁(incontinence)、勃起障碍(erectiledysfunction)和尿渗漏(urinary leakage)。
仍不清楚前列腺癌为什么发病以及什么决定其进展。另外，对前列腺癌的测试主要限于体格检查、针吸活检(needle biopsy)和骨扫描。现在，循环的前列腺特异性抗原(PSA)的水平升高最常用于预测前列腺癌的存在。这是唯一常见的前列腺癌非侵入性筛选法。
然而，PSA测试不具有诊断意义。PSA的水平升高可由其它不相关因子如良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎导致。它对疾病状态并不特异并且不能指出死亡风险(Frankel等，2003)。不能仅凭PSA筛选提供的信息做出临床决策。PSA试验不能区分恶性和非恶性形式，或预测损伤如何发展。并且，不是所有前列腺癌都导致血清PSA浓度上升。事实上，PSA水平上升且进行根治治疗(前列腺切除术)的男性有85％如此而无预期益处(Frankel等，2003)。
由此，需要更可靠的方法诊断前列腺癌或其前兆，并随时监测疾病(动态(active)监测)，特别在早期阶段进行监测，以便仍有机会选择治疗方案。也需要标记物用于测定患者的状态。
因此，本发明的一个目的是提供用于测定患者的前列腺癌状态的标记物，或至少给公众提供了可用的选择。
本发明的另一个目的是提供诊断和/或预测前列腺癌或前列腺上皮内瘤后果或其倾向的方法。
发明概述
第一方面，本发明提供了分离的核酸分子或其变体或片段，其包含SEQID NO：3的序列或其功能等同变体或片段，或在严谨条件与SEQ ID NO：3杂交的序列，。
优选杂交是在严谨条件中进行。
另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含上述核酸序列优选SEQ ID NO：3的至少10个核苷酸的片段，或其互补物，所述片段在严谨条件与下述杂交：
(a)上述核酸序列，优选SEQ ID NO：3或其互补物；
(b)对应于上述核酸序列或其互补物的核酸序列的cDNA的全长编码序列；
(c)上述(a)或(b)的反向互补物(reverse complement)。
所述核酸分子可以是至少20，至少30，至少40，至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，至少70个核苷酸，至少80个核苷酸，至少90个核苷酸，或优选至少100个核苷酸。
在另一方面，本发明提供了包含本发明核酸分子的基因构建体。
优选，所述构建体是本文所限定的表达构建体。
本发明还提供了包含本发明基因构建体的载体。
本发明也提供了包含本发明基因构建体或载体的宿主细胞。
本发明也提供了由本发明核酸分子编码的分离的多肽。优选，所述多肽长度为至少5个氨基酸。
本发明也提供了分离的多肽，其包含(a)SEQ ID NO：9，(b)SEQ ID：10，(c)SEQ ID NO：11，(d)SEQ ID NO：12，(e)SEQ ID NO：13，或(f)SEQ ID NO：14的序列；或(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)的功能等同变体或片段，或在严谨条件与(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)任一杂交的序列。
在另一方面，本发明提供了重组制备本发明多肽的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)培养包含本发明基因构建体的宿主细胞，所述构建体如本文限定的能够表达本发明多肽的表达构建体；
(b)选择表达本发明多肽的细胞；
(c)从所述细胞分离所表达的多肽；并可选(optionally)
(d)纯化所表达的多肽。
作为预先步骤(pre-step)，所述方法可包括用所述构建体转染所述宿主细胞。
本发明也提供了抗体，其特异性结合本发明核酸分子所编码的多肽或所述多肽的功能等同变体或片段。
优选，所述抗体为多克隆的、单克隆的、单链的抗体或人源化抗体，或其免疫活性片段。
在另一方面，本发明提供了阵列，其包含一或多个结合PSPU 43(SEQID NO：3)的核酸序列。
本发明也提供了阵列，其包含一或多个本发明的核酸序列。
优选，所述阵列还包含一或多个结合转凝蛋白(transgelin)1(SEQ IDNO：7)、转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)、PCA3(SEQ ID NO：6)、和PSA(SEQ IDNO：5)的核酸序列。
本发明也提供了筛选改变本发明核酸分子的表达的化合物的方法，所述核酸分子优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)，所述方法包括如下步骤：
(a)使表达所述核酸的被测细胞与被测化合物接触；
(b)测定所述核酸的表达水平；和
(c)选出化合物，与在所述被测化合物不存在时相比，其改变了表达水平。
还提供了筛选改变本发明任一种核酸的活性的化合物的方法，所述核酸优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)标记物，该方法包括：
(a)将被测化合物与由所述核酸分子编码的肽接触；
(b)检测所述肽的生物活性；和下列任一步骤：
(c)选出化合物，与在该化合物不存在时检测的生物活性相比，该化合物改变所述肽的生物活性；或
(d)选出结合所述肽的化合物。
本发明也提供了用本发明的筛选方法选出的改变本发明核酸分子的表达或活性的化合物，所述核酸分子优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)。
另一方面，本发明提供了包含药物有效量的用本发明的筛选方法选出的化合物的组合物。
本发明也涉及本发明化合物在制备用于治疗PIN或PRC的药物中的用途。
本发明也提供了PIN或PRC表达图谱(profile)，其包含包括本发明核酸分子的标记物表达的模式，所述核酸分子优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)。优选，所述图谱还包含选自由转凝蛋白1(SEQ ID NO：7)、转凝蛋白2(SEQ IDNO：8)、PCA 3(SEQ ID NO：6)和PSA(SEQ ID NO：5)组成的组的一或多种标记物。
另一方面，本发明提供了治疗或预防患者的PIN或PRC的方法，所述方法包括改变患者中本发明核酸分子的表达水平或所述标记物编码的肽的活性，所述核酸分子优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)。这可以通过促进表达或施用组合物来实现，所述组合物含有所述核酸分子如PSPU 43编码的多肽。或者这可以通过抑制表达来实现。促进或抑制表达水平哪个合适，取决于所述核酸分子和PSPU 43编码的多肽是过表达还是表达不足(under-expressed)。不希望受理论所限，此时相信过表达和表达不足都是可能的。
优选，本发明核酸分子所编码的多肽是过表达的，通过给患者施用反义组合物来抑制表达，所述组合物包含本发明核酸分子的一或多个反义核苷酸序列，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)的反义序列。
在另一个实施方案中，通过给患者施用siRNA组合物来抑制表达。所述组合物降低本发明核酸分子，优选PSPU 43、(SEQ ID NO：3)的表达。
在另一个实施方案中，通过给患者施用核酶组合物来抑制表达。
也可以通过施用抗体或活性抗体片段来抑制表达，所述抗体或片段特异性结合本发明核酸分子，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)。此活性片段优选免疫活性片段。
在一个实施方案中，所施用的组合物是疫苗。
本发明也涉及反义-寡核苷酸、核酶或siRNA，其针对本发明核酸分子，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)。所述序列可用于上述方法。
本发明也提供了治疗或预防患者的PIN或PRC的方法，在所述患者中本发明多肽的表达不足，所述多肽如PSPU 43编码的多肽，所述方法包括给所述患者施用组合物，该组合物包含本发明核酸分子所编码的表达不足的多肽或该多肽的活性变体或片段，所述核酸分子如PSPU 43(SEQ IDNO：3)。
另一方面，本发明提供了治疗或预防患者的PIN或PRC的方法，所述方法包括给所述患者施用改变本发明多肽的表达或活性的化合物，所述多肽优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)所编码的多肽。
另一方面，本发明提供了治疗或预防患者的PIN或PRC的方法，在所述患者中本发明核酸分子是过表达的，所述核酸分子优选PSPU 43(SEQ IDNO：3)，所述方法包括给所述患者施用降低本发明多肽的表达或活性的化合物，所述多肽优选由PSPU 43编码的多肽。
本发明也提供了组合物，其包含药物有效量的本发明核酸分子，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)，或其编码的多肽。
本发明还提供了组合物，其包含药物有效量的针对本发明核酸分子的反义-寡核苷酸、核酶或小干扰(small interfering)RNA，所述核酸分子优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)。
所述组合物可包含两或多种针对所述核酸分子的反义-寡核苷酸、核酶或siRNA。
在另一方面，本发明提供了组合物，其包含药物有效量的特异性结合本发明多肽的抗体或其片段，所述多肽优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)标记物所编码的多肽。
本发明也提供了治疗患者的PIN或PRC的方法，所述方法包括给需要的患者施用有效量的本发明化合物或本发明组合物。
本发明也提供了本发明核酸分子，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)或其编码的多肽在制备用于治疗或预防患者的PIN或PRC的药物中的用途。
本发明也提供了分析法(assay)，用于检测样本中本发明核酸分子，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)的存在，所述方法包括：
(a)将所述样本与核苷酸探针接触，该探针与本发明核酸序列，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)在严谨杂交条件杂交；和
(b)检测样本中杂交复合物的存在。
优选，所述探针是标记的探针，常为荧光标记的探针。在一个实施方案中，所述探针是SEQ ID NO：3的互补物。
本发明也提供了测定患者样本中本发明核酸分子的表达水平的方法，所述核酸分子优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)，所述方法包括直接或间接测定所述核酸分子。
方便地，所述核酸分子被用于原位杂交或RT-PCR分析中而被测定。
本发明也涉及测定样本中本发明核酸分子的表达水平的方法，所述核酸分子优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)，所述方法包括：
(a)扩增所述核酸分子或其互补物的DNA序列；或
(b)扩增所述核酸分子或其互补物的cDNA序列；和
(c)测定所述样本中DNA、cDNA或RNA之一或多种的水平
本发明也提供了检测本发明多肽在患者样本中的存在的分析法，所述方法包括：
(a)使所述样本接触本发明的抗体；和
(b)检测样本中结合多肽的存在。
优选，所述抗体带有可检测的标记。
在另一方面，本发明涉及诊断患者的前列腺上皮内瘤(PIN)、前列腺癌(PRC)或发生PIN或PRC的倾向的方法，所述方法包括测定本发明核酸分子，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)在患者样本中的表达水平，其中该核酸分子的表达水平相比对照水平的改变表明该患者患PIN、PRC、或有发生PIN或PRC的风险。
通常，所述表达水平的改变是比正常对照水平高至少10％。方便地，所述对照水平是在正常前列腺中测定的PSPU 43的表达水平。
所述样本可包括正常前列腺细胞、PIN或PRC细胞，并优选来自正常前列腺、PIN或前列腺癌肿瘤的上皮细胞。
本发明也提供了测试患者的前列腺上皮内瘤(PIN)和前列腺癌(PRC)状态的方法，所述方法包括测定本发明核酸分子，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)在患者样本中的表达水平，其中所述分子的表达水平比对照水平高表明该患者患有PIN或PRC状态、或有发生PIN或PRC的风险。
在另一方面，本发明涉及监测受试者对PIN或PRC治疗的反应的方法，所述方法包括测定本发明核酸分子，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)在患者样本中的表达水平，并将所述PSPU 43(SEQ ID NO：3)的水平与对照水平相比，其中测定的水平与对照水平相比有统计学显著性改变表明对该治疗有反应。
优选，这些测定、测试和监测方法还包括测定PIN或PRC的一或多种其它标记物的水平，并将所述水平与对照中的标记物水平比较，其中所述水平与对照水平相比有显著性偏差，以及本发明核酸分子水平有统计学显著性升高，一起表明PRC或PIN，或可用于监测PIN或PRC状态，所述核酸分子优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)。
所述其它标记物可以是选自由转凝蛋白1(SEQ ID NO：7)、转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)、PCA 3(SEQ ID NO：6)和PSA(SEQ ID NO：5)组成的组的一或多种标记物。
本发明也提供了检测样本中本发明核酸分子的存在的试剂盒，所述核酸分子优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)，所述试剂盒包含至少一个盛有本发明核酸的容器。
本发明也提供了包含结合本发明核酸分子或本发明多肽的一或多种检测试剂的试剂盒。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含下列之一或多种：
(a)编码转凝蛋白1(SEQ ID NO：7)的核酸或其互补物；
(b)编码转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)的核酸或其互补物；
(c)编码PCA3(SEQ ID NO：6)的核酸或其互补物；和
(d)编码PSA(SEQ ID NO：5)的核酸或其互补物。
在另一方面，本发明涉及本发明的诊断、测试或监测方法，其中转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)用作参比标记物。
本发明也涉及转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)在本发明的诊断、测试和监测方法中作为参比标记物的用途。
也提供了非人动物，其基因组中PSPU 43(SEQ ID NO：3)的核酸序列被改变、破坏(disrupt)、消除或添加。
优选所述动物为小鼠。
附图简述
本发明现在参照下面的附图来进行描述：
图1：显示Pspu43的共有(consensus)序列。该共有序列从包含UniGene簇Hs.161160的EST的毗连序列群(contig)产生；
图2：显示SYBR Green qPCR分析法的解离曲线，该分析法使用针对Pspu1，Pspu2，Pspu8，Pspu43，T1和T2的引物组。所用的cDNA模板从PC3细胞系产生；
图3：显示用于测试前列腺组织中的标记物表达的每种引物和探针/引物组合的qPCR效果。标准曲线使用通用的参比cDNA作为模板；
图4：显示从匹配的组织对产生的cDNA模板得到的原始(raw)平均CT值。每个误差棒(bar)表示从一式两份的qPCR反应计算出的+/-1标准偏差；
图5：显示校正了基因组DNA污染后每份样本中每种标记物的cDNA相对量。从平均CT和从为每种标记物作的标准曲线计算出的最优拟合线(best fit line)测定相对量。在仅有RNA的模板(无RT反应)上对qPCR进行类似计算，从对cDNA模板测定的值中减去此反应的相对量；和
图6：显示核苷酸序列Pspu43的六个读码框的翻译。使用单字母的氨基酸编码。-表示终止密码子。
定义
此说明书及权利要求中所用的术语“包含”指“至少部分由......组成”，也就是说在解释包含此术语的此说明书及权利要求时，在每次叙述中由该术语打头的特征都需要存在，但其他特征也可存在。相关术语如“含有”和“包括”也以类似方式来解释。
提及本文公开的数值范围(例如1到10)，它也应包括在那个范围内提及的所有相关数值(例如，1，1.1，2，3，3.9，4，5，6，6.5，7，8，9和10)，并包括在那个范围内的任何有理数范围(例如2到8，1.5到5.5，和3.1到4.7)，因此明确公开了所有本文明确公开范围的所有亚范围(sub-range)。这些仅仅是应包括的例子，并且在列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合应在此申请中以类似方式明确叙述。
本文所用的术语“标记物”指在染色体上有可鉴定物理位置的DNA节段。标记物可以是基因或其它可鉴定的核酸序列，如开放读码框，内含子或基因间的基因组DNA节段的部分。
本文所用标记物的“对照水平”指在来自正常健康个体的样本中检测的表达水平，或基于已知没有患PRC或PIN的个体群测定的水平。所述对照水平可以是来自单一参照群的单一表达类型或可以是多种表达类型。例如，所述对照水平可以是来自之前测试过的细胞的表达类型数据库。另一个例子可以是参照标记物(如转凝蛋白2)和本发明标记物之间的比例计尺度(ratiometric measure)。可选地，所述对照水平可以是早些从同一患者取的一或多个读数或这些读数的均值。
本文所用术语的“多核苷酸”意味着任何长度的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并包括非限制性例子，基因的编码和非编码序列，正义和反义序列，外显子，内含子，基因组DNA，cDNA，前体mRNA(pre-mRNA)，mRNA，rRNA，siRNA，miRNA，tRNA，核酶，重组多核苷酸，分离的和纯化的天然存在的DNA或RNA序列，合成的RNA和DNA序列，核酸探针，引物，片段。应类似理解提及的核酸分子。
本文所用的“反义”通常指DNA或RNA或其组合，其与至少部分的编码本发明多肽的mRNA分子互补，并能够干扰后转录事件，如mRNA翻译。
本文提供的多核苷酸序列的“片段”是邻接核苷酸的子序列(subsequence)，其能够与目的靶(如长度为至少10个核苷酸的序列)特异性杂交。本发明片段包含本发明多核苷酸的邻接核苷酸的10，优选15个核苷酸，优选至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，更优选至少40个核苷酸，更优选至少50个核苷酸并最优选至少60个核苷酸。多核苷酸序列的片段可用于反义、基因沉默、三股螺旋(triple helix)或核酶技术，或作为引物、探针，包括在微阵列中或用于本发明基于多核苷酸的选择方法。
本文所用的术语“患者”优选哺乳动物患者，包括人，和非人哺乳动物如猫、狗、马、母牛、绵羊、鹿、小鼠、负鼠和灵长类动物(包括大猩猩、猕猴、和黑猩猩)及其它家养家畜或观赏动物(zoo animal)。优选，所述哺乳动物是人。
术语“治疗”和“预防”指治疗和预防(phrophylactic)措施，其停止、逆转或减轻(lessen)前列腺癌或PIN。所述患者显示出可观察到或可测定(统计学显著性)地使：癌或PIN细胞数；肿瘤尺寸；与癌或PIN有关的症状的一或多种下降；抑制：肿瘤尺寸；肿瘤生长；转移；提高生活质量。
本文所用的“患者样本”指源自要筛选的患者的生物样本。该生物样本可以是本领域已知的任何适合样本，其中可检测被选标记物的表达。包括从体液或液体获得的个体细胞和细胞群。被测的适合体液的例子是血浆、前列腺按摩液(massage fluid)、血液、精液、淋巴液和尿液。
优选，所述被测样本包括上皮细胞，其源自已知或疑似显示PIN或PRC的组织，最常为前列腺组织。也可测试来自健康个体的样本。正常健康个体无PIN或PRC的临床症状或良性前列腺发育不全(hypoplasia)(BPH)，并优选在30岁以下。可选地，来自前列腺活检的正常区域的正常健康细胞可用作方法的对照。
术语“引物”指通常有游离3’OH基团的短多核苷酸，其与模板杂交并用于引导与所述靶互补的多核苷酸的聚合。
术语“探针”指短多核苷酸，其用于在基于杂交的分析法中检测与所述探针互补的多核苷酸序列。该探针可由本文限定的多核苷酸的“片段”组成。
本文所用的术语“多肽”包括任何长度的氨基酸链，但优选至少5个氨基酸，优选至少10，优选至少15，优选至少20，优选至少25，优选至少30，优选至少40，优选至少50，优选至少60，优选至少70，优选至少80，优选至少90，优选至少100，优选至少110，优选至少120，优选至少125个氨基酸，并包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本发明的多肽可以是纯化的天然产物，或可能用重组或合成技术部分或全部地制备。该术语可指多肽，多肽聚集物如二聚体或其它多聚体，融合多肽，多肽片段，多肽变体或其衍生物。
多肽的“片段”是所述多肽的子序列，其执行了生物活性所需的功能和/或提供了所述多肽的三级结构。此术语可指多肽，多肽聚集物如二聚体或其它多聚体，融合多肽，多肽片段，多肽变体或其衍生物。
用于本文公开的多核苷酸或多肽序列的术语“分离的”用于指从它们的天然细胞环境取出的序列。分离的分子可用任何方法或方法的组合获得，包括生化、重组及合成技术。所述多核苷酸或多肽序列可用至少一步纯化步骤制备。
术语“重组”指多核苷酸序列，其从在天然环境中位于其周围的序列中取出和/或与在其天然环境中不存在的序列重组。
“重组”多肽序列是通过从“重组”多核苷酸序列翻译制备的。
本文所用的术语“变体”指与特异鉴定的序列不同的多核苷酸或多肽序列，其中缺失、取代或添加了一或多个核苷酸或氨基酸残基。变体可以是天然存在的等位变体或非天然存在的变体。变体可来自相同或其它物种，并可包括同源物(homologue)、旁系同源物(paralogue)及直系同源物(orthologue)。在某些实施方案中，本发明多肽和多核苷酸的变体与本发明多肽或多核苷酸具有相同或相似的生物活性。对于多核苷酸和多肽而言的术语“变体”包括本文限定的所有形式的多核苷酸和多肽。
变体多核苷酸序列优选与本发明序列展示了至少50％，更优选至少51％，更优选至少52％，更优选至少53％，更优选至少54％，更优选至少55％，更优选至少56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少61％，更优选至少62％，更优选至少63％，更优选至少64％，更优选至少65％，更优选至少66％，更优选至少67％，更优选至少68％，更优选至少69％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的同一性。与本发明多核苷酸的至少20个核苷酸位置，优选至少50个核苷酸位置，更优选至少100个核苷酸位置，最优选全长的比对窗口可见同一性。
可用总体(global)序列比对程序对候选及受试多核苷酸序列的重叠的全长计算多核苷酸序列同一性(如Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)。全面实现Needleman-Wunsch总体比对算法见于EMBOSS包的needle程序(Rice，P.Longden，I.and Bleasby，A.EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite，Trends in Genetics June2000，vol 16，No 6.pp.276-277)，其可得自http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/。欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)服务器也提供了在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/对两个序列在线进行EMBOSS-needle总体比对的设备。
或者可利用GAP程序，其计算两个序列的最适总体比对，而不对末端缺口罚分。GAP在下述论文中进行了描述：Huang，X.(1994)On GlobalSequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences 10，227-235。
多核苷酸变体也包括与一或多条特异鉴定的序列显示类似性的那些，所述特异鉴定的序列可能保留那些序列的功能型等同(functionalequivalence)，以及根据合理预测本不会随机出现的那些。此程序在所述序列中发现了类似区域，并对每个这样的区域报告了“E值”，该值是预期能在有固定参照尺寸(reference size)的包含随机序列的数据库中随机看到此匹配的预期次数。在b12seq程序中缺省设定此数据库的尺寸。对于远低于1的小E值，该E值约为此随机匹配的可能性。
在与任一条特异鉴定的序列相比时，变体多核苷酸序列优选显示出E值不到1×10-5，更优选不到1×10-6，更优选不到1×10-9，更优选不到1×10-12，更优选不到1×10-15，更优选不到1×10-18，最优选不到1×10-21。
BLASTN的应用优选用于测定本发明多核苷酸变体的序列同一性。
多核苷酸序列的同一性可用如下UNIX命令行参数测定：
bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-F F-p blastn
参数-F F关闭(turnoff)了对低复杂性部分(section)的滤过。参数-p选择了对序列对合适的算法。bl2seq程序将序列同一性报告为在一行中同一的核苷酸的数和百分比“Identities＝”。
多核苷酸序列同一性和相似性也可用如下方式测定。将受试多核苷酸序列与候选多核苷酸序列用序列比对算法及序列相似性检索工具(如Genbank，EMBL，Swiss-PROT及其它数据库中)来比较。Nucleic Acids Res29：1-10和11-16，2001提供了在线资源的例子。bl2seq中的BLASTN(来自BLAST程序套装(suite of programs)，2.2.13版March 2007(Tatiana A.等，FEMS Microbiol Lett.174：247-250(1999)，Altschul等，Nuc.Acis Res25：3389-3402，(1997))，其可公开得自NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)或得自位于Bethesda，Maryland，USA的NCB1。利用b12seq的缺省参数，只是应关闭对低复杂性部分的滤过。
可选地，变体多核苷酸与特定的多核苷酸序列，或其互补物在严谨条件杂交。
术语“在严谨条件杂交”及其语法同义词，指多核苷酸分子与靶多核苷酸分子(如固定在DNA或RNA印迹，如Southern印迹或Northern印迹上的靶多核苷酸分子)在温度和盐浓度的限定条件杂交的能力。测定在严谨杂交条件杂交的能力可通过，最初在不太严谨的条件杂交，然后将严谨度提高到理想的严谨度。
对于长度超过约100个碱基的多核苷酸分子，通常严谨杂交条件是低于天然双链的解链温度(Tm)不超过25-30℃(例如10℃)(常见Sambrook等，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold SpringHarbor Press；Ausubel等，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing，incorporated herein by reference)。超过约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可用公式Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na+)计算(Sambrook等，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold SpringHarbor Press；Bolton和McCarthy，1962，PNAS 84：1390)。对于长度超过100个碱基的多核苷酸的常用严谨条件会是杂交条件，如在6X SSC，0.2％ SDS的溶液中预洗涤；在65℃，6X SSC，0.2％ SDS过夜杂交；随后，在1X SSC，0.1％ SDS于65℃各洗涤两次，每次30分钟，及在0.2X SSC，0.1％ SDS于65℃各洗涤两次，每次30分钟。
在一个实施方案中，严谨条件在42℃使用50％甲酰胺、5x SSC、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt’s溶液、超声的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％ SDS、和10％硫酸葡聚糖，然后于42℃在0.2x SSC和50％甲酰胺在55℃中多次洗涤，随后在包含含EDTA的0.1x SSC中在55℃洗涤。
对于长度不足100个碱基的多核苷酸分子，严谨杂交条件举例是低于Tm 5-10℃。长度不足100bp的多核苷酸分子的Tm平均会下降约(500/寡核苷酸长度)℃。
对于称为肽核酸(PNAs)的DNA模拟物(Nielsen等，Science.1991 Dec6；254(5037)：1497-500)，其Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA杂种的那些，并可用Giesen等，Nucleic Acids Res.1998 Nov 1；26(21)：5004-6所述的公式计算。对长度不足100个碱基的DNA-PNA杂种的严谨杂交条件举例是低于Tm 5-10℃。
变体多核苷酸也包括与本发明序列不同的多核苷酸，但遗传密码简并性的结果是编码了多肽，所述多肽与本发明多核苷酸所编码的多肽具有类似活性。不改变所述多肽的氨基酸序列的序列改变是“沉默变化(silentvariation)”。除了ATG(蛋氨酸)和TGG(色氨酸)之外，相同氨基酸的其它密码也可用本领域共知的技术改变，如在特定宿主生物中使密码表达最适。
本发明也包括了多核苷酸序列改变，其使得所编码的多肽序列内的一或多个氨基酸被保守取代而不显著改变其生物活性。熟练技术人员了解制备表型沉默的氨基酸取代的方法(见例如Bowie等，1990，Science 247，1306)。
由于沉默变化以及所编码的多肽序列内的保守取代而得到的变体多核苷酸可用b12seq程序经上述tblastx算法来测定。
本文所用的术语“反义-寡核苷酸”包括与靶序列完全互补的核苷酸，及具有一或多个核苷酸错配的那些，只要所述反义-寡核苷酸可以特异性地与所述靶序列杂交。例如，本发明的反义-寡核苷酸包括下述多核苷酸，其与本发明核酸序列，优选PSPU 43(SEQ ID NO：3)的至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、优选75、优选100、更优选200个邻接核苷酸或全长，具有至少70％或更高，优选至少75％或更高、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％或更高、更优选至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％或更高、甚至更优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％的同一性。上述本领域公知的算法也可用于测定同一性。另外，所述反义-寡核苷酸的衍生物或经修饰产物也可用作本发明中的反义-寡核苷酸。
对于多肽而言的术语“变体”包括天然存在的、重组及合成制备的多肽。变体多肽序列优选与本发明序列展示至少50％，更优选至少51％，更优选至少52％，更优选至少53％，更优选至少54％，更优选至少55％，更优选至少56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少61％，更优选至少62％，更优选至少63％，更优选至少64％，更优选至少65％，更优选至少66％，更优选至少67％，更优选至少68％，更优选至少69％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并最优选至少99％的同一性。在本发明多肽的至少20个氨基酸位置、优选至少50个氨基酸位置、更优选至少100个氨基酸位置、并最优选全长的比较窗口中可见同一性。
多肽变体也包括与一或多条特异鉴定的序列显示相似性的那些以及根据合理预测本不会随机出现的那些，所述特异鉴定的序列可能保留那些序列的功能型等同。
多肽序列同一性和相似性可以如下方式测定。比较受试多肽序列与候选多肽序列是用bl2seq中的BLASTP(来自BLAST程序套装，2.2.13版May2007)，其公开得自NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)。bl2seq的缺省参数利用，除了关掉滤过低复杂性的区域。
多肽序列的相似性可用下UNIX命令行参数检测：
bl2seq-i peptideseq1-j peptideseq2-F F-p blastp
在与任一条特异鉴定的序列相比时，变体多核苷酸序列优选显示出E值不到1×10-5，更优选不到1×10-6，更优选不到1×10-9，更优选不到1×10-12，更优选不到1×10-15，更优选不到1×10-18，最优选不到1×10-21。
参数-F F关闭(turnoff)了对低复杂性部分(section)的滤过。参数-p选择了对序列对合适的算法。此程序在所述序列中发现了类似区域，并对每个这样的区域报告了“E值”，该值是预期能在有固定参照尺寸的包含随机序列的数据库中随机看到此匹配的预期次数。对于远低于1的小E值，该E值约为此随机匹配的可能性。
也可用总体序列比对程序对在候选和受试多肽序列之间的重叠的全长计算多肽序列同一性。EMBOSS-needle(自http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/可得)和GAP(Huang，X.(1994)On Global Sequence Alignment.ComputerApplications in the Biosciences 10，227-235.)如上述，也适合总体序列比对程序来计算多肽序列同一性。
本文所述的BLASTP的用途优选用于本发明多肽变体的测定。
本发明也包括所述多肽序列的一或多个氨基酸的保守取代，但不显著改变其生物活性。保守取代常包括将一个氨基酸取代为另一个具有类似性质的氨基酸，如在下组内的取代：缬氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。也可用下表1内的其它保守取代。
表1
 
原始残基 取代举例
Ala(A) val；leu；ile；gly
Arg(R) lys；gln；asn
Asn(N) gln；his；lys；arg
Asp(D) glu
Cys(C) ser
Gln(Q) asn；his
Glu(E) asp
Gly(G) pro；ala
His(H) asn；gln；lys；arg
Ile(I) leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸
Leu(L) 正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe
Lys(K) arg；gln；asn
Met(M) leu；phe；ile
Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr
Pro(P) ala；gly
Ser(S) thr
Thr(T) ser
Trp(W) tyr；phe
Tyr(Y) trp；phe；thr；ser
Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸
天然存在的残基基于共有侧链性质而分组：
(1)疏水：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水：cys，ser，thr；
(3)酸性：asp，glu；
(4)碱性：asn，gln，his，lys，arg；
(5)影响链取向(orientation)的残基：gly，pro；和
(6)芳香族：trp，tyr，phe。
非保守取代需要将这些类别之一的成员替换为另一类别的成员。
其它变体包括带有影响肽稳定性的修饰的肽。这些类似物可包含例如，肽序列中的一或多个非肽键(其替代了肽键)。也包括类似物，其包含天然存在的L-氨基酸之外的残基如D-氨基酸，或非天然存在的合成氨基酸，如β或γ氨基酸及环状类似物。
可用本领域公知的诱变方法制备取代、缺失、添加或插入。熟练技术人员会知道制备表型沉默氨基酸替代的方法(见例如Bowie等，1990，Science247，1306)。
本发明多肽内也包括在合成之中或之后已经修饰的那些，所述修饰如通过生物素化、苄基化、糖基化、磷酸化、酰胺化、通过用封闭(blocking)/保护基团衍生化(derivatization)等等。这些修饰可提高所述多肽的稳定性或活性。
术语“基因构建体”指多核苷酸分子，常为双链DNA，其中本可插入其它的多核苷酸分子(插入的多核苷酸分子)如，但不限于cDNA分子。基因构建体可包含允许转录插入的多核苷酸分子并可选翻译转录物为多肽的必要元件。所述插入的多核苷酸分子可衍生自宿主细胞，或可衍生自不同的细胞或生物体和/或可能是重组的多核苷酸。一旦在宿主细胞内，所述基因构建体就可能整合到宿主的染色体DNA内。所述基因构建体可与载体连接。
术语“载体”指多核苷酸分子，常为双链DNA，其用于将基因构建体转运到宿主细胞中。所述载体可能够在至少一个其它宿主系统如大肠杆菌中复制。
术语“表达构建体”指包含必要元件的基因构建体，所述元件允许转录插入的多核苷酸分子，并可选将转录物翻译为多肽。表达构建体常以5’到3’的方向包含：
a)在将会用所述构建体转化的宿主细胞中起作用的启动子，
b)被表达的多核苷酸，和
c)在将会用所述构建体转化的宿主细胞中起作用的终止子。
术语“编码区”或“开放读码框”(ORF)指基因组DNA序列的正义链或cDNA序列，其能受合适的调控序列控制产生转录产物和/或多肽。所述编码序列通过存在5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子来被鉴定。在插入基因构建体时，“编码序列”能够在与启动子和终止子序列和/或其它调控元件可操作地连接时被表达。
“可操作地连接”意味着将表达的序列处于受调控元件控制的位置，所述调控元件包括启动子、转录控制序列、翻译控制序列、复制起点、组织特异性调控元件、时间调控元件、增强子、聚腺苷化(polyadenylation)信号、阻抑物(repressor)和终止子。
术语“非编码区”指在翻译起始位点上游和翻译终止位点下游的未翻译序列。这些序列也分别指5’UTR和3’UTR。这些区域包括转录起始和终止所需以及调控翻译有效性的元件。
终止子是终止转录且发现于在被翻译序列下游的基因的3’未翻译末端的序列。终止子是mRNA稳定性的重要决定物，且有时已经发现它有空间调控功能。
术语“启动子”指非转录的顺式-调控元件，其位于调控基因转录的编码区的上游。启动子包含顺式-起始元件，其特定针对(specify)转录起始位点及保守盒如TATA盒，以及转录因子所结合的基序。
本发明多核苷酸或多肽的术语“要改变的表达”及“已改变的表达”应包括如下情况，其中对应于本发明多核苷酸的基因组DNA被修饰，因此使本发明多核苷酸或多肽的表达改变。对基因组DNA的修饰可通过本领域公知诱导突变的遗传转化或其它方法。“已改变的表达”可与信使RNA和/或所产生的多肽的量的提高或下降有关，也可由于多核苷酸及所产生的多肽的序列改变而导致多肽活性改变。
发明内容
通过利用新的生物信息方法来采集(mine)测序前列腺cDNA文库，申请人已经鉴定出对于前列腺癌或PIN的新标记物。数据漫游(Data-panning)是一种测定转录物对给定(given)组织具有的特异性程度的技术。此方法利用了UniGene数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene)。评估UniGene簇内的EST的文库来源，并保留来自特定组织的记录的那些。此记录表示为UniGene簇内EST总数的百分比。百分比越高，该转录物在特殊指定的组织之外的组织中被检出的几率越低。此方法具有超过其它技术如cDNA微阵列的优点(Carlisle等，2000)，这是由于无偏移的(unbiased)基因选择，以及分辨疾病状态差异的区分能力更高。之前努力绘制前列腺癌的基因表达图谱所用的方法限于所分析的表达序列标签(expressed sequence tag)数目(Huang等，1999)或在基因选择上有偏移(Carlisle等，2000).
申请人已经从此分析鉴定了新标记物，据认为其表达随前列腺癌或PIN的进展而改变。此标记物也可能是开发治疗前列腺癌或PIN的药物的有潜力的新靶。
所述标记物列于下表1中，且序列表中给出全部序列。所述标记物的表达水平在前列腺癌患者中有改变。为了便利，所述标记物在本文被称为前列腺特异性单基因(prostate specific unigene)(PSPU)标记物。所述标记物可以是DNA或RNA序列，基因或染色体片段。任何由基因编码的对应多肽都被称为PSPU多肽或PSPU蛋白质。
前列腺癌或Pin所涉及的标记物
名称      单基因#       SEQ ID No：      ％富集     组织
PSPU 43   161160        3                83         前列腺，其它
本发明的或其它本文所述的核酸分子可从组织用多种本领域一般技术人员公知的技术分离。例如，这些多核苷酸可通过利用聚合酶链式反应(PCR)来分离，如Mullis等，Eds.1994 The Polymerase Chain Reaction，Birkhauser所述。本发明核酸分子可用引物扩增，如本文所限定，衍生自本发明的多核苷酸序列。
分离多核苷酸的其它方法包括利用所有的或部分的本发明多核苷酸，特别是具有SEQ ID NO：3所述序列的多核苷酸，作为杂交探针。将标记的多核苷酸探针与固定在固相支持物(如硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上的多核苷酸杂交的技术，可用于筛选基因组或cDNA文库。类似地，可将探针与珠子偶联并杂交到靶序列上。可用本领域公知的方案如磁性分离(magneticseparation)进行分离。严谨杂交和洗涤条件举例如上。
多核苷酸片段可用本领域公知的技术，如限制性内切酶消化和寡核苷酸合成来制备。
由此，一方面，本发明提供了分离的核酸，该核酸包含SEQ ID NO：3，其功能等同变体或片段，或与这些的任一在严谨条件杂交的序列。
另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其由本发明核酸序列的至少10个核苷酸的片段组成，所述核酸序列优选SEQ ID NO：3或其互补物，其在严谨条件与下述杂交：
(a)本发明的核酸序列，优选SEQ ID NO：3或其互补物；
(b)对应于本发明核酸序列或其互补物的cDNA的全长编码序列；
(c)(a)或(b)的反向互补物。
严谨条件如上讨论。
所述核酸分子可以是至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，至少40个核苷酸，至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，至少70个核苷酸，至少80个核苷酸，至少90个核苷酸，或优选是至少100个核苷酸。
部分的多核苷酸序列可在本领域公知方法中用作探针来鉴定样本中的对应全长多核苷酸序列。这些方法包括基于PCR的方法，5’RACE(MethodsEnzymol.218：340-56(1993)；Sambrook等，见上文)及基于杂交的方法、基于计算机/数据库的方法。可检测标记物如放射性同位素、荧光、化学发光和生物发光标记物，可用于利于检测。反向PCR也允许获得未知序列，位于本文公开的多核苷酸序列侧翼，从基于已知区域的引物开始(Triglia等，Nucleic Acids Res 16，8186，(1998))。此方法使用多种限制性酶来产生在基因已知区域内的合适片段。然后通过分子内连接来散布(circularize)此片段，并用作PCR模板。从已知区域设计多样性引物。为了物理上(physically)装配全长克隆，可用标准分子生物学方法(Sambrook等，见上文)。允许本发明多核苷酸扩增的引物和引物对也构成了本发明的其它方面。
可用所述方法鉴定变体(包括直系同源物)。可用基于PCR-的方法鉴定变体多核苷酸(Mullis等，Eds.1994 The Polymerase Chain Reaction，Birkhauser)。通常，引物的多核苷酸序列，用于通过PCR扩增多核苷酸分子的变体，可基于编码对应氨基酸序列的保守区的序列。
用于鉴定变体多核苷酸的其它方法包括使用所有的或部分的特定多核苷酸作为杂交探针来如上述筛选基因组或cDNA文库。可使用通常基于编码对应氨基酸序列的保守区的序列的探针。杂交条件也可不如筛选与所述探针等同的序列时所用的那些条件严谨。
所述变体序列，包括多核苷酸和多肽变体，也可用上述讨论的基于计算机的方法来鉴定。
一组相关序列的多重序列比对可用如下进行：CLUSTALW(Thompson，等，Nucleic Acids Research，22：4673-4680(1994)，http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(Cedric Notredame等，J.Mol.Biol.302：205-217(2000)))或PILEUP，其使用递增的成对比对(Feng等，J.Mol.Evol.25，351(1987))。
存在发现基序或签名序列的类型识别的软件应用。例如，MEME(Multiple Em for Motif Elicitation)在一组序列中发现基序和签名序列，且MAST(Motif Alignment and Search Tool)在询问(query)序列中使用这些基序来鉴定类似或相同基序。提供的MAST结果为带合适统计数据的系列比对及所发现基序的可视综述(overview)。MEME和MAST是由University ofCalifornia，San Diego开发的。
PROSITE(Bairoch等，Nucleic Acids Res.22，3583(1994)；Hofmann等，Nucleic Acids Res.27，215(1999))是鉴定从基因组或cDNA序列翻译的未表征蛋白质的功能的方法。该PROSITE数据库(www.expasy.org/prosite)包含生物显著类型和图谱，并被设计从而可与合适的计算工具使用，来将新序列与已知族的蛋白质比对，或测定在所述序列中存在哪个已知的结构域(Falquet等，Nucleic Acids Res.30，235(2002))。Prosearch是能用给定序列类型或签名检索SWISS-PROT和EMBL数据库的工具。
可根据蛋白质与在相同基因组(旁系同源物)或不同基因组(直系同源物)的其它蛋白质的序列相关性对它们作分类。直系同源(Orthologous)基因是从共同的祖先基因经物种形成而进化的、并通常在进化时保留相同功能的基因。旁系同源基因是在基因组内复制的基因，并可获得可能与原来有关的新特异性(specificities)或经修饰功能的基因。对系统进化分析(phylogeneticanalysis)方法的综述见Tatusov等，Science 278，631-637，1997)。
除了上述的计算机/数据库方法，可用物理方法，例如用通过重组DNA技术抗本发明多肽的抗体筛选表达文库来鉴定多肽变体(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press，1987)，对该重组DNA技术的描述见Sambrook等，或通过借助于这些抗体鉴定来自天然来源的多肽。
多肽(包括变体多肽)可用本领域公知的肽合成方法制备，所述方法如使用固相技术的直接肽合成(如Merrifield，1963，in J.Am Chem.Soc.85，2149；Stewart等，1969，in Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co，SanFrancisco California；Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191，1981)或自动合成，例如使用Applied Biosystems(California，USA)的合成仪。所述多肽的突变形式也可用合成方法制备，所述方法如编码氨基酸序列的DNA的定点诱变，如Adelmen等，DNA 2，183(1983)所述。
所述多肽和变体多肽也可用多种本领域公知的技术从天然来源分离或纯化(如Deutscher，1990，Ed，Methods in Enzymology，Vol.182，Guide toProtein Purification，)。技术包括但不限于HPLC、离子交换层析、和免疫层析。
可选地，可在适合宿主细胞中重组表达所述多肽和变体多肽，并从下面讨论的细胞中分离。所述多肽和变体用于产生抗体并用于产生配体及其它用途。
因此，本发明也提供了本发明核酸分子所编码的分离多肽。
本发明的具体多肽包括具有都如随后序列表所述的SEQ ID NO：9，SEQID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的氨基酸序列的多肽。也包括本文限定的这些多肽的功能等同性变体和片段，以及在严谨条件与那些序列杂交的序列。
本文所述的基因构建体可包含本发明的一或多个公开的多核苷酸序列和/或编码所述公开多肽的多核苷酸，并可用于转化，例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。本发明的基因构建体应包括本文限定的表达构建体。包括载体(如pBR322，pUC18，pU19，Mp18，Mp19，ColE1，PCR1和pKRC)、噬菌体(如lambda gt10)、及M13质粒(如pBR322，pACYC184，pT127，RP4，p1J101，SV40和BPV)、粘粒、YACS、BAC穿梭载体如pSA3，PAT28转座子(如US 5,792,294所述)等等。
所述构建体很容易包括选择性基因或可选择性标记物。通常使用抗生素如氨苄青霉素、氨甲蝶呤(methotrexate)或四环素的抗性标记物。
用于此构建体的启动子包括β内酰胺酶、碱性磷酸酶、色氨酸及tac启动子系统，它们都是本领域公知的。酵母启动子包括但不限于3-磷酸甘油激酶、烯醇化酶、已糖激酶、丙酮酸脱羧酶、葡糖激酶、和甘油醛(glyceraldehydrate)-3-磷酸(phosphanate)脱氢酶。
可用增强子作用于启动子来增强转录。在本文使用的合适增强子包括SV40启动子、巨细胞病毒(cytomegalovirus)早期启动子增强子、珠蛋白、白蛋白、胰岛素等。
制备并使用基因构建体和载体的方法是本领域公知的，并通常如Sambrook等，(见上文)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing，1987所述。用所述载体转化被选宿主细胞的方法也是已知的，例如氯化钙处理，如Cohen，SN；PNAS 69，2110，1972所述。
包含所述基因构建体和载体的宿主细胞可源自原核或真核来源，例如酵母、细菌、真菌、昆虫(如杆状病毒)、动物、哺乳动物或植物生物体。最常用作宿主细胞的原核细胞是大肠杆菌菌株。其它原核生物宿主包括但不限于假单胞菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、链霉菌属、李斯特氏菌属、糖酵母属(Saccharomyces)、沙门氏菌属和分枝杆菌属。
表达重组蛋白质的真核细胞包括但不限于Vero细胞、HeLa、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、293、BHK细胞、MDCK细胞和COS细胞，以及前列腺癌细胞系，如PrEC、LNCaP、Du 145和RWPE-2。所述细胞得自ATCC，Virginia，USA。
与本发明核酸分子的表达匹配的原核启动子包括本领域已知的组成型启动子(如λ噬菌体的int启动子和pBR322的β内酰胺酶基因序列的bla启动子)和可调控启动子(如lacZ，recA和gal)。PSPU 43编码序列上有的核糖体结合位点也是表达所需的。
包含基因构建体如表达构建体的宿主细胞，可用于重组制备多肽的方法。这些方法是本领域公知的(见例如Sambrook等，见上文)。所述方法常涉及在合适培养基中在适合或有助于表达并选择本发明多肽的条件培养宿主细胞。带可选择性标记物的细胞可另外生长在适合选择宿主细胞的培养基中，所述宿主细胞表达本发明的多肽。表达本发明多肽的转化宿主细胞在适合表达所述多肽的条件选择并培养。所表达的重组多肽可用本领域公知方法自培养基分离并纯化，所述方法包括硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶滤过、亲和层析、电泳等(如Deutscher，Ed，1990，MEthods in Enzymology，Vol 182，Guide to Protein Purification)。宿主细胞也可用于制备由本发明表达多肽所产生的产物的方法。
本发明也提供了动物模型。有前列腺癌倾向的宿主细胞或动物可用于测试可用于治疗前列腺癌的化合物，或用于鉴定涉及会导致癌症的化合物。动物模型特别用于测试目的。本文限定的非人患者可能适合动物使用。优选所述动物是啮齿类动物或兔子。优选使用大鼠、特别是小鼠。
动物模型中可掺入编码本发明多肽或其反义或siRNA序列的基因，其不天然存在于动物中(外源性)，或不出现在引入了基因的位置，或与引入的基因不出现在相同构象(configuration)中。动物模型也包括对应于本发明核酸分子的内源性基因被改变、破坏或去除的动物。
动物的种系改变可用任何已知的本领域方法实现。例如基因可通过显微注射接合子(zygote)来掺入动物基因组(Brinster等，PNAS(USA)82：4438-4442(1985)；通过用逆转录病毒感染卵裂球(blastomer)或囊胚腔(blastocoel)来整合病毒(Jaenuch，R；PNAS(USA)73：1260-1264(1976)，Johner，D等，Nature 298：623-628(1982)；或通过转化胚胎干细胞(Lovel-Badge，R.H.，Tetracarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，Robertson，E.J.等，DRL Press，Oxford，153-182(1987)。也见Houdebine，Transgenic Animals—Generation and Use(Harwood Academic，1997)。
另一方面，本发明提供了诊断和/或预后患者中的前列腺癌、PIN或发作这些疾病的倾向的方法。
在一个实施方案中，通过测定患者样本中本发明核酸分子如PSPU 43(SEQ ID NO：3)的表达水平来进行所述方法。所述分子表达水平相对该分子对照水平的改变表示，该受试者患有或有风险患有PIN，PRC。所述分子表达水平的改变包括鉴定所述患者样本中存在或缺无所述分子。
在另一实施方案中，本发明提供了测试患者的前列腺上皮内瘤(PIN)、前列腺癌(PRC)状态的方法，该方法包括测定PSPU 43(SEQ ID NO：3)或其它本发明核酸分子在患者样本的表达水平，其中所述分子的表达水平比对照水平升高表明该患者有PIN、PRC状态或有风险患有PIN或PRC。
如果本发明分子的表达水平与对照水平相差统计学显著性的量，可以认为其表达水平发生改变，包括上升。通常与对照水平相差5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，优选50％以上，或更多。统计学显著性可以可选计算为P<0.05。在其它可选方案中，可以借助于分析法参考限值(assay reference limit)或参考区间(reference interval)来测定偏差。可以从直观评估(intuitive assessment)或非参数方法计算这些。总体而言，这些方法计算0.025，和0.975分位数(fractile)为0.025*(n+1)和0.975(n+1)。这些方法是本领域公知的。见例如the Immunoassay Handbook，3rd edition，ed.DavidWild.Elsevier Ltd，2005；和Solber H.Approved Recommendation(1987)Collected reference values.Determination of reference limits.Journal of ClinicalChemistry and Clinical Biochemistry 1987，25：645-656。
存在对照中不存在的标记物，或不存在对照中存在的标记物，也包括在表达水平的改变中。
在样本中存在标记物及它们的表达水平可根据本领域公知方法测定，如Southern Blotting、Northern Blotting、FISH或定量PCR来定量mRNA的转录[(Thomas，Pro.NAH，Acad.Sci.USA 77：5201-52051980)，(Jain KK，MedDevice Technol.2004 May；15(4)：14-7)]、点印迹、(DNA分析)或体外杂交，其基于本文提供的标记物序列使用合适标记的探针。
因此，本发明也提供了检测样本中存在的本发明核酸分子，优选PSPU43(SEQ ID NO：3)的分析法，所述方法包括：
(a)使所述样本与多核苷酸探针接触，所述探针在严谨杂交条件与所述核酸序列杂交；和
(b)检测样本中杂交复合物的存在。
优选所述杂交探针是标记的探针。标记物的例子包括荧光的、化学发光的、放射性酶的和生物素-亲和素的标记物。用如上述那些的本领域公知方法来标记并观察标记的探针。
为了方便，所述核酸探针可固定在固相支持物上，包括树脂(如聚丙烯酰胺)、碳水化合物(如琼脂糖(sepharose))、塑料(如聚碳酸酯(polycarbonate))及胶乳(latex)珠子。
如上讨论，所述核酸分子探针可以是RNA或DNA分子。优选的探针包括
 
Pspu43 正向反向 5’-AACAAATATAAAGTACCAGACACTCCA-3’(SEQ ID NO：15)5’-ATCTCCAGATCTTCCTTCTAGCC-3’(SEQ ID NO：16)    
所述核酸标记物的表达水平可用本领域公知技术测定，如RT-PCR和电泳技术，包括SDS-PAGE。用这些技术，扩增患者样本中的本发明核酸分子，及PSPU 43(SEQ ID NO：3)的DNA或cDNA序列，并测定DNA或cDNA或RNA的水平。
在另一方法中，可直接测定样本中的DNA、cDNA或RNA水平而不需扩增。
现在优选的方法是Northern印迹杂交分析。用于Northern印迹杂交分析的探针可以基于本文鉴定的标记物序列来制备。探针优选包括参照序列的至少10，至少15，至少20，至少30，至少40，至少50，优选75，优选100，或更优选200或更多个邻接核苷酸。
可选地，可用基于逆转录的PCR(RT-PCR)分析法用对所述核酸序列特异的引物来测量表达水平。如果需要，将样本中所述标记物的表达水平相比表达不依赖于被测参数或条件的对照核酸分子作比较。对照核酸分子指其表达在PIN/PRC状态和健康状态无差别的分子。对照分子的表达水平可用于使所比较群的表达水平正态化。此对照分子的的例子是转凝蛋白2。所述标记物会改变疾病的表达水平。
可选地，对于肽标记物，可用抗体，其能识别特异性双链体，包括DNA双链体，RNA双链体，及DNA-RNA杂种双链体或DNA-蛋白质双链体。反过来，可标记所述抗体，并可进行所述分析法，此时所述双链体结合到表面上，从而在表面上形成双链体时，可检测结合到所述双链体上的抗体的存在。
由此，另一方面本发明提供了检测患者样本中本发明核酸分子所编码的多肽或其功能等同变体或片段的存在的分析法，该方法包括使所述样本与本发明抗体在形成免疫复合物的条件接触，并检测样本中结合多肽的存在。
检测样本中的本发明抗体的反向(reverse)测试也是可行的。此时，所述样本与本发明的肽在适合形成免疫复合物的条件接触，并检测结合抗体的存在。
为此目的本领域常可用的免疫分析法包括放射性免疫分析(RIA)、酶免疫吸附分析(ELISA)等等(Lutz等，Exp.Cell.Res.175：109-124(1988)。
可以任选通过免疫方法如免疫组织化学染色细胞或组织切片，和细胞培养物或体液的分析法来直接定量表达水平，来测定标记物表达。用于免疫组织化学染色和/或用于样本液体的分析法的抗体优选是单克隆或多克隆的，并如下以更多细节讨论。可方便地制备抗体，所述抗体针对本发明多肽或针对合成的肽基于本文公开的DNA序列，或针对与本发明核酸分子(特别是PSPU43)的DNA融合的外源序列，并编码特定抗体表位。
用本发明生物标记物从血细胞监测前列腺健康，可使用下述这些技术进行，例如Fehm等，Clinical Cancer Research，8：2073-2084(2002)“Cytogenetic evidence that circulating epithelial cells in patients with carcinomaare malignant”所述。
尿取样也是可行的。尿道经过前列腺使得前列腺细胞被排到尿中。对尿中核酸PCA3标记物的前列腺试验已经由Bostwick Laboratories(http://bostwicklaboratories.com/patientservices/uPM3.html)开发。可对PSPU43进行类似试验。
患者样本中一或多种PSPU标记物相对正常对照水平的表达改变，表明该患者患有或有风险患上PIN或PRC。该改变是升高还是下降取决于疾病的阶段。通常，已经显示PSPU 43在前列腺癌患者是过表达的。然而，表达不足，例如在前列腺癌的晚期(advanced stages)也是可能的。
其它标记物也可与本发明的PSPU标记物联用。可用的标记物包括已知的前列腺癌标记物如PCA3，PSA。也可使用已经显示在前列腺癌患者表达不足的转凝蛋白1。也可包括不随疾病状态而改变的基准(benchmark)或参照标记物。转凝蛋白2可用于此目的。将PSPU标记物的水平与其它标记物相关可提高预测性诊断本发明PSPU标记物的监测值。PSPU 43与已知前列腺癌标记物使用可提高患者结果的预测或诊断值。
对数个肽标记物的分析可用单一被测样本同时或分别进行。优选同时的或二位模式分析法(two site format assays)。微阵列或生物芯片分析时特别有用的。所述分析法或芯片可有数个审慎的可寻址定位(addressablelocation)，其包含针对一或多种标记物包括本发明PSPU标记物的抗体。US2005/0064511提供了对本发明所用芯片和技术的描述。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了监测受试者对治疗PIN或PRC的反应的方法，所述方法包含测定本发明核酸分子，优选PSPU 43(SEQID NO：3)在患者样本中的表达水平，并将所述分子的水平与对照水平比较，其中测定水平与对照水平的统计学显著性改变表示对治疗有反应。
PSPU分子(特别是PSPU 43)的统计学显著性升高表明了PIN或PRC，或者所述结果可与非PSPU 43标记物的改变(如包括上述讨论的那些)相关。这些标记物水平与对照的改变，与PSPU分子相对对照的升高偶联，更可以表明PRC或PIN。
在将要监测受试者时，可随时取数种生物样本。连续取样允许标记物水平有改变，特别是被测的PSPU 43有随时的改变。取样可为癌症出现、癌症严重程度提供信息，该治疗方案可以是合适的，使用了对治疗方案的反应，以及长期预后。在现场护理(points of care)如在大夫办公室、在临床表现(clinical presentation)、在住院期间、在门诊病人、或在常规健康筛选时可进行分析。
本发明方法也可与一或多种风险因子的分析联用进行，例如但不限于年龄、家族病史及伦理背景。
本文的方法可用作疗法的指导。例如，用什么疗法起始并且在什么时候。
在另一方面，本发明提供了包含一或多种检测试剂的试剂盒，所述检测试剂特异性结合本发明的PSPU核酸标记物分子或由该核酸序列编码的多肽。优选，该试剂盒包括PSPU43(SEQ ID NO：3)。所述检测试剂可以是与PSPU标记物部分相互补的寡核苷酸序列，可以被设计成已知位于PSPU标记物侧翼的核酸或肽序列或与PSPU标记物编码的多肽结合的抗体。所述试剂可以与如上讨论的固相基质结合，或与将它们结合到基质的试剂一起包装。固相基质或底物可以是珠子、板、管(tube)、浸量尺(dip stick)、条(strip)或生物芯片的形式。带可寻址定位并审慎的微滴板的生物芯片或板是特别有用的。
检测试剂包括洗涤试剂以及能够检测结合抗体(如标记的二级抗体)的试剂，或能够与标记抗体反应的试剂。
所述试剂盒将会有利地包括对照试剂(阳性和/或阴性)和/或检测所述核酸或抗体的工具。所述试剂盒内也可包括所用的说明。最通常，所述试剂盒将会被设计成(format)用于本领域公知的分析法，更常用于PCR、Northern杂交或SouthernELISA分析法，这些是本领域公知的。
也可通过使用本发明核酸分子用于筛选方法如FISH来设计试剂盒，所述筛选方法检测与疾病和疾病进展有关的染色体重排。所述试剂盒还可包含针对核酸的检测试剂及对照。
所述试剂盒也可包含一或多种其它前列腺癌的标记物或对照，包括转凝蛋白1，转凝蛋白2，PCA 3及PSA。在一个实施方案中，在试剂盒中包含所有所述的标记物。
该试剂盒会包含一或多个容器，并也可包含收集容器，例如瓶、袋(如静脉内输液袋(intravenous fluids bag))、小瓶、注射器和试管。至少一个容器盛有可有效用于诊断、监测或治疗PIN或PRC的组合物。在组合物中的活性剂通常是本发明的化合物、多肽或抗体。在优选实施方案中，在所述容器上或连接的说明书或标签(label)表明所述组合物用于诊断、监测或治疗PIN或PRC。其它组分可包括针(needle)、稀释剂和缓冲液。通常所述试剂盒可包括至少一个容器，该容器包含可药用的缓冲液如磷酸盐缓冲盐水、Ringer’s溶液和右旋糖溶液。
用于分析法和试剂盒的抗体可以是单克隆或多克隆的，并可以在任何哺乳动物中制备。它们优选针对本发明PSPU核酸序列编码或标示的天然肽，或基于相同序列的合成肽来制备，或可针对与编码本发明PSPU肽的核酸序列融合的外源序列产生。
抗体结合研究可用任何已知分析方法进行，如竞争性结合分析法、非竞争性分析法、直接和间接夹心分析法、荧光免疫分析法、免疫放射性分析法(immunoradiometric assay)、发光分析法(luminescence assay)、化学发光分析法、酶联免疫荧光分析法(ELIFA)及免疫沉淀分析法。Zola，MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.，1987)；Harlow and Lome(1998)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbour Publications，New York；US 5,221,685；US 5,310,687；US 5,480,792；US 5,525,524；US 5,679,526；US 5,824,799；US 5,851,776；US 5,885,527；US5,922,615；US 5,939,272；US 5,647,124；US 5,985,579；US 6,019,944；US6,113,855；US 6,143,576；US 5,955,371；US 5,631,171和US 2005/0064511.
例如，一类夹心分析法是ELISA分析法，此时可检测的部分是酶。ELISA特别可用于预测、检测或监测PIN或PRC。
可替代的本文可用的分析技术包括质谱分析如表面增强激光解吸离子化(surface-enhanced laser desorption and ionization，SELDI)、电喷射离子化(electrospray ionization，ESI)和基质辅助激光解吸离子化(matrix assistedlaser-desorption ionization，MALDI)。
对于免疫组织化学，例如，组织样本可能是新鲜的或冷冻的，或可能包埋在石蜡中，并用防腐剂如甲醛固定。
在一个试剂盒实施方案中，将PSPU检测试剂固定在固相基质如有孔条上来形成至少一个PSPU检测位点。有孔条的测量或检测区域可包含多个检测位点，这些检测位点包含PSPU检测试剂。所述位点可以棒、十字(cross)或点或其它排列方式来排列。测试条也可包含阴性和/或阳性对照的位点。所述对照位点可任选在不同的条上。不同的检测位点可包含不同量的固定的核酸，如在第一个检测位点的量较大而在随后的位点量较小。在加入被测生物样本后，展示可检测信号的位点数目提供了对在样本中存在的PSPU的量的定量指示(indication)。
在另一方面，本发明提供了分析法，其包含与PSPU 43的一或多个PSPU核酸序列结合的一或多个核酸序列。大范围的正义和反义探针及引物可以从本文PSPU的核酸序列来设计。所述PSPU序列的表达水平用上述讨论的本领域已知技术来鉴定。所述阵列可以是固相底物如“芯片”，如USPatent No.5,744,305所述，或硝酸纤维素膜。
本文PSPU标记物所表达的蛋白质也可用于分析法中，并将结果与在正常样本中表达的相同蛋白质的表达水平相比较。蛋白质的存在及量可用本领域公知并且在本文讨论的分析法模式来评估。
在另一方面，本发明提供了筛选改变本发明核酸分子特别是PSPU 43(SEQ ID NO：3)的表达的化合物的方法。在广义术语中，被测化合物与本发明核酸分子(标记物)所编码的肽接触，评估所述肽的生物活性，并选出在所述化合物不存在时改变所述分子生物活性的化合物，或结合所述肽的化合物。在可选的实施方案中，使表达所述分子的被测细胞接触被测化合物，并选出在所述化合物不存在时改变所述标记物表达水平的化合物。这些化合物包括激动或拮抗所述核酸分子表达的分子。
更具体地，设计药物候选物的筛选分析法来鉴定化合物，其与本文鉴定的核酸分子(标记物)所编码的多肽或其生物活性片段结合、优选特异性结合、或复合，或者干扰所编码肽与其它细胞蛋白质的相互作用。这些筛选分析法包括适合高通量筛选化学文库的分析法，使它们特别适合鉴定小分子药物候选物。小分子通常具有低于500 Daltons的分子量，包括合成的有机或无机化合物包括肽，优选可溶肽，(多)肽-免疫球蛋白融合物，并特别是抗体，包括但不限于多克隆的和单克隆抗体及抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体、和嵌合的或人源化的这些抗体或片段、以及人抗体(humanantibodies)和抗体片段。
可从多种已知化合物、从天然来源如植物获得的未知化合物、提取物和微生物获得本发明的被测化合物，或用本领域公知的组合文库的多种方法中的任一种。见例如Lam Anticancer Drug Des.12：1145(1997)and DeWitt等，PNAS 90：6909(1993)。
可以多种模式进行分析法，包括蛋白质-蛋白质结合分析、生化筛选分析、免疫分析及基于细胞的分析法，它们在本领域都是表征良好的。所有分析法都是常用的，因为它们都需要使药物候选物接触由本文鉴定的PSPU核酸分子所编码的肽，接触的条件和时间足以使这两种组分相互作用。
如果候选化合物与本文鉴定的标记物所编码的特定肽相互作用但不结合，其与该肽的相互作用可用公知检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法来分析。这些分析法包括传统方法，如交联、共免疫沉淀、及经梯度或层析柱的共纯化。另外，可用基于酵母的遗传系统监测蛋白质-蛋白质相互作用，见例如Fields及其合作者所述[Chevray等，PNAS 89：5789-5793(1991)。Clontech，California，USA提供了试剂盒(MATCHMAKERTM)用双-杂交(two-hybrid)技术鉴定两种特定蛋白质之间的此种蛋白质-蛋白质相互作用。此系统也可扩展到定位(map)特定蛋白质相互作用所涉及的蛋白质结构域，以及精确定位(pinpoint)对这些相互作用关键的氨基酸残基。
为测试被测化合物抑制结合的能力，制备反应混合物并在被测化合物不存在和存在时应用(run)。该反应混合物通常含有本文所述的PSPU多肽，被测化合物，及与所述标记物多肽相互作用的组分。也可应用阳性对照。如上监测被测化合物以及与所述标记物多肽相互作用的组分之间的结合(复合物形成)。在对照反应物中而不是在含被测化合物的反应混合物中形成复合物表明，该被测化合物干扰被测化合物及其反应配偶体(partner)的相互作用。
用这些筛选分析法，可鉴定改变PSPU标记物优选PSPU 43的活性的化合物。活化PSPU标记物的功能的化合物是激动剂。类似地，抑制PSPU标记物功能的化合物是拮抗剂。用本发明筛选方法鉴定的这些化合物也形成部分本发明。
当被检测的生物活性是细胞增殖、不依赖支持物(anchorage-independent)的生长、侵入和迁移，对该活性的检测可以例如，通过制备表达一或多种PSPU肽的细胞，在存在被测化合物时培养所述细胞，并测定细胞增殖的速度，测量细胞周期、和/或软琼脂中的集落形成活性、改良的Boyden侵入分析法和迁移分析法。
由本发明PSPU核酸序列所编码的一或多种肽的结合活性或生物活性比该筛选方法所检测的标记物的正常对照水平低，表明该被测化合物是PSPU标记物的抑制剂或拮抗剂。相反，所述PSPU标记物的结合活性或生物活性比正常对照水平高，表明该被测化合物是该标记物的强化剂(enhancer)或激动剂。
肽、非肽化合物、合成的小分子(micromolecular)化合物和天然化合物可用于本发明的筛选方法。
对本发明核酸分子的激动剂和拮抗剂的计算机制模也可用公知程序如AUTODOCK(Dunbrack等，1997，Folding and Design 2：R27-42)CHARMm和QUANTA程序(Polygen Corporation，Massachusetts，USA)成为可能。
本发明也提供了PIN或PRC参照表达图谱。这包括了本发明核酸分子，优选PSPU 43的标记物表达的类型。通常，所述表达图谱包括一或多种选自PCA3、转凝蛋白1、转凝蛋白2、和PSA的其它标记物。在一个实施方案中，所述标记物是PCA3和PSA。在另一个实施方案中，包括了所有其它的标记物。用上述讨论的表达技术，可产生所述图谱并用作在诊断PIN或PRC或其倾向中比较新患者样本的点。所述图谱也可用于监测治疗PIN或PRC的过程，并作为鉴定为患有PIN或PRC的患者的预后工具。
由此，本发明的另一种方面提供了治疗或预防患者的PIN或PRC的方法，其中过表达了本发明PSPU分子。所述方法包括改变所述PSPU标记物的表达或其编码的肽的活性。可通过施用用上述筛选方法获得的一或多种化合物来实现抑制。可选地，可用本领域已知方法抑制表达，如施用抑制或拮抗所述标记物表达的核酸。破坏标记物表达的反义寡核苷酸、siRNA、细胞内抗体和核酶都能用于抑制表达。
对应于本文PSPU分子、优选PSPU 43的反义-寡核苷酸可用于在需要的情况降低所述PSPU分子的表达水平。本发明反义-寡核苷酸可通过结合本发明PSPU核酸分子编码的多肽起作用，或对应的DNA或mRNA，从而抑制所述标记物的转录或翻译，提高所述mRNA的降解，和/或抑制所述PSPU核酸分子编码的蛋白质的表达，并最后抑制所述蛋白质的功能。
抑制过表达基因的一或多种基因产物的核酸也包括小干扰RNAs(siRNA)，其包含编码所述PSPU标记物的核苷酸序列的正义链核酸和反义链核酸的组合。术语“siRNA”指预防靶mRNA翻译的双链RNA分子。将本发明siRNA引入所述细胞的标准技术可用于治疗或预防PIN或PRC，包括其中DNA是转录出RNA的模板的那些。可这样构建siRNA，从而单个转录物具有来自靶基因的正义和互补的反义序列，如发夹。
所述方法用于阻抑(suppress)上调表达本发明PSPU分子的细胞的基因表达。靶细胞中siRNA与PIN或PRC标记物转录物的结合导致由细胞产生的PIN或PRC蛋白质下降。所述寡核苷酸的长度为至少10个核苷酸并可能与天然存在的转录物等长。优选，所述寡核苷酸长度不足100，不足75，不足50或不足25个核苷酸。优选，所述寡核苷酸长度为19-25个核苷酸。
siRNA的核苷酸序列可用siRNA设计计算机程序来设计，所述程序得自Ambion的网址(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)并如Yuan等，Nucleic Acids Research 2004 vol 32，W130-W134所述。用如下方案由计算机程序选择siRNA的核苷酸序列：
siRNA靶位点的选择：
1.从转录物的AUG起始密码开始，扫描AA双核苷酸序列的下游。记录出现的每个AA和3’邻近的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点。Harborth等，(2003)推荐设计针对5’和3’未翻译区(UTRs)以及邻近起始密码子的区(在75个碱基内)的siRNA，所述区可能较富含调控蛋白质结合位点。设计针对这些区域的内切核酸酶和siRNA的复合体可能会干扰UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物的结合。
2.与人基因组数据库比较潜在的靶位点，并从考虑中去除与其它编码序列有显著同源性的任何靶序列。可用BLAST如上所述进行同源性检索，其可发现于在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的NCBI服务器中。
3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion网址，可选择多项优选靶序列以及基因的长度作评估。
所述siRNA可抑制PSPU分子的表达，由此可用于阻抑所述蛋白质的生物活性。因此，包含siRNA的组合物可用于治疗或预防PIN或PRC，其中涉及到PSPU分子的过表达。
抑制过表达基因的一或多种基因产物的核酸也包括抗所述过表达标记物的核酶。核酶通常是具有以类似于DNA限制性内切酶的方式切割其它单链RNA能力的RNA分子。
设计和构建核酶的方法是本领域公知的(见例如Koizumi等，FEBS Lett.228：225(1998)；Kikuchi等，NAR 19：6751(1992))，并且可基于编码PIN或PRC蛋白质的核苷酸序列的序列信息，根据制备核酶的常用方法，构建抑制过表达PIN或PRC蛋白质表达的核酶。因此，包含所述核酶的组合物可用于治疗或预防PIN或PRC。
可选地，任何过表达基因的一或多种基因产物的功能可通过施用化合物来被抑制，所述化合物结合或者抑制所述基因产物的功能。例如，结合过表达标记物的一或多种产物的抗体可用于PIN/PRC治疗以及诊断和预后分析法。
本发明也涉及抗体或所述抗体的片段的用途。本文所用的术语“抗体”指具有特定结构的免疫球蛋白分子，其与包含用于合成所述抗体的抗原的分子或与所述抗体密切相关的抗原特异性相互作用(结合)。抗体特异性结合本发明PSPU多肽，如果它不结合非-PSPU多肽。通常，该抗体对PSPU抗原会有不超过10-7M，优选低于约10-8M，优选低于约10-9M的结合亲和力(解离常数(Kd)值)。结合亲和力可用表面等离子体共振(surface plasma resonance)来估测。
结合本文PSPU标记物多肽的抗体可以是任何形式，如单克隆或多克隆抗体，并包括通过用所述多肽免疫接种动物如小鼠、大鼠或兔子获得的抗血清，所有类型的多克隆的、单克隆的、人的抗体，以及通过遗传重组制备的人源化的和细胞内抗体。
另外，用于治疗或预防PIN或PRC的方法的抗体可以是抗体或经修饰的抗体的片段，只要它结合本文所述标记基因所编码的一或多种蛋白质。所述片段通常包含抗原结合区和/或其互补决定区。所述抗体片段可以是Fab、F(ab’)2及Fc或Fv或单链Fv(scFv)，其中H和L链的Fv片段通过适当接头而连接(Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83(1988))。
制备抗体的方法是本领域公知的(见例如Antibodies：A LaboratoryManual，CSH press，eds，Harlow and Lane(1988))。最常用的抗体是通过免疫接种上述讨论的合适宿主动物制备的。与PSPU蛋白质的融合蛋白也可用作免疫原。
可通过与多种分子(如聚乙二醇(PEG))偶联来修饰抗体。经修饰的抗体可通过化学修饰抗体来获得。这些修饰方法是本领域常用的。
任选地，获得的抗体可以是源自非人抗体的可变区与源自人抗体的恒定区的嵌合抗体，或是人源化抗体，后者包含源自非人抗体的互补决定区(CDR)、源自人抗体的框架区(FR)以及恒定区。这些抗体可用本领域已知方法制备。
简言之，制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。可在哺乳动物产生多克隆抗体，例如通过一或多次注射免疫剂，以及佐剂(如果需要的话)。通常，可在哺乳动物内通过多次皮下或腹腔内注射来注射免疫剂和/或佐剂。所述免疫剂可包括PSPU多肽或其融合蛋白。它可用于将免疫剂与被免疫的哺乳动物内已知为免疫原性的蛋白质偶联。这些免疫原性的蛋白的例子包括但不限于匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、及大豆胰蛋白酶抑制剂。可用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL TDM佐剂(单磷酸脂类(moriophosphoryl Lipid)A、合成的海藻糖二霉菌酸酯(dicorynomycolate))。可由本领域熟练技术人员不需不当试验就可选择免疫方案。
细胞内抗体通常是本文的单链抗体，它们会包含特异性结合PSPU多肽的单链抗体。它们可用于基因疗法，所述疗法通过将编码所述抗体的序列掺入重组载体并施用到过表达PSPU多肽的细胞来结合并抑制其功能。制备这些抗体的方法是本领域已知的。(见例如Tanaka等，Nucleic AcidsResearch 31(5)：e23(2003)。
可用本领域也公知的杂交瘤方法制备单克隆抗体。见例如Kohler andMilstein，Nature，256：495(1975)。可在适合培养基中培养杂交瘤细胞，任选地，所述杂交瘤细胞可作为哺乳动物内的腹水体内培养。优选的无限增殖细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如MPC-11和MOPC-21，它们可得自例如来自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Virginia，USA。可用免疫分析法筛选分泌目的抗体的无限增殖的细胞系。由本文PSPU标记物或其变体或片段编码的多肽可用于筛选。
由此，本文也包括杂交瘤，其为能分泌PSPU肽特异性单克隆抗体的无限增殖的细胞系。
建立由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性的公知手段包括免疫沉淀、放射免疫分析法(radio-linked immunoassay)(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)及Western印迹。(Lutz等，Exp.Cell.Res.175：109-124(1988))。可类似筛选来自免疫动物的抗病毒是否存在多克隆抗体。
为了利于检测，本文的抗体和片段可用允许直接测定抗体结合的可检测标记物，如荧光的、生物发光的、和化学发光的化合物，以及放射性同位素、磁珠、和亲和标记(如生物素和亲和素)来标记。允许间接测定结合的标记物的例子包括酶，其中底物可提供有色荧光产物，适合的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶等。荧光色素(Fluorochrome)(如德克萨斯红(Texas Red)、荧光素(fluorescein)、藻胆蛋白(phycobiliprotein)、和藻红蛋白(phycoerythrin))可与荧光激活细胞分选仪(fluorescence activatedcell sorter)应用。标记技术是本领域公知的。
可以通过常用的免疫球蛋白纯化方法如，例如蛋白质A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析将所述细胞分泌的单克隆抗体从培养基或腹水分离或纯化。
单克隆抗体或片段也可通过重组DNA工具制备(见例如U.S.Patent No.4,816,567)。DNA修饰如用人的重链和轻链恒定区的编码序列替代同源的鼠序列(U.S.Patent No.4,816,567；见上文)也是可行的。本文也包括制备嵌合的二价抗体。
所述抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域公知的。
本发明的抗-PSPU抗体还可包含人源化抗体或人抗体。这些人源化抗体优选作治疗用。人源化抗体包括人免疫球蛋白，其中受者互补决定区(CDR)的残基被非人物种CDR的残基替代。从非人来源如兔子、大鼠和小鼠制备人源化抗体是公知的。(Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988)；Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)。
人抗体也可用本领域已知的多项技术，包括噬菌体展示技术(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991))；及转基因方法，见例如Nature Biotechnology 14，826(1996)；和Vaughan et al，NatureBiotechnology 16：535-539(1998)来制备。
双特异性抗体是单克隆的，优选人的或人源化的抗体，其对至少两种不同抗原具有结合特异性。本文包括双特异性抗体，其中一种结合特异性是针对所述PSPU标记物，另一种是针对任何其它抗原，并优选针对细胞表面蛋白或受体或受体亚基(subunit)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。见例如Milstein和Cuello，Nature，305：537-539(1983)和Suresh等，Method in Enzymology，121：210(1986)，Brennan等，Science 229：81(1985)。
双特异性抗体可结合本文给定PSPU多肽上的两个不同表位。任选，它们可结合抗-PSPU及表位，所述表位结合在表达PSPU的细胞中参与细胞防御的一或多个分子。例如，白细胞T-细胞受体分子，和针对IgG的Fc受体。还任选，双特异性抗体可包含结合细胞毒性剂的表位，所述细胞毒性剂如蓖麻毒蛋白(ricin)A链、皂草素(saporin)、或氨甲蝶呤或放射性核素螯合剂，如EOTUBE或DOTA。
本文也包括具有超过两种特异性的抗体，如三特异性抗体(trispecificantibodies)。
本文也包括由两条共价连接的抗体组成的异偶联(Heteroconjugate)抗体。已经提示这些抗体用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(US Patent No.4,676,980)。所述抗体可用本领域已知的交联技术体外产生。
可提高所述抗体的有效性。例如，通过向Fe区引入一或多个半胱氨酸残基，从而允许在此区域形成链间二硫键来产生同二聚体(Homodimeric)抗体。同二聚体抗体可用本领域已知的交联剂产生，如Wolff等，CancerResearch，53：2560-2565(1993)所述。
抗独特型(Antiidiotypic)抗体也可用于本文讨论的疗法，来诱导对表达PSPU蛋白质的细胞的免疫应答。制备这些抗体也是公知的(见例如Wagner等，Hybridoma 16：33-40(1997))。
本发明抗体可固定在固相支持物上：合适的支持物包括对于核酸序列上述讨论的那些。将抗体与固相支持物结合可通过本领域公知的技术实现。见例如Handbook of Experimental Immunology，4th Edition，BlackwellScientific Publications，Oxford(1986)。结合的抗体用于本文讨论的分析法。
本发明提供了在有需要的患者中治疗或预防PIN或PRC的方法，其使用抗PSPU多肽的抗体。根据所述方法，给所述患者施用药物有效量的抗PIN或PRC多肽的抗体。以足以降低PIN或PRC多肽活性的剂量施用，在PIN或PRC中涉及本发明PSPU分子特别是PSPU43的过表达。任选地，与对肿瘤细胞特异的细胞表面标记物结合的抗体可用作药物递送的工具。因此，例如，与细胞毒性剂(如美登醇(maytonsinoid)、氟尿嘧啶、紫杉醇(taxol)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、白喉毒素、柔红霉素(doxorubicin)、氨甲蝶呤、依诺霉素(neomycin)、白树毒素(gelonin)、放射性核素如186Re，212Bi，p32，I125和131I)偶联的抗PSPU多肽的抗体，可以足以损伤或杀灭肿瘤细胞的剂量施用。治疗方法可涉及施用一或多种抗体。用于制备在这些方法中使用的免疫偶联物的方法例如见Vitetta等，Science，238：1098(1987)所述。
本发明也涉及治疗或预防患者的PIN或PRC的方法，该方法是通过施用改变本发明PSPU多肽的表达或活性的化合物。在过表达时，施用降低所述PSPU多肽的表达或活性的化合物。所述化合物或组合物可以是疫苗，其包含本发明PSPU多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码所述多肽或其片段的多核苷酸。施用所述多肽可诱导受试者内的抗肿瘤免疫。所述多肽或其免疫活性片段也可用作抗PIN或PRC的疫苗。可施用包含本文的一或多种PSPU多肽的疫苗，如同施用多种包含单一PSPU多肽的疫苗。在受试者内经诱导抗肿瘤免疫可治疗或预防良性肿瘤。有时候，可以施用所述蛋白质或其片段的形式是结合到T细胞受体(TCR)或递呈到抗原递呈细胞(APC)，特别是树突细胞(DC)上。
在本发明中，术语PIN或PRC疫苗指经接种诱导抗肿瘤免疫或经免疫系统起作用来阻抑PSPU的物质。通常，抗肿瘤免疫包括免疫应答、诱导抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，诱导识别肿瘤的抗体，并诱导产生抗肿瘤的细胞因子。
可通过观察宿主动物内抗所述蛋白质的免疫系统应答来检测诱导抗肿瘤免疫。检测应答的系统是本领域公知的。
诱导针对肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞的多肽，如同所诱导的细胞毒性T淋巴细胞，可用于抗PIN或PRC的疫苗。能诱导针对PIN或PRC的细胞毒性T淋巴细胞的抗原递呈细胞也用于针对PIN或PRC的疫苗。用结构不同的蛋白质/肽的组合可提高对细胞毒性T淋巴细胞的诱导。这些组合可包括用于本文讨论的免疫疗法。
也可通过测定抗肿瘤抗体的产生来评估多肽的抗肿瘤免疫。如果生长，肿瘤细胞的增殖或转移就被抗体阻抑，用于制备所述抗体的多肽明显具有诱导抗肿瘤免疫的能力。
施用本发明疫苗，从而允许通过诱导抗肿瘤免疫来治疗和/或预防PIN或PRC。治疗性和预防性治疗PIN或PRC可包括任何对肿瘤细胞生长的抑制，以及对出现肿瘤细胞的阻抑，PIN或PRC标记物在血中水平的改变，陪同PIN或PRC的可检测症状减轻，并降低患者死亡率。这些治疗性和预防性作用优选是统计学显著性的。例如，与对照相比的显著水平在5％或更高，优选10％或更高。
在配制本发明疫苗时，具有免疫活性的多肽或编码所述多肽的多核苷酸或载体可与佐剂组合。佐剂指在与具有免疫活性的蛋白质一起(或连续(successively))施用时增强抗该蛋白质的免疫应答的化合物。佐剂的例子包括但不限于霍乱菌(cholera)毒素、沙门菌(salmonella)毒素、及明矾(alum)。本发明疫苗可与可药用载体如无菌水、生理盐水及磷酸盐缓冲液组合。另外，如果必要，所述疫苗可含稳定剂、混悬剂(suspension)、防腐剂(preservative)、表面活性剂等。所述疫苗可在全身或局部单一或多重施用。在用作免疫原时，所述多肽可与载体如KLH、BSA或其它本领域公知蛋白质偶联。其它治疗组合物见下讨论。
本发明也提供了治疗或预防受试者的PIN或PRC的方法，通过施用改变本发明PSPU核酸分子或PSPU多肽的表达或生物活性的化合物。
在此方法的一个实施方案中，所述治疗化合物包括表达不足的标记物的多肽产物，或其生物活性片段，编码位于表达控制元件下游的表达不足的基因的核酸，所述表达控制元件允许所述基因在PIN或PRC细胞中表达，提高在PIN或PRC细胞中内源性存在的标记物的表达水平的化合物。可用本文所述的筛选方法获得这些化合物。为向细胞递送丢失的基因或蛋白质，可用逆转录病毒系统。这些系统是本领域公知的。见例如US 5,082,670及DNA cloning：A Practical Approach，V olume 3，DRL Press，Washington(1987)中的“Retroviral Vector”。如上讨论，将载体掺入细胞可通过技术如显微注射、转染、转导和电穿孔及其它(Sambrook等，见上文)。可用基因疗法来抑制不当的过表达或增强PSPU 43分子或多肽的表达。
本发明也提供了治疗或预防PIN或PRC的组合物，其包含药物有效量的：本发明方法鉴定的化合物；或结合本发明PSPU多肽的抗体或其片段。所述组合物可包括两或多种这些化合物、抗体和多肽或其组合。所述组合物中也包括可药用的载体、赋形剂或稀释剂。也提供了药物组合物，其包含有效量的至少一个PSPU反义序列、siRNA、核酶或多肽，以及可药用的载体、赋形剂或稀释剂。
含本发明化合物、反义序列、siRNA、核酶、多肽或抗体的药物组合物，可以通过将有效量的活性分子与可选的可药用载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.[1980])。
本文所用的有效量指任何本文公开的活性物质(active)包括多肽、抗体、小分子、siRNA、反义序列、核酶、激动剂或拮抗剂为足以实现所述目的的量。熟练工人可根据经验用常规方法确定所述量。类似地，“药物有效量”或“治疗有效量”指本文公开的活性物质的量，其可有效预防或治疗上述PIN或PRC(见“治疗”的定义)。
所述组合物可配制为了口服施用(如胶囊、片剂、锭剂(lozenge)、粉剂、糖浆剂等)、肠胃外施用(如静脉内溶液、皮下、肌内或栓剂配制剂)、局部施用(如乳膏、凝胶)、吸入(如鼻内、肺内)或其它这些本领域公知的施用形式。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂是本领域公知的。它们在所用剂量和浓度必须对受者无害，并包括缓冲液(如磷酸和柠檬酸(citratic acid))、水、油、特别是橄榄油、芝麻油、椰子油、矿物油和植物油；碳水化合物，包括乳糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子(counter-ion)如钠；金属复合物(如Zn-蛋白复合物)；非离子型表面活性剂如TWEENTM，或聚乙二醇(PEG))。
对于片剂，稀释剂如碳酸盐(如钠盐和钙盐)、磷酸盐(如磷酸钙)或乳糖，常与抗氧化剂、成粒剂(granulating)和崩解剂(disintegrating agent)(如玉米淀粉)、粘合剂(binding agent)如淀粉、及润滑剂如硬脂酸和硬脂酸镁共用。可包被片剂来摄入(ingestion)、稳定性或崩解(disintegration)。
可注射的组合物通常用润湿剂(wetting agent)(如聚氧乙烯硬脂酸酯(polyoxyethylene stearate)、卵磷脂和聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(polyoxyethylene sorbitol monooleate))、助悬剂(suspending agent)(如甲基纤维素、海藻酸钠(sodium alginate)和西黄蓍胶(gum tragacanth))以及稀释剂制备。
如果必要，所述组合物也可包括添加剂如着色剂、抗氧化剂(如抗坏血酸)、甜味剂(sweetener)、增稠剂(thickening agent)(如石蜡、蜂蜡)、调味剂(flavouring agent)和防腐剂(如烷基对羟基苯甲酸酯(alkyl parabens)、苯酚、间苯二酚和苯扎氯铵(benzalkonium chloride))。
可用任何常用技术制备片剂、局部和静脉内配制剂、糖浆剂、水包油乳化剂、吸入剂等(Remington’s见上文)。
也可用脂质体将活性物质递送到细胞。当使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白结合区的最小抑制片段。可如上讨论或如本领域公知来通过化学合成重组制备肽。参见例如PNAS USA 90，7889-7893(1993)。
治疗组合物也可包含一或多种其它活性剂。其它所选的活性物质不应对上述讨论的主要活性剂有明显副作用。其它活性剂的例子有细胞毒性剂、细胞因子、化疗剂如Taxol
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以及顺铂、和/或生长抑制剂。所述活性物质以治疗有效量组合存在。所述活性物质可配制为治疗组合物的部分，或分开来与所述治疗组合物同时或顺序(sequential)使用。
所述活性剂也可配制为微胶囊(microcapsule)或水性混悬液(aqueoussuspension)例如，与助悬剂如海藻酸钠、甲基纤维素类(如甲基纤维素，羧甲基纤维素，羟丙甲基(hydroxlpopylmethyl)纤维素)或大分子乳液(macroemulsion)。这些技术公开在Remington’s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980)中。
要用于体内施用的组合物必须是无菌的。这可通过用无菌过滤膜或其他已知本领域技术过滤来容易地实现。
可制备缓释(Sustained-release)制剂。缓释制剂的合适例子如上述讨论的微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯及水凝胶。
在免疫辅助(immunoadjuvant)疗法中，施用本发明的蛋白质、抗体或化合物可与化疗、化学雄激素去势疗法、或放疗，或与分开(separate)、同时或顺序施用其它抗癌剂联用。药剂的制备和按剂量给药(dosing)的方案可根据生产商的说明书使用或由熟练操作人员确定。化疗剂的制备和按剂量给药的方案参见例如Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中。为了治疗或降低PIN或PRC严重程度或其症状，本发明活性物质的合适剂量会依赖于患者的年龄、所治疗疾病的类型和严重程度(无论该药剂(agent)是为了预防性还是治疗性目的施用)、之前的或其它共同时存在的疗法、施用途径、患者病史、以及根据药物的公知原理对活性物质的反应。所述化合物可以给患者只施用一次、或持续地或重复地施用。例如每日、每周、每月、每日若干次，并且施用可以是规律的、间歇的或以隔开的(spaced)间隔。
根据疾病的种类及严重程度，约1μg/kg到15mg/kg(如0.005到20mg/kg，优选0.1到1mg/kg)的包括本发明的化合物、组合物、核酸分子、多肽或抗体的本发明活性物质是给患者的起始候选剂量，以单一或分开的剂量或通过持续输注施用。通常的日剂量可能从约1μg/kg到100mg/kg，更常为1mg-75mg/kg，或更依赖于上述强调的因素。可进行治疗，直到已经消除(abate)了疾病或其症状，或直至做出了终止的决定。可用上面讨论的分析法或其它常用监测技术来监测所述治疗方案。
本说明书参照了专利说明书、其他外部文件(external document)、或其它信息来源，这常常是为了提供讨论本发明特征的上下文的目的。除非特别额外指出，参照这些外部文件不应视为认可(admission)这些文件；或者这些信息来源，在任何法律视角中(in any jurisdiction)，都是现有技术，或形成本领域的一部分公知常识。
现在以非限制性方式参照如下实施例来阐述本发明：
实施例1
鉴定第8号染色体，前列腺-富集序列：Pspu1，Pspu2，Pspu8和Pspu43
引言
我们开发了自动数据采集(datamining)，我们称为数据清查(data-panning)的系统。此系统始于从组织样本捕捉转录物(mRNAs)，将它们转变为cDNA文库形式的稳定产物(cDNAs)。cDNA文库经仔细测序，结果在GenBank中保藏了大量表达序列标签(EST)。这些表达序列是UniGene数据库中EST的来源(Schuler等，1996)。目前在人UniGene数据库中有约410万的人EST/mRNA。
UniGene将从GenBank引入的EST隔成基因定位簇(gene-orientedcluster)的非丰余组(non-redundant set)，而每个UniGene簇名义上含有代表单个基因所得转录物的序列(Schuler等，1996)。UniGene的关键特征是给EST指定dbEST文库ID。因dbEST文库ID识别用于生成dbEST文库的组织，故此ID是UniGene簇中该EST的组织来源在计算机中唯一的标记。
dbEST文库源自广泛多种器官和组织。如果这些文库从整体上代表该机体，则单个文库的转录组(transcriptome)聚集起来将反映整体的转录组。同时，单个文库将反映转录体组中可归因于器官和组织的区域性(regional)差别。含有高比例的来自单一组织的EST的UniGene簇可在整体UniGene背景中被识别出来。
我们用此计算机方法鉴定了前列腺组织中的富集基因表达图谱(enriched gene expression profile)。这无需事先知晓这些基因的功能或最可能的分布。用我们的方法鉴定出位于第8号染色体上的四个转录物，详述于此。我们称这些转录物为前列腺特异性单基因(unigene)1(Pspu1)、前列腺特异性单基因2(Pspu2)、前列腺特异性单基因8(Pspu8)和前列腺特异性单基因43(Pspu43)。EST详情如下：
表1：构成每个第8号染色体候选物的EST序列列表
 
标记物 GenBank登录号 全长EST序列
Pspu1 AA635472AI659328AI659339BX112742AW014583
Pspu2 CB050448BX113278AI420913AI927409AW293795
Pspu8 BX283231CF139278BM043676BU543602
Pspu43 AI611685AI418055BF446403 ctttctttttttttgctctatctccagatcttccttctagccaaactcctttgcacccaaaaagcagcctttgctttcttgagatgaaagaacattcatgaaaatcatccctctactggagtcctctagcaattcctgtgatttccacttacctgactatgtacacaagcccagatacctggcttagtgtggggacagagcagagtgaccaagagtccagacctagagcctgcttgcctgggttcaaatctcatctctaccactcagtaaactctgtcccactttcctcatctgaaaaatgggcataacaatagtcccttatctacagg(SEQ ID NO：28)ttttttttttttttgctctatctccagatcttccttctagccaaactcctttgcacccaaaaagcagcctttgctttcttgagatgaaagaacattcatgaaaatcatccctctactggagtcctctagcaattcctgtgatttccacttacctgactatgtacacaagcccagatacctggcttagtgtggggacagagcagagtgaccaagagtccagacctagagcctgcttgcctgggttcaaatctcatctctaccactcagtaaactctgtcccactttcctcatctgaaaaatgggcataacaat(SEQ ID NO：29)tttttttttttttttgctctatctccagatcttccttctagccaaactcctttgcacccaaaaagcagcctttgctttcttgagatgaaagaacattcatgaaaatcatccctctac
 
BF222603BX109457AA658380 tggagtcctctagcaattcctgtgatttccacttacctgactatgtacacaagcccagatacctggcttagtgtggggacagagcaaagtgaccaagagtccaaacctagagcctgcttgcctgggttcaaatctcatctctaccactcagtaaactctgtcccactttcctcatctgaaaaatgggcataacaatagtcccttatctcaca(SEQ ID NO：30)ctttctttttttttgctctatctccagatcttccttctagccaaactcctttgcacccaaaaagcagcctttgctttcttgagatgaaagaacattcatgaaaatcatccctctactggagtcctctagcaattcctgtgatttccacttacctgactatgtacacaagcccagatacctggcttagtgtggggacagagcagagtgaccaagagtccagacctagagcctgcttgcctgggttcaaatctcatctctaccactcagtaaactctgtcccactttcctcatctgaaaaatgggcataacaatagtcccttatctcacaggtttttagtaaaattaaatgagttaatttaattttctaagcact(SEQ ID NO：31)tttattaacaaatataaagtaccagacactccaagtgcttagaaaattaaattaactcatttaattttactaaaaacctgtgagataagggactattgttatgcccatttttcagatgaggaaagtgggacagagtttactgagtggtagagatgagatttgaacccaggcaagcaggctctaggtctggactcttggtcactctgctctgtccccacactaagccaggtatctgggcttgtgtacatagtcaggtaagtggaaatcacaggaattgctagaggactccagtagagggatgattttcatgaatgttctttcatctcaagaaagcaaaggctgctttttgggtgcaaaggagtttggctagaaggaagatctggagatagagcaaaaaaaaagaaagaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ ID NO：32)ttttttttttgctctatctccagatcttccttctagccaaactcctttgcacccaaaaagcagcctttgctttcttgagatgaaagaacattcatggaaatcatccctctactggagtcctctagcaattcctgtgatttccacttacctgactatgtacacaagcccagatacctggcttagtgtggggacagagcagagtgaccaagagtccagacctagagcctgcttgcctgggttcaaatctcatctctaccactcagtaaactctgtcccactttcctcatctggtcgac(SEQ ID NO：33)                          
系统和方法
记录在每个UniGene簇中的数据提供了针对下述组织或细胞类型产生富集基因表达图谱的方法，所述组织或细胞已测序cDNA文库并分配了dbEST文库ID。经UniGene算法归类的每组EST都分配了一个UniGene编号。在UniGene数据库中，凭此编号进入所述簇，有生成所述簇的基因的任何已知信息，该基因的任何STS标记物，可能的蛋白质相似性，染色体定位等。在UniGene记录内称为‘scount’的领域显示出形成UniGene簇的序列数。每个UniGene记录的最后部分列出了所有形成该簇的序列。此列表的格式包括每个序列的登录号，如果该EST作为cDNA文库的一部分测序的话，还包括dbEST文库ID号。所述dbEST ID号起标记给定序列的生物来源的作用。
从此信息产生基因表达图谱依赖大量随机测序的cDNA文库以及dbEST文库编号系统。如果一个基因只被一种组织表达，那么只有从那种组织构建的文库具有来自那个基因的代表性序列。通过测定每个UniGene簇的dbEST文库ID，在所有EST都源自只从一种组织构建的文库时才显示出组织特异性基因表达。
大多数基因不是完全对于一种组织特异的，而是显示分布在一个范围的组织内。在随机测序的cDNA文库中，高丰度表达的基因将会比那些低水平表达的基因测序得更频繁。这会通过UniGene反映出来。用来自组织的dbEST文库ID给序列做标签，比起以低水平表达所述基因的组织，在该组织中所述基因更常高表达。这意味着序列用来自UniGene簇内的目标组织的dbEST ID号作标记的次数可表明该组织内基因表达的水平。可用占构成(contributed to)该UniGene簇的EST总数的百分比来表示。我们已经用此方法来获得对前列腺特异的生物标记物。
算法
从ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/repository/UniGene下载UniGene数据文件(Hs.data.gz)。用利用Bioperl工具试剂盒(toolkit)的三个Perl脚本(script)(Stajich等，2002)编辑这些文件。特定地，这些脚本引用了(call)Bio::Cluster::Unigene和Bio::ClusterIO模块(module)。第一个脚本“lib_extract”自动浏览每个UniGene簇中的EST序列行数，并舍弃构成的(contributing)序列数超过特定阈水平的那些UniGene。
通过限定变量“$threshold”等于4来设定此阈水平，并将它与每个UniGene簇的scount相比。Scount是构成簇的序列总数。舍弃任何构成该簇的序列数等于或低于阈值的记录。将高于序列行数阈值的那些带入(parseinto)内部(in-house)数据库做随后的数据漫游(见下)。
从原始Hs.data文件带入Scount，并且包括那些无区分dbEST文库ID号的行。因为随后的计算是基于dbEST文库ID，舍弃了显示出具有低于规定的(stipulated)阈值数的EST的一些簇。一旦出现这种情况，较低值会反映出UniGene簇中有dbEST文库ID的EST数。
从NIH下载的UniGene文件大(对于人为400Mb)。创造一系列编辑的内部数据库极有利于随后的计算，所述数据库仅保留了UniGene簇号且为每个构成的EST保留了dbEST ID。此方法利用“lib_extract”脚本，将人的数据文件降到40Mb。
在UniGene的网址有带一些描述符(descriptor)的文库目录(Hs.lib.info.gz)。在UniGene Library Browser(http://ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)中有关于文库构建的更多细节。所有UniGene文库都有dbEST文库ID。
用“lib_percentage”脚本进行数据漫游。这需要研究者指定的一组UniGene文库，然后查询(interrogate)所编辑的内部数据库。这些内部数据库不再含有序列数低于阈值的UniGene簇。所述脚本测定了源自指定组的文库的每个UniGene簇内的EST序列行数。这些表示为占UniGene簇内的EST行总数的百分比。
执行
从网址http://ftp.ncbi.nih.gov/repository/dbEST下载Human dbEST文库列表。在程序BBedit中打开该列表，鉴定了前列腺文库，并用GREP功能制备编辑的列表。鉴定290个文库是从前列腺组织构建的。用于此分析来鉴定人前列腺特异性序列的dbEST文库为689，787，792，876，910，924，925，926，928，934，935，940，994，1016，1017，1053，1054，1055，1333，1410，1498，1654，1655，1668，1670，1671，1672，1673，4267，4268，4711，4712，4713，4714，4715，4716，4717，4718，4719，4720，6013，6014，6015，6016，6017，6018，6019，6020，6021，6022，6023，6024，6025，6026，6027，6028，6029，6030，6031，6032，6033，6034，6035，6036，6037，6038，6039，6040，6041，6042，6043，6044，6045，6046，6047，6048，6049，6050，6051，6052，6053，6054，6055，6056，6057，6058，6059，6060，6061，6062，6063，6064，6065，6066，6067，6068，6069，6070，6071，6072，6073，6074，6075，6076，6077，6078，6079，6080，6081，6082，6083，6084，6085，6086，6087，6088，6089，6090，6091，6092，6093，6094，6095，6096，6097，6098，6099，6100，6101，6102，6103，6104，6105，6106，6107，6308，6309，6310，6311，6312，6313，6314，6315，6316，6317，6318，6319，6320，6321，6322，6323，6324，6325，6326，6327，6328，6329，6330，6331，6332，6333，6334，6335，6336，6337，6338，6339，6340，6341，6342，6343，6344，6345，6346，6347，6348，6349，6350，6351，6352，6353，6354，6355，6356，6357，6358，6359，6360，6361，6362，6363，6364，6365，6366，6367，6368，6369，6370，6371，6372，6373，6374，6375，6376，6377，6378，6379，6380，6381，6382，6383，6384，6385，6386，6387，6388，6389，6390，6391，6392，6393，6394，6395，6396，6397，6398，6399，6400，6401，6402，6601，6602，6603，6763，6831，7180，7181，8480，8481，8482，8483，8484，8485，8486，8487，8488，8489，8490，8491，8492，8493，8494，8495，8496，8497，8498，8499，8500，8501，8502，8503，8504，8505，8506，8507，8508，8509，8510，8511，8512，8513，8514，8515，8585，8834，9134，9135，9136，9137，9138，10161，10549，11034，11037，14129，14130，14131。这些文库都是从正常或患病的前列腺材料构建的。在2004年3月4日构建的人UniGene上进行计算。将结果输入MicrosoftExcel作分选。
结果和讨论
几项研究提示从第8号染色体短臂(8p)失去基因序列是早期分子事件(Cher等，1994；Macoska等，1994；1995；2000；Haggman等，1997)，它出现在几乎所有前列腺癌中，并显著出现在前列腺癌最可能的前兆前列腺上皮内瘤(PIN)中(Bostwick，1996)。用数据漫游算法鉴定为100％、75％和80％富集水平的3个转录物(下表2)位于8p。两个，在硅片上(in silico)显示与在正常和患病组织之间失去表达相一致的类型。另一个对前列腺表达有83％富集的转录物位于8q。我们称这些转录物为前列腺特异性单基因1(Pspu1)、前列腺特异性单基因2(Pspu2)、前列腺特异性单基因8(Pspu8)和前列腺特异性单基因43(Pspu43)。之前没有描述过这些转录物。Pspu1位于8p12，发现Pspu2在8p21，Pspu8位于8p22-23且Pspu43位于8q23。
表2：对Pspu1，Pspu2，Pspu8和Pspu43的富集结果
 
UniGene号      PspuID号 前列腺文库的EST  其它文库的EST    UniGene簇中的EST总数 百分比(％)  
197095 Pspu1 4 1 5 80
444680 Pspu2 3 1 4 75
458397 Pspu8 4 0 4 100
161160 Pspu43 5 1 6 83
对于Pspu1和Pspu2的硅片上基因表达图谱用Stanton and Green(2001)所述的荟萃分析(meta-analysis)系统测定。简言之，从NCBI(http://ncbi.nllm.nih.gov)下载测序的前列腺cDNA文库。将每个文库置于由制备它的组织所决定的目录。这意味着从PIN组织制备的所有文库被分组到一起，而来自正常组织的所有cDNA文库形成另一组。每个文库中的EST基于UniGene而聚类。这样得到落入每个目录的转录单元列表。通过记录在每个目录中给定UniGene的EST数，产生硅片上的基因表达图谱，其表示每个组织类型所表达的特定转录物的水平。此数据用于产生下表3。Pspu8和Pspu43不包括在内，因为产生它们的文库由于它们的构建性质被排除在荟萃分析之外。
表3：正常前列腺上皮细胞和前列腺癌进展阶段中的基因的表达图谱例子。给正常前列腺作正态化丰度的评分，而患病组织中的水平为正常表达的百分比。在括号中给出的显著性水平用拟合度(goodness of fit)的卡方检验(Chi squared test)测定为2类，ns＝无显著性差异
 
描述 正常前列腺   前列腺上皮内瘤           侵入性癌 转移的损伤
前列腺特异性抗原 1580 188％(0.001) 103％(ns) 50％(0.001)
前列腺酸性磷酸酶 790 169％(0.001) 83％(ns) 33％(0.001)
前列腺特异性单基因1 20 0％(0.001) 0％(0.001) 0％(0.001)
前列腺特异性单基因2 10 0％(0.001) 0％(0.001) 0％(0.001)
已知若干基因在前列腺癌进展中的表达改变，对这些基因作的比较与此荟萃分析一致。例如，数字表达图谱显示前列腺特异性抗原(PSA)在前列腺上皮内瘤的表达上升与普遍认为的一致(表3)。另外，荟萃分析显示前列腺酸性磷酸酶下调(表3)。前列腺酸性磷酸酶被用于在PSA试验前诊断前列腺癌(Bostwick，1996)，现在认为它与前列腺肿瘤的失去雄激素反应性有关(Meng等，2000)。
从独立文库多次取样Pspu1，Pspu2，Pspu8和Pspu43的序列，由此确定它们代表了合法转录物。5个EST构成了UniGene簇Hs.197095，我们称此序列毗连序列群为Pspu1。这些来自3个cDNA文库NCI_CGAp_Pr28(dbEST文库ID.1410)、NCI_CGAP_Pr22(dbEST文库ID.910)和NCI_CGAP_Sub2(dbEST文库ID.2359)。文库1410和910是从正常前列腺组织构建的。文库2359是从为了鉴定乳腺特异性基因而设立的减差(subtracted)cDNA文库产生(Bonaldo等，1996)。
4个EST构成了UniGene Hs.444680或Pspu2。在cDNA文库NCI_CGAP_Pr28(dbEST文库ID.1410)、NCI_CGAP_Pr22(dbEST文库ID.910)和NCI_CGAP_Sub4(dbEST文库ID.2721)中鉴定了这些EST。这些文库中的2个是从正常前列腺制备的(1410和910)。第三个文库是另一个为发现前列腺特异性基因而设立的减差文库(2721)(Bonaldo等，1996)。执行我们的数据漫游算法不是为了鉴定减差文库2721是从前列腺构建的，并因此给予此簇的富集水平只有75％。事实上此UniGene可代表仅限于前列腺的转录物。
Pspu8由4条EST序列组成，它们取自包含UniGene Hs.458397的3个克隆。这些克隆自2个文库分离，它们两个都是从前列腺癌细胞系构建的。这些文库是dbEST文库14129和文库8834。
6个EST组成UniGene Hs.161160。从这些EST序列形成的毗连序列群被称为Pspu43。这些EST来自在2个cDNA文库中发现的5个克隆。这些文库是NCI_CGAP_Pr28(dbEST文库ID.1410)和NCI_CGAP_Pr2(dbEST文库ID.574)。此数据漫游算法指出此转录物在前列腺中只有83％富集。然而，文库574没有掺入前列腺特异性文库的列表，所以来自此文库的EST没有被标记为前列腺源性。像Pspu2一样，此转录物可能仅仅是前列腺源性的。
对组成Pspu1，Pspu2，Pspu8和Pspu43的EST做比对，以得到对每个候选物最佳的共有序列。图1中给出共有序列，下表4给出相对在NCBI的非冗余的GenBank数据库获得的BLASTN(Altschul等，1990)结果。
表4：对Pspu1，Pspu2，Pspu8和Pspu43前列腺特异性候选物的BLASTN分析汇总
 
毗连序列群序列     与GenBank候选物比对的毗连序列群碱基对                 最佳GenBank比对的登录号        意见
Pspu1 1-353 AC044849.12 基因组DNA
Pspu2 1-379 AC090786.6 基因组DNA
Pspu8 1-1320 NM_0540281 cDNA
 
Pspu43 1-392 AP001207/AP000426 基因组DNA
Pspu1和Pspu2共有序列长度分别为368bp和394bp，然而它们都在事实上长度不同的polyA序列片段(stretch)(分别为18bp和15bp)终止。两端序列定位在人基因组上，但不与已知的表达基因产生高得分匹配。所述Pspu43共有序列长为392bp，并也定位在人基因组上但不是表达的序列。Pspu8长为1320bp并定位在人酰基-丙二酰基(Acyl-malonyl)缩合酶的表达序列上。
结论
我们已经用UniGene数据采集算法鉴定了4条前列腺特异性核酸序列Pspu1，Pspu2，Pspu8和Pspu43。Pspu1，Pspu2和Pspu8分别定位在8p12/21边缘、8p21和8p22-p23。已知从这些位点缺失是前列腺癌的早期事件(MacGrogan等，1994)。在疾病中失去这些序列中的两条得到正常前列腺和前列腺癌的基因表达荟萃分析的支持。Pspu43定位在第8号染色体长臂的8q23。最近，邻近区域8q24已经与前列腺癌易感性遗传连锁(Amundadottir等，2006)。我们设想Pspu1，Pspu2，Pspu8和Pspu43会是作为发病前列腺癌的早期事件而出现的第8号染色体改变的有用标记物。
实施例2：Pspu43：表征第8号染色体长臂上的前列腺疾病标记物。
引言
通过用上面实施例1所述的数据漫游算法对cDNA组织文库作数据采集，鉴定出Pspu43对前列腺有重要性。用数据漫游方法，总共鉴定了定位在第8号染色体上的4条序列。3条位于第8号染色体的短臂上，而Pspu43位于该染色体的长臂上。Pspu43紧邻第8号染色体上在前列腺肿瘤中常改变的区域，并已经与前列腺癌易感性遗传连锁(Amundadottir等，2006)。
此实施例汇总了我们对Pspu43的发现，包括确认基因组序列、细胞培养系统中的表达图谱以及组织特异性数据。
系统和方法
PCR引物设计
从由EST簇Hs.161160产生的毗连序列群设计对Pspu43的PCR引物。该毗连序列群经BLASTN(Altschul等，1990)分析确认该毗连序列群未掺入克隆载体的序列。将此经编辑的序列带入(load into)PCR引物设计程序(Primer 3，Rozen and Skaletsky，2000)。选出产生最长扩增子的最适引物对，并在NCBI用BLASTN与非冗余的基因序列数据库进行比较。用AMPLIFY程序(William Engles，Genetics Department，University of Wisconsin)进行毗连序列群和引物序列的模拟PCR，来确保匹配的忠诚度，避免引物二聚体形成并测试可能的引物二级结构。通过Invitrogen(USA)合成引物。表5给出引物序列。
表5：PCR引物序列
 
Pspu43 正向反向 5’-AACAAATATAAAGTACCAGACACTCCA-3’5’-ATCTCCAGATCTTCCTTCTAGCC-3’    
转凝蛋白2 正向反向 5’-CTTCCAGAACTGGCTCAAGG-3’5’-GAGAAGAGCCCATCATCTCG-3’
PSA 正向反向 5’-CACTGCATCAGGAACAAAAGCGT-3’5’-CATCACCTGGCCTGAGGAATC-3’  
提取并扩增RNA和基因组DNA
正常前列腺上皮和基质细胞(PrEC和PrSC；Clonetics，San Diego CA)生长并保持在专用培养基(PrEGM Bullet Kit；Clonetics，San Diego CA)中，而前列腺癌细胞系LNCaP(ATCC CRL 1740，Manassas，VA)、DU145(ATCCHTB-81，Manassas，VA)和RWPE-2(ATCC CRL-11610，Manassas，VA)生长并保持在补充了10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。
RWPE-2是人乳头瘤(papillary)病毒无限增殖的前列腺上皮细胞系(RWPE-1)被v-Ki-ras转化的衍生物。它是雄激素反应性的、侵入性的(invasive)且致肿瘤的(tumorogenic)(Bello等，1997；Webber等，1997a)。LNCaP是转移的前列腺癌损伤的衍生物，其对雄激素是反应性的(Webber等，1997b)。DU-145衍生自转移的前列腺癌损伤，它是雄激素无反应性的，高度侵入性的且致肿瘤的(Webber等，1997b)。
分别以2500细胞.cm-2或4000细胞.cm-2的密度接种PrEC和LNCaP细胞，并在5％ CO2的潮湿环境于37℃在25cm2排气式锥形瓶(vented flask)中培养到70％汇合。通过胰蛋白酶消化收获细胞，在无胰蛋白酶的培养基中洗涤，并在500g浓集。用TriZol(Invitrogen，Carlsbad，USA)根据生产商手册从细胞粒(pellet)提取基因组DNA(gDNA)和RNA。用Superscript II(Invitrogen，Carlsbad，USA)根据生产商说明书将RNA转变为cDNA。在160ng基因组DNA或37.5ng cDNA上用上述引物进行PCR扩增。用AmplitaqGoldTM master mix(Applied Biosystems，NJ，USA)进行PCR。使PCR条件最适并确立了65℃的有效退火温度。比较来自所有前列腺细胞系的样本。
来自一系列组织的RNA购自Clontech laboratories Inc.(Mountain View，CA，USA)或得自其它研究计划的捐助。这些样本源自乳腺、卵巢、睾丸、肾和血。这些被如上转化为cDNA，并在PCR分析法中以37.5ng RNA当量的浓度使用。
测序PCR产物
用QIAgen PCR纯化系统(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)对PCR产物进行凝胶纯化。从1％琼脂糖凝胶用QX1缓冲液根据生产商说明书提取DNA。从纯化柱在无菌milliQ水中洗脱DNA。
使用BigDye Terminator v3.1 chemistry，用正向和反向PCR引物(10μM)一起测序纯化的PCR扩增子。
结果
表6显示了从3个前列腺细胞系的基因组DNA和合成cDNA获得的PCR结果。这些是LNCaP、PrEC和PrSC细胞系。PrEC和PrSC分别源自正常前列腺上皮和基质细胞。LNCaP源自患前列腺癌的患者的淋巴结转移损伤。在从所有3个细胞系分离的基因组DNA中检测到Pspu43序列。这表明Pspu43是人基因组的一部分，并完全不从LNCaP细胞系中丢失。
表6：从PrEC、PrSC和LNCaP细胞系分离的基因组和cDNA的PCR分析法结果汇总。
 
PrEC PrSC LNCaP
基因组DNA + + +
cDNA + - +
+＝预期PCR产物/-＝无PCR产物
用RT-PCR从自每个前列腺细胞系合成的cDNA模板获得基因表达结果。所有5个细胞系的结果汇总在表7中。在至少2个模板上重复RT-PCR最少3次。在5个细胞系中的4个中表达Pspu43。也就是说，它存在于PrEC、LNCaP、DU145和RWPE2样本上，而不是在PrSC样本上。这里包括了转凝蛋白2和PSA的RT-PCR结果作比较。
表7：细胞系的RT-PCR结果
 
细胞系 PSPU43 转凝蛋白2 PSA
PrSC - + +
PrEC + +
LNCaP + + +
DU145 + + +
RWPE2 + + +
+＝PCR试验阳性，-＝PCR试验阴性
用RT-PCR在一些分离自卵巢、肾、乳腺、睾丸和血的不同RNA样本上检测对于Pspu43的组织特异性。在乳腺和肾而不是其它被测组织检测Pspu43序列(表8)。
表8：分离自5种组织的RNA的PCR分析法结果汇总。
 
卵巢 睾丸 乳腺 肾 血
- - + + -
+＝预期PCR产物/-＝无PCR产物
从首先鉴定Hs.161160为前列腺生物学目的的UniGene簇开始，它已经142个EST、7条mRNA序列一起分组，并称为TFCP2L3(Grainyhead-样2(Drosophila))。组成毗连序列群Pspu43的原来6个EST仍位于此UniGene簇中。然而，毗连序列群Pspu43并不定位在现在与TFCP2L3有关的任一条mRNA序列上。这用毗连序列群Pspu43和所有7个mRNA序列的2-向(way)BLAST来显示。所述Pspu43毗连序列群与非冗余序列数据库的BLAST比对显示，它仅与2个基因组克隆AP000426和AP001207完全匹配。这些克隆是未经注释的大DNA序列，它们分别为239,116和153,936个核酸。
TFCP2L3(Grainyhead-样2(Drosophila))EST在前列腺是高度代表性的(表达图谱产生单位(expression profiler)-NCBI)，并通过Northern Blotting显示(Peters等，2002)。然而，显示TFCP2L3没掺入Pspu43序列。TFCP2L3是已经与导致听觉丧失的突变有关的转录因子(Peters等，2002)。
结论
Pspu43是表达的RNA序列，据鉴定它在从正常和癌性前列腺组织制备的cDNA文库中专一存在。它可以在前列腺上皮细胞中正常表达。因此，Pspu43表达可能是前列腺健康的标记物。
实施例3：尿分析
引言
我们希望检测Pspu43在经过了前列腺疾病临床检查的男性的尿中是否可检测。从Department of Urology，Dunedin Hospital，Dunedin，New Zealand收集尿样本。从这些尿样本提取RNA，并进行RT-PCR来检测Pspu43、转凝蛋白2和PSA。给这些分析法计分。只有在获得RT-PCR结果之后才可诊断患者。
方法
此研究中的所有参与者都出具了书面同意，且该项目得到了LowerSouth Regional Ethics Committee(“Development of non-invasive，Diagnosisand prognostic tests of Prostate cancer”LRS/05/05/016)的伦理学认可。男性接受了作为常规检查方法的一部分的前列腺操作，来确定他们前列腺的物理状态。前列腺操作包括手指触诊(digital palpation)右和左叶及通过用食指从顶端到底部在每侧抚过3次。之后，收集20-30ml的尿样本。将等体积的磷酸盐缓冲液(pH7.0)加入尿样本。将此样本于4℃储存过夜。通过在2500g于4℃离心15分钟来收获细胞，弃上清，并在800μl TriZol(Invitrogen，Carlsbad，USA)中重悬细胞粒。加入糖原(Invitrogen，Carlsbad，USA)得到250μg/ml的终浓度。根据生产商方案提取RNA。在16.5μl H2O中重悬RNA粒。用Dnase I(Roche，Switzerland)根据生产商说明书处理8μl所述样本。用Superscript II(Invitrogen，Carlsbad，USA)根据生产商说明书将一半用Dnase I处理的样本转变为cDNA。在1到2.5μl的cDNA和等体积的Dnase I处理的RNA间中用下述引物(表9)进行PCR扩增。用Amplitaq GoldTM master mix(Applied Biosystems，NJ，USA)进行PCR。使PCR条件最适并确立65℃的有效退火温度。
表9：Pspu43、转凝蛋白2和PSA的PCR引物
 
Pspu43 正向反向 5’-AACAAATATAAAGTACCAGACACTCCA-3’5’-ATCTCCAGATCTTCCTTCTAGCC-3’    
转凝蛋白2 正向反向 5’-CTTCCAGAACTGGCTCAAGG-3’5’-GAGAAGAGCCCATCATCTCG-3’
PSA 正向反向 5’-CACTGCATCAGGAACAAAAGCGT-3’5’-CATCACCTGGCCTGAGGAATC-3’  
结果和讨论
我们从8个男性提供的尿样本获得了可靠RT-PCR结果，这些男性经过了前列腺检查排除疑似疾病，以及来自1个男性的尿样本，该男性无前列腺疾病症状。如果仅有RNA的样本不产生PCR产物，那么认为PCR结果是可靠的。我们的PCR系统中所用的酶不能用RNA作为模板。因此，从仅有RNA的反应物产生的PCR产物表明样本中存在基因组DNA。此时，不可能将基因表达与基因组污染区分。这些结果汇总在表10中。
表10：9个男性的尿样本
 
样本ID PSPU43 转凝蛋白2 PSA Gleason级别
U“S” - + + 正常
U1 - + + 无肿瘤
U3 + 7
U6 + + + 6
U7 + + + 无肿瘤
U12 - +(+RT-) + 7
U14 + + + 良性前列腺增生
U20 - + + 良性前列腺增生
U22 + + + 7
+＝PCR试验阳性，-＝PCR试验阴性
对于无路径的细胞无可靠结果。
这些试验使用非定量的RT-PCR分析法，并且这些患者无长期随访数据。样本U“S”来自无明显疾病的男性。没有试图表征这些尿样本中的细胞群。它证明从尿样本提取始终一致的高品质RNA是有挑战性的，并且获得的RNA量是变化的。结果，很多样本不适合源于建立所述技术的试验变量。
从这些结果清楚知道Pspu43、转凝蛋白2和PSA的转录物在尿中可检出。在2个已知癌症患者(U6 & U22)、1个无肿瘤者(U7)及1个良性者(U14)中检出Pspu43。然而，我们没有这些患者的长期随访数据。如果Pspu43是早期疾病进展指标，患者U7和U14可能已被误诊并确定在疾病的很早阶段。在正常的(U“S”)、无肿瘤(U1)或良性(U20)样本中不能检出Pspu43，并且在1个癌症患者(U12)中不能检出它。
在所有样本检出转凝蛋白2，尽管疑似U12的读数为也从非RT对照产生的产物。这也是不对Pspu43产生阳性反应的唯一已知肿瘤样本。试图从此样本扩增2个不相关的产物3次，每次都得到不一致的结果(数据未示)。仅试了PSA分析法一次。对从此样本产生的结果最有利的解释是，该RT-PCR反应不可靠，这是由于从此样本分离的RNA品质低或浓度低。
不管疾病状态如何，在所有样本中都检出PSA。这会表明PSA是否存在于尿样本中不能是诊断性的，因为无论前列腺健康或个人的病理如何，都会检出它。
结论
Pspu43可以在男性的尿中检出。它在随后从前列腺活检诊断出患有前列腺肿瘤的患者中比在无肿瘤或有良性前列腺增生(BPH)的男性中更常检出。在所有样本中检出PSA和转凝蛋白2。因此，PSA或Trangelin 2均不合适确认存在或不存在标记物的简单诊断试验。从另一方面，Pspu43可以能够从患肿瘤的患者检出。这支持了Pspu43作为前列腺癌标记物的用途。PSA升高作为前列腺癌进展的预测物的问题在于，它不能将前列腺癌与其它病理区分。BPH和前列腺炎都可提高血PSA得分。因Pspu43可区分BPH及前列腺癌，它具有潜在作为癌存在标记物的较高灵敏性。
实施例4：前列腺肿瘤组织中的Pspu43表达
引言
此试验的目的是检查在患病状态的前列腺中的Pspu43表达改变。
此研究中使用来自单个个体的10个匹配对的正常的和损伤的活检。这些样本收集自经过对前列腺腺癌的前列腺切除术的男性，且都是Gleason级别6及以上的。从这些样本提取RNA，并进行定量PCR(qPCR)处理，来确定Pspu43是否在前列腺中表达，并且比较肿瘤对比正常组织的相对表达水平。匹配的活检确保不同个体之间的潜在遗传变异不会混淆结果。我们使用转凝蛋白1，显示出它在其它癌症中下调(Chang等，2001，Shields等，2002)，作为与Pspu43表达的比较。
方法
组织
从Cancer Society Tissue Bank(Christchurch，New Zealand)获得组织活检。从向组织银行捐献材料的所有患者获得书面同意，并从Cancer SocietyTissue Bank Governing Board and The Lower South Regional Ethics Committee(“Development of non-invasive，Diagnosis and prognostic tests of Prostatecancer”LRS/05/05/016)获得对此项目的特别认可。以冷冻组织块(block)提供组织，在从患者取出后，所述组织块已经在15-30分钟内于液氮中速冻。表11和12中给出了组织和相应的患者细节。所有肿瘤都是前列腺腺癌组织型的，并且都显示出神经周侵入。
表11：组织和患者细节
 
ID 年龄 N或T Gleason级别   肿瘤最大尺寸mm       肿瘤的％vol       淋巴/血管侵入          坏死 结节中Mets＊
5 F6 60 正常 无
5 F8 60 肿瘤 6 25 无
9 B3 70 正常
9 B4 70 肿瘤 6 30
9 F5 70 正常
9 F6 70 肿瘤 6 25 有
14 B9 71 正常 1/5
14 C1 71 肿瘤 9 85 有 1/5
14 D1 49 正常
14 D2 49 肿瘤 7 80 +/-
37 i9 67 正常 无 0/12
38 A1 67 肿瘤 7 20 无 无 0/12
38 A3 63 正常 20 有 0/5
38 A4 63 肿瘤 8 20 10 有 有 0/5
38 F1 66 正常 无 0/14
38 F2 66 肿瘤 7 30 无 无 0/14
42 B1 63 正常 20 无 0/11
42 B2 63 肿瘤 7 20 无 无 0/11
 
43C3 62 正常 25 无 0/2
43C4 62 肿瘤 7 25 20 +/- 无 0/2
*淋巴结转移
表12：病理学详情
 
ID 病理学详情
5 F6/5 F8 产自左叶的高中度(well-moderately)分化的前列腺腺癌，其邻近从组织银行取的新鲜材料。Gleason级别2+4(得分＝6)                                                        
9 B3/9 B4 1级水平囊状(capsular)侵入，边缘阴性。该肿瘤涉及约30％的腺体积，并涉及在右侧有尿道周分布的左叶和右叶。                                                            
9 F5/9 F6 前列腺腺癌，Gleason得分6，2级水平囊状侵入，涉及精囊。肿瘤涉及25％的腺体体积。存在淋巴血管侵入                                                                
14 B9/14 C1 在切除边缘存在
14 D1/14 D2 2级水平囊状】散布(spread)。双叶大部分被肿瘤浸润
37 i9/38 A1 无描述
38 A3/38 A4 不受限的(non-confined)3级水平，在病灶(focall)
38 F1/38 F2 受限的2级水平
42 B1/42 B2 2级水平，受限的
43 C3/43 C4 不受限的，确立3级水平。癌是部分乳头瘤性的。面积提示但不诊断血管侵入。PSA＝21
RNA分离
将所述前列腺组织块的每一块封固(mount)在OCT(Lab Tek products，Tennessee，USA)的Cryomould中。然后切片组织来制备RNA。所取的第一份和最后一份切片由8μm的切片组成，它们被封固在玻片上。此玻片被储存在-80℃，并用作组织学参照，如果需要的话。在第一份和最后一份切片之间，切割10片60μm切片，并置于半加仑瓶(pottle)中。
将4μl的TriZol(Invitrogen，Carlsbad，USA)加入半加仑瓶中，并立即将所述切片匀质化30秒。将匀浆物(homogenate)转移到15ml离心管(falcontube)中，然后加入1.5ml氯仿。将匀浆物涡旋震荡15秒，并立即置于冰上。然后将这些匀浆物在4000rpm于4℃离心15分钟。将顶层转移到干净的管中，再用1ml氯仿重提取，在4000rpm于4℃重复离心15分钟。再收集顶层并转移到新的管中。在剧烈涡旋震荡所述样本时加入0.53体积的100％乙醇。然后将全部核酸/乙醇混合物转移到与多头抽真空装置(vacuum manifold)连接的Rneasy柱(Qiagen，Germany)中，并应用真空装置。然后用700μl RW1洗涤缓冲液洗涤带有结合核酸的该柱，之后再次应用真空装置。然后在真空从柱中抽出500μl的洗涤缓冲液RPE。拆下该柱，然后通过在8000rpm离心15-30秒来干燥该柱。将该柱置于新的1.5ml离心管中，向该柱加入30μl水，然后在8000rpm再离心15-30秒。将30μl流出(flow through)体积再加回柱顶端，然后在8000rpm再离心该单位15-30秒。此柱洗脱物含有从每个组织块获得的每组10片60μm切片所提取的RNA。通过用Nanodrop分光计测定光密度及260/280比率，并也用Experion Bio-analyzer芯片系统(Bio-Rad，California，USA)电泳，来测试回收RNA的品质。在-80℃储存RNA备用。
cDNA合成
将1μl的5μg/μl Random Hexamers(Roche，Switzerland)加入600ng的RNA。将此混合物加热到95℃ 5分钟，之后在25℃ 5分钟。然后将样本转移到冰上。将4μl First链缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，USA)、每种2.5mM的4μl dNTP、2μl 0.1M DTT、0.5μl 40U/μl Rnase抑制剂(Invitrogen，Carlsbad，USA)及1μl 200U/μl Superscript II(Invitrogen，Carlsbad，USA)的分层混合物(cocktail)加入所述RNA，并通过吸排(pipetting)混合。在42℃温育120分钟，之后在70℃温育10分钟，再在80℃温育1分钟。
用Qiagen PCR cleanup柱(Qiagen，Germany)清洗所述cDNA。将80μl水和500μl的PB缓冲液加入20μl的cDNA合成反应物(reaction)。通过Qiagencleanup柱在12000rpm离心它1分钟。弃流出物，并通过在12000rpm离心750μl PE缓冲液1分钟来洗涤含有结合cDNA的柱。然后通过在12000rpm离心1分钟来干燥该柱。将该柱转移到新的洗脱物收集器，并加入40μl水。通过在8000rpm离心1分钟来从该柱洗脱cDNA。将第二份40μl的等份体积(aliquot)加入所述柱，并重复离心步骤。将干净的洗脱的cDNA样本储存在-80℃备用。
qPCR
将cDNA稀释到7.5ng/μl的浓度，并将2×5μl等份体积的每种样本吸量到96 opti-孔板的孔中。也将RNA样本稀释到7.5ng/μl，并将1份5μl等份体积吸量到96孔板的孔中。做无模板对照来检测PCR污染，并将复制的标准曲线cDNA加入每个96孔板。向每个样本加入合适的探针/引物混合物，或加入SYBR green(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)和qPCRmaster mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。密封、混合然后简单离心所述板，来确保内容物已收集到每个孔的底部。在ABI7000机器(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)上进行qPCR。
表13中给出了引物和探针组。用两个系统来测量RNA转录物的水平。在通过解离分析检测单一产物时，用SYBR green作为非特异性的中间螯合的(inter-chelating)染料来检测DNA扩增。在解离分析中存在多条带时，用双标记的Taqman探针来提供扩增子区分。根据生产商的方案以96孔模式使用每个系统。用来自Applied Biosystems，California，USA的SDS软件包(1.2.3版)分析结果。
表13：用于qPCR的引物和探针
 
靶 正向 探针 反向
Pspu43 5’GGCTCTAGGTCTGGACTCTTGGT3’ (5’FAM)TGCTCTGTCCCCACACTAAGCCAGG(3’DABCYL)   5’CCTGACTATGTACACAAGCCCAGAT3’
Pspu8 5’GGCTGGGCCTGCTTCTGT3’     (5’FAM)CTCAACGTCCTCAGCATTGGATGTGC(3’DABCYL)  5’GCGGAGCATACGGTGGAA3’      
Pspu2 5’CCCTGTATGAAATACTAAGAGGAGTCCTT3’       (5’FAM)CGGACATGAAAGGACACTAGACAAATCCACA(3’DABCYL)            5’CTATCGTTTATATTTGCCTATGTAGTTACTTCAC3’   
Pspu1 5’TGGCTGTTACCTGCTCTTTCAC3’ (5’FAM)AGCTATCTTGCCACTGCAGACTCAGCAGT(3’DABCYL  5’CAGGAGGGCTGAGGTACTGTGT3’  
转凝蛋白1(T1)      5′AAGAATGATGGGCACTACCG3′ SYBR Green 5′ACTGATGATCTGCCGAGGTC3′    
转凝蛋白2(T2)      5’CTTCCAGAACTGGCTCAAGG3’   SYBR Green 5’GAGAAGAGCCCATCATCTCG3’  
结果和讨论
从每对匹配的来自前列腺的肿瘤和正常样本提取RNA，所述前列腺来自进行了前列腺切除术的个体。从每份提取物获得的RNA的平均量为586ng/μl，260/280比率在1.77到2之间。
最初，用来自PC3前列腺癌细胞系(ATCC CRL 1435，Virginia，USA)的cDNA使针对每个引物/探针组合的qPCR反应物达到最适。如解离峰分析测定，用SYBR green技术的分析法对T1和T2合适，但不适合任何Pspu转录物分析法(图2)。因此，要为Pspu候选物设计与TaqMan qPCR系统一起使用的引物/探针对。
用绝对定量方法来测定每份样本中的转录物量。从通用标准的多个稳定细胞系产生的标准曲线，对每个引物/探针对显示了0.9998到0.9932的R2值(图3)。图4给出了对每个样本对的未经处理的总CT值。计算一式两份qPCR反应物的CT的标准偏差，且图4对每份样本给出了+/-1标准偏差。然后从平均CT计算转录物cDNA的相对浓度，并从标准曲线计算对应的cDNA值。然后校正此值的基因组DNA污染，这是通过从仅有RNA的qPCR反应物测定相对cDNA浓度，并从用转录cDNA的qPCR获得的值减去该值。图5给出了来自每个组织对的每个标记物的经校正的相对cDNA定量。表14给出了数据汇总，以及每个患者的肿瘤的Gleason级别。
表14：前列腺肿瘤样本：来自10个个体的正常和患病组织的匹配成对样本(qPCR)
 
患者 T1 T2 Pspu1 Pspu2 Pspu8 Pspu43 Gleason
5 F6/5 F8 < <ns < < <ns < 9
9 B3/9 B4 < < > <ns ns <ns 7
9 F5/9 F6 < >ns <ns >ns >ns > 7
14 B9/14 C1 < > > < > > 8
14 D1/14 D2 < <ns <ns > < > 7
37 i9/38 A1 < < < > < > 7
38 A3/38 A4 < < >ns > >ns > 7
38 F1/38 F2 >ns >ns >ns >ns > >ns 6
42 B1/42 B2 < <ns > > >ns > 6
43 C3/43 C4 < >ns <ns <ns < <ns 6
得分 1/9 4/6 5/5 6/4 5/5 7/3
<＝肿瘤相对正常的下降
>＝肿瘤相对正常的上升
ns＝正常和肿瘤的无统计学显著性的差异
得分＝肿瘤上升/肿瘤下降。
从这些结果显示，所有标记物在正常和肿瘤组织中都作为RRNA转录物来表达。通常，较少的T1转录物存在于肿瘤组织中，而Pspu43转录物增加(在肿瘤比正常组织中Pspu43升高的显著相关性(P＝0.0055)为×3列联表(contingency table)，费希氏(Fisher’s)精确检验)。T1丢失与在其它癌症的发现一致(Chang等，2001，Shields等，2002)，并与细胞支架完整性的丧失和转移相对应。
Pspu43在Gleason级别在6到8之间的所有肿瘤相对正常样本上调，其中所有样本取自每份样本之间的差异超过标准误差的每个个体。在最严重的损伤(14B9/C1，Gleason 9)中，在前列腺的正常部分中有相对较多的Pspu43标记物。令人质疑的是，反映前列腺作用正常的此‘正常的’样本给出了此特定器官(85％涉及该腺体)内疾病的范围，且这可代表该疾病的晚期性质。很可能Gleason级别9的肿瘤的转录体特征显著不同于该疾病不太严重的形式。
在标记物Pspu1、Pspu2、Pspu8或T2的表达中没有见到公开一致的类型。因此，尽管我们的生物信息算法鉴定了Pspu标记物1，2和8，我们不能证明它们能够在此试验中区分肿瘤和正常的前列腺。
结论
此试验显示，无论疾病状态如何，转凝蛋白1和2以及Pspu1、2、8和43都表达在前列腺组织中。标记物T2、Pspu 1、Pspu2或Pspu8没有显示公开的癌症分化表达类型。然而，T1显示在肿瘤组织中下调，这与他人对于肺癌、乳腺癌和结肠癌的发现相一致(Chang等，2001，Shields等，2002)。反过来，Pspu43显示在肿瘤组织中比正常样本上调。这是显著的。我们知道第8号染色体的此区域在很多男性的早期疾病过程中发生改变。这些结果表明Pspu43升高会提示患有前列腺癌。
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序列表
<110>ASSINDER，Stephen J
     STANTON，Jo-Ann L
<120>诊断方法和标记物
<130>516938 TVG
<150>60/811,407
<151>2006-06-09
<160>35
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>368
<212>DNA
<213>Pspu1
<400>1
Figure A200780029465D00731
<210>2
<211>394
<212>DNA
<213>Pspu2
<220>
<221>misc_feature
<222>(143)..(143)
<223>＂N＂可以是＂A＂或什么也不是
<400>2
Figure A200780029465D00732
<210>3
<211>392
<212>DNA
<213>Pspu43
<400>3
<210>4
<211>1320
<212>DNA
<213>Pspu8
<220>
<221>misc_feature
<222>(1021)..(1021)
<223>s可以是C或G，w可以是A或T，而k可以是T或G
<400>4
Figure A200780029465D00751
<210>5
<211>1906
<212>DNA
<213>PSA
<400>5
Figure A200780029465D00752
Figure A200780029465D00761
<210>6
<211>3922
<212>DNA
<213>PCA3/DD3
<400>6
Figure A200780029465D00771
Figure A200780029465D00781
<210>7
<211>1574
<212>DNA
<213>转凝蛋白1
<400>7
Figure A200780029465D00782
Figure A200780029465D00791
<210>8
<211>1360
<212>DNA
<213>转凝蛋白2
<400>8
Figure A200780029465D00792
<210>9
<211>130
<212>PRT
<213>正向读诓1
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
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<220>
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<220>
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<220>
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<223>Xaa表示终止密码子
<400>9
Figure A200780029465D00801
<210>10
<211>130
<212>PRT
<213>正向读诓2
<220>
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<400>10
Figure A200780029465D00821
<210>11
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<220>
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<220>
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<223>Xaa表示终止密码子
<400>11
Figure A200780029465D00831
<210>12
<211>130
<212>PRT
<213>反向读诓1
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<400>12
Figure A200780029465D00841
<210>13
<211>130
<212>PRT
<213>反向读诓2
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(129)..(129)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(130)..(130)
<223>Xaa表示终止密码子
<400>13
Figure A200780029465D00851
<210>14
<211>130
<212>PRT
<213>反向读诓3
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa表示终止密码子
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(57)..(57)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(64)..(64)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(70)..(70)
<223>Xaa表示终止密码子
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(93)..(93)
<223>Xaa表示终止密码子
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(107)..(107)
<223>Xaa表示终止密码子
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(108)..(108)
<223>Xaa表示终止密码子
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(110)..(110)
<223>Xaa表示终止密码子
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(113)..(113)
<223>Xaa表示终止密码子
<400>14
Figure A200780029465D00861
Figure A200780029465D00871
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>Pspu1正向引物
<400>15
Figure A200780029465D00872
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>Pspu1反向引物
<400>16
Figure A200780029465D00873
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>Pspu2正向引物
<400>17
Figure A200780029465D00874
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>Pspu2反向引物
<400>18
Figure A200780029465D00875
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>Beta-actin正向引物
<400>19
Figure A200780029465D00876
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>Beta-actin反向引物
<400>20
Figure A200780029465D00877
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>Pspu8正向引物
<400>21
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>Pspu8反向引物
<400>22
Figure A200780029465D00882
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>Pspu43正向引物
<400>23
<210>24
<211>23
<212>DNA
<213>Pspu43反向引物
<400>24
Figure A200780029465D00884
<210>25
<211>238
<212>PRT
<213>PSA氨基酸序列
<400>25
Figure A200780029465D00885
Figure A200780029465D00891
<210>26
<211>201
<212>PRT
<213>转凝蛋白1氨基酸序列
<400>26
<210>27
<211>199
<212>PRT
<213>转凝蛋白2氨基酸序列
<400>27
Figure A200780029465D00902
Figure A200780029465D00911
<210>28
<211>329
<212>DNA
<213>EST 1
<400>28
Figure A200780029465D00912
<210>29
<211>312
<212>DNA
<213>EST 2
<400>29
Figure A200780029465D00913
<210>30
<211>329
<212>DNA
<213>EST 3
<400>30
<210>31
<211>373
<212>DNA
<213>EST 4
<400>31
Figure A200780029465D00922
<210>32
<211>421
<212>DNA
<213>EST 5
<400>32
Figure A200780029465D00923
<210>33
<211>296
<212>DNA
<213>EST 6
<400>33
Figure A200780029465D00924
<210>34
<211>51
<212>PRT
<213>PCA 3A氨基酸序列
<400>34
Figure A200780029465D00931
<210>35
<211>51
<212>PRT
<213>PCA 3B氨基酸序列
<400>35
Figure A200780029465D00932

Claims (92)

1.分离的核酸分子，包含SEQ ID NO：3的序列或其功能等同片段或变体，或在严谨条件与SEQ ID NO：3或其片段或变体杂交的序列。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其与SEQ ID NO：3具有70％，优选75％，优选80％，优选90％，优选95％，优选99％的序列同一性。
3.分离的核酸分子，其包含权利要求1的核酸序列优选SEQ ID NO：3的至少10个核苷酸的片段，或其互补物，该片段或互补物在严谨条件与下述序列杂交：
(a)权利要求1的核酸序列，优选SEQ ID NO：3，或其互补物；
(b)与权利要求1的核酸序列或其互补物对应的cDNA的全长编码序列；
(c)(a)或(b)的反向互补物。
4.权利要求1-3任一项所述的核酸分子，其长度为至少20，至少30，至少40，至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，至少70个核苷酸，至少80个核苷酸，至少90个核苷酸，或优选至少100个核苷酸。
5.基因构建体，其包含权利要求1-4任一项所述核酸分子。
6.权利要求5的基因构建体，其为表达构建体。
7.载体，其包含权利要求6的基因构建体。
8.宿主细胞，其包含根据权利要求5-7任一项所述基因构建体或载体。
9.分离的多肽，其由权利要求1-4任一项所述核酸分子或其功能等同变体或片段编码。
10.权利要求9的分离的多肽，其长度为至少5个氨基酸。
11.分离的多肽，其包含(a)SEQ ID NO：9，(b)SEQ ID：10，(c)SEQ IDNO：11，(d)SEQ ID NO：12，(e)SEQ ID NO：13，或(f)SEQ ID NO：14的序列；或(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)的功能等同变体或片段，或在严谨条件与(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)任一项杂交的序列。
12.权利要求9-11任一项所述分离的多肽，其中所述多肽与权利要求9-11任一项所述多肽具有至少：70％，优选75％，优选80％，优选85％，优选90％，优选95％，优选99％的氨基酸同一性。
13.抗体，其特异性结合权利要求9-12任一项所述多肽或所述多肽的功能等同变体或片段。
14.根据权利要求13的抗体，其为多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体或人源化抗体，或其免疫活性片段。
15.根据权利要求14的抗体，其为单克隆抗体。
16.权利要求13-15任一项所述抗体，其标记了可检测标记物。
17.重组制备根据权利要求9-12任一项所述多肽的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)培养包含权利要求5或6的基因构建体的宿主细胞，其能够表达权利要求9-12任一项所述多肽；和
(b)选择表达本发明多肽的细胞；
(c)从所述细胞分离所表达的多肽；并可选
(d)纯化所表达的多肽。
18.权利要求17的方法，其中所述方法包括预先用所述构建体转染所述宿主细胞的步骤。
19.阵列，包含结合PSPU43(SEQ ID NO：3)的一或多个核酸序列。
20.阵列，其包含一或多个权利要求1-4任一项所述核酸序列。
21.权利要求19或20的阵列，其还包含一或多个结合转凝蛋白1(SEQ ID NO：7)的核酸序列。
22.权利要求19-21任一项所述的阵列，其还包含一或多个结合转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)的核酸序列。
23.权利要求19-22任一项所述的阵列，其还包含一或多个结合PCA3(SEQ ID NO：6)的核酸序列。
24.权利要求19-23任一项所述的阵列，其还包含一或多个结合前列腺特异性抗原(PSA)(SEQ ID NO：5)的核酸序列。
25.权利要求19-24任一项所述的阵列，其中所述核酸序列为RNA。
26.权利要求19-25任一项所述的阵列，其中所述核酸序列为DNA。
27.筛选改变权利要求1-4任一项所述核酸分子的表达的化合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)使表达所述核酸分子的细胞与被测化合物接触；
(b)测定所述核酸分子的表达水平；和
(c)选出化合物，与在所述被测化合物不存在时的水平相比，其改变了表达水平。
28.权利要求27的方法，其中所述核酸分子为PSPU43(SEQ IDNO：3)。
29.筛选改变权利要求1-4任一项所述核酸分子的活性的化合物的方法，该方法包括：
(a)将被测化合物与由所述核酸分子编码的肽接触；
(b)检测所述肽的生物活性；和下列任一步骤：
(c)选出化合物，与在该化合物不存在时检测的生物活性相比，该化合物改变所述肽的生物活性；或
(d)选出结合所述肽的化合物。
30.权利要求29的方法，其中所述核酸分子为PSPU43(SEQ IDNO：3)。
31.改变权利要求1-4任一项所述核酸分子的表达或活性的化合物，所述核酸分子优选PSPU43(SEQ ID NO：3)，所述化合物由权利要求27-30任一项所述筛选方法选出。
32.权利要求31的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防前列腺上皮内瘤(PIN)或前列腺癌(PRC)。
33.PIN或PRC表达图谱，其包含包括权利要求1-4任一项所述核酸分子的标记物的表达模式。
34.根据权利要求33的图谱，其中所述核酸分子为PSPU43(SEQ IDNO：3)。
35.根据权利要求33或34的图谱，其还包含选自PCA3(SEQ IDNO：6)、转凝蛋白1(SEQ ID NO：7)、转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)和PSA(SEQID NO：5)的一或多种标记物。
36.根据权利要求33-35任一项所述图谱，其包含标记物PSPU 43(SEQ ID NO：3)、PCA3(SEQ ID NO：6)、转凝蛋白1(SEQ ID NO：7)、转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)和PSA(SEQ ID NO：5)。
37.治疗或预防患者的PIN或PRC的方法，所述方法包括改变患者中权利要求1-4任一项所述核酸分子的表达水平，或改变权利要求9-12任一项所述多肽的活性。
38.权利要求37的方法，其中所述核酸分子为PSPU43(SEQ IDNO：3)。
39.权利要求37或38的方法，其中通过给患者施用反义组合物、siRNA组合物、或核酶组合物来抑制表达，所述组合物包含权利要求1所述核酸分子的一或多个互补核苷酸序列。
40.权利要求39的方法，其中所述核酸分子为PSPU43(SEQ IDNO：3)。
41.权利要求39或40的方法，其中所述组合物是疫苗。
42.权利要求37的方法，其中通过施用特异性结合权利要求9-12任一项所述多肽的抗体来抑制表达。
43.权利要求42的方法，其中所述多肽由PSPU43(SEQ ID NO：3)编码。
44.权利要求42或43的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
45.治疗或预防患者的PIN或PRC的方法，所述方法包括给所述患者施用改变权利要求9-12任一项所述多肽的表达或活性的化合物。
46.权利要求45的方法，其中所述多肽由SEQ ID NO：3编码。
47.治疗或预防患者的PIN或PRC的方法，所述患者中权利要求1所述核酸分子是过表达的，所述方法包括给所述患者施用降低由所述核酸分子编码的多肽的表达或活性的化合物。
48.权利要求47的方法，其中所述核酸分子为PSPU43(SEQ IDNO：3)。
49.组合物，其包含药物有效量的，根据权利要求1-4任一项所述核酸分子，或根据权利要求9-12任一项所述多肽。
50.组合物，其包含药物有效量的针对权利要求1-4任一项所述核酸分子的反义-寡核苷酸、核酶或siRNA。
51.权利要求49或50的组合物，其中所述核酸分子为PSPU43(SEQID NO：3)。
52.组合物，其包含药物有效量的特异性结合权利要求9-12任一项所述多肽的抗体或其片段。
53.权利要求52的组合物，其中所述多肽由SEQ ID NO：3编码。
54.组合物，其包含药物有效量的由权利要求27-30任一项所述筛选方法选出的化合物。
55.权利要求49-54任一项所述组合物，还包含可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
56.治疗或预防患者的PIN或PRC的方法，所述方法包括给需要的患者施用有效量的权利要求31的化合物或49-55任一项所述组合物。
57.PSPU43(SEQ ID NO：3)或其编码的多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防患者的PIN或PRC。
58.权利要求1-4任一项所述核酸分子或9-12任一项所述多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防患者的PIN或PRC。
59.针对权利要求1所述核酸分子的反义-寡核苷酸、siRNA或核酶。
60.针对PSPU43(SEQ ID NO：3)的反义-寡核苷酸、siRNA或核酶。
61.分析法，用于检测样本中权利要求1-4任一项所述核酸分子的存在，所述核酸分子优选PSPU43(SEQ ID NO：3)，该方法包括：
(a)将所述样本与核苷酸探针接触，该探针与权利要求1所述核酸序列在严谨杂交条件杂交；和
(b)检测样本中杂交复合物的存在。
62.权利要求61的分析法，其中所述探针是标记的探针。
63.权利要求62的分析法，其中所述探针是荧光标记的。
64.权利要求59-63任一项所述分析法，其中所述探针是SEQ ID NO：3的互补物。
65.测定患者样本中权利要求1所述核酸分子的表达水平的方法，所述核酸分子优选PSPU43(SEQ ID NO：3)，所述方法包括直接或间接测定所述核酸分子。
66.权利要求65的方法，其中所述核酸分子被用于原位杂交或RT-PCR分析中。
67.测定权利要求1所述核酸分子在患者样本中的表达水平的方法，所述方法包括：
(a)扩增所述核酸分子或其互补物的DNA序列；或
(b)扩增所述核酸分子或其互补物的cDNA序列；和
(c)测定所述样本中DNA、cDNA或RNA之一或多个的水平。
68.权利要求67的方法，其中所述核酸分子为PSPU43(SEQ IDNO：3)。
69.权利要求67或68的方法，其中所述DNA或cDNA用PCR扩增。
70.权利要求65-69任一项所述方法，其中DNA、cDNA或RNA在样本中的水平用电泳测量。
71.分析法，其用于检测权利要求9-12任一项所述多肽在患者样本中的存在，所述方法包括：
(a)使所述样本接触权利要求13-16任一项所述抗体；和
(b)检测样本中结合多肽的存在。
72.权利要求71的分析法，其中所述抗体带有可检测的标记。
73.诊断患者的前列腺上皮内瘤(PIN)、前列腺癌(PRC)或发生PIN或PRC的倾向的方法，所述方法包括测定权利要求1所述核酸分子在患者样本中的表达水平，其中与该核酸分子对照水平相比表达水平的改变表明该患者患PIN、PRC、或有发生PIN或PRC的风险。
74.权利要求73的方法，其中所述改变是表达水平升高。
75.根据权利要求74的方法，其中所述表达水平的改变是比正常对照水平高至少10％。
76.权利要求73-75任一项所述方法，其中所述对照水平是在正常前列腺样本中测定的。
77.测试患者的前列腺上皮内瘤(PIN)、前列腺癌(PRC)状态的方法，所述方法包括测定权利要求1所述核酸分子在患者样本中的表达水平，其中与所述分子的对照水平相比表达水平高，表明该患者有PIN或PRC状态、或有发生PIN或PRC的风险。
78.监测受试者对PIN或PRC治疗的反应的方法，所述方法包括测定权利要求1所述核酸分子在患者样本中的表达水平，并将所述核酸分子的水平与对照水平相比，其中测定的水平与对照水平相比统计学显著性改变表明对该治疗有反应。
79.权利要求73-78任一项所述方法，其中所述核酸分子为PSPU43(SEQ ID NO：3)。
80.权利要求73-79任一项所述的方法，其还包括测定PIN或PRC的一或多种其它标记物的水平，并将所述水平与对照中的标记物水平比较，其中所述水平与对照水平相比显著性偏差，以及权利要求1-4任一项所述核酸分子优选PSPU43(SEQ ID NO：3)的水平的统计学显著性升高，两者一起，表明PRC或PIN，或可用于监测PIN或PRC状态。
81.权利要求80的方法，其中所述其它标记物选自由转凝蛋白1(SEQID NO：7)、前列腺特异性抗原(SEQ ID NO：5)、和PCA3(SEQ ID NO：6)组成的组。
82.权利要求73-81任一项所述方法，其中所述样本是尿液、淋巴液、血液、血浆、精液、前列腺按摩液、或前列腺组织样本。
83.权利要求73-82任一项所述方法，其中转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)被用作参比标记物。
84.转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)在权利要求73-82任一项所述方法中作为参比标记物的用途。
85.检测样本中权利要求1-4任一项所述核酸分子的存在的试剂盒，所述核酸分子优选PSPU43(SEQ ID NO：3)，所述试剂盒包含至少一个容器，所述容器中容纳权利要求1-4任一项所述核酸分子。
86.权利要求85的试剂盒，还包含一或多种用于检测所述核酸分子的试剂。
87.试剂盒，其包含一或多种与权利要求1所述核酸分子或由所述核酸分子编码的多肽结合的检测试剂，所述核酸分子优选PSPU43(SEQ ID NO：3)。
88.权利要求85-87任一项的试剂盒，其还包含下列一或多项：
(a)编码转凝蛋白1(SEQ ID NO：7)的核酸分子或其互补物；
(b)编码转凝蛋白2(SEQ ID NO：8)的核酸分子或其互补物；
(c)编码PCA3(SEQ ID NO：6)的核酸分子或其互补物；和
(d)编码PSA(SEQ ID NO：5)的核酸分子或其互补物。
89.权利要求88的试剂盒，其包含(a)，(b)，(c)和(d)。
90.非人动物，其具有的基因组中权利要求1的核酸分子被改变、破坏、消除或添加。
91.权利要求90的动物，其为小鼠。
92.权利要求90或91的动物，其中所述核酸分子为PSPU43(SEQ IDNO：3)。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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