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CN101535341A - 人glp-1模拟体、组合物、方法和用途 - Google Patents

人glp-1模拟体、组合物、方法和用途 Download PDF

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CN101535341A CNA2007800342628A CN200780034262A CN101535341A CN 101535341 A CN101535341 A CN 101535341A CN A2007800342628 A CNA2007800342628 A CN A2007800342628A CN 200780034262 A CN200780034262 A CN 200780034262A CN 101535341 A CN101535341 A CN 101535341A
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K·T·奥奈尔
K·皮查
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Centocor Ortho Biotech Inc
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Abstract

本发明涉及至少一种改进的人GLP－1模拟体(mimetibody)或特定部分或变体，包括编码至少一种GLP－1模拟体或特定部分或变体的分离核酸、GLP－1模拟体或特定部分或变体、载体、宿主细胞、转基因动物或植物及其制备和使用方法，还包括治疗组合物、方法和装置。

Description

人GLP-1模拟体、组合物、方法和用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年7月18日申请的美国临时申请顺序号60/831,704权益的优先权。上述有关美国专利申请的全部公开内容通过引用结合到本文用于所有目的。
发明背景
发明领域
[0001]本发明涉及对生物活性蛋白、片段或配体有特异性的改进的哺乳动物GLP-1模拟体(mimetibody)、特定部分和变体、GLP-1模拟体编码核酸和互补核酸、宿主细胞及它们的制备和使用方法，包括治疗制剂、给药和装置。
相关技术
[0002]重组蛋白是一类新兴的治疗药物。这种重组治疗药在蛋白质制剂和化学修饰方面已取得进展。这种修饰有可能通过例如延长半衰期(例如通过阻断其暴露于蛋白水解酶中)、提高生物活性或减少有害副作用，来提高治疗性蛋白的治疗功效。一种这样的修饰是利用与受体蛋白融合的免疫球蛋白片段，例如enteracept。还曾利用Fc结构域构建了治疗性蛋白质，以期提供较长半衰期或整合功能，例如Fc受体结合、A蛋白结合和补体结合。
[0003]糖尿病是一种正在蔓延的流行病，据估计，到2025年将影响3亿多人，但却没有有效的药物治愈方法。2型糖尿病占所有病例的90-95％。由血浆葡萄糖水平持续升高导致的并发症包括心血管疾病、肾病、神经病和视网膜病。另外，在2型糖尿病晚期，由于胰腺β细胞死亡而导致停止分泌胰岛素。糖尿病的现行疗法与包括低血糖症和体重增加在内的多种有害副作用有关。另外，2型糖尿病的现行疗法无法治愈该病，仅仅只是延长患者需要胰岛素疗法的时间。
[0004]胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种37个氨基酸的肽，在口服葡萄糖激发后由肠L细胞分泌。随后在第6和第7位之间进行的内源切割产生了有生物活性的GLP-1(7-37)肽。GLP-1(7-37)肽序列可分成2个结构域。该肽的氨基端结构域参与信号转导，而该肽的其余部分似乎与呈螺旋构象的GLP-1受体的胞外环结合。在响应葡萄糖时，活性GLP-1与胰腺的GLP-1受体结合，引起胰岛素分泌增加(促胰岛素作用)。另外，已经证实，GLP-1减缓胃排空，这就降低了葡萄糖释放到循环中的量并可减少食物摄取。这些作用联合起来降低了血糖水平。同样已证实，GLP-1抑制细胞凋亡，增加胰腺的β细胞增殖。因此，GLP-1是一种颇具吸引力的活性治疗药，用于降低糖尿病患者的血糖并对其胰腺的β细胞有保护作用。另外，GLP-1活性受到血糖水平的控制。当血糖水平降低至某一阈值水平时，GLP-1便没有活性。因此，不存在与涉及GLP-1治疗有关的低血糖症的风险。
[0005]临床上已经证实了GLP-1疗法的持久性。在2型糖尿病患者中，GLP-1输注六周有效降低空腹血糖水平和8小时平均血糖水平。GLP-1疗法还导致β细胞功能的改善。艾塞那肽(Exenatide)是一种GLP-1类似物，目前正在做临床试验。艾塞那肽最初是在大毒蜥(gilamonster)唾液中鉴定出来的，与GLP-1有53％同一性。艾塞那肽可与GLP-1受体结合，并启动信号转导级联，该信号转导级联负责起因于GLP-1(7-37)的多种活性。迄今为止，已经证实艾塞那肽降低2型糖尿病患者的HbA1c水平和血清果糖胺水平。另外，在健康志愿者中，延迟胃排空，抑制食物摄取。
[0006]然而，蛋白酶二肽基肽酶IV(DPP-IV)使GLP-1在体内快速失活。因此，涉及GLP-1肽的疗法的实用性受其快速清除和较短半衰期的限制。例如，GLP-1(7-37)的血清半衰期仅有3-5分钟。当皮下给药时，GLP-1(7-36)酰胺的作用时间约为50分钟。即使对内源蛋白酶切割有抗性的类似物和衍生物也没有足够长的半衰期以避免在24小时时间内重复给药。例如，艾塞那肽是抗DPP-IV的，但由于其半衰期短，体内药代动力学特征尤其变化不定，因此仍需要每天两次餐前给药。NN2211，另一种目前正在做临床试验的化合物，是一种脂质化GLP-1类似物。预期每日用药一次。
[0007]在需要较长时间内维持药物高血液水平的情况下，治疗药物的快速清除十分不利，因为必然需要重复给药。此外，长效化合物对于过往治疗方案仅包括口服药物的糖尿病患者特别重要。这些患者常常对过渡到包括多次药物注射的方案感到极为困难。比起其它GLP-1肽和研发中的化合物，半衰期延长的GLP-1疗法具有明显的优势。
[0008]因此，需要提供改进和/或修饰形式的GLP-1治疗性蛋白质，它能克服上述多个难题和本领域已知的其它难题。模拟体技术为肽治疗药物提供了新的递药平台。GLP-1模拟体可提供以持续方式递送GLP-1肽的方法，这就提供了优于现行研发中的GLP-1肽的改进方面。此外，根据其二聚体结构及其组织分布特征，对于胰岛素分泌、β细胞维持和食物摄取而言，GLP-1模拟体可具有区别特征。
发明概述
[0009]按照本文所描述的和/或本文所提供的方法，结合本领域已知方法，本发明提供改进的人GLP-1模拟体，包括修饰的免疫球蛋白、裂解产物和其它特定部分及其变体，本发明还提供GLP-1模拟体组合物、编码核酸或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、制剂、装置、转基因动物、转基因植物及其制备和使用方法。
[0010]优选通过将O-联糖基化位点(例如但不限于Val-Xaa-Ser)改变成为N-联糖基化位点(例如但不限于Asn-Xaa-Ser或Gln-Xaa-Ser)，来改进这种GLP-1模拟体的表达、纯化和/或稳定性。本发明为GLP-1CH1缺失模拟体(GLP-1CH1deleted mimetibody)(例如丙氨酸)提供这样的改进，即O-糖基化位点例如但不限于序列Val-Xaa-Ser可被N-糖基化位点(例如Asn-Xaa-Ser或Gln-Xaa-Ser)取代，优选可以是例如但不限于如序列表中给出的下列残基上所进行的取代：Val-Xaa-Ser(O-糖基化位点)在下列序列位点上变成N-糖基化位点Asn-Xaa-Ser：SEQ ID NO：2、4、7-14的44位，SEQ ID NO：43、45的64位，SEQ ID NO：44、46和51的82位；SEQ ID NO：48、50、53-55的88位，SEQ ID NO：47的89位，SEQ ID NO：49的90位；SEQ IDNO：56和63的103位和/或185位；或SEQ ID NO：60和61的39位；SEQ ID NO：64的79位或本文公开的或本领域已知的任何其它合适位点。
[0011]本发明还提供至少一种如本文所描述和/或本领域已知的分离的GLP-1模拟体或特定部分或变体。GLP-1模拟体可任选包含至少一个CH3区、至少一个CH2区、至少一个铰链区的至少一个部分或其片段(H)、至少一个部分可变区(V)、任选的接头序列(L)和至少一个GLP-1治疗性肽(P)，其中至少一个CH3区与至少一个CH2区直接连接，至少一个CH2区与至少一个铰链区的至少一个部分或其片段(H)直接连接，至少一个铰链区的至少一个部分或其片段(H)与至少一个部分可变区(V)直接连接，至少一个部分可变区(V)与任选的接头序列(L)直接连接，任选的接头序列(L)与至少一个GLP-1治疗性肽(P)直接连接。
[0012]在一个优选的实施方案中，本发明提供一对CH3-CH2-铰链区-部分V区序列-接头序列-治疗性肽序列，这一对任选通过缔合或共价键连接起来，例如但不限于至少一个Cys-Cys二硫键或至少一个CH4或其它免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，GLP-1模拟体包含式(I)：
(P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
[0013]其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一个接头序列，它可以是通过使模拟体具有选择性方向和结合特性从而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，该GLP-1模拟体模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE或其任何亚类等，或其任何组合。
[0014]抗体序列的可变区可以是但不限于SEQ ID NO：47-55中至少一个的至少一部分或者表1或SEQ ID NO：47-64中所示其片段，还任选包含至少一个取代、插入或缺失，详见2004年6月24日申请并于2005年1月20日公布的PCT公开文本WO05/05604(PCT/US04/19898)中的图1-9，其对应于SEQ ID NO：1-9。CH2、CH3和铰链区可以是但不限于SEQ ID NO：56-64中至少一个的至少一部分或者表1中所示其片段，还任选包含至少一个取代、插入或缺失，详见2004年6月24日申请并于2005年1月20日公布的PCT公开文本WO05/05604(PCT/US04/19898)中的图32-40，其对应于SEQ IDNO：32-40。
[0015]因此，本发明的GLP-1模拟体模拟抗体或免疫球蛋白结构或功能的至少一部分并具有其固有特性和功能，同时提供GLP-1治疗性肽及其固有或获得的体外、体内或原位特性或活性。可按本文所述方法并结合本领域已知方法，改变抗体的不同部分和本发明GLP-1模拟体的治疗性肽部分。
[0016]本发明还提供至少一种分离的GLP-1模拟体或特定部分或变体，其具有至少一种活性，例如但不限于如本文所描述或本领域已知的至少一种生物活性GLP-1肽或多肽(相当于式(I)中的P部分)的已知生物活性。
[0017]一方面，本发明提供至少一种分离的人GLP-1模拟体，其包含SEQ ID NO：1的至少一个多肽序列，或者任选具有一个或多个如本文所描述或如本领域已知的取代、缺失或插入。另一方面，本发明的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体模拟至少一种GLP-1肽或多肽(相当于式(I)中的模拟体P部分)与至少一个表位的结合，该表位包含至少一种配体的至少1-3个氨基酸至完整氨基酸序列，该配体例如但不限于GLP-1受体或其片段，其中该配体与SEQ ID NO：1的至少一部分结合，或者任选具有一个或多个如本文所描述或如本领域已知的取代、缺失或插入。至少一种GLP-1模拟体可任选与GLP-1受体结合，其结合亲和力为至少10-7M、至少10-8M、至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M。因此，可按照已知方法筛选GLP-1模拟体的相应活性，例如但不限于针对受体或其片段的结合活性。
[0018]本发明还提供抗至少一种本发明GLP-1模拟体的至少一种抗独特型抗体。抗独特型抗体或片段与至少一种本发明GLP-1模拟体特异性结合。抗独特型抗体包括含有任何蛋白质或肽的分子，该分子包含至少一部分免疫球蛋白分子，例如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区或它们的任何部分；并且竞争性结合至少一种本发明GLP-1模拟体的GLP-1配体结合区。本发明的这种独特型抗体可包括任何哺乳动物的独特型抗体或者来源于任何哺乳动物的独特型抗体，哺乳动物例如但不限于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿动物、灵长类动物等。
[0019]一方面，本发明提供包含编码至少一种GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体或其特定部分或变体(包含其至少一个特定序列、结构域、部分或变体)的多核苷酸并且与该多核苷酸互补、有显著同一性或杂交的分离核酸分子。本发明还提供包含至少一种所述分离的GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体编码核酸分子的重组载体、含有这类核酸和/或重组载体的宿主细胞以及这类GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体核酸、载体和/或宿主细胞的制备和/或使用方法。
[0020]本发明还提供编码至少一种分离的哺乳动物GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体的分离核酸、包含分离核酸的分离核酸载体和/或包含分离核酸的原核或真核宿主细胞。宿主细胞可任选为至少一种细胞，选自：COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞或其任何衍生细胞、无限增殖化细胞或转化细胞。
[0021]本发明还提供至少一种在宿主细胞内表达至少一种GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体或特定部分或变体的方法，该方法包括在其中可按可检测和/或可回收量表达至少一种GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体或特定部分或变体的条件下，按本文所述和/或本领域已知方法培养宿主细胞。本发明还提供用于生产至少一种GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体的方法，该方法包括在按可检测或可回收量体外、体内或原位表达GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体的条件下，使GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体编码核酸进行翻译。
[0022]本发明还提供用于生产本发明的至少一种分离的人GLP-1模拟体或GLP-1抗独特型抗体的方法，该方法包括提供能够按可回收量表达GLP-1模拟体或GLP-1抗独特型抗体的宿主细胞或转基因动物或转基因植物。
[0023]本发明还提供由上述方法生产的至少一种GLP-1模拟体。
[0024]本发明还提供至少一种组合物，该组合物包含(a)本文所述的分离的GLP-1模拟体或特定部分或变体编码核酸和/或GLP-1模拟体；和(b)合适的载体或稀释剂。按照已知方法，载体或稀释剂可任选为药学上可接受的。该组合物任选还可包含至少一种其它的化合物、蛋白质或组合物。
[0025]本发明还提供一种组合物，该组合物包含至少一种分离的人GLP-1模拟体和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。组合物任选还可包含有效量的至少一种化合物或蛋白质，选自以下成分的至少一种：可检测标记或报道分子、抗感染药、糖尿病或胰岛素代谢相关药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素类药物、用于体液或电解质平衡的药物、血液系统药物、抗肿瘤药、免疫调节药、眼、耳或鼻用药物、局部用药物、营养药、TNF拮抗剂、抗风湿药、肌肉松驰药、麻醉品(narcotic)、非甾体抗炎药(NTHE)、镇痛药、麻醉剂(anesthetic)、镇静药、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞药、抗微生物药物、抗银屑病药、皮质类固醇、同化激素类药(anabolic steroid)、红细胞生成素、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制药、生长激素类药、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药、β激动剂、吸入型类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
[0026]本发明还提供递送治疗或预防有效量的本发明的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的至少一种组合物、装置和/或方法。
[0027]本发明还提供至少一种GLP-1模拟体方法或组合物，用于给予治疗有效量以在细胞、组织、器官、动物或患者中和/或在相关疾病之前、之后或期间调节或治疗本领域已知和/或本文所述的至少一种GLP-1相关疾病。
[0028]本发明在方法或组合物中还提供至少一种GLP-1模拟体、特定部分或变体，当以治疗有效量给予时，和/或按需要在许多不同条件下，例如但不限于在本领域已知的相关疾病或治疗条件之前、之后或期间给予时，用于调节、治疗或减轻细胞、组织、器官、动物或患者的至少一种以下疾病的症状：代谢疾病、免疫疾病、心血管疾病、感染性疾病、恶性疾病和/或神经疾病。
[0029]本发明在方法或组合物中还提供至少一种GLP-1模拟体、特定部分或变体，当以治疗有效量给予时，按需要在许多不同条件下，例如但不限于在本领域已知的相关疾病或治疗条件之前、之后或期间给予时，用于调节、治疗或减轻至少一种以下疾病的症状：糖尿病或胰岛素代谢相关疾病、骨和关节疾病、心血管疾病、牙或口腔疾病、皮肤病、耳鼻咽喉疾病、内分泌或代谢疾病、胃肠疾病、妇科疾病、肝胆疾病、产科疾病、血液系统疾病、免疫或变应性疾病、感染性疾病、肌肉骨骼疾病、肿瘤疾病、神经疾病、营养性疾病、眼科疾病、儿科疾病、中毒性疾病、精神疾病、肾病、肺病或任何其它已知疾病(参见例如The Merck Manual，第17版，Merck ResearchLaboratories，Merck and Co.，Whitehouse Station，NJ(1999)，其内容通过引用全部结合到本文中)。
[0030]本发明还提供递送本发明的至少一种GLP-1模拟体的至少一种组合物、装置和/或方法，用于诊断GLP-1相关疾病。
[0031]本发明还提供至少一种GLP-1模拟体方法或组合物，用于在细胞、组织、器官、动物或患者中和/或在本领域已知和/或本文所述相关疾病之前、之后或期间诊断至少一种GLP-1相关疾病。
[0032]本发明还提供用于诊断或治疗细胞、组织、器官或动物的疾病的方法，该方法包括：(a)使包含有效量的本发明的至少一种分离的人GLP-1模拟体的组合物与细胞、组织、器官或动物接触，或者将包含有效量的本发明的至少一种分离的人GLP-1模拟体的组合物给予细胞、组织、器官或动物。该方法还可任选包括每0-24小时、1-7天、1-52周、1-24个月、1-30年使用有效量为0.001-50mg/千克细胞、组织、器官或动物或者其中的任何范围或数值。该方法还可任选包括通过至少一种选自以下的方式接触或给药：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注(bolus)、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮。该方法还可任选包括在所述(a)接触或给予之前、同时或之后给予至少一种包含有效量的至少一种化合物或蛋白质的组合物，其中所述化合物或蛋白质选自可检测标记或报道分子、抗感染药、糖尿病或胰岛素代谢相关药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素类药物、用于体液或电解质平衡的药物、血液系统药物、抗肿瘤药、免疫调节药、眼、耳或鼻用药物、局部用药物、营养药、TNF拮抗剂、抗风湿药、肌肉松驰药、麻醉品、非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静药、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞药、抗微生物药物、抗银屑病药、皮质类固醇、同化激素类药、红细胞生成素、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制药、生长激素类药、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药、β激动剂、吸入型类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。
[0033]本发明还提供包含本发明至少一种分离的人GLP-1模拟体的医疗装置，其中该装置适于通过至少一种选自以下的方式接触或给予至少一种GLP-1模拟体：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注(bolus)、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮。
[0034]本发明还提供用于人用药物或诊断用途的制造品，该制造品包括包装材料和容器，该容器装有溶液或冻干形式的本发明的至少一种分离的人GLP-1模拟体。该制造品可任选包括具有作为以下方式的递药装置或系统的构件的容器：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注(bolus)、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递药装置或系统。
[0035]本发明还提供本文所述的任何发明。
附图说明
[0036]图1表示IgG4支架中GLP-1模拟体(GLP-1MMB)的核苷酸和肽序列，显示SEQ ID NO：4的重要功能结构域。
[0037]图2A-2C表示GLP-1MMB的FACS结合试验。图2A表示GLP-1MMB与过量表达GLP-1R的HEK293细胞结合。灰色区域：GLP-1MMB但无二抗；灰色线：仅二抗；虚线，阴性对照MMB和二抗；黑线：GLP-1MMB和二抗。图2B表示GLP-1MMB不与对照HEK293细胞结合。灰色区域：GLP-1MMB但无二抗；黑线：仅二抗；灰色线：GLP-1MMB和二抗。图2C表示GLP-1肽类似物(A2S)能够与GLP-1MMB竞争结合过量表达GLP-1R的HEK293细胞。灰色区域：GLP-1MMB但无二抗；黑线：GLP-1MMB和二抗；间断线：GLP-1MMB、0.2nM竞争剂、二抗；虚线：GLP-1MMB、20nM竞争剂、二抗；灰色线：GLP-1MMB、100nM竞争剂、二抗)。
[0038]图3A-3E表示GLP-1MMB的cAMP测定法。图3A：IgG1支架中的野生型GLP-1MMB；图3B：GLP-1肽；图3C：IgG4(Ala/Ala，Ser->Pro)支架中的GLP-1(A2G)MMB；图3D：IgG4(Ala/Ala，Ser->Pro)支架中的GLP-1(A2S)MMB；图3E：IgG4(Ala/Ala，Ser->Pro)支架中的野生型GLP-1MMB。
[0039]图4表示GLP-1MMB对DPP-IV裂解的抗性。
[0040]图5表示GLP-1MMB在血清中的稳定性。
[0041]图6证明GLP-1MMB导致RINm细胞分泌胰岛素。图6A表示GLP-1(7-36)肽和毒蜥激动肽4(exendin-4)刺激RINm细胞释放胰岛素。图6B表示IgG1或IgG4(Ala/Ala，Ser->Pro)支架中的GLP-1(A2S)MMB或者IgG4(Ala/Ala，Ser->Pro)支架中的GLP-1(A2G)MMB具有刺激RINm细胞分泌胰岛素的活性。
[0042]图7证明GLP-1MMB以剂量依赖性方式(图7B)降低葡萄糖(图7A)。
[0043]图8表示四种GLP-1MMB(A2G、A2S、Ex-cap和野生型)在猕猴(cynomolgus monkey)中的药代动力学曲线图。
[0044]图9表示糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量试验期间GLP-1MMB的作用。
[0045]图10表示糖尿病小鼠长期给药期间GLP-1MMB对空腹血糖的作用。
[0046]图11表示糖尿病小鼠长期给药后GLP-1MMB对口服葡萄糖耐量试验的作用。
[0047]图12表示糖尿病小鼠长期给药后GLP-1MMB对减少HbA1c的作用。
[0048]图13表示正常猕猴口服葡萄糖耐量试验中GLP-1MMB对血糖(图13A)和胰岛素(图13B)水平的作用。
[0049]图14表示单剂量后GLP-1MMB对糖尿病小鼠胰岛的胰岛素染色的作用。
[0050]图15证明GLP-1MMB延迟正常狗的胃排空。
[0051]图16证明GLP-1MMB在饮食诱导的肥胖小鼠的口服葡萄糖耐量试验中降低血糖。
[0052]图17证明GLP-1MMB在糖尿病小鼠腹膜内葡萄糖耐量试验中降低血糖(图17A)和降低胰岛素水平(图17B)。
[0052.1]图18A证明大鼠INS-1E细胞中cAMP对GLP-1MMB浓度增加的反应。数据被拟合成提供EC50为8.7nM且cAMP最大分泌量为48.3nM的双曲线。
[0052.2]图18B证明大鼠INS-1E细胞中cAMP对GLP-1肽浓度增加的反应。数据被拟合成提供EC50为0.11nM且cAMP最大分泌量为46.7nM的双曲线。
[0052.3]图19证明大鼠INS-1E细胞中GLP-1MMB浓度增加时的胰岛素分泌。
[0052.4]图20A证明单剂静脉内和皮下给药(3mg/kg)后大鼠血浆中的GLP-1MMB水平。
[0052.5]图20B证明单剂静脉内给药(1mg/kg)后在猴血浆中的GLP-1MMB水平。
[0052.6]图21A证明给予GLP-1MMB的DIO小鼠中的ipGTT。
[0052.7]图21B表示由图21A所示ipGTT计算得出的曲线下面积(AUC)。
[0052.8]图21C表示得自图21B的数据拟合成提供ED50为15μg/kg的双曲线。
[0052.9]图22A和图22B表示用CNTO1996(1mg/kg)、毒蜥激动肽4(0.07mg/kg)和GLP-1MMB(1mg/kg)单剂静脉治疗的野生型(A)和GLP-1R-/-(B)小鼠中的24小时累积食物摄取。数值表示平均值±SE；对于CNTO1996治疗组*p<0.05。
[0052.10]图23A、图23B和图23C表示CNTO1996(1mg/kg)、毒蜥激动肽4(0.07mg/kg)和GLP-1MMB(1mg/kg)单剂静脉给药后野生型(A)和GLP-1R-/-(B)小鼠的葡萄糖耐量试验。(C)野生型(黑色条形柱)和GLP-1R-/-(灰色条形柱)小鼠中ipGTT试验的曲线下面积。数值表示平均值±SE；对于CNTO1996治疗组*p<0.05。
[0052.11]图24表示CNTO1996(1mg/kg)、毒蜥激动肽4(0.07
mg/kg)和GLP-1MMB(1mg/kg)治疗的野生型(黑色条形柱)和GLP-1R-/-(灰色条形柱)小鼠的胃内容物。数值表示平均值±SE；对于CNTO1996治疗组*p<0.05。
[0052.12]图25表示给予DIO小鼠静脉内单剂GLP-1MMB(1mg/kg)的不同时间点上进行的葡萄糖耐量试验。
[0052.13]图26表示DIO小鼠ipGTT所获得数据的曲线下面积(图25)。
[0052.14]图27表示给予DIO小鼠静脉内单剂(1mg/kg)后血浆中的GLP-1MMB水平。
[0052.15]图28表示单剂静脉内给予GLP-1MMB(1mg/kg)后葡萄糖耐量试验的曲线下面积对紧接葡萄糖耐量试验后的GLP-1MMB血浆浓度的函数绘制的曲线图。
发明详述
[0053]本发明提供分离、重组和/或合成的模拟体或特定部分或变体，以及组合物和编码核酸分子，其包含编码至少一种GLP-1模拟体的至少一种多核苷酸。本发明的这种模拟体或特定部分或变体包含特定的GLP-1模拟体序列、结构域、片段及其特定变体，以及所述核酸和模拟体或特定部分或变体的制备和使用方法，包括治疗组合物、方法和装置。
[0054]优选通过将O-联糖基化位点(例如但不限于Val-Xaa-Ser)改变成N-联糖基化位点(例如但不限于Asn-Xaa-Ser或Gln-Xaa-Ser)，以改进这种GLP-1模拟体的表达、纯化和/或稳定性。本发明为GLP-1CH1缺失模拟体提供这样的改进。
[0055]本发明还提供如本文所描述和/或本领域已知的至少一种分离的GLP-1模拟体或特定部分或变体。GLP-1模拟体可任选包含至少一个CH3区、至少一个CH2区、至少一个铰链区或其片段(H)、至少一个部分可变区(V)、任选的接头序列(L)和至少一个GLP-1治疗性肽(P)，其中至少一个CH3区与至少一个CH2区直接连接，至少一个CH2区与至少一个铰链区或其片段(H)直接连接，至少一个铰链区或其片段(H)与至少一个部分可变区(V)直接连接，至少一个部分可变区(V)与任选的接头序列(L)直接连接，任选的接头序列(L)与至少一个GLP-1治疗性肽(P)直接连接。
[0056]在一个优选的实施方案中，GLP-1模拟体包含式(I)：
((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
[0057]其中P是至少一种生物活性GLP-1多肽，L是至少一个接头序列，该接头序列可以是通过使模拟体具有选择性方向和结合特性从而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，m、n、o、p、q、r、s和t可独立地为0和10之间并包括0和10的整数，该GLP-1模拟体模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE或其任何亚类等，或其任何组合。
[0058]优选通过将O-联糖基化位点(例如但不限于Val-Xaa-Ser)改变成N-联糖基化位点(例如但不限于Asn-Xaa-Ser或Gln-Xaa-Ser)，以改进这种GLP-1模拟体的表达、纯化和/或稳定性。本发明为GLP-1CH1缺失模拟体提供这样的改进。
[0059]因此，本发明的GLP-1模拟体模拟具有抗体固有特性和功能的抗体结构，同时提供治疗性肽及其固有或获得的体外、体内或原位特性或活性。在其中t＝1的一个优选的实施方案中，单体CH3-CH2-铰链区-部分J序列-接头序列-治疗性肽可通过缔合或共价键(例如但不限于Cys-Cys二硫键)与其它单体连接起来。可按本文所述方法并结合本领域已知方法，改变该抗体的不同部分和至少一种本发明GLP-1模拟体的GLP-1治疗性肽部分。
[0060]CH3-CH2-铰链部分可被大量修饰，以形成本发明的变体，前提是保持与补救受体(salvage receptor)的结合。在这种变体中，可以除去一个或多个并非本发明融合分子所必需的提供结构特征或功能活性的天然位点。可通过例如取代或缺失残基、将残基插入位点或截短含该位点的部分来除去这些位点。插入或取代的残基还可以是异常氨基酸，例如模拟肽(peptidomimetics)或D-氨基酸。CH3-CH2-铰链变体可缺少一个或多个天然位点或残基，该天然位点或残基影响或参与(1)二硫键形成，(2)与选定宿主细胞的不相容性，(3)在选定宿主细胞中表达的不均匀性，(4)糖基化作用，(5)与补体相互作用，(6)与除补救受体以外的Fc受体的结合，或(7)依赖抗体的细胞毒性(ADCC)。示例性的CH3-CH2-铰链变体包括这样的分子和序列，其中：1.除去参与二硫键形成的位点。这种除去可避免在用来产生本发明分子的宿主细胞中与其它含半胱氨酸的蛋白质反应。为此目的，半胱氨酸残基可缺失或被其它氨基酸(例如丙氨酰、丝氨酰)取代。即使半胱氨酸残基被除去，单链CH3-CH2-铰链结构域仍可形成非共价地保持在一起的二聚CH3-CH2-铰链结构域；2.CH3-CH2-铰链区经修饰使得与选定的宿主细胞更相容。例如，当分子在大肠杆菌(E.coli)等细菌细胞中进行重组表达时，可除去铰链中被大肠杆菌中的消化酶(例如脯氨酸亚氨基肽酶)识别的PA序列；3.部分铰链区缺失或被其它氨基酸取代，以防止在选定宿主细胞中表达的不均匀性；4.除去一个或多个糖基化位点。通常被糖基化的残基(例如缬氨酸或天冬酰胺)可赋予细胞溶解反应。这类残基可缺失或被未糖基化残基(例如丙氨酸)取代，或者O-糖基化位点(例如但不限于序列Val-Xaa-Ser)可被N-糖基化位点(例如Asn-Xaa-Ser或Gln-Xaa-Ser)取代，优选可以是但不限于如序列表中给出的下列残基上所进行的取代：Val-Xaa-Ser(O-糖基化位点)改变成N-糖基化位点Asn-Xaa-Ser，在：SEQ ID NO：2、4、7-14的44位；SEQID NO：43、45的64位；SEQ ID NO：44、46和51的82位；SEQ ID NO：48、50、53-55的88位；SEQ ID NO：47的89位；SEQ ID NO：49的90位；SEQ ID NO：56和63的103位和/或185位；SEQ ID NO：60和61的39位；或SEQ ID NO：64的79位或本文公开的或本领域已知的任何合适的位点；5.除去参与与补体相互作用的位点，例如C1q结合位点。补体募集可能不利于本发明的分子，因此可用这种变体予以避免；6.除去影响与除补救受体以外的Fc受体结合的位点。CH3-CH2-铰链区可具有与并非本发明融合分子所必需的某些白细胞相互作用的位点，所以可除去；7.除去ADCC位点。ADCC位点为本领域所知，参见例如Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)有关IgG1中的ADCC位点。这些位点也不是本发明融合分子必需的，所以可除去。
[0061]接头多肽通过使模拟体具有选择性方向和结合特性而提供结构柔性。当存在时，它的化学结构并不是关键。接头优选由通过肽键连接在一起的氨基酸组成。因此，在优选的实施方案中，接头由1-20个通过肽键连接的氨基酸组成，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中有一些可糖基化，正如本领域技术人员所所熟知的一样。在一个更优选的实施方案中，1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。接头甚至更优选由大部分空间不受位阻的氨基酸组成，例如甘氨酸和丙氨酸。因此，优选的接头为聚(Gly-Ser)、聚甘氨酸(特别是(Gly)4、(Gly)5)、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。接头的其它具体实例是：(Gly)3Lys(Gly)4(SEQID NO：65)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO：66)、(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO：67)和GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO：68)。
[0062](Gly)3Lys(Gly)4是指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly，这个例子用来解释上述命名。还优选Gly和Ala的组合。此处所示接头是示例性的；本发明范围内的接头可更长，并可包括其它残基。
[0063]还可以是非肽接头。例如可以使用烷基接头，例如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头还可被任何非空间位阻基团取代，例如低级烷基(例如C1-C6)低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。示例性的非肽接头为分子量为100-5000kD、优选100-500kD的PEG接头。可按上述相同方式改变肽接头以形成衍生物。
[0064]本文所用“GLP-1肽”或“GLP-1肽、变体或衍生物”可以是至少一种GLP-1肽、GLP-1片段、GLP-1同源物、GLP-1类似物或GLP-1衍生物。GLP-1肽具有约25个至约45个天然存在的或非天然存在的氨基酸，该GLP-1肽与天然GLP-1(7-37)有足够的同源性使得通过与胰腺β细胞上的GLP-1受体结合而显示促胰岛素活性。GLP-1(7-37)的氨基酸序列为SEQ ID NO：15：
[0065]His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly。
[0066]GLP-1片段是从GLP-1(7-37)或其类似物或衍生物的N端和/或C端截短一个或多个氨基酸而获得的多肽。GLP-1同源物是在GLP-1(7-37)或其片段或类似物的N端和/或C端上添加了一个或多个氨基酸的肽。GLP-1类似物是其中GLP-1(7-37)的一个或多个氨基酸被修饰和/或取代的肽。GLP-1类似物与GLP-1(7-37)或GLP-1(7-37)的片段有足够的同源性使得该类似物具有促胰岛素活性。GLP-1衍生物定义为这样的分子，即具有GLP-1肽、GLP-1同源物或GLP-1类似物的氨基酸序列，但其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧基的一个或多个上又具有化学修饰。
[0067]本领域已知多种活性GLP-1片段、类似物和衍生物，这些类似物和衍生物的任一种都可为本发明GLP-1模拟体的组成部分。本领域已知的一些GLP-1类似物和GLP-1片段参见美国专利号5,118,666、5,977,071和5,545,618及Adelhorst等，J.Biol.Chem.269：6275(1994)。实例包括但不限于GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Gln9-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。
[0068]“GLP-1模拟体”、“GLP-1模拟体部分”或“GLP-1模拟体片段”和/或“GLP-1模拟体变体”等具有、模拟或刺激至少一种生物活性，例如但不限于配体在体外、原位和/或优选体内结合至少一种GLP-1肽、变体或衍生物，例如但不限于SEQ ID NO：1的至少一种。例如，合适的GLP-1模拟体、特定部分或变体还可调节、增强、改变、激活至少一种GLP-1受体信号转导活性或其它可测量的或可检测的活性。
[0069]用于本发明方法和组合物的GLP-1模拟体的特征是与蛋白质配体(例如GLP-1受体)结合的合适的亲和力，以及任选和优选具有低毒性。具体地讲，其中各个组分单独和/或共同任选和优选具有低免疫原性的GLP-1模拟体可用于本发明，所述组分例如可变区部分、恒定区部分(无CH1部分)和构架区部分或其任何部分(例如重链或轻链可变区的J、D或V区部分；至少一个铰链区的至少一部分，重链或轻链恒定区)。可用于本发明的模拟体任选以其长期治疗患者使症状缓解能达到好至非常好的能力和毒性低为特征。低免疫原性和/或高亲和力以及其它未明特性可有助于所要达到的治疗效果。本文“低免疫原性”定义为在少于约75％或优选少于约50％、45％、40％、35％、30％、35％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％和/或1％的受治疗患者中引起明显的HAMA、HACA或HAHA反应和/或在受治疗患者中引起的滴度低(用双抗原酶免疫测定法(doubleantigen enzyme immunoassay)测定小于约300，优选小于约100)(参见例如Elliott等，Lancet 344：1125-1127(1994))。
[0070]用途：本发明的分离核酸可用于产生至少一种GLP-1模拟体、其片段或特定变体，它们可用于在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人)中起作用，从而调节、治疗、减轻至少一种蛋白质相关疾病；辅助预防至少一种蛋白质相关疾病的发生，或者减轻至少一种蛋白质相关疾病的症状，所述蛋白质相关疾病选自但不限于至少一种以下疾病：糖尿病相关疾病、胰岛素代谢相关疾病、免疫障碍或疾病、心血管障碍或疾病、感染性病症或疾病、恶性病症或疾病和/或神经障碍或疾病以及其它已知或特定的蛋白质相关疾病。
[0071]这种方法可包括给予需要这种调节、治疗、减缓、预防或者减轻症状、作用或机制的细胞、组织、器官、动物或患者有效量的包含至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的组合物或药物组合物。有效量可包括每单剂或多剂给药的量约0.0001-500mg/kg，或者每单剂或多剂给药以达到血清浓度为0.01-5000μg/ml的量，或者其中任何的有效范围或数值，正如采用已知方法、本文所述方法或相关领域已知方法所进行和测定的一样。
[0072]引证：本文所引用的所有出版物或专利由于其体现了与本发明同时期的现有技术水平，和/或提供了本发明的描述和实施方法，因而通过引用全部结合到本文中。出版物是指任何学术出版物或专利出版物或者从包括所有录音形式、电子形式或印刷形式在内的任何媒介形式可获取的任何其它资料。下列文献通过引用全部结合到本文中：Ausubel等主编，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2003)；Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan等主编，Current Protocols in Immunology，JohnWiley & Sons，Inc.，NY(1994-2003)；Colligan等，Current Protocols inProtein Science，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2003)。
[0073]本发明的模拟体。GLP-1模拟体可任选包含至少一个CH3区、至少一个CH2区、至少一个铰链区片段的至少一个部分(H)(例如包含至少一个核心铰链区)、至少一个部分可变区(V)、任选的接头序列(L)和至少一个GLP-1治疗性肽(P)，其中至少一个CH3区与至少一个CH2区直接连接，至少一个CH2区与至少一个铰链区片段的至少一个部分(H)(例如包含至少一个核心铰链区)直接相连，至少一个部分铰链区片段(H)与至少一个部分可变区(V)直接连接，至少一个可变区(V)与任选的接头序列(L)直接连接，任选的接头序列(L)与至少一个GLP-1治疗性肽(P)直接连接。在一个优选的实施方案中，一对CH3-CH2-H-V-L-P可通过缔合或共价键(例如但不限于Cys-Cys二硫键)连接起来。因此，本发明的GLP-1模拟体模拟具有抗体固有特性和功能的抗体结构，同时提供治疗性肽及其固有或获得的体外、体内或原位特性或活性。可按照本文所述并结合本领域已知方法改变所述抗体的不同部分和至少一种本发明GLP-1模拟体的治疗性肽部分。
[0074]因此，与已知蛋白质相比，本发明的模拟体提供至少一种合适的性质，例如但不限于以下性质中的至少一种：半衰期延长、活性提高、活性更为特异、亲合力提高、解离速率(off rate)提高或降低、特定或更合适的细分活性、免疫原性低、至少一种所需治疗效果的质量提高或持续时间延长、副作用低，等等。
[0075]可按照本领域已知的和/或本文所述方法，通过酶促切割、合成或重组技术来制备式(I)模拟体的片段。还可用抗体基因制备模拟体的各种截短形式，该抗体基因中一个或多个终止密码子已被导入天然终止位点的上游。模拟体的不同部分可通过常规技术用化学方法连接在一起，或者可采用遗传工程技术制备成邻接蛋白(contiguousprotein)。例如，可表达编码人抗体链的至少一个恒定区的核酸以产生用于本发明模拟体的邻接蛋白。有关单链抗体可参见例如Ladner等，美国专利第4,946,778号和Bird，R.E.等，Science，242：423-426(1988)。
[0076]本文所用术语“人模拟体”是指预期其中基本上蛋白质的每一部分(例如GLP-1肽、CH结构域(例如CH2、CH3)、铰链、V)在人体中都基本为非免疫原性的抗体，仅具有较少的序列变化或变异。相对于未修饰的人抗体或本发明的模拟体，这种变化或变异任选和优选在人体中保持免疫原性或者降低免疫原性。因此，人抗体和相应的本发明GLP-1模拟体与嵌合抗体或人源化抗体截然不同。要指出的是，可通过能够表达人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或细胞产生GLP-1模拟体。
[0077]可针对合适的配体，例如分离的GLP-1受体或其部分(包括合成分子，例如合成肽)，来设计对其至少一种蛋白质配体有特异性的人模拟体。采用鉴定并表征至少一种蛋白质或其部分的配体结合区或序列的已知技术来进行这种模拟体的制备。
[0078]在一个优选的实施方案中，本发明的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体通过至少一个细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖化和/或培养细胞的克隆群体产生。产生蛋白的无限增殖化细胞可采用合适的方法来生产。优选通过提供核酸或载体来制备至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，所述核酸或载体包含源自功能上被重排或者可进行功能重排的至少一个人免疫球蛋白基因座的DNA，或者具有与功能上被重排或者可进行功能重排的至少一个人免疫球蛋白基因座基本相似的序列的DNA，所述核酸或载体还包含本文所述的模拟体结构，例如但不限于式(I)，其中部分C端可变区可用于V，铰链区可用于H，CH2可用于CH2，CH3可用于CH3，正如本领域所知一样。
[0079]本文所用术语“功能重排”是指来自已经过V(D)J重组的免疫球蛋白基因座的核酸区段，从而产生编码免疫球蛋白链(例如重链)或其任何部分的免疫球蛋白基因。可采用合适的方法直接或间接鉴定功能重排的免疫球蛋白基因，例如核苷酸测序、利用可退火至基因区段之间编码结合处的探针进行的杂交(例如蛋白质印迹、RNA印迹)或者采用可退火至基因区段之间编码结合处的引物对免疫球蛋白基因进行的酶促扩增(例如聚合酶链式反应)。还可采用合适的方法来确定细胞是否产生包含特定可变区或包含特定序列(例如至少一个P序列)的可变区的GLP-1模拟体或部分或变体。
[0080]也可采用至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的编码核酸，以提供转基因动物或哺乳动物，例如山羊、牛、马、绵羊等，这些动物在其乳汁中产生模拟体或特定部分或变体，从而产生本发明的模拟体、特定部分和变体。可使用应用于抗体编码序列的已知方法以提供所述动物。参见例如但不限于美国专利号5,827,690、5,849,992、4,873,316、5,849,992、5,994,616、5,565,362、5,304,489等，这些专利的每一个都通过引用全部结合到本文中。
[0081]另可采用至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体编码核酸，提供转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草和玉米)，可在植物部分或来自植物部分的细胞培养物中产生这种模拟体、特定部分或变体，从而制备本发明的模拟体、特定部分和变体。以非限制性实例为例，例如用诱导型启动子，表达重组蛋白的转基因烟草叶已成功用来提供大量重组蛋白。参见例如Cramer等，Curr.Top.Microbol.Immunol.240：95-118(1999)及其中引用的参考文献。同样，转基因玉米已被用来在商用生产水平上表达哺乳动物蛋白质，其生物学活性等同于在其它重组系统产生或由天然来源纯化的蛋白的生物学活性。参见例如Hood等，Adv.Exp.Med.Biol.464：127-147(1999)及其中引用的参考文献。还从包括单链模拟体(scFv)等抗体片段的转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)中产生了大量抗体。参见例如Conrad等，Plant Mol.Biol.38：101-109(1998)及其中引用的参考文献。因此，也可按照已知方法，用转基因植物生产本发明的模拟体、特定部分和变体。另参见例如Fischer等，Biotechnol.Appl.Biochem.30：99-108(1999年10月)；Ma等，Trends Biotechnol.13：522-7(1995)；Ma等，Plant Physiol.109：341-6(1995)；Whitelam等，Biochem.Soc.Trans.22：940-944(1994)及其中引用的参考文献。上述文献均通过引用全部结合到本文中。
[0082]本发明模拟体可与人蛋白质配体结合的亲和力(KD)的范围极宽。在一个优选的实施方案中，至少一种本发明的人GLP-1模拟体可任选以高亲和力结合至少一种蛋白质配体。例如，至少一种本发明GLP-1模拟体可与至少一种蛋白质配体结合的KD≤约10-7M，或更优选KD≤约0.1-9.9(或其中的任何范围或数值)x 10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或10-13M或者其中的任何范围或数值。
[0083]GLP-1模拟体对至少一种蛋白质配体的亲和力或亲合力可用任何合适的方法经过实验测定，例如用于测定抗体-抗原结合亲和力或亲合力的方法(参见例如Berzofsky等，“Antibody-AntigenInteractions”，载于Fundamental Immunology，Paul，W.E.主编，RavenPress：New York，NY(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freemanand Company：New York，NY(1992)及其中所述方法)。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测定，则所测得的特定GLP-1模拟体-配体相互作用的亲和力可能不同。因此，优选用GLP-1模拟体和配体的标准溶液和标准缓冲液(例如本文所描述或本领域已知的缓冲液)，来测定亲和力和其它配体结合参数(例如KD、Ka、Kd)。
[0084]核酸分子。采用本文所描述或本领域已知的方法，利用本文提供的信息，可获得例如编码SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6中至少一个的至少90-100％连续氨基酸以及至少一部分抗体的核苷酸序列，其中上述序列被作为式(I)的P序列插入，以提供还包含特定片段、变体或其共有序列的本发明GLP-1模拟体，或者可获得包含这些序列中至少一个的经保藏的载体(deposited vector)、编码至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的本发明的核酸分子。
[0085]本发明的核酸分子可以是RNA形式，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其它形式，或者是DNA形式，包括但不限于通过克隆获得或者通过合成产生的cDNA和基因组DNA或其任何组合。该DNA可为三链、双链或单链或其任何组合。DNA链或RNA链的至少一条的任一部分可为编码链，也称为有义链，或者可为非编码链，也称为反义链。
[0086]本发明的分离核酸分子可包括含有可读框(ORF)并任选带有一个或多个内含子的核酸分子、包含GLP-1模拟体或特定部分或变体的编码序列的核酸分子以及包含这样的核酸分子，即其核苷酸序列基本上不同于上述核苷酸序列，但由于遗传密码简并性仍编码本文所述和/或本领域已知的至少一种GLP-1模拟体。当然，所述遗传密码是本领域周知的。因此，对本领域技术人员而言，产生这种编码本发明特定GLP-1模拟体或特定部分或变体的简并核酸变体是常规工作。参见例如上述Ausubel等(出处同上)，这种核酸变体包括在本发明中。
[0087]正如本文所指出的一样，包含GLP-1模拟体或特定部分或变体编码核酸的本发明核酸分子可包括但不限于编码GLP-1模拟体片段氨基酸序列本身的核酸分子；完整GLP-1模拟体或其部分的编码序列；GLP-1模拟体、片段或部分的编码序列；以及其它序列，例如至少一种信号前导肽或融合肽的编码序列，有或无上述其它编码序列(例如至少一个内含子)并连同其它非编码序列，包括但不限于非编码5’和3’序列，例如在转录、包括剪接和聚腺苷酸化信号在内的mRNA加工(例如mRNA的核糖体结合和稳定性)的转录中起作用的非翻译序列；编码其它氨基酸的其它编码序列，例如提供其它功能的编码序列。因此，编码GLP-1模拟体或特定部分或变体的序列可与标记序列融合，标记序列例如有助于包含GLP-1模拟体片段或部分的融合GLP-1模拟体或特定部分或变体进行纯化的肽的编码序列。
[0088]与本文所述多核苷酸选择性杂交的多核苷酸。本发明提供在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸或本文公开的其它多核苷酸(包括其特定变体或部分)杂交的分离核酸。因此，本实施方案的多核苷酸可用于分离、检测和/或定量测定包含这类多核苷酸的核酸。
[0089]低或中等严格性杂交条件通常但并非唯一用于相对于互补序列而言其序列同一性降低的序列。中等和高严格性条件可任选用于较高同一性的序列。低严格性条件便于序列同一性约40-99％的序列进行选择性杂交，可用于鉴定直系同源或共生同源序列。
[0090]本发明的多核苷酸可任选编码由本文所述多核苷酸编码的GLP-1模拟体或特定部分或变体的至少一部分。本发明的多核苷酸包含可用于与编码本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见例如Ausubel(出处同上)、Colligan(出处同上)，这些文献都通过引用全部结合到本文中。
[0091]核酸的构建。本发明的分离核酸可按照本领域众所周知的以下方法制备：(a)重组方法，(b)合成技术，(c)纯化技术，或它们的组合。
[0092]所述核酸可方便地包含本发明多核苷酸以外的序列。例如，包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点可被插到核酸中以助于多核苷酸的分离。同样，可插入可翻译序列以助于分离本发明已翻译的多核苷酸。例如，六聚组氨酸标记序列为本发明蛋白质的纯化提供了便利方法。本发明的核酸--编码序列除外--任选为用于本发明多核苷酸克隆和/或表达的载体、适体或接头。
[0093]在这种克隆和/或表达序列中可以添加其它序列，使其克隆和/或表达功能最优化、利于多核苷酸分离或者促进多核苷酸导入细胞。克隆载体、表达载体、适体和接头的应用是本领域众所周知的。参见例如Ausubel(出处同上)或参见Sambrook(出处同上)。
[0094]用于构建核酸的重组方法。利用本领域技术人员已知的多种克隆方法，可从生物来源中获得本发明的分离核酸组合物，例如RNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。在某些实施方案中，在合适的严格性条件下，采用与本发明多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针从cDNA或基因组DNA文库鉴定出所需要的序列。RNA的分离以及cDNA和基因组文库的构建均为本领域普通技术人员所熟知(参见例如Ausubel(出处同上)或参见Sambrook(出处同上))。
[0095]用于构建核酸的合成方法。本发明的分离核酸还可通过已知方法通过直接化学合成制备(参见例如Ausubel等(出处同上))。化学合成通常产生单链寡核苷酸，通过与互补序列杂交，或者可通过使用该单链为模板用DNA聚合酶聚合，将该单链寡核苷酸转变为双链DNA。本领域技术人员应了解的是，虽然DNA的化学合成可能限于约100个以上碱基的序列，但是通过较短序列的连接可获得较长序列。
[0096]重组表达盒。本发明还提供包含本发明核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列，例如编码本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体的cDNA或基因组序列，可用于构建可导入至少一种所需宿主细胞的重组表达盒。重组表达盒通常可包含与转录起始调节序列有效连接的本发明的多核苷酸，该转录起始调节序列将指导所述多核苷酸在所需宿主细胞中转录。异源和非异源(即内源)启动子均可用于指导本发明核酸的表达。
[0097]在一些实施方案中，用作启动子、增强子或其它元件的分离核酸可被导入非异源形式的本发明多核苷酸的合适位置(上游、下游或内含子中)，以上调或下调本发明多核苷酸的表达。例如，可按照本领域已知方法通过突变、缺失和/或取代，在体内或体外改变内源启动子。本发明的多核苷酸可按需要以有义或反义方向进行表达。应当了解的是，以有义或反义方向控制基因表达可对可观测特征产生直接影响。另一种抑制方法为有义抑制。导入以有义方向排列的核酸已被证实是阻断目标基因转录的有效方法。
[0098]载体和宿主细胞。本发明还涉及包括本发明分离核酸分子的载体、通过本领域众所周知的重组技术用重组载体经遗传工程改造并产生至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的宿主细胞。参见例如Sambrook等(出处同上)、Ausubel等(出处同上)，所述各份文献都通过引用全部结合到本文中。
[0099]多核苷酸可任选与载体结合，该载体含有用于在宿主内增殖的选择标记。一般而言，采用合适的已知方法(例如电穿孔等)，将质粒载体导入细胞，其它已知方法包括使用载体作为沉淀物，例如磷酸钙沉淀法或与带电脂质形成复合物。如果载体为病毒，则可用使用合适的包装细胞系在体外包装，然后转导进入宿主细胞。
[0100]DNA插入片段应与合适的启动子有效连接。表达构建体还可含有任选至少用于转录起始和终止之一的位点及转录区内用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可优选包括位于起点的翻译起始密码子和适当位于待翻译mRNA末端的终止密码子(例如UAA、UGA或UAG)，其中UAA和UAG优选用于哺乳动物或真核细胞表达。
[0101]表达载体可优选但任选包括至少一种选择标记。这类标记包括但不限于用于真核细胞培养的甲氨蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利号4,399,216、4,634,665、4,656,134、4,956,288、5,149,636、5,179,017)、氨苄西林、新霉素(G418)、麦考酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利号5,122,464、5,770,359、5,827,739)抗性基因，以及在大肠杆菌和其它细菌或原核生物中培养的四环素或氨苄西林抗性基因(上述专利都通过引用全部结合到本文中)。用于上述宿主细胞的合适的培养基和条件为本领域所知。合适的载体对于技术人员而言是显而易见的。将载体构建体导入宿主细胞可通过以下方法实现：磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知方法。这类方法可参见本领域文献，例如Sambrook(出处同上)，第1-4章和第16-18章；Ausubel(出处同上)，第1、9、13、15、16章。
[0102]至少一种本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体可以修饰形式(例如融合蛋白)表达，不仅可包括分泌信号，而且还可包括其它异源功能区。例如，可将其它氨基酸区(特别是带电荷的氨基酸)加到GLP-1模拟体或特定部分或变体的N端，以改进其在宿主细胞内、在纯化期间或后续处理和保存期间的稳定性和持久性。同样，可将肽部分加到本发明的GLP-1模拟体或特定部分或变体以利于纯化。可在GLP-1模拟体或其至少一个片段最终制成前除去这些区域。这类方法记载于许多标准实验指南，例如Sambrook(出处同上)，第17.29-17.42章和第18.1-18.74章；Ausubel(出处同上)，第16、17和18章。
[0103]本领域普通技术人员熟知可用于本发明蛋白质编码核酸表达的多个表达系统。
[0104]用于生产模拟体、其特定部分或变体的示例性细胞培养物是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统常常为单层细胞形式，尽管也可使用哺乳动物细胞悬液或生物反应器。本领域已经开发出能够表达完整糖基化蛋白的多个合适的宿主细胞系，包括COS-1(例如ATCCCRL 1650)、COS-7(例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCC CRL-10)、CHO(例如ATCC CRL1610，DG-44)和BSC-1(例如ATCC CRL-26)细胞系、hepG2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，这些均易获自例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Va.)。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC保藏号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC保藏号CRL-1851)。
[0105]这些细胞的表达载体可包括一个或多个以下表达调控序列，例如但不限于复制起点；启动子(例如晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(例如美国专利号5,168,062、5,385,839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(例如美国专利第5,266,491号)、至少一种人免疫球蛋白启动子；增强子和/或加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T抗原加poly A位点)和转录终止子序列。参见例如Ausubel等(出处同上)、Sambrook等(出处同上)。用于生产本发明核酸或蛋白质的其它细胞是已知的和/或可获自例如美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或其它已知来源或商业来源。
[0106]如果采用真核宿主细胞，则通常将聚腺苷酸化或转录终止子序列整合入载体。终止子序列的实例是来自牛生长素基因的聚腺苷酸化序列。也可包括用于转录物精确剪接的序列。剪接序列的实例是SV40的VP1内含子(Sprague等，J.Virol45：773-781(1983))。此外，可按照本领域已知方法，将在宿主细胞内控制复制的基因序列整合入载体。
[0107]GLP-1模拟体或其特定部分或变体的纯化。GLP-1模拟体或特定部分或变体可通过众所周知的方法由重组细胞培养物中回收并纯化，方法包括但不限于A蛋白纯化法、硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水作用层析法、亲和层析法、羟磷灰石层析法和凝集素层析法。还可采用高效液相层析法(＂HPLC＂)进行纯化。参见例如Colligan，CurrentProtocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science，JohnWiley & Sons，NY，NY，(1997-2003)，例如第1、4、6、8、9、10章，所述每份文献都通过引用全部结合到本文中。
[0108]本发明的模拟体或特定部分或变体包括天然的纯化产物、化学合成方法的产物和通过重组技术由真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。根据重组生产方法中所用的宿主，本发明的GLP-1模拟体或特定部分或变体可以是糖基化的或可以是非糖基化的，优选为糖基化的。该方法记载于多种标准实验指南，例如Sambrook(出处同上)，第17.37-17.42节；Ausubel(出处同上)，第10、12、13、16、18和20章；Colligan，Protein Science(出处同上)，第12-14章，所有这些文献都通过引用全部结合到本文中。
[0109]模拟体、特定片段和/或变体。本发明分离的模拟体包含本发明任一多核苷酸编码的GLP-1模拟体或特定部分或变体(更全面的论述见本文)或任何分离或制备的GLP-1模拟体或其特定部分或变体。
[0110]优选GLP-1模拟体或配体结合部分或变体与至少一种GLP-1蛋白配体结合，从而提供相应的蛋白质或其片段的至少一种GLP-1生物活性。在治疗或诊断方面具有重要性的不同蛋白质是本领域众所周知的，这类蛋白质合适的测定法或生物学活性也是本领域众所周知的。
[0111]本发明合适的GLP-1肽、变体和衍生物的非限制性实例如下：SEQ ID NO：1：His-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31，其中：Xaa2为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；Xaa3为Glu、Asp或Lys；Xaa5为Thr、Ala、Gly、Ser、Leu、Ile、Val、Arg、His、Glu、Asp或Lys；Xaa6为Phe、His、Trp或Tyr；Xaa7为Thr或Asn；Xaa8为Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Val、Gln、His、Glu或Lys；Xaa11为Ser、Val、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp或Lys；Xaa12为Ser、Val、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp或Lys；Xaa13为Tyr、Gln、His、Glu或Lys；Xaa14为Leu、Gln、His、Glu或Lys；Xaa15为Glu、Ala、Thr、Ser、Gly、Gln、Asp或Lys；Xaa16为Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Gln、Asn、Arg、Cys、Glu、Asp或Lys；Xaa17为Gln、Asn、Arg、His、Glu、Asp或Lys；Xaa18为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Glu、Asp或Lys；Xaa19为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Met、Glu、Asp或Lys；Xaa20为Lys、Arg、His、Gln、Trp、Tyr、Phe、Glu或Asp；Xaa21为Glu、Leu、Ala、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、Gln、Thr、Ser、Gly、Asp或Lys；Xaa23为Ile、Ala、Val、Leu或Glu；Xaa24为Ala、Gln、His、Glu或Lys；Xaa25为Trp、Phe、Tyr、Glu、Asp或Lys；Xaa26为Leu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；Xaa27为Val、Gln、His、Glu或Lys；Xaa28为Lys、Asn、Arg、His、Glu或Asp；Xaa29是Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、His、Glu、Asp或Lys；Xaa30为Arg、His、Thr、Ser、Trp、Tyr、Phe、Glu、Asp或Lys；Xaa31为Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Trp、Tyr、Phe、His、Glu、Asp、Lys。
[0112]另一组优选的GLP-1肽、变体或衍生物以SEQ ID NO：6：His-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Ser-Xaa12-Tyr-Xaa14-Glu-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Lys-Xaa21-Phe-Xaa23-Ala-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa30为例说明，其中Xaa2为Ala、Gly或Ser；Xaa3为Glu或Asp；Xaa6为Phe或Tyr；Xaa7为Thr或Asn；Xaa8为Ser、Thr或Ala；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Val、Gln、His、Glu或Lys；Xaa12为Ser或Lys；Xaa14为Leu、Gln、His、Glu或Lys；Xaa16为Gly、Ala、Glu或Asp；Xaa17为Gln或Glu；Xaa18为Ala或Lys；Xaa19为Ala、Val、Ile、Leu或Met；Xaa21为Glu或Leu；Xaa23为Ile、Ala、Val、Leu或Glu；Xaa24为Ala、Gln、His、Glu或Lys；Xaa27为Val、Gln、His、Glu或Lys；Xaa28为Lys或Asn；Xaa30为Arg或Glu。
[0113]可通过已公开的和/或本领域已知的方法制备这些肽。序列中(以及本说明书全文中，除非在特定情况下另有说明)的Xaa包括特定的氨基酸残基、其衍生物或修饰的氨基酸。因为酶即二肽基肽酶IV(DPP-IV)可能是造成观察到的所给予的GLP-1在体内快速失活的原因，所以在模拟体的情况下，优选为受到保护而免于DPP-IV活性的GLP-1肽、同源物、类似物和衍生物。
[0114]部分提供或优选基本上提供至少一种GLP-1生物活性的GLP-1模拟体或其特定部分或变体可与GLP-1配体结合，从而提供否则要通过GLP-1与至少一种配体(例如GLP-1受体)结合或者通过其它蛋白质依赖性机制或其它蛋白质介导的机制而介导的至少一种活性。本文所用术语“GLP-1模拟体活性”是指GLP-1模拟体可以调节或引起至少一种GLP-1依赖性活性达约20-10,000％，优选达至少约60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、6000％、7000％、8000％、9000％以上，这取决于测定法。
[0115]优选通过本文所述和/或按照本领域已知的至少一种合适的蛋白质生物测定法，来评价GLP-1模拟体或特定部分或变体提供至少一种蛋白质依赖性活性的能力。本发明的人GLP-1模拟体或特定部分或变体可与任何类别(IgG、IgA、IgM等)或同种型类似，并可包含至少一部分κ或λ轻链。在一个实施方案中，人GLP-1模拟体或特定部分或变体包含至少一种同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的IgG重链可变区片段、铰链区、CH2和CH3。
[0116]本发明的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与至少一种配体、亚基、片段、部分或其任何组合结合。至少一种本发明GLP-1模拟体、特定部分或变体的至少一种GLP-1肽、变体或衍生物可任选与配体的至少一个特定表位结合。该结合表位可包含蛋白质配体(例如GLP-1受体或其部分)序列中至少1-3个氨基酸至完整的特定部分连续氨基酸的至少一个氨基酸序列的任何组合。
[0117]这种模拟体可通过以下方法制备：采用已知技术将式(I)GLP-1模拟体的不同部分连接起来，采用已知重组DNA技术来制备和表达编码GLP-1模拟体的至少一种核酸分子或者采用任何其它合适的方法，例如化学合成法。
[0118]可采用合适的方法，例如噬菌体展示(Katsube，Y.等，IntJMol.Med，1(5)：863-868(1998))，或者利用本领域已知的转基因动物的方法，制备与人GLP-1配体(例如受体)结合并包含规定的重链或轻链可变区或其部分的模拟体。可在合适的宿主细胞内用编码核酸或其部分表达GLP-1模拟体、特定部分或变体。
[0119]本发明还涉及包含与本文所述氨基酸序列基本相同的序列中的氨基酸的模拟体、配体结合片段和免疫球蛋白链。优选这类模拟体或其配体结合片段可以高亲和力(例如KD≤约10-7M)与人GLP-1配体(例如受体)结合。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸取代是指第一氨基酸被第二氨基酸置换，第二氨基酸的化学和/或物理性质(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)与第一氨基酸的相似。保守取代包括一种氨基酸被以下组别的另一种氨基酸置换：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
[0120]氨基酸代码。组成本发明模拟体或特定部分或变体的氨基酸常常使用缩写。可通过本领域熟知的氨基酸单字母代码、三字母代码、名称或三核苷酸密码子命名氨基酸，来表示氨基酸名称(参见Alberts，B.等，Molecular Biology of The Cell，第3版，GarlandPublishing，Inc.，New York，1994)。
单字母    三字母    名称     三核苷酸密码子
代码      代码
A         Ala       丙氨酸   GCA，GCC，GCG，GCU
C         Cys       半胱氨酸 UGC，UGU
D         Asp       天冬氨酸 GAC，GAU
E         Glu       谷氨酸   GAA，GAG
F         Phe       苯丙氨酸 UUC，UUU
G         Gly       甘氨酸   GGA，GGC，GGG，GGU
H         His       组氨酸   CAC，CAU
I         Ile       异亮氨酸 AUA，AUC，AUU
K         Lys       赖氨酸   AAA，AAG
                             UUA，UUG，CUA，CUC，CUG，
L         Leu       亮氨酸
                             CUU
M         Met       甲硫氨酸 AUG
N         Asn       天冬酰胺 AAC，AAU
P         Pro       脯氨酸   CCA，CCC，CCG，CCU
Q         Gln       谷氨酰胺 CAA，CAG
                             AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，
R         Arg       精氨酸
                             CGU
                             AGC，AGU，UCA，UCC，UCG，
S         Ser       丝氨酸
                             UCU
T         Thr       苏氨酸   ACA，ACC，ACG，ACU
V         Val       缬氨酸   GUA，GUC，GUG，GUU
W         Trp       色氨酸   UGG
Y         Tyr       酪氨酸   UAC，UAU
[0121]本发明的GLP-1模拟体或特定部分或变体可包括由天然突变或本文具体说明的人为操作引起的一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。可用于本发明的这类序列或其它序列包括但不限于表1中所示的下列序列，如对应于SEQ ID NO：47-64的特定部分所示，其中抗体序列的部分可变区可以是但不限于SEQ ID NO：47-55中至少一个的至少一部分或者表1中所示其片段，还任选包含至少一个取代、插入或缺失，详见2004年6月24日申请并于2005年1月20日公布的PCT公开文本WO 05/05604(PCT/US04/19898)中的图1-9，其对应于SEQ ID NO：1-9。CH2、CH3和铰链区可以是但不限于SEQ IDNO：56-64中至少一个的至少一部分或表1中所示其片段，还任选包含至少一个取代、插入或缺失，详见2004年6月24日申请并于2005年1月20日公布的PCT公开文本WO 05/05604(PCT/US04/19898)中的图32-40，其对应于SEQ ID NO：32-40。当然，熟练技术人员可以进行的氨基酸置换数取决于许多因素，包括上述因素。一般而言，根据本文的具体说明，至少一种GLP-l模拟体的氨基酸取代、插入或缺失数将不超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸，例如1-30个或其中的任何范围或数值。
[0122]本发明式I((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)中，式I的V、H、CH2、CH3部分可为任何合适的人或人相容性序列，例如如表1中所示序列，其中抗体序列的部分可变区可以是但不限于SEQ ID NO：47-55中至少一个的至少一部分或表1中所示其片段，还任选包含至少一个取代、插入或缺失，详见2004年6月24日申请并于2005年1月20日公布的PCT公开文本WO 05/05604(PCT/US04/19898)中的图1-9，其对应于SEQ ID NO：1-9；其中CH2、CH3和铰链区可以是但不限于SEQ ID NO：56-64中至少一个的至少一部分或表1中所示其片段，还任选包含至少一个取代、插入或缺失，详见2004年6月24日申请并于2005年1月20日公布的PCT公开文本WO 05/05604(PCT/US04/19898)中的图32-40，其对应于SEQ IDNO：32-40；或本领域已知序列，或其任何组合或共有序列，或其任何融合蛋白，优选来源于人或经过改造，从而当给予人时使免疫原性最小。
[0123]P部分可包含本领域已知或本文所述的至少一种GLP-1治疗性肽，例如但不限于SEQ ID NO：1中所示肽或其任何组合或共有序列或其任何融合蛋白。在一个优选实施方案中，P部分可包含至少一种GLP-1肽，其具有SEQ ID NO：6中至少一个序列或其任何组合或共有序列或其任何融合蛋白。
[0124]任选的接头序列可以是本领域已知的任何合适的肽接头。优选的序列包括G和S的任何组合，例如，X1-X2-X3-X4-...-Xn，其中X可为G或S，n可为5-30。非限制性的实例包括GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO：16)、GSGGGS(SEQ ID NO：17)、GGSGGGS(SEQID NO：18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO：19)和GGGSGGGSGG(SEQ IDNO：20)等。
[0125]可通过本领域已知方法鉴定本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体中对功能而言必不可少的氨基酸，例如位点定向诱变或丙氨酸分区诱变(例如Ausubel(出处同上)，第8、15章；Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后一种方法在分子的每个残基上都引入单丙氨酸突变。然后检测所得突变分子的生物活性，例如但不限于本文具体说明或本领域已知的至少一种蛋白质相关活性。对于GLP-1模拟体或特定部分或变体结合是关键的位点还可通过结晶、核磁共振或光亲和标记等结构分析法进行鉴定(Smith等，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)和de Vos等，Science 255：306-312(1992))。
[0126]本发明的模拟体或特定部分或变体可包含为式(I)的P部分，例如但不限于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6中至少一个的至少一部分。GLP-1模拟体或特定部分或变体还可任选包含为式(I)P部分的至少一种多肽的至少一个功能部分，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6中至少一个的至少90-100％。可提高或保留至少一种上述活性的非限制性变体包括但不限于上述多肽的任一种，所述多肽还包含与不显著影响所述GLP-1模拟体合适生物学活性或功能的至少一个取代、插入或缺失相对应的至少一个突变。
[0127]在一个实施方案中，P氨基酸序列或其部分与SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：6中至少一个相应部分的相应氨基酸序列的同一性为约90-100％(即90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其中的任何范围或数值)。优选90-100％氨基酸同一性(即90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其中的任何范围或数值)运用本领域已知合适的计算机算法确定。
[0128]本发明的模拟体或特定部分或变体可包含本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体的任何数量的连续氨基酸残基，其中该数量选自GLP-1模拟体中连续残基数10-100％的整数。任选该连续氨基酸的亚序列长度为至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250个或更多个氨基酸或其中的任何范围或数值。此外，这类亚序列的数目可为选自1-20的任何整数，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个以上。
[0129]本领域技术人员应了解的是，本发明包括本发明至少一种生物活性GLP-1模拟体或特定部分或变体。生物活性模拟体或特定部分或变体的比活是天然(非合成)、内源或相关和已知的插入或融合蛋白或特定部分或变体的至少20％、30％或40％，优选至少50％、60％或70％，最优选至少80％、90％或95％-1000％。酶促活性和底物特异性的分析法和定量测定法为本领域技术人员所熟知。
[0130]另一方面，本发明涉及本文所述通过有机部分共价连接而被修饰的人模拟体和配体结合片段。这种修饰可产生药代动力学性质得到改进(例如体内血清半衰期延长)的GLP-1模拟体或配体结合片段。有机部分可为直链或支链亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在具体的实施方案中，亲水聚合基团的分子量可为约800道尔顿至约120,000道尔顿，可为聚烷烃二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、糖聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含约8个至约40个碳原子。
[0131]本发明的修饰模拟体和配体结合片段可包含与GLP-1模拟体或特定部分或变体直接或间接共价键合的一个或多个有机部分。与本发明GLP-1模拟体或配体结合片段键合的每个有机部分可独立地为亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。本文所用术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸。本文所用术语“亲水聚合基团”是指在水中比在辛烷中更易溶解的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶解。因此，本发明包括通过聚赖氨酸共价连接而被修饰的GLP-1模拟体。适于修饰本发明模拟体的亲水聚合物可为直链或支链，包括例如聚烷烃二醇(例如PEG、聚乙二醇单甲醚(mPEG)、PPG等)、糖(例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚氧化烷烃(例如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选修饰本发明GLP-1模拟体的亲水聚合物作为独立分子实体的分子量为约800道尔顿至约150,000道尔顿。可采用例如PEG2500、PEG5000、PEG7500、PEG9000、PEG10000、PEG12500、PEG15000和PEG20,000，其中下标是聚合物的平均分子量，单位为道尔顿。
[0132]亲水聚合基团可被1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。被脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水聚合物可应用合适的方法制备。例如，包含胺基团的聚合物可与脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸偶联，而脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧酸(例如经由N，N-羰基二咪唑活化)可与聚合物上的羟基偶联。
[0133]适于修饰本发明模拟体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或者可含有一个或多个不饱和单元。适于修饰本发明模拟体的脂肪酸包括例如正十二烷酸(C12，月桂酸)、正十四烷酸(C14，肉豆蔻酸)、正十八烷酸(C18，硬脂酸)、正二十烷酸(C20，花生酸)、正二十二烷酸(C22，山萮酸)、正三十烷酸(C30)、正四十烷酸(C40)、顺式-Δ9-十八烷酸(C18，油酸)、全顺式-Δ5，8，11，14-二十碳四烯酸(C20，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括含直链或支链低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基可包含1个至约12个、优选1个至约6个碳原子。
[0134]修饰的人模拟体和配体结合片段可采用合适的方法制备，例如通过与一种或多种改性剂进行反应。本文所用的术语“改性剂”是指包含活化基团的合适的有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是指在适当条件下可与第二化学基团反应的化学部分或官能团，从而在改性剂与第二化学基团之间形成共价健。例如，胺反应性活化基团，包括亲电子基团，例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可与硫醇反应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰、丙烯酰、吡啶基二硫化物、5-巯基-2-硝基硫代苯甲酸(TNB-thiol)等。醛官能团可与含有胺或酰肼的分子偶联，叠氮基可与三价磷基团反应从而形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将活化基团引入分子的合适方法为本领域所知(参见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press SanDiego，CA(1996))。活化基团可直接或者通过连接部分与有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)键合，接头部分例如其中一个或多个碳原子可被氧、氮或硫等杂原子置换的二价C1-C12基团。合适的连接部分包括例如四甘醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。可制备包含连接部分的改性剂，例如在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在下，使单-Boc-烷基二胺(例如单Boc-乙二胺、单Boc-己二胺)与脂肪酸反应，以在游离胺与脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键。可如下除去产物中的Boc保护基：用三氟乙酸(TFA)处理，使可与所述另一羧酸酯偶联或者可与马来酐反应的伯胺暴露出来，使所得产物环化生成该脂肪酸的活化马来酰亚胺衍生物(参见例如Thompson等，WO 92/16221，其全部教导内容通过引用结合到本文中)。
[0135]可通过使人GLP-1模拟体或配体结合片段与改性剂反应产生本发明修饰的模拟体。例如，可通过应用胺反应性改性剂(例如PEG的NHS酯)，以非位点特异性方式将有机部分与GLP-1模拟体键合。也可通过还原GLP-1模拟体或配体结合片段的二硫键(例如链内二硫键)来制备修饰的人模拟体或配体结合片段。然后，可使还原的GLP-1模拟体或配体结合片段与硫醇反应性改性剂反应，以产生本发明修饰的GLP-1模拟体。可采用合适的方法制备含有机部分的修饰的人模拟体和配体结合片段，其中所述有机部分与本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体的特定位点键合，所述方法例如反向蛋白酶解(reverse proteolysis)(Fisch等，Bioconjugate Chem.，3：147-153(1992)；Werlen等，Bioconjugate Chem.，5：411-417(1994)；Kumaran等，ProteinSci6(10)：2233-2241(1997)；Itoh等，Bioorg.Chem.，24(1)：59-68(1996)；Capellas等，Biotechnol.Bioeng.，56(4)：456-463(1997))，以及Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)中所描述的方法。
[0136]GLP-1模拟体组合物。本发明还提供至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物，所述组合物包含本文所述和/或本领域已知的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多种模拟体或其特定部分或变体，以非天然存在的组合物、混合物或形式提供。这类组合物的百分比以重量、体积、浓度、摩尔浓度来计，或者以本领域已知或本文所述的液体或无水溶液、混合物、混悬液、乳液或胶体的摩尔浓度来计。
[0137]以重量、体积、浓度、摩尔浓度或者本领域已知或本文所述的液体、气体、或无水溶液、混合物、混悬液、乳液或胶体的摩尔浓度来计，这类组合物可占0.00001-99.9999％或其中的任何范围或值，例如但不限于0.00001％、0.00003％、0.00005％、0.00009％、0.0001％、0.0003％、0.0005％、0.0009％、0.001％、0.003％、0.005％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4.％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.3％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％。因此，本发明的这类组合物包括但不限于0.00001-100mg/ml和/或0.00001-100mg/g。
[0138]该组合物任选还可包含有效量的至少一种化合物或蛋白质，选自以下的至少一种：糖尿病或胰岛素代谢相关药物、抗感染药、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素类药物、用于体液或电解质平衡的药物、血液系统药物、抗肿瘤药、免疫调节药、眼、耳或鼻用药物、局部用药物、营养药等。这些药物是本领域众所周知的，包括本文所列各药物的制剂、适应症、剂量和给药法(参见例如Nursing2001 Handbook of Drugs，第21版，Springhouse Corp.，Springhouse，PA，2001；Health Professional’s Drug Guide 2001，Shannon，Wilson，Stang主编，Prentice-Hall，Inc.，Upper Saddle River，NJ；PharmcotherapyHandbook，Wells等主编，Appleton&Lange，Stamford，CT，所述每份文献均通过引用全部结合到本文中)。
[0139]糖尿病相关药物可为以下的至少一种：格列酮类、胰岛素和衍生物、磺酰脲类、美格列奈类、双胍类、α-葡糖苷酶抑制剂、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B、糖原合酶激酶3、糖原异生抑制剂、丙酮酸脱氢酶激酶(PDH)抑制剂、脂解抑制剂、脂肪氧化抑制剂、肉碱棕榈酰转移酶I抑制剂和/或肉碱棕榈酰转移酶II抑制剂、β-3肾上腺素受体激动剂、钠和葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)抑制剂或者对以下一个或多个方面起作用的化合物：T细胞的自身免疫抑制、免疫调节、活化、增殖、迁移和/或抑制细胞功能、抑制T细胞受体/肽/MHC-II相互作用、诱导T细胞无反应性、缺失自体反应性T细胞、减少穿过血脑屏障的运输、改变促炎细胞因子(Th1)和免疫调节细胞因子(Th2)的平衡、抑制基质金属蛋白酶抑制剂、神经保护、减少神经胶质增生、促进髓鞘再生。
[0140]抗感染药物可为选自以下的至少一种：杀阿米巴药或抗原生动物药、驱肠虫药、抗真菌药、抗疟药、抗结核药或抗麻风药、氨基糖苷类药、青霉素类药、头孢菌素类药、四环素类药、磺胺类药、氟喹诺酮类药、抗病毒药、大环内酯类抗感染药和其它多种抗感染药。CV药物可为选自以下的至少一种：强心药(inotropics)、抗心律失常药、抗心绞痛药、抗高血压药、降血脂药和其它各种心血管药物。CNS药物可为选自非麻醉性镇痛药中的至少一种或选自以下的至少一种：退热药、非甾体抗炎药、麻醉性镇痛药、阿片样镇痛药、镇静催眠药、抗惊厥药、抗抑郁药、抗焦虑药、抗精神病药、中枢神经系统兴奋药、抗帕金森病药和其它中枢神经系统药物。ANS药物可为选自以下的至少一种：胆碱能药(拟副交感神经药)、抗胆碱能药、肾上腺素能药(拟交感神经药)、肾上腺素能阻滞药(交感神经阻滞药)、骨骼肌松弛药和神经肌肉阻滞药。呼吸道药物可为选自以下的至少一种：抗组胺药、支气管扩张药、祛痰药或镇咳药和其它各种呼吸系统药物。胃肠道药物可为选自以下的至少一种：抗酸药、吸附药、抗胃肠气胀药、消化酶、胆石溶解药、止泻药、缓泻药、止吐药和抗溃疡药。激素类药物可为选自以下的至少一种：皮质类固醇、雄激素类药、同化激素类药(anabolic steroid)、雌激素类药、孕酮类药、促性腺激素类药、抗糖尿病药、至少一种胰高血糖素类药、甲状腺激素类药、甲状腺激素拮抗剂、垂体激素类药和甲状旁腺样药物(parathyroid-like drug)。用于体液和电解质平衡的药物可为选自以下的至少一种：利尿药、电解质、置换溶液、酸化剂和碱化剂。血液药物可为选自以下的至少一种：补血药、抗凝血药、血液衍生物和溶栓酶。抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种：烷基化药物、抗代谢药、抗生素抗肿瘤药、改变激素平衡的抗肿瘤药和其它各种抗肿瘤药。免疫调节药可为选自以下的至少一种：免疫抑制药、疫苗、类毒素、抗毒素、抗蛇毒血清、免疫血清和生物反应调节剂。眼、耳和鼻用药可为选自以下的至少一种：眼用抗感染药、眼用抗炎药、缩瞳药、散瞳药、眼用血管收缩药和其它各种眼、耳、鼻用药物。局部用药可为选自以下的至少一种：局部抗感染药、杀疥螨药、灭虱药和局部用皮质类固醇类。营养药可为选自以下的至少一种：维生素、矿物质和热质(calorics)。参见例如Nursing 2001Drug Handbook中的内容(出处同上)。
[0141]至少一种杀阿米巴药或抗原生动物药可为选自以下的至少一种：阿托伐醌(atovaquone)、盐酸氯喹(chloroquinehydrochloride)、磷酸氯喹(chloroquine phosphate)、甲硝唑(metronidazole)、盐酸甲硝唑(metronidazole hydrochloride)和依西酸喷他脒(pentamidine isethionate)。至少一种驱肠虫药可为选自以下的至少一种：甲苯达唑(mebendazole)、双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)和噻苯达唑(thiabendazole)。至少一种抗真菌药可为选自以下的至少一种：两性霉素B(amphotericin B)、硫酸两性霉素B胆固醇复合物(amphotericin B cholesteryl sulfate complex)、两性霉素B脂质复合物(amphotericin B liposomal complex)、两性霉素B脂质体(amphotericin Bliposomal)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、微粉化灰黄霉素(griseofulvin microsize)、超微粉化灰黄霉素(griseofulvinultramicrosize)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、制霉菌素(nystatin)和盐酸特比萘芬(terbinafine hydrochloride)。至少一种抗疟药可为选自以下的至少一种：盐酸氯喹、磷酸氯喹、多西环素(doxycycline)、硫酸羟氯喹(hydroxychloroquine sulfate)、盐酸甲氟喹(mefloquine hydrochloride)、磷酸伯氨喹(primaquine phosphate)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)和磺胺多辛-乙胺嘧啶(pyrimethamine withsulfadoxine)。至少一种抗结核药或抗麻风药可为选自以下的至少一种：氯法齐明(clofazimine)、环丝氨酸(cycloserine)、氨苯砜(dapsone)、盐酸乙胺丁醇(ethambutol hydrochloride)、异烟肼(isoniazid)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、利福布汀(rifabutin)、利福平(rifampin)、利福喷汀(rifapentine)和硫酸链霉素(streptomycin sulfate)。至少一种氨基糖苷类药可为选自以下的至少一种：硫酸阿米卡星(amikacin sulfate)、硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)、硫酸新霉素、硫酸链霉素和硫酸妥布霉素(tobramycin sulfate)。至少一种青霉素类药可为选自以下的至少一种：阿莫西林/克拉维酸钾合剂(amoxcillin/clavulanate potassium)、三水合阿莫西林(amoxicillin trihydrate)、氨苄西林、氨苄西林钠、三水合氨苄西林、氨苄西林钠/舒巴坦钠合剂(ampicillin sodium/sulbactam sodium)、氯唑西林钠(cloxacillin sodium)、双氯西林钠(dicloxacillin sodium)、美洛西林钠(mezlocillin sodium)、萘夫西林钠(nafcillin sodium)、苯唑西林钠(oxacillin sodium)、苄星青霉素(penicillin G benzathine)、青霉素钾(penicillin G potassium)、普鲁卡因青霉素G(penicillin G procaine)、青霉素钠(penicillin G sodium)、青霉素V钾(penicillin V potassium)、哌拉西林钠(piperacillin sodium)、哌拉西林钠/三唑巴坦钠合剂(piperacillin sodium/tazobactam sodium)、替卡西林二钠(ticarcillindisodium)和替卡西林二钠/克拉维酸钾合剂(ticarcillindisodium/clavulanate potassium)。至少一种头孢菌素类药可为选自以下的至少一种：头孢克洛(cefaclor)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢唑林钠(cefazolin sodium)、头孢地尼(cefdinir)、盐酸头孢吡肟(cefepimehydrochloride)、头孢克肟(cefixime)、头孢美唑钠(cefmetazole sodium)、头孢尼西钠(cefonicid sodium)、头孢哌酮钠(cefoperazone sodium)、头孢噻肟钠(cefotaxime sodium)、头孢替坦二钠(cefotetan disodium)、头孢西丁钠(cefoxitin sodium)、头孢泊肟酯(cefpodoxime proxetil)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟钠(ceftizoxime sodium)、头孢曲松钠(ceftriaxone sodium)、头孢呋辛酯(cefuroxime axetil)、头孢呋辛钠(cefuroxime sodium)、盐酸头孢氨苄(cephalexin hydrochloride)、头孢氨苄一水合物(cephalexinmonohydrate)、头孢拉定(cephradine)、氯碳头孢(loracarbef)。至少一种四环素类药可为选自以下的至少一种：盐酸地美环素(demeclocyclinehydrochloride)、多西环素钙(doxycycline calcium)、海克多西环素(doxycycline hyclate)、盐酸多西环素(doxycycline hydrochloride)、多西环素单水合物(doxycycline monohydrate)、盐酸米诺环素(minocyclinehydrochloride)、盐酸四环素(tetracycline hydrochloride)。至少一种磺胺类药可为选自以下的至少一种：复方新诺明(co-trimoxazole)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、磺胺异噁唑(sulfisoxazole)、磺胺乙酰异噁唑(sulfisoxazole acetyl)。至少一种氟喹诺酮类药可为选自以下的至少一种：甲磺酸阿拉曲沙星(alatrofloxacinmesylate)、环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、盐酸洛美沙星(lomefloxacin hydrochloride)、萘啶酸(nalidixic acid)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、甲磺酸曲伐沙星(trovafloxacin mesylate)。至少一种抗病毒药可为选自以下的至少一种：硫酸阿巴卡韦(abacavir sulfate)、阿昔洛韦钠(acyclovir sodium)、盐酸金刚烷胺(amantadine hydrochloride)、安普那韦(amprenavir)、西多福韦(cidofovir)、甲磺酸地拉韦定(delavirdine mesylate)、去羟肌苷(didanosine)、依法韦仑(efavirenz)、泛昔洛韦(famciclovir)、福米韦生钠(fomivirsen sodium)、膦甲酸钠(foscarnet sodium)、更昔洛韦(ganciclovir)、硫酸茚地那韦(indinavirsulfate)、拉米夫定(lamivudine)、拉米夫定/齐多夫定合剂(lamivudine/zidovudine)、甲磺酸奈非那韦(nelfinavir mesylate)、奈韦拉平(nevirapine)、磷酸奥塞米韦(oseltamivir phosphate)、利巴韦林(ribavirin)、盐酸金刚乙胺(rimantadine hydrochloride)、利托那韦(ritonavir)、沙奎那韦(saquinavir)、甲磺酸沙奎那韦(saquinavirmesylate)、司他夫定(stavudine)、盐酸伐昔洛韦(valacyclovirhydrochloride)、扎西他滨(zalcitabine)、扎那米韦(zanamivir)、齐多夫定(zidovudine)。至少一种大环内酯类抗感染药可为选自以下的至少一种：阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素碱(erythromycin base)、依托红霉素(erythromycinestolat)、琥乙红霉素(erythromycin ethylsuccinate)、乳糖酸红霉素(erythromycin lactobionate)、硬脂酸红霉素(erythromycin stearate)。至少一种其它抗感染药可为选自以下的至少一种：氨曲南(aztreonam)、杆菌肽(bacitracin)、氯霉素琥珀酸钠(chloramphenicol sodium sucinate)、盐酸克林霉素(clindamycin hydrochloride)、盐酸棕榈酸克林霉素酯(clindamycin palmitate hydrochloride)、磷酸克林霉素(clindamycinphosphate)、亚胺培南(imipenem)和西司他丁钠(cilastatin sodium)、美罗培南(meropenem)、粗晶呋喃妥因(nitrofurantoin macrocrystals)、微晶呋喃妥因(nitrofurantoin microcrystals)、奎奴普丁/达福普汀(quinupristin/dalfopristin)、盐酸大观霉素(spectinomycin hydrochloride)、甲氧苄啶(trimethoprim)、盐酸万古霉素(vancomycin hydrochloride)。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook第24-214页)。
[0142]至少一种强心药可为选自以下的至少一种：乳酸氨力农(amrinone lactate)、地高辛(digoxin)、乳酸米立农(milrinone lactate)。至少一种抗心律失常药可为选自以下的至少一种：腺苷(adenosine)、盐酸胺碘酮(amiodarone hydrochloride)、硫酸阿托品(atropine sulfate)、托西溴苄铵(bretylium tosylate)、盐酸地尔硫
Figure A200780034262D0058101033QIETU
(diltiazem hydrochloride)、丙吡胺(disopyramide)、磷酸丙吡胺(disopyramide phosphate)、盐酸艾司洛尔(esmolol hydrochloride)、醋酸氟卡尼(flecainide acetate)、富马酸伊布利特(ibutilide fumarate)、盐酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)、盐酸美西律(mexiletine hydrochloride)、盐酸莫雷西嗪(moricizinehydrochloride)、苯妥英(phenytoin)、苯妥英钠(phenytoin sodium)、盐酸普鲁卡因胺(procainamide hydrochloride)、盐酸普罗帕酮(propafenonehydrochloride)、盐酸普奈洛尔(propranolol hydrochloride)、奎尼丁硫酸氢盐(quinidine bisulfate)、葡糖酸奎尼丁(quinidine gluconate)、聚半乳糖醛酸奎尼丁(quinidine polygalacturonate)、硫酸奎尼丁(quinidinesulfate)、索他洛尔(sotalol)、盐酸妥卡尼(tocainide hydrochloride)、盐酸维拉帕米(verapamil hydrochloride)。至少一种抗心绞痛药可为选自以下的至少一种：苯磺酸氨氯地平(amlodipidine besylate)、亚硝酸异戊酯(amyl nitrite)、盐酸苄普地尔(bepridil hydrochloride)、盐酸地尔硫
Figure A200780034262D0058101033QIETU
(diltiazem hydrochloride)、二硝酸异山梨酯(isosorbide dinitrate)、单硝酸异山梨酯(isosorbide mononitrate)、纳多洛尔(nadolol)、盐酸尼卡地平(nicardipine hydrochloride)、硝苯地平(nifedipine)、硝酸甘油(nitroglycerin)、盐酸普萘洛尔(propranolol hydrochloride)、维拉帕米(verapamil)、盐酸维拉帕米(verapamil hydrochloride)。至少一种抗高血压药可为选自以下的至少一种：盐酸醋丁洛尔(acebutololhydrochloride)、苯磺酸氨氯地平(amlodipine besylate)、阿替洛尔(atenolol)、盐酸贝那普利(benazepril hydrochloride)、盐酸倍他洛尔(betaxolol hydrochloride)、富马酸比索洛尔(bisoprolol fumarate)、坎地沙坦酯(candesartan cilexetil)、卡托普利(captopril)、盐酸卡替洛尔(carteolol hydrochloride)、卡维地洛(carvedilol)、可乐定(clonidine)、盐酸可乐定(clonidine hydrochloride)、二氮嗪(diazoxide)、盐酸地尔硫
Figure A200780034262D0058101033QIETU
(diltiazem hydrochloride)、甲磺酸多沙唑嗪(doxazosin mesylate)、依那普利拉(enalaprilat)、马来酸依那普利(enalapril maleate)、甲磺酸依普罗沙坦(eprosartan mesylate)、非洛地平(felodipine)、甲磺酸非诺多泮(fenoldopam mesylate)、福辛普利钠(fosinopril sodium)、醋酸胍那苄(guanabenz acetate)、硫酸胍那决尔(guanadrel sulfate)、盐酸胍法辛(guanfacine hydrochloride)、盐酸肼屈嗪(hydralazine hydrochloride)、厄贝沙坦(irbesartan)、伊拉地平(isradipine)、盐酸拉贝洛尔(labetalolhydrchloride)、赖诺普利(lisinopril)、氯沙坦钾(losartan potassium)、甲基多巴(methyldopa)、盐酸甲基多巴乙酯(methyldopate hydrochloride)、琥珀酸美托洛尔(metoprolol succinate)、酒石酸美托洛尔(metoprololtartrate)、米诺地尔(minoxidil)、盐酸莫昔普利(moexipril hydrochloride)、纳多洛尔(nadolol)、盐酸尼卡地平(nicardipine hydrochloride)、硝苯地平(nifedipine)、尼索地平(nisoldipine)、硝普钠(nitroprusside sodium)、硫酸喷布洛尔(penbutolol sulfate)、培哚普利叔丁胺盐(perindoprilerbumine)、甲磺酸酚妥拉明(phentolamine mesylate)、吲哚洛尔(pindolol)、盐酸哌唑嗪(prazosin hydrochloride)、盐酸普奈洛尔(propranolol hydrochloride)、盐酸喹那普利(quinapril hydrochloride)、雷米普利(ramipril)、替米沙坦(telmisartan)、盐酸特拉唑嗪(terazosinhydrochloride)、马来酸噻吗洛尔(timolol maleate)、群多普利(trandolapril)、缬沙坦(valsartan)、盐酸维拉帕米(verapamilhydrochloride)。至少一种降血脂药可为选有以下的至少一种：阿托伐他汀钙(atorvastatin calcium)、西立伐他汀钠(cerivastatin sodium)、消胆胺(cholestyramine)、盐酸考来替泊(colestipol hydrochloride)、非诺贝特(fenofibrate)(微粉化)、氟伐他汀钠(fluvastatin sodium)、吉非贝齐(gemfibrozil)、洛伐他汀(lovastatin)、烟酸(niacin)、普伐他汀钠(pravastatin sodium)、辛伐他汀(simvastatin)。至少一种其它CV药物可为选自以下的至少一种：阿昔单抗(abciximab)、前列地尔(alprostadil)、盐酸阿布他明(arbutamine hydrochloride)、西洛他唑(cilostazol)、氯吡格雷硫酸氢盐(clopidogrel bisulfate)、双嘧达莫(dipyridamole)、依替巴肽(eptifibatide)、盐酸米多君(midodrine hydrochloride)、己酮可可碱(pentoxifylline)、盐酸噻氯匹定(ticlopidine hydrochloride)、盐酸替罗非班(tirofiban hydrochloride)。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook第215-336页)。
[0143]至少一种非麻醉性镇痛药或退热药可为选自以下的至少一种：对乙酰氨基酚(acetaminophen)、阿司匹林(aspirin)、三水杨酸胆碱镁(choline magnesium trisalicylate)、二氟尼柳diflunisal)、水杨酸镁。至少一种非甾体抗炎药可为选自以下的至少一种：塞来考昔(celecoxib)、双氯芬酸钾(diclofenac potassium)、双氯芬酸钠(diclofenacsodium)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬钙(fenoprofen calcium)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、吲哚美辛钠三水合物(indomethacin sodium trihydrate)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸氨丁三醇(ketorolac tromethamine)、萘丁美酮(nabumetone)、奈普生(naproxen)、奈普生钠(naproxen sodium)、奥沙普秦(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、罗非考昔(rofecoxib)、舒林酸(sulindac)。至少一种麻醉性镇痛药或阿片样镇痛药可为选自以下的至少一种：盐酸阿芬太尼(alfentanil hydrochloride)、盐酸丁丙诺啡(buprenorphinehydrochloride)、酒石酸布托啡诺(butorphanol tartrate)、磷酸可待因(codeine phosphate)、硫酸可待因(codeine sulfate)、枸橼酸芬太尼(fentanyl citrate)、芬太尼透皮系统、经粘膜吸收芬太尼(fentanyltransmucosal)、盐酸氢吗啡酮(hydromorphone hydrochloride)、盐酸麦啶(meperidine hydrochloride)、盐酸美沙酮(methadone hydrochloride)、盐酸吗啡(morphine hydrochloride)、硫酸吗啡(morphine sulfate)、酒石酸吗啡(morphine tartrate)、盐酸纳布啡(nalbuphine hydrochloride)、盐酸羟考酮(oxycodone hydrochloride)、果胶酸羟考酮(oxycodonepectinate)、盐酸羟吗啡酮(oxymorphone hydrochloride)、盐酸喷他佐辛(pentazocine hydrochloride)、盐酸喷他佐辛(pentazocine hydrochloride)和盐酸纳洛酮(naloxone hydrochloride)、乳酸喷他佐辛(pentazocinelactate)、盐酸丙氧芬(propoxyphene hydrochloride)、萘磺酸丙氧芬(propoxyphene napsylate)、盐酸瑞芬太尼(remifentanil hydrochloride)、枸橼酸舒芬太尼(sufentanil citrate)、盐酸曲马多(tramadolhydrochloride)。至少一种镇静催眠药可为选自以下的至少一种：水合氯醛(chloral hydrate)、艾司唑仑(estazolam)、盐酸氟西泮(flurazepamhydrochloride)、戊巴比妥(pentobarbital)、戊巴比妥钠(pentobarbitalsodium)、苯巴比妥钠(phenobarbital sodium)、司可巴比妥钠(secobarbitalsodium)、替马西泮(temazepam)、三唑仑(triazolam)、扎来普隆(zaleplon)、酒石酸唑吡旦(zolpidem tartrate)。至少一种抗惊厥药可为选自以下的至少一种：乙酰唑胺钠(acetazolamide sodium)、卡马西平(carbamazepine)、氯硝西泮(clonazepam)、氯氮
Figure A200780034262D0058101033QIETU
二钾(clorazepatedipotassium)、地西泮(diazepam)、双丙戊酸钠(divalproex sodium)、乙琥胺(ethosuximde)、磷苯妥英钠(fosphenytoin sodium)、加巴喷丁(gabapentin)、拉莫三嗪(lamotrigine)、硫酸镁、苯巴比妥(phenobarbital)、苯巴比妥钠(phenobarbital sodium)、苯妥英(phenytoin)、苯妥英钠(phenytoin sodium)、苯妥英钠(长效)、扑米酮(primidone)、盐酸噻加宾(tiagabine hydrochloride)、托吡酯(topiramate)、丙戊酸钠(valproatesodium)、丙戊酸。至少一种抗抑郁药可为选自以下的至少一种：盐酸阿米替林(amitriptyline hydrochloride)、双羟萘酸阿米替林(amitriptylinepamoate)、阿莫沙平(amoxapine)、盐酸安非他酮(bupropionhydrochloride)、氢溴酸西酞普兰(citalopram hydrobromide)、盐酸氯米帕明(clomipramine hydrochloride)、盐酸地昔帕明(desipraminehydrochloride)、盐酸多塞平(doxepin hydrochloride)、盐酸氟西汀(fluoxetine hydrochloride)、盐酸丙米嗪(imipramine hydrochloride)、双羟萘酸丙米嗪(imipramine pamoate)、米氮平(mirtazapine)、盐酸奈法唑酮(nefazodonehydrochloride)、盐酸去甲替林(nortriptylinehydrochloride)、盐酸帕罗西汀(paroxetine hydrochloride)、硫酸苯乙肼(phenelzine sulfate)、盐酸舍曲林(sertraline hydrochloride)、硫酸反苯环丙胺(tranylcypromine sulfate)、马来酸曲米帕明(trimipramine maleate)、盐酸文拉法辛(venlafaxine hydrochloride)。至少一种抗焦虑药可为选自以下的至少一种：阿普唑仑(alprazolam)、盐酸丁螺环酮(buspironehydrochloride)、氯氮
Figure A200780034262D0063101157QIETU
(chlordiazGLP-1xide)、盐酸氯氮
Figure A200780034262D0063101201QIETU
(chlordiazGLP-1xidehydrochloride)、氯氮
Figure A200780034262D0063101206QIETU
二钾(clorazepatedipotassium)、地西泮(diazepam)、盐酸多塞平(doxepin hydrochloride)、恩波酸羟嗪(hydroxyzine embonate)、盐酸羟嗪(hydroxyzinehydrochloride)、双羟萘酸羟嗪(hydroxyzine pamoate)、劳拉西泮(lorazepam)、甲丙氨酯(mephrobamate)、盐酸咪达唑仑(midazolamhydrochloride)、奥沙西泮(oxazepam)。至少一种抗精神病药可为选自以下的至少一种：盐酸氯丙嗪(chlorpromazine hydrochloride)、氯氮平(clozapine)、癸酸氟奋乃静(fluphenazine decanoate)、庚酸氟奋乃静(fluephenazine enanthate)、盐酸氟奋乃静(fluphenazine hydrochloride)、氟哌啶醇(haloperidol)、癸酸氟哌啶醇(haloperidol decanoate)、乳酸氟哌啶醇(haloperidol lactate)、盐酸洛沙平(loxapine hydrochloride)、琥珀酸洛沙平(loxapine succinate)、苯磺酸美索达嗪(mesoridazine besylate)、盐酸吗茚酮(molindone hydrochloride)、奥氮平(olanzapine)、奋乃静(perphenazine)、匹莫齐特(pimozide)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、富马酸喹硫平(quetiapinefumarate)、利培酮(risperidone)、盐酸硫利达嗪(thioridazine hydrochloride)、替沃噻吨(thiothixene)、盐酸替沃噻吨(thiothixenehydrochloride)、盐酸三氟拉嗪(trifluoperazinehydrochloride)。至少一种中枢神经系统兴奋药可为选自以下的至少一种：硫酸苯丙胺(amphetamine sulfate)、咖啡因、硫酸右苯丙胺(dextroamphetamine sulfate)、盐酸多沙普仑(doxapram hydrochloride)、盐酸脱氧麻黄碱(methamphetamine hydrochloride)、盐酸哌甲酯(methylphenidate hydrochloride)、莫达非尼(modafinil)、匹莫林(pemoline)、盐酸芬特明(phentermine hydrochloride)。至少一种抗帕金森病药可为选自以下的至少一种：盐酸金刚烷胺(amantadinehydrochloride)、甲磺酸苯扎托品(benztropine mesylate)、盐酸比哌立登(biperiden hydrochloride)、乳酸比哌立登(biperiden lactate)、甲磺酸溴隐亭(bromocriptine mesylate)、卡比多巴-左旋多巴(carbidopa-levodopa)、恩他卡朋(entacapone)、左旋多巴(levodopa)、甲磺酸培高利特(pergolide mesylate)、普拉克索二盐酸盐(pramipexoledihydrochloride)、盐酸罗匹尼罗(ropinirole hydrochloride)、盐酸司来吉兰(selegiline hydrochloride)、托卡朋(tolcapone)、盐酸苯海索(trihexyphenidyl hydrochloride)。至少一种其它中枢神经系统药物可为选自以下的至少一种：盐酸安非他酮(bupropion hydrochloride)、盐酸多奈哌齐(donepezil hydrochloride)、氟哌利多(droperidol)、马来酸氟伏沙明(fluvoxamine maleate)、碳酸锂、柠檬酸锂、盐酸那拉曲坦(naratriptan hydrochloride)、尼古丁树脂复合物(nicotine polacrilex)、烟碱透皮系统(nicotine transdermal system)、丙泊酚(propofol)、苯甲酸利扎曲普坦(rizatriptan benzoate)、盐酸西布曲明一水合物(sibutraminehydrochloride monohydrate)、琥珀酸舒马曲坦(sumatriptan succinate)、盐酸他克林(tacrine hydrochloride)、佐米曲普坦(zolmitriptan)。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook第337-530页)。
[0144]至少一种胆碱能药(例如拟副交感神经药)可为选自以下的至少一种：氯贝胆碱(bethanechol chloride)、依酚氯铵(edrophoniumchloride)、溴新斯的明(neostigmine bromide)、甲硫酸新斯的明(neostigmine methylsulfate)、水杨酸毒扁豆碱(physostigmine salicylate)、溴吡斯的明(pyridostigmine bromide)。至少一种抗胆碱能药可为选自以下的至少一种：硫酸阿托品(atropine sulfate)、盐酸双环维林(dicyclomine hydrochloride)、格隆铵(glycopyrrolate)、茛菪碱(hyoscyamine)、硫酸茛菪碱(hyoscyamine sulfate)、溴丙胺太林(propantheline bromide)、东茛菪碱(scopolamine)、丁溴东茛菪碱(scopolaminebutylbromide)、氢溴酸东茛菪碱(scopolaminehydrobromide)。至少一种肾上腺素能药(拟交感神经药)可为选自以下的至少一种：盐酸多巴酚丁胺(dobutamine hydrochloride)、盐酸多巴胺(dopamine hydrochloride)、重酒石酸间羟胺(metaraminol bitartrate)、重酒石酸去甲肾上腺素(norepinephrine bitartrate)、盐酸去氧肾上腺素(phenylephrine hydrochloride)、盐酸伪麻黄碱(pseudoephedrinehydrochloride)、硫酸伪麻黄碱(pseudoephedrine sulfate)。至少一种肾上腺素能阻滞药(交感神经阻滞药)可为选自以下的至少一种：甲磺酸双氢麦角胺(dihydroergotamine mesylate)、酒石酸麦角胺(ergotaminetartrate)、马来酸美西麦角(methysergide maleate)、盐酸普奈洛尔(propranolol hydrochloride)。至少一种骨骼肌松弛药可为选自以下的至少一种：巴氯芬(baclofen)、卡立普多(carisoprodol)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)、盐酸环苯扎林(cyclobenzaprine hydrochloride)、丹曲林钠(dantrolene sodium)、美索巴莫(methocarbamol)、盐酸替扎尼定(tizanidine hydrochloride)。至少一种神经肌肉阻滞药可为选自以下的至少一种：苯磺酸阿曲库铵(atracurium besylate)、苯磺酸顺阿曲库铵(cisatracurium besylate)、多库氯铵(doxacurium chloride)、米库氯铵(mivacurium chloride)、泮库溴铵(pancuronium bromide)、哌库溴铵(pipecuronium bromide)、雷库溴铵(rapacuronium bromide)、罗库溴铵(rocuronium bromide)、氯化琥珀胆碱(succinylcholine chloride)、氯筒箭毒碱(tubocurarine chloride)、维库溴铵(vecuronium bromide)。(参见例如Nuring 2001 Drug Handbook第531-84页)。
[0145]至少一种抗组胺药可为选自以下的至少一种：马来酸溴苯那敏(brompheniramine maleate)、盐酸西替利嗪(cetirizinehydrochloride)、马来酸氯苯拉敏(chlorpheniramine maleate)、富马酸氯马斯汀(clemastine fumarate)、盐酸赛庚啶(cyproheptadinehydrochloride)、盐酸苯海拉明(diphenhydramine hydrochloride)、盐酸非索非那定(fexofenadine hydrochloride)、氯雷他定(loratadine)、盐酸异丙嗪(promethazine hydrochloride)、茶氯酸异丙嗪(promethazine theoclate)、盐酸曲普利啶(triprolidine hydrochloride)。至少一种支气管扩张药可为选自以下的至少一种：沙丁胺醇(albuterol)、硫酸沙丁胺醇(albuterolsulfate)、氨茶碱(aminophylline)、硫酸阿托品(atropine sulfate)、硫酸麻黄碱(ephedrine sulfate)、肾上腺素、重酒石酸肾上腺素(epinephrinebitartrate)、盐酸肾上腺素、异丙托溴铵(ipratropium bromide)、异丙肾上腺素(isoproterenol)、盐酸异丙肾上腺素(isoproterenol hydrochloride)、硫酸异丙肾上腺素(isoproterenol sulfate)、盐酸左沙丁胺醇(levalbuterolhydrochloride)、硫酸奥西那林(metaproterenol sulfate)、胆茶碱(oxtriphylline)、醋酸吡布特罗(pirbuterol acetate)、沙美特罗昔萘酸酯(salmeterol xinafoate)、硫酸特布他林(terbutaline sulfate)、茶碱(theophylline)。至少一种祛痰药或镇咳药可为选自以下的至少一种：苯佐那酯(benzonatate)、磷酸可待因(codeine phosphate)、硫酸可待因(codeine sulfate)、氢溴酸右美沙芬(dextromethorphan hydrobromide)、盐酸苯海拉明(diphenhydramine hydrochloride)、愈创甘油醚(guaifenesin)、盐酸氢吗啡酮(hydromorphone hydrochloride)。至少一种其它呼吸系统药物可为选自以下的至少一种：乙酰半胱氨酸(acetylcysteine)、丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、贝拉坦(beractant)、布地奈德(budesonide)、calfactant、色甘酸二钠(cromolynsodium)、阿法链道酶(dornase alfa)、依前列醇钠(GLP-1 prostenolsodium)、氟尼缩松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、孟鲁司特钠(montelukast sodium)、奈多罗米钠(nedocromil sodium)、帕利珠单抗(palivizumab)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、扎鲁司特(zafirlukast)、齐留通(zileuton)。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook第585-642页)。
[0146]至少一种抗酸药、吸附药或抗胃肠气胀药可为选自以下的至少一种：碳酸铝、氢氧化铝、碳酸钙、镁加铝(magaldrate)、氢氧化镁、氧化镁、西甲硅油(simethicone)和碳酸氢钠。至少一种消化酶或胆石溶解药可为选自以下的至少一种：胰酶(pancreatin)、胰脂肪酶和熊去氧胆酸(ursodiol)。至少一种止泻药可为选自以下的至少一种：绿坡缕石(attapulgite)、碱式水杨酸铋(bismuth subsalicylate)、聚卡波非钙(calcium polycarbophil)、盐酸地芬诺酯(diphenoxylate hydrochloride)或硫酸阿托品(atropine sulfate)、洛哌丁胺(loperamide)、醋酸奥曲肽(octreotide acetate)、阿片酊(opium tincture)、复方樟脑酊(opium tincure(camphorated))。至少一种缓泻药可为选自以下的至少一种：比沙可啶(bisocodyl)、聚卡波非钙(calcium polycarbophil)、美鼠李皮(cascarasagrada)、美鼠李皮芳香流浸膏(cascara sagrada aromatic fluidextract)、美鼠李皮流浸膏(cascara sagrada fluidextract)、蓖麻油、多库酯钙(docusate calcium)、多库酯钠(docusate sodium)、甘油、乳果糖(lactulose)、柠檬酸镁、氢氧化镁、硫酸镁、甲基纤维素、矿物油、聚乙二醇或电解质溶液、欧车前(psyllium)、番泻叶(senna)、磷酸钠。至少一种止吐药可为选自以下的至少一种：盐酸氯丙嗪(chlorpromazinehydrochloride)、茶苯海明(dimenhydrinate)、甲磺酸多拉司琼(dolasetronmesylate)、屈大麻酚(dronabinol)、盐酸格拉司琼(granisetronhydrochloride)、盐酸美克洛嗪(meclizine hydrochloride)、盐酸甲氧氯普胺(metocloproamide hydrochloride)、盐酸昂丹司琼(ondansetronhydrochloride)、奋乃静(perphenazine)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、乙二磺酸丙氯拉嗪(prochlorperazine edisylate)、马来酸丙氯拉嗪(prochlorperazine maleate)、盐酸异丙嗪(promethazine hydrochloride)、东茛菪碱(scopolamine)、马来酸硫乙拉嗪(thiethylperazine maleate)、盐酸曲美苄胺(trimethobenzamide hydrochloride)。至少一种抗溃疡药可为选自以下的至少一种：西咪替丁(cimetidine)、盐酸西咪替丁(cimetidinehydrochloride)、法莫替丁(famotidine)、兰索拉唑(lansoprazole)、米索前列醇(misoprostol)、尼扎替丁(nizatidine)、奥美拉唑(omeprazole)、雷贝拉唑钠(rabeprazole sodium)、雷尼替丁枸橼酸铋(rantidine bismuthcitrate)、盐酸雷尼替丁(ranitidine hydrochloride)、硫糖铝(sucralfate)。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook第643-95页)。至少一种皮质类固醇类药可为选自以下的至少一种：倍他米松(betamethasone)、醋酸倍他米松(betamethasone acetate)或倍他米松磷酸钠(betamethasonesodium phosphate)、倍他米松磷酸钠、醋酸可的松(cortisone acetate)、地塞米松(dexamethasone)、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、醋酸氟氢可的松(fludrocortisone acetate)、氢化可的松(hydrocortisone)、醋酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松(hydrocortisone cypionate)、氢化可的松磷酯钠、氢化可的松琥珀酸钠、甲泼尼龙(methylprednisolone)、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠、泼尼松龙(prednisolone)、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙叔丁乙酯(prednisolone tebutate)、泼尼松(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone)、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、双醋曲安西龙(triamcinolone diacetate)。至少一种雄激素类药或者同化激素类药可为选自以下的至少一种：达那唑(danazol)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、甲睾酮(methyltestosterone)、癸酸诺龙(nandrolone decanoate)、苯丙酸南诺龙(nandrolone phenpropionate)、睾酮(testosterone)、环戊丙酸睾酮(testosterone cypionate)、庚酸睾酮(testosterone enanthate)、丙酸睾酮(testosterone propionate)、睾酮透皮体系。至少一种雌激素类药或孕酮类药可为选自以下的至少一种：酯化雌激素、雌二醇(estradiol)、环戊丙酸雌二醇、雌二醇/醋酸炔诺酮(norethindrone acetate)透皮体系、戊酸雌二醇、结合雌激素(estrogens(conjugated))、硫酸哌嗪雌酮(estropipate)、炔雌醇(ethinyl estradiol)、炔雌醇和去氧孕烯(desogestrel)、炔雌醇和双醋酸炔诺醇(ethynodioldiacetate)、炔雌醇和去氧孕烯、炔雌醇和双醋酸炔诺醇、炔雌醇和左炔诺孕酮(levonorgestrel)、炔雌醇和炔诺酮(norethindrone)、炔雌醇和醋酸炔诺酮、炔雌醇和诺孕酯(norgestimate)、炔雌醇和炔诺孕酮(norgestrel)、炔雌醇和炔诺酮和醋酸盐和富马酸亚铁、左炔诺孕酮(levonorgestrel)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、美雌醇(mestranol)和炔诺酮、炔诺酮、醋酸炔诺酮、炔诺孕酮、黄体酮(progesterone)。至少一种促性腺激素类药可为选自以下的至少一种：醋酸加尼瑞克(ganirelix acetate)、醋酸戈那瑞林(gonadoreline acetate)、酸醋组氨瑞林(histrelin acetate)、尿促性素(menotropins)。至少一种抗糖尿病药或胰高血糖素类药可为选自以下的至少一种：阿卡波糖(acarbose)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)、胰高血糖素(glucagon)、格列本脲(glyburide)、胰岛素、盐酸二甲双胍(metformin hydrochloride)、米格列醇(miglitol)、盐酸吡格列酮(pioglitazone hydrochloride)、瑞格列奈(repaglinide)、马来酸罗格列酮(rosiglitazone maleate)、曲格列酮(troglitazone)。至少一种甲状腺激素类药可为选自以下的至少一种：左甲状腺素钠(levothyroxinesodium)、碘塞罗宁钠(liothyronine sodium)、左甲状腺素钠-三碘甲状腺原氨酸钠(liotrix)、甲状腺干粉(thyroid)。至少一种甲状腺激素拮抗剂可为选自以下的至少一种：甲巯咪唑(methimazole)、碘化钾、碘化钾(饱和溶液)、丙硫尿嘧啶(propylthiouracil)、放射性碘(碘化钠131I)、浓碘溶液。至少一种垂体激素类药可为选自以下的至少一种：促皮质素(corticotropin)、十四肽促皮质素(cosyntropin)、去氨加压素(desmophressin acetate)、醋酸亮丙立德(leuprolide acetate)、长效促皮质素(rGLP-1sitory corticotropin)、人蛋氨生长素(somatrem)、生长激素(somatropin)、加压素(vasopressin)。至少一种甲状旁腺样药物可为选自以下的至少一种：骨化二醇(calcifediol)、降钙素(calcitonin)(人)、降钙素(鲑鱼)、骨化三醇(calcitriol)、双氢速甾醇(dihydrotachysterol)、依替膦酸钠(etidronate disodium)。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook第696-796页)。
[0147]至少一种利尿药可为选自以下的至少一种：乙酰唑胺(acetazolamide)、乙酰唑胺钠、盐酸阿米洛利(amiloride hydrochloride)、布美他尼(bumetanide)、氯噻酮(chlorthalidone)、依他尼酸钠(ethacrynatesodium)、依他尼酸(ethacrynic acid)、呋塞米(furosemide)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、吲达帕胺(indapamide)、甘露醇、美托拉宗(metolazone)、螺内酯(spironolactone)、托塞米(torsemide)、氨苯蝶啶(triamterene)、脲。至少一种电解质或置换溶液可为选自以下的至少一种：乙酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、乳酸钙、磷酸氢钙(calcium phosphate(dibasic))、磷酸钙(calcium phosphate(tribasic))、葡聚糖(高分子量)、葡聚糖(低分子量)、羟乙基淀粉(hetastarch)、氯化镁、硫酸镁、乙酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、葡糖酸钾、林格氏注射液、林格氏注射液(乳酸化)、氯化钠。至少一种酸化剂或碱化剂可为选自以下的至少一种：碳酸氢钠、乳酸钠、氨丁三醇(tromethamine)。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook第797-833页)。
[0148]至少一种补血药可为选自以下的至少一种：富马酸亚铁、葡糖酸亚铁、硫酸亚铁、硫酸亚铁(无水)、右旋糖酐铁(iron dextran)、山梨醇铁、多糖-铁复合物、葡萄糖酸铁钠复合物。至少一种抗凝血药可为选自以下的至少一种：阿地肝素钠(ardeparin sodium)、达肝素钠(dalteparin sodium)、达那肝素钠(danaparoid sodium)、依诺肝素钠(enoxaparin sodium)、肝素钙(heparin calcium)、肝素钠(heparin sodium)、华法林钠(warfarin sodium)。至少一种血液衍生物可为选自以下的至少一种：白蛋白5％、白蛋白25％、抗血友病因子(antihemophilic factor)、抗抑制剂凝剂复合物(anti-inhibitor coagulant complex)、抗凝血酶III(人)、IX因子(人)、IX因子复合物、血浆蛋白组分。至少一种溶栓酶可为选自以下的至少一种：阿替普酶(alteplase)、阿尼普酶(anistreplase)、瑞替普酶(reteplase)(重组)、链激酶(streptokinase)、尿激酶(urokinase)。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook第834-66页)。
[0149]至少一种烷基化药物可为选自以下的至少一种：白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、洛莫司汀(lomustine)、盐酸氮芥(mechlorethaminehydrochloride)、美法仑(melphalan)、盐酸美法仑(melphalanhydrochloride)、链佐星(streptozocin)、替莫唑胺(temozolomide)、塞替派(thiotepa)。至少一种抗代谢药可为选自以下的至少一种：卡培他滨(capecitabine)、克拉屈滨(cladribine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿苷(floxuridine)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、羟基脲(hydroxyurea)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氨蝶呤钠、硫鸟嘌呤(thioguanine)。至少一种抗生素抗肿瘤药可为选自以下的至少一种：硫酸博来霉素(bleomycinsulfate)、放线菌素D(dactinomycin)、枸橼酸柔红霉素脂质体(daunorubicin citrate liposomal)、盐酸柔红霉素(daunorubicinhydrochloride)、盐酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride)、盐酸多柔比星脂质体、盐酸表柔比星(epirubicin hydrochloride)、盐酸伊达比星(idarubicin hydrochloride)、丝裂霉素(mitomycin)、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)、戊柔比星(valrubicin)。至少一种可改变激素平衡的抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种：阿那曲唑(anastrozole)、比卡鲁胺(bicalutamide)、雌莫司汀磷酸钠(estramustinephosphate sodium)、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、来曲唑(letrozole)、醋酸亮丙立德(leuprolideacetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、尼鲁米特(nilutamide)、枸橼酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)、睾内脂(testolactone)、枸橼酸托瑞米芬(toremifene citrate)。至少一种其它抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种：天冬酰胺酶、卡介苗(bacillus Calmette-Guerin，BCG)(活体膀胱内)、达卡巴嗪(dacarbazine)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷、盐酸吉西他滨(gemcitabine hydrochloride)、盐酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)、米托坦(mitotane)、盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)、紫衫醇(paclitaxel)、培门冬酶(pegaspargase)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、盐酸丙卡巴肼(procarbazinehydrochloride)、利妥昔单抗(rituximab)、替尼泊苷(teniposide)、盐酸托泊替康(topotecan hydrochloride)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维A酸(tretinoin)、硫酸长春碱(vinblastine sulfate)、硫酸长春新碱(vincristinesulfate)、酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)。(参见例如Nursing 2001Drug Handbook第867-963页)。
[0150]上述至少一种免疫抑制药可为选自以下的至少一种：硫唑嘌呤(azathioprine)、巴利昔单抗(basiliximab)、环孢菌素(cyclosporine)、达克珠单抗(daclizumab)、淋巴细胞免疫球蛋白、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、麦考酚酸酯(mycophenolate mofetil)、盐酸麦考酚酸酯、西罗莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)。上述至少一种疫苗或类毒素可为选自以下的至少一种：BCG疫苗、霍乱疫苗、白喉和破伤风类毒素(吸附型)、白喉和破伤风类毒素和吸附无细胞百日咳疫苗、白喉和破伤风类毒素和全细胞百日咳疫苗、b型嗜血杆菌结合疫苗、甲型肝炎疫苗(灭活)、乙型肝炎疫苗(重组)、A和B型流感病毒疫苗1999-2000三价型(纯表面抗原)、A和B型流感病毒疫苗1999-2000三价型(亚病毒体或纯化的亚病毒体)、A和B型流感病毒疫苗1999-2000三价型(全病毒粒)、日本脑炎病毒疫苗(灭活)、莱姆病(Lyme disease)疫苗(重组OspA)、麻疹和流行性腮腺炎和风疹病毒疫苗(活疫苗)、麻疹和流行性腮腺炎和风疹病毒疫苗(减毒活疫苗)、麻疹病毒疫苗(减毒活疫苗)、流行性脑膜炎多糖疫苗、流行性腮腺炎病毒疫苗(活疫苗)、鼠疫菌苗、肺炎球菌菌苗(多价)、脊髓灰质炎病毒疫苗(灭活)、脊髓灰质炎病毒疫苗(三价口服活疫苗)、狂犬病疫苗(吸附型)、狂犬病疫苗(人二倍体细胞)、风疹和流行性腮腺炎病毒疫苗(活疫苗)、风疹病毒疫苗(减毒活疫苗)、破伤风类毒素(吸附型)、破伤风类毒素(液体)、伤寒疫苗(口服)、伤寒疫苗(胃肠外)、伤寒Vi多糖疫苗、水痘病毒疫苗、黄热病疫苗。至少一种抗毒素或抗蛇毒血清可为选自以下的至少一种：黑寡妇蜘蛛抗蛇毒血清、响尾蛇抗蛇毒素(多价)、白喉抗毒素(马)、金黄珊瑚蛇(Micrurus fulvius)抗蛇毒血清。至少一种免疫血清可为选自以下的至少一种：巨细胞病毒免疫球蛋白(静脉内)、乙型肝炎免疫球蛋白(人)、肌内注射免疫球蛋白、静脉注射免疫球蛋白、狂犬病免疫球蛋白(人)、静脉注射呼吸道合胞体病毒免疫球蛋白(人)、Rh0(D)免疫球蛋白(人)、静脉注射Rh0(D)免疫球蛋白(人)、破伤风免疫球蛋白(人)、水痘-带状疱疹免疫球蛋白。至少一种生物反应调节剂可为选自以下的至少一种：阿地白介素(aldesleukin)、阿法依泊汀(GLP-1 etin alfa)、非格司亭(filgrastim)、醋酸格拉默注射剂(glatirameracetate for injection)、复合干扰素-1(interferon alfacon-1)、干扰素α-2a(重组)、干扰素α-2b(重组)、干扰素β-1a、干扰素β-1b(重组)、干扰素γ-1b、盐酸左旋咪唑(levamisole hydrochloride)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、沙格司亭(sargramostim)。(参见例如Nursing 2001 DrugHandbook第964-1040页)。
[0151]至少一种眼用抗感染药可选自以下的至少一种：杆菌肽(bacitracin)、氯霉素(chloramphenicol)、盐酸环丙沙星(ciprofloxacinhydrochloride)、红霉素(erythromycin)、硫酸庆大霉素(gentamic insulfate)、氧氟沙星(ofloxacin)0.3％、硫酸多粘菌素B(polymyxin Bsulfate)、磺胺醋酰钠(sulfacetamide sodium)10％、磺胺醋酰钠15％、磺胺醋酰钠30％、妥布霉素(tobramycin)、阿糖腺苷(vidarabine)。上述至少一种眼用抗炎药可为选自以下的至少一种：地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸钠、双氯芬酸钠(diclofenac sodium)0.1％、氟米龙(fluorometholone)、氟比洛芬钠(flurbiprofen sodium)、酮咯酸氨丁三醇(ketorolac tromethamine)、醋酸泼尼松龙(prednisoloneacetate)(混悬液)、泼尼松龙磷酸钠(溶液剂)。上述至少一种缩瞳药可为选自以下的至少一种：氯乙酰胆碱(acetylocholine chloride)、卡巴胆碱(carbachol)(眼内)、卡巴胆碱(局部)、碘依可酯(echothiophate iodide)、毛果芸香碱(pilocarpine)、盐酸毛果芸香碱、硝酸毛果芸香碱。至少一种散瞳药可为选自以下的至少一种：硫酸阿托品(atropine sulfate)、盐酸环喷托酯(cyclopentolate hydrochloride)、盐酸肾上腺素(epinephrinehydrochloride)、环硼肾上腺素(epinephryl borate)、氢溴酸后马托品(homatropine hydrobromide)、盐酸去氧肾上腺素(phenylephrinehydrochloride)、氢溴酸东莨菪碱(scopolamine hydrobromide)、托吡卡胺(tropicamide)。至少一种眼用血管收缩药可为选自以下的至少一种：盐酸萘甲唑啉(naphazoline hydrochloride)、盐酸羟甲唑啉(oxymetazoline hydrochloride)、盐酸四氢唑啉(tetrahydrozolinehydrochloride)。至少一种其它眼药可为选自以下的至少一种：盐酸阿可乐定(apraclonidine hydrochloride)、盐酸倍他洛尔(betaxololhydrochloride)、酒石酸溴莫尼定(brimonidine tartrate)、盐酸卡替洛尔(carteolol hydrochloride)、盐酸地匹福林(dipivefrin hydrochloride)、盐酸多佐胺(dorzolamide hydrochloride)、二富马酸依美斯汀(emedastinedifumarate)、荧光素钠、富马酸酮替芬(ketotifen fumarate)、拉坦前列素(latanoprost)、盐酸左布诺洛尔(levobunolol hydrochloride)、盐酸美替洛尔(metipranolol hydrochloride)、氯化钠(高渗)、马来酸噻吗洛尔(timolol maleate)。至少一种耳用药可为选自以下的至少一种：硼酸、过氧化氢脲、氯霉素、油酸三乙醇胺多肽缩合物。至少一种鼻用药可为选自以下的至少一种：丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、布地奈德(budesonide)、硫酸麻黄碱(ephedrine sulfate)、盐酸肾上腺素、氟尼缩松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、盐酸萘甲唑啉(naphazoline hydrochloride)、盐酸羟甲唑啉(oxymetazolinehydrochloride)、盐酸去氧肾上腺素(phenylephrine hydrochloride)、盐酸四氢唑啉(tetrahydrozoline hydrochloride)、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、盐酸赛洛唑啉(xylometazoline hydrochloride)。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook第1041-97页)。
[0152]至少一种局部抗感染药可为选自以下的至少一种：阿昔洛韦(acyclovir)、两性霉素B(amphotericin B)、壬二酸乳膏、杆菌肽(bacitracin)、硝酸布康唑(butoconazole nitrate)、磷酸克林霉素(clindamycin phosphate)、克霉唑(clotrimazole)、硝酸益康唑(econazolenitrate)、红霉素、硫酸庆大霉素、酮康唑(ketoconazole)、醋酸磺胺米隆(mafenide acetate)、甲硝唑(metronidazole)(局部)、硝酸咪康唑(miconazole nitrate)、莫匹罗星(mupirocin)、盐酸萘替芬(naftifinehydrochloride)、硫酸新霉素(neomycin sulfate)、呋喃西林(nitrofurazone)、制霉菌素(nystatin)、磺胺嘧啶银(silver sulfadiazine)、盐酸特比萘芬(terbinafine hydrochloride)、特康唑(terconazole)、盐酸四环素、噻康唑(tioconazole)、托萘酯(tolnaftate)。至少一种杀疥螨药或灭虱药可为选自以下的至少一种：克罗米通(crotamiton)、林旦(lindane)、扑灭司林(permethrin)和除虫菊酯(pyrethrin)。至少一种局部用皮质类固醇可为选自以下的至少一种：倍他米松二丙酸盐(betamethasone dipropionate)、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索(clobetasolpropionate)、地奈德(desonide)、去羟米松(desoximetasone)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸钠、双醋二氟拉松(diflorasonediacetate)、氟轻松(fluocinolone acetonide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟氢缩松(flurandrenolide)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、哈西奈德(halcinonide)、氢化可的松(hydrocortisone)、醋酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、丁酸氢化可的松(hydrocortisone butyrate)、戊酸氢化可的松(hydrocorisone valerate)、糠酸莫米松(mometasonefuroate)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)。(参见例如Nursing 2001Drug Handbook第1098-1136页)。
[0153]上述至少一种维生素或矿物质可为选自以下的至少一种：维生素A、复合维生素B、维生素B12、叶酸、羟钴胺(hydroxocobalamin)、亚叶酸钙(leucovorin calcium)、烟酸(niacin)、烟酰胺(niacinamide)、盐酸吡哆醇(pyridoxine hydrochloride)、核黄素、盐酸硫胺(thiamine hydrochloride)、维生素C、维生素D、胆钙化醇(cholecalciferol)、麦角骨化醇(ergocalciferol)、维生素D类似物、度骨化醇(doxercalciferol)、帕立骨化醇(paricalcitol)、维生素E、维生素K类似物、维生素K1(phytonadione)、氟化钠、氟化钠(局部)、痕量元素、铬、铜、碘、锰、硒、锌。至少一种热质可为选自以下的至少一种：氨基酸输液剂(结晶)、氨基酸右旋糖输液剂、氨基酸与电解质输液剂、氨基酸与电解质右旋糖输液剂、用于肝衰竭的氨基酸输液剂、用于高代谢应激的氨基酸输液剂、用于肾衰竭的氨基酸输液剂、右旋糖、脂肪乳、中链脂肪酸甘油三酯。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook第1137-63页)。
[0154]本发明还提供任何合适和/或有效量的组合物或药物组合物的至少一种，该组合物或药物组合物包含至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，任选还包含有效量的至少一种其它化合物、蛋白质或组合物，所述其它化合物、蛋白质或组合物选自以下的至少一种：TNF拮抗剂(例如但不限于TNF化学或蛋白质拮抗剂、TNF单克隆或多克隆抗体或片段、可溶性TNF受体(例如p55、p70或p85)或片段、其融合多肽、或小分子TNF拮抗剂，例如TNF结合蛋白I或II(TBP-I或TBP-II)、奈瑞莫单抗(nerelimonmab)、英利昔单抗(infliximab)、enteracept、CDP-571、CDP-870、阿非莫单抗(afelimomab)、来那西普(lenercept)等)、抗风湿药(例如甲氨蝶呤、金诺芬(auranofin)、金硫葡糖(aurothioglucose)、硫唑嘌呤(azathioprine)、依那西普(etanercept)、金硫丁二钠(gold sodium thiomalate)、硫酸羟氯喹(hydroxychloroquinesulfate)、来氟米特(leflunomide)、柳氮磺吡啶(sulfasalzine))、肌肉松弛药、麻醉品、非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静药、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞药、抗微生物药物(例如氨基糖苷类药(aminoglycoside))、抗真菌药、抗寄生虫药、抗病毒药、卡巴培南类药(carbapenem)、头孢菌素类药(cephalosporin)、氟喹诺酮类药(flurorquinolone)、大环内酯类药(macrolide)、青霉素类药、磺胺类药(sulfonamide)、四环素类药、其它抗微生物药物)、抗银屑病药、皮质类固醇、同化激素类药、糖尿病相关药物、矿物质类药、营养类药、甲状腺药物、维生素、钙相关激素类药、止泻药、镇咳药、止吐药、抗溃疡药、缓泻药、抗凝血药、红细胞生成素(例如阿法依泊汀)、非格司亭(例如G-CSF、优保津(Neupogen))、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制药(例如巴利昔单抗、环孢菌素、达克珠单抗)、生长激素类药、激素替代药物、雌激素受体调节物、散瞳药、睫状肌麻痹药、烷基化药物、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂药、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐(donepezil)、他克林(tacrine)、哮喘药、β激动剂、吸入型类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸(cromolyn)、肾上腺素或类似物、阿法链道酶(dornasealpha/Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。所述细胞因子的非限制性实例包括但不限于IL-1至IL-23的任一种。合适剂量为本领域所熟知。参见例如Wells等主编，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，精装版，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，所述每份文献均通过引用全部结合到本文中。
[0155]这种组合物还可包括与至少一种本发明抗体或多肽缔合、结合、共同配制或共同给予的毒素分子。该毒素任选可起选择性杀死病理细胞或组织的作用。病理细胞可为癌细胞或其它细胞。这类毒素可为但不仅限于纯毒素或重组毒素或含毒素的至少一个功能性细胞毒素结构域的毒素片段，所述毒素选自例如以下的至少一种：蓖麻毒蛋白、白喉毒素、蛇毒毒素或细菌毒素。术语毒素还包括由任何天然存在、突变型或重组细菌或病毒所产生的、可在人和其它哺乳动物中引起任何病理病症的内毒素和外毒素，所述病理病症包括可导致死亡的中毒性休克。这类毒素可包括但不限于：肠产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、耐热肠毒素(ST)、志贺氏菌(Shigella)细胞毒素、气单胞菌(Aeromonas)肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌肠毒素A(SEA)、葡萄球菌肠毒素B(SEB)或葡萄球菌肠毒素C(SEC)、链球菌肠毒素等。这类细菌包括但不限于以下细菌的菌株：产肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌种、肠出血性大肠杆菌(例如血清型0157：H7菌株)、葡萄球菌菌种(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酿脓葡萄球菌(Staphylococcus pyogenes))、志贺氏菌菌种(例如痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)和宋内氏志贺氏菌(Shigellasonnei))、沙门氏菌(Salmonella)菌种(例如伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholera-suis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis))、梭菌(Clostridium)菌种(例如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridium dificile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum))、弯曲杆菌(Camphlobacter)菌种(例如空肠弯曲杆菌(Camphlobacter jejuni)、胎儿弯曲杆菌(Camphlobacter fetus))、螺杆菌(Heliobacter)菌种(例如幽门螺杆菌(Heliobacterpylori))、气单胞菌菌种(例如温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae))、类志贺邻单胞菌(Pleisomonas shigelloides)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinaenterocolitica)、弧菌(Vibrios)菌种(例如霍乱弧菌(Vibrios cholerae)、副溶血弧菌(Vibrios parahemolyticus))、克雷伯氏菌(Klebsiella)菌种、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和链球菌属(Streptococci)。参见例如Stein主编，INTERNAL MEDICINE，第3版，第1-13页，Little，Brown and Co.，Boston，(1990)；Evans等主编，Bacterial Infections ofHumans：Epidemiology and Control，第2版，第239-254页，PlenumMedical Book Co.，New York(1991)；Mandell等，Principles and Practiceof Infectious Diseases，第3版，Churchill Livingstone，New York(1990)；Berkow等主编，The Merck Manual，第16版，Merck and Co.，Rahway，N.J.，1992；Wood等，FEMS Microbiology Immunology，76：121-134(1991)；Marrack等，Science，248：705-711(1990)，这些文献的内容均通过引用全部结合到本文中。
[0156]本发明的GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物还可含有至少任一种合适的助剂，例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂等。优选药学上可接受的助剂。这些无菌溶液剂的非限制性实例及制备方法是本领域众所周知的，例如但不限于Gennaro主编，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(Easton，PA)1990。可按照本领域熟知或本文所描述方法，以常规方法选出适于GLP-1模拟体组合物的给药方式、溶解度和/或稳定性的药学上可接受的载体。
[0157]用于本发明组合物的药用赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质和糖类(例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，它们可单独或组合存在，单独或组合地占1-99.99％(重量或体积)。示例性的蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可发挥缓冲功能的代表性氨基酸/GLP-1模拟体或特定部分或变体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿司帕坦(aspartame)等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
[0158]适用于本发明的糖类赋形剂包括例如单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇等。适用于本发明的优选糖类赋形剂为甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
[0159]GLP-1模拟体组合物还可包括缓冲剂或pH调节剂，缓冲剂通常是由有机酸或碱制成的盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐或苯二甲酸盐；Tris、盐酸氨丁三醇或磷酸盐缓冲剂。适用于本发明组合物优选的缓冲剂为有机酸盐，例如柠檬酸盐。
[0160]另外，本发明的GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物可包括聚合的赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、菲可(ficoll)(一种聚糖)、葡萄糖结合剂(例如环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、矫味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨酯，例如“吐温20(TWEEN20)”和“吐温80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
[0161]适用于本发明GLP-1模拟体组合物的这些药物赋形剂和/或添加剂及其它已知的药物赋形剂和/或添加剂为本领域所知，例如以下文献中所列举的药物赋形剂和/或添加剂：“Remington TheScience & Practice ofPharmacy”，第19版，Williams & Williams，(1995)和“Physician′s Desk Reference”第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)，这些文献的公开内容通过引用全部结合到本文中。优选的载体或赋形剂材料为糖类(例如糖和糖醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合物。
[0162]制剂。如上所述，本发明提供稳定的制剂，该制剂优选可含有盐水或选定盐的合适缓冲剂、任选含有防腐剂的防腐溶液和制剂及适于药用或兽用的多用途防腐制剂、以及包含在药学上可接受的制剂中的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。防腐制剂含有至少一种已知的防腐剂或任选选自以下的至少一种：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、三氯叔丁醇、氯化镁(例如六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞或它们在水性稀释液中的混合物。可按照本领域所知使用任何合适的浓度或混合物，例如0.001-5％，或其中的任何范围或数值，例如但不限于0.001％、0.003％、0.005％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.3％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％或其中的任何范围或数值。非限制性实例包括：无防腐剂、0.1-2％间甲酚(例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.9％、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如0.5％、0.9％、1.1％、1.5％、1.9％、2.0％、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如0.005％、0.01％)、0.001-2.0％苯酚(例如0.05％、0.25％、0.28％、0.5％、0.9％、1.0％)、0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烷基酯(例如0.00075％、0.0009％、0.001％、0.002％、0.005％、0.0075％、0.009％、0.01％、0.02％、0.05％、0.075％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.75％、0.9％、1.0％)等。
[0163]如上所述，本发明提供一种制造品，该制造品包括包装材料和至少一个小瓶，小瓶装有至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与指定缓冲剂和/或防腐剂的溶液，任选溶于水性稀释液中，其中所述包装材料包括标明了该溶液可在1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长时间内保存的标签。本发明还包括一种制造品，该制造品包括包装材料、装有至少一种冻干GLP-1模拟体或特定部分或变体的第一小瓶以及装有指定缓冲剂或防腐剂的水性稀释液的第二小瓶，其中所述包装材料包括一个标签，指导患者如何将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体在水性稀释液中重配成可在24小时或更长时间内保存的溶液。
[0164]用于本发明的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体可通过重组方法产生，包括由哺乳动物细胞或转基因制品产生，或者可按照本文所描述或本领域已知的方法，从其它生物来源中纯化出来。
[0165]本发明产品中至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体量的范围包括重配后(如果是湿/干系统的话)产生约10μg/ml至约1000mg/ml浓度的量，尽管更低和更高浓度也是可行的，这取决于拟定的递送载体，例如溶液制剂可不同于透皮药贴、经肺、经粘膜或渗透法或微泵法。
[0166]优选上述水性稀释液还任选包含药学上可接受的防腐剂。优选的防腐剂包括选自以下的防腐剂：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞或其混合物。用于制剂中的防腐剂的浓度是足以产生抗微生物作用的浓度。该浓度取决于所选择的防腐剂，技术人员易作出决定。
[0167]可任选和优选地将其它赋形剂，例如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐增强剂加到稀释液中。通常以已知浓度使用等渗剂，例如甘油。优选加入生理可耐受的缓冲剂，以改进pH控制。所述制剂可包括大范围的pH，如由约pH4至约pH10，优选范围为约pH5至约pH9，最优选范围为约pH6.0至约pH8.0。优选本发明制剂的pH值约6.8至约7.8之间。优选的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂，最优选为磷酸钠，尤其是磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
[0168]任选可将其它添加剂加到所述制剂或组合物中，以减少聚集作用，所述其它添加剂如药学上可接受的增溶剂，例如吐温20(聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)、吐温40(聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、吐温80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)、普流罗尼克F68(Pluronic F68)(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或非离子表面活性剂(例如聚山梨酯20或80或泊洛沙姆184或188)，
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 polyl、其它嵌段共聚物以及螯合剂，例如EDTA和EGTA。如果使用泵或塑料容器给予所述制剂，则这些添加剂特别有用。药学上可接受的表面活性剂的存在降低蛋白质的聚集倾向。
[0169]本发明的制剂可通过这样的方法制备，即包括将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与选自以下的防腐剂在水性稀释液中混合：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞或其混合物。使用常规溶解和混合方法，将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与防腐剂在水性稀释液中混合。为了制备合适的制剂，例如，将已测量的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的缓冲溶液与所需防腐剂的缓冲溶液以足以提供所需蛋白质和防腐剂浓度的量相混合。本领域普通技术人员应了解该方法的变通方法。例如，制备制剂时，加入各组分的顺序、是否采用其它添加剂、温度和pH，这些都是使所用浓度和给药途径最优化的因素。
[0170]要求保护的制剂可作为澄清溶液或以两个小瓶提供给患者，两小瓶中第一小瓶装有的至少一种冻干GLP-1模拟体或特定部分或变体，可用第二小瓶装有的水、防腐剂和/或赋形剂的水性稀释液、优选磷酸盐缓冲剂和/或盐水和选定盐的水性稀释液重配。单一溶液小瓶或需重配的两小瓶均可重复使用多次，并可满足患者治疗的一个或多个周期，从而可提供比现行治疗方案更为便利的治疗方案。
[0171]本发明要求保护的制造品适用于在即用至24小时以上的一段时间内给予。因此，本发明要求保护的制造品为患者提供相当大的益处。本发明制剂可任选在约2℃至约40℃的温度下安全保存并长期保持蛋白质的生物活性，因而使得包装标签能够标明该溶液可在6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时或更长时间内保存和/或使用。如采用防腐稀释剂，则该标签可包括长达1-12个月、半年、一年半和/或两年的至少一个使用期限。
[0172]本发明的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的溶液可通过这样的方法制备，即包括将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体在水性稀释液中混合。使用常规溶解和混合方法进行混合。例如，为了制备合适的稀释液，将已测量的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的水或缓冲液与足以提供所需蛋白质和任选防腐剂或缓冲剂浓度的量相混合。本领域普通技术人员应了解该方法的变通方法。例如，制备制剂时，加入各组分的顺序、是否采用其它添加剂、温度和pH，这些都是可使所用浓度和给药途径优化的因素。
[0173]要求保护的产品可以澄清溶液或两个小瓶提供给患者，两小瓶中第一小瓶装有的至少一种冻干GLP-1模拟体或特定部分或变体，可用第二小瓶装有的水性稀释液重配。单一溶液小瓶或需重配的两个小瓶均可重复使用多次，并可满足患者治疗的一个或多个周期，从而可提供比现行治疗方案更为便利的治疗方案。
[0174]可通过向药房、诊所或其它这样的机构和设施提供澄清溶液或两个小瓶，而间接将要求保护的产品提供给患者，两个小瓶中第一小瓶装有的至少一种冻干GLP-1模拟体或特定部分或变体，可用第二小瓶装有的水性稀释液重配。这情况下澄清溶液的体积可多达一升甚至更大，只要可一次或多次从大储液器中取出较少部分的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体溶液，以转移到较小的小瓶中，并由药房或诊所提供给其顾客和/或患者。
[0175]普遍接受的装有这些单瓶系统的装置包括用于递送溶液的笔型注射器，例如
Figure A200780034262D0084101911QIETU
、
Figure A200780034262D0084101918QIETU
、
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、
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和
Figure A200780034262D0084101941QIETU
。普遍接受的装有两小瓶系统的装置包括可用于在针筒中重配冻干药物并递送该重配溶液的笔型注射器系统，例如。
[0176]本发明要求保护的产品包括包装材料。除管理机构要求的信息外，该包装材料还提供使用该产品的条件。对于两小瓶湿/干产品，本发明的包装材料向患者提供使用说明书，以便将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体在水性稀释液中重配成溶液剂并在2-24小时或更长时间内使用该溶液剂。对于单瓶溶液产品而言，标签标明该溶液可在2-24小时或更长时间内使用。本发明要求保护的产品可用于人用药品用途。
[0177]本发明的制剂可通过这样的方法制备，即包括将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与选定的缓冲液混合，所述缓冲液优选为含有盐水或选定盐的磷酸缓冲液。使用常规溶解和混合方法，将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与缓冲液的水性稀释液相混合。例如，为了制备合适的制剂，将已测量的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的水溶液或缓冲液与所需缓冲剂的水溶液以足以提供所需蛋白质和缓冲剂浓度的量相混合。本领域普通技术人员应了解该方法的变通方法。例如，制备制剂时，加入各组分的顺序、是否采用其它添加剂、温度和pH，这些都是使所用浓度和给药途径最优化的因素。
[0178]要求保护的稳定制剂或防腐制剂可作为澄清溶液或以两个小瓶提供给患者，两小瓶中第一小瓶装有的至少一种冻干GLP-1模拟体或特定部分或变体，可用第二小瓶装有的防腐剂或缓冲剂和赋形剂的水性稀释液重配。单个溶液瓶或需重配的两个小瓶均可重复使用多次，并可满足患者治疗的一个或多个周期，从而提供比现行治疗方案更为便利的治疗方案。
[0179]可按照本发明通过多种递药方法给予患者本文所述的稳定制剂或防腐制剂或溶液中的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，递药方法包括皮下(SC)注射或肌内(IM)注射；透皮、经肺、经粘膜、植入、渗透泵、针筒、微量泵或技术人员了解本领域熟知的其它方法。
[0180]治疗应用。本发明的模拟体还提供用于在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗以下疾病的方法：糖尿病、I型或II型糖尿病，包括成人起病或青少年型、胰岛素依赖型、非胰岛素依赖型等，包括相关体征和症状，例如但不限于胰岛素抵抗、高血糖症、低血糖症、胰腺炎、Sushing综合征、黑棘皮病、脂肪萎缩型糖尿病、视网膜病、肾病、多神经病、单神经病、自主神经病、溃疡、足溃疡、关节问题、感染(例如真菌或细菌感染)等。
[0181]本发明还提供用于在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗与免疫相关疾病有关的至少一种糖尿病的方法，包括但不限于以下的至少一种：I型或II型糖尿病，包括成人起病或青少年型、胰岛素依赖型、非胰岛素依赖型等，包括相关体征和症状，例如但不限于胰岛素抵抗、高血糖症、低血糖症、胰腺炎、Sushing综合征、黑棘皮病、脂肪萎缩型糖尿病、视网膜病、肾病、多神经病、单神经病、自主神经病、溃疡、足溃疡、关节问题、感染(例如真菌或细菌感染)等。参见例如Merck Manual，第12-17版，Merck & Company，Rahway，NJ(1972，1977，1982，1987，1992，1999)，PharmacotherapyHandbook，Wells等主编，第二版，Appleton and Lange，Stamford，Conn.(1998，2001)，所述每份文献都通过全部结合到本文中。
[0182]该方法可任选包括给予需要这种调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者有效量的至少一种组合物或药物组合物，其包含至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。
[0183]本发明还提供用于在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗至少一种心血管疾病的方法，所述心血管疾病包括但不限于以下的至少一种：心源性眩晕综合征(cardiac stun syndrome)、心肌梗死、充血性心力衰竭、中风、缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、糖尿病性动脉硬化病、高血压、动脉高血压(arterialhypertension)、肾血管高血压、晕厥、休克、心血管系统梅毒、心力衰竭、肺源性心脏病(cor pulmonale)、原发性肺动脉高血压、心律失常、房性异位搏动、心房扑动、心房性纤维颤动(持续性或阵发性)、紊乱性或多源性房性心动过速、有规律的窄QRS心动过速、特殊心律失常、心室性纤维颤动、希氏束心律失常、房室传导阻滞、束支传导阻滞、心肌局部缺血失调、冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张型充血性心肌病、限制性心肌病、瓣膜心脏病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉瘤和周围动脉瘤、主动脉壁夹层形成、主动脉炎症、腹主动脉及其分支闭塞、外周血管疾病、闭塞性动脉疾病、外周动脉粥样硬化病、血栓闭塞性脉管炎、功能性外周动脉失调、雷诺现象(Raynaud’s phenomenon)和雷诺病、手足发绀、红斑性肢痛病、静脉疾病、静脉血栓形成、静脉曲张、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定心绞痛、再灌注损伤、体外冠状动脉搭桥术后综合征(post pumpsyndrome)、局部缺血-再灌注损伤等。这种方法任选可包括给予需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者有效量的含至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的组合物或药物组合物。
[0184]本发明的任何方法都可包括给予需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者有效量的组合物或药物组合物，所述组合物或药物组合物包含至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。这种方法任选还可包括共同给药或联合疗法用于治疗这类免疫疾病，其中给予所述至少一种GLP-1模拟体、其特定部分或变体还包括在其之前、同时和/或之后给予至少一种选自以下的至少一种：TNF拮抗剂(例如但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、其融合蛋白或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药、肌肉松弛药、麻醉药、非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静药、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞药、抗微生物药物(例如氨基糖苷类药、抗真菌药、抗寄生虫药、抗病毒药、卡巴培南类药、头孢菌素类药、氟喹诺酮类药、大环内酯类药、青霉素类药、磺胺类药、四环素类药、其它抗微生物药物)、抗银屑病药、皮质类固醇、同化激素类药、糖尿病相关药物、矿物质类药、营养类药、甲状腺药物、维生素、钙相关激素类药、止泻药、镇咳药、止吐药、抗溃疡药、缓泻药、抗凝血药、红细胞生成素(例如阿法依泊汀(GLP-1etin alfa))、非格司亭(例如G-CSF、优保津)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制药(例如巴利昔单抗、环孢菌素、达克珠单抗)、生长激素类药、激素替代药物、雌激素受体调节物、散瞳药、睫状肌麻痹药、烷基化药物、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂药、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β激动剂、吸入型类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、阿法链道酶(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。合适的剂量是本领域众所周知的。参见例如Wells等主编，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon PocketPharmacopoeia 2000，精装版，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，所述每份文献都通过引用全部结合到本文中。
[0185]还可离体使用模拟体，例如自体骨髓培养物。简单地讲，在化学治疗之前，从患者体内取出骨髓，并采用TPO和/或GLP-1处理，任选结合模拟体，任选结合一种或多种其它细胞因子进行该处理。然后，将经过处理的骨髓再输回经过化学治疗的患者，以加速骨髓恢复。另外，TPO可单用，也可与GLP-1模拟体和/或GLP-1联用，以用于离体骨髓细胞或外周血祖细胞(PBPC)增殖。在化学治疗之前，可使用干细胞生长因子(SCF)或G-CSF刺激骨髓，以将早期祖细胞释放到外周循环中。任选从外周血中收集并浓缩这些祖细胞，然后用TPO和模拟体在培养物中进行处理，任选结合一种或多种其它细胞因子，包括但不限于SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6或IL-11，使其分化并增殖成为高密度巨核细胞培养物，然后任选将其再输回经过高剂量化学治疗的患者体内。用于离体处理骨髓的TPO的剂量范围可为100pg/ml～1ong/ml，优选为500pg/ml～3ng/ml。模拟体的剂量应在活性上等同于GLP-1，GLP-1剂量范围可为0.1单位/ml～20单位/ml，优选为0.5单位/ml～2单位/ml或其中的任何范围或数值。
[0186]适用于本发明组合物、联合疗法、共同给药、装置和/或方法的TNF拮抗剂(还包括本发明的至少一种抗体、其特定部分和变体)包括但不限于：抗TNF抗体、其配体结合片段和与TNF特异性结合的受体分子；阻止和/或抑制TNF合成、TNF释放或其对靶细胞起作用的化合物，例如沙利度胺、替尼达普、磷酸二酯酶抑制剂(例如己酮可可碱和咯利普兰(rolipram))、A2b腺苷受体激动剂和A2b腺苷受体增强剂；阻止和/或抑制TNF受体信号转导的化合物，例如促分裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制剂；阻断和/或抑制膜TNF裂解的化合物，例如金属蛋白酶抑制剂；阻断和/或抑制TNF活性的化合物，例如血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利)；和阻断和/或抑制TNF产生和/或合成的化合物，例如MAP激酶抑制剂。
[0187]本文所用的“肿瘤坏死因子抗体”、“TNF抗体”、“TNFα抗体”或片段等在体外、原位和/或优选体内降低、阻断、抑制、消除或干扰TNFα活性。例如，本发明合适的TNF人抗体可与TNFα结合，并包括抗TNF抗体、其抗原结合片段和与TNFα特异性结合的特定突变体或其结构域。合适的TNF抗体或片段还可降低、阻断、消除、干扰、阻止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白质合成、TNF释放、TNF受体信号转导、膜TNF裂解、TNF活性、TNF产生和/或合成。
[0188]嵌合抗体cA2由高亲和力中和小鼠抗人TNFαIgG1抗体(称为A2)的抗原结合可变区和人IgG1恒定区(K免疫球蛋白)组成。人IgG1Fc区改进同种异型抗体效应子功能，增加抗体的循环血清半衰期，降低抗体的免疫原性。嵌合抗体cA2的亲合力和表位特异性来源于鼠抗体A2的可变区。在一个具体实施方案中，编码鼠抗体A2可变区的核酸的优选来源是A2杂交瘤细胞系。
[0189]嵌合A2(cA2)以剂量依赖性方式中和天然和重组人TNFα这二者的细胞毒效应。由嵌合抗体cA2与重组人TNFα结合测定法计算出嵌合抗体cA2的亲和常数为1.04×1010M-1。通过竞争抑制测定单克隆抗体特异性和亲和力的优选方法可参见Harlow等，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1988；Colligan等主编，CurrentProtocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience，New York，(1992-2005)，Kozbor等，Immunol Today，4：72-79(1983)，Ausubel等主编，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New York(1987-2005)；以及Muller，Meth.Enzymol.，92：589-601(1983)，这些文献都通过引用全部结合到本文中。
[0190]本领域记载了可用于本发明的单克隆抗TNF抗体的其它实例(参见例如美国专利第5,231,024号；
Figure A200780034262D0089102118QIETU
，A.等，Cytokine 2(3)：162-169(1990)；美国专利申请号07/943,852(1992年9月11日申请)；Rathjen等，国际公布号WO 91/02078(1992年2月21日公开)；Rubin等，GLP-1专利公布号0218868(1987年4月22日公开)；Yone等，GLP-1专利公布号0 288 088(1988年10月26日)；Liang等，Biochem.Biophys.Res.Comm.137：847-854(1986)；Meager等，Hybridoma6：305-311(1987)；Fendly等，Hybridoma 6：359-369(1987)；Bringman等，Hybridoma6：489-507(1987)；以及Hirai等，J.Immunol.Meth.96：57-62(1987)，这些文献都通过引用全部结合到本文中)。
[0191]TNF受体分子。用于本发明优选的TNF受体分子是以高亲和力结合TNFα的TNF受体分子(参见例如Feldmann等，国际公布号WO 92/07076(1992年4月30日公开)，Schall等，Cell 61：361-370(1990)和Loetscher等，Cell 61：351-359(1990)，这些文献都通过引用全部结合到本文中)，并任选具有低免疫原性。具体地说，55kDa(p55TNF-R)和75kDa(p75TNF-R)TNF细胞表面受体可用于本发明。这些受体的截短形式，包括该受体的胞外域(ECD)或其功能部分(参见例如Corcoran等，Eur.J.Biochem.223：831-840(1994))也可用于本发明。在尿液和血清中已检测到TNF受体的截短形式(包括ECD)，其为30kDa和40kDa的TNFα抑制性结合蛋白(Engelmann，H.等，J.Biol.Chem.265：1531-1536(1990))。TNF受体多聚体分子和TNF免疫受体融合分子(immunoreceptor fusion molecule)及其衍生物和片段或部分都是可用于本发明方法和组合物的TNF受体分子的其它实例。可用于本发明的TNF受体分子的特征是其长期治疗患者并具有良好至非常好的缓解症状和降低毒性的能力。低免疫原性和/或高亲和力以及其它未明特性均可能是所达到的治疗效果的原因。
[0192]可用于本发明的TNF受体多聚体分子包含经一个或多个多肽接头或其它非肽接头(如聚乙二醇(PEG))连接的两个或更多个TNF受体ECD的全部或功能部分。该多聚体分子还可含有分泌性蛋白的信号肽，以指导多聚体分子的表达。这些多聚体分子及其生产方法可参见美国专利申请号08/437,533(1995年5月9日申请)，该申请的内容通过引用全部结合到本文中。
[0193]用于本发明方法和组合物的TNF免疫受体融合分子包括一种或多种免疫球蛋白分子的至少一部分，及一种或多种TNF受体的全部或功能部分。这些免疫受体融合分子可被装配为单体或者异多聚体或同多聚体。该免疫受体融合分子也可为单价或多价。这种TNF免疫受体融合分子的实例是TNF受体/IgG融合蛋白。本领域已记载了TNF免疫受体融合分子及其生产方法(Lesslauer等，Eur.J.Immunol.21：2883-2886(1991)；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10535-10539(1991)：Peppel等，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991)；Kolls等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：215-219(1994)；Butler等，Cytokine6(6)616-623(1994)；Baker等，Eur.J.Immunol.24：2040-2048(1994)，Beutler等，美国专利第5,447,851号和美国专利申请号08/442,133(1995年5月16日申请)，这些文献的每一份均通过引用全部结合到本文中)。生产免疫受体融合分子的方法也可参见Capon等，美国专利第5,116,964号，Capon等，美国专利第5,225,538号和Capon等，Nature 337：525-531(1989)，这些文献都通过引用全部结合到本文中。
[0194]TNF受体分子的功能等同物、衍生物、片段或区域是指TNF受体分子部分，或编码TNF受体分子的TNF受体分子序列部分，其具有足够大小，具有在功能上类似于可用于本发明的TNF受体分子(例如以高亲和力结合TNFα且免疫原性低)的序列。TNF受体分子的功能等同物还包括经修饰的TNF受体分子，其在功能上类似于可用于本发明的TNF受体分子(例如以高亲和力结合TNFα且免疫原性低)。例如，TNF受体分子的功能等同物可含有“沉默”密码子或一个或多个氨基酸取代、缺失或添加(例如用一个酸性氨基酸取代另一个酸性氨基酸；或者用一个编码相同或不同疏水氨基酸的密码子取代另一个编码疏水氨基酸的密码子)。参见Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience，NewYork(1987-2003)。
[0195]细胞因子包括但不限于所有已知的细胞因子。参见例如CopewithCytokines.com。细胞因子拮抗剂包括但不限于任何抗体、片段或模拟物、任何可溶性受体、片段或模拟物、任何小分子拮抗剂或它们的任何组合。
[0196]本发明的任何方法均可包括用于治疗蛋白质介导的病症的方法，该方法包括给予需要这种调节、处理或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者有效量的含至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的组合物或药物组合物。这种方法任选还可包括用于治疗这类免疫疾病的共同给药或联合疗法，其中所述至少一种GLP-1模拟体、其特定部分或变体的给予还包括在其之前、同时和/或之后给予至少一种选自以下的至少一种其它细胞因子：例如IL-3、IL-6和IL-11、干细胞生长因子、G-CSF和GM-CSF。
[0197]病理病症的治疗通常通过给予有效量或有效剂量的至少一种GLP-1模拟体组合物予以实现，所述组合物整体平均范围至少约为0.0001-500毫克的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体/千克患者/剂，优选每一次或多次给予至少约0.001-100毫克的GLP-1模拟体或特定部分或变体/千克患者，这取决于组合物中的比活。或者，有效血清浓度可包括每一次或多次给予0.001-5000μg/ml血清浓度。适宜的剂量为医学从业人员所知，当然将取决于具体疾病状态、所给予组合物的比活和接受治疗的具体患者。在某些情况下，为达到所期望的治疗结果，必须重复给药，即特定监控量或计量的重复单次给药，其中重复单次给药直至实现所期望的日剂量或效果。
[0198]优选的剂量可任选包括每次给予0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、00009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30mg/kg或其任何范围、数值或分数，或者每一次或多次给药的血清浓度达到0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、00009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5.、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400和/或500μg/ml或其任何范围、数值或分数。
[0199]或者，给药剂量可根据已知因素而变化，所述已知因素例如特定药物的药代动力学特征及其给药方式和给药途径、接受者的年龄、健康状况和体重、症状的性质和程度、同时治疗的种类、治疗频率和预期效果。通常，有效成分的剂量可为每千克体重约0.0001-100毫克。通常每次给予0.001-10mg/kg体重、优选每次给予0.001-1mg/kg体重或者缓释形式对获得预期效果有效。
[0200]以非限制性实例为例，可按0.0001-100mg/kg的至少一种本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体的一次性或周期性剂量为人或动物提供治疗，例如在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一个，或者在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一个或其任何组合、采用单剂、输注或重复剂量，每天给予0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、00009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。
[0201]适于体内给药的剂型(组合物)一般含有约0.0001毫克至约500毫克的活性成分/单位或容器。在这些药物组合物中，活性成分通常占组合物总重量的约0.5-99.999％(重量)。
[0202]对于胃肠外给药，GLP-1模拟体或特定部分或变体可与药学上可接受的胃肠外溶媒配制成以组合提供或单独提供的溶液剂、混悬剂、乳液剂或冻干粉针剂。这类溶媒的实例为水、盐水、林格液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可采用脂质体和非水性溶媒，例如固定油。溶媒或冻干粉针剂可含有维持等渗性的添加剂(例如氯化钠、甘露醇)和维持化学稳定性的添加剂(例如缓冲剂和防腐剂)。该制剂通过已知或合适的技术进行灭菌。
[0203]合适的药用载体参见本领域标准教科书Remington′sPharmaceutical Sciences，A.Osol，最新版本。
[0204]治疗性给药。可采用许多已知和已开发的给药方式来给予药用有效量的至少一种本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体。可采用适于通过吸入的各种装置和方法或者本文所描述或本领域已知的其它方式，来递送作为溶液剂、乳液剂、胶体或混悬剂或作为粉针剂，在载体中的本发明GLP-1模拟体。
[0205]胃肠外剂型和给药。用于胃肠外给药的剂型可含有作为普通赋形剂的无菌水或盐水、聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)、植物来源的油、氢化萘等。可根据已知方法，通过使用合适的乳化剂或增湿剂和悬浮剂来制备注射用水性或油性混悬剂。注射用药剂可以是无毒、非口服给药的稀释剂，例如水性溶液剂或溶剂中的无菌注射用溶液剂或混悬剂。水、林格液、等渗盐水等可用作适用的溶媒或溶剂；无菌不挥发油可用作普通溶剂或悬浮溶剂。为此，可使用任何类型的不挥发油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸、天然或合成或半合成的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。胃肠外给药是本领域已知的，包括但不限于常规注射方法、气压式无针注射装置(gaspressured needle-less injection device)(参见美国专利第5,851,198号)和激光穿孔器装置(laser perforator device)(参见美国专利第5,839,446号)，所述专利均通过引用全部结合到本文中。
[0206]替代性递药。本发明还涉及通过胃肠外、皮下、肌内、静脉内、推注(bolus)、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮方法给予至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。可以制备蛋白质、GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物，用于胃肠外(皮下、肌内或静脉内)给药时，特别为液体溶液剂或混悬剂的形式；用于阴道或直肠给药时，特别为半固体形式，例如乳膏剂和栓剂；对于口腔或舌下给药，特别为片剂或胶囊剂形式；鼻内给药时，特别为粉剂、滴鼻剂或气雾剂或某些药剂形式；透皮给药时，特别为凝胶剂、软膏剂、洗剂、混悬剂或贴剂递药系统形式，所述贴剂递药系统具有化学增强剂(例如二甲亚砜)，以改变皮肤结构或增加透皮贴剂中的药物浓度(Junginger等，载于“Drug Permeation Enhancement”；Hsieh，D.S.主编，第59-90页(Marcel Dekker，Inc.New York 1994)，该文献通过引用全部结合到本文中)，或者具有能够使含有蛋白质和肽的制剂应用到皮肤上的氧化剂(WO 98/53847)，或者施加电场以产生瞬时运输通路(例如电穿孔)或增加带电药物穿过皮肤的活动性(例如离子导入法)，或应用超声例如超声波导入法(sonophoresis)(美国专利号4,309,989和4,767,402)(上述出版物和专利均通过引用全部结合到本文中)。
[0207]经肺给药/经鼻给药。对于经肺给药，优选至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物以有效达到肺部下气道或鼻窦的粒径递送。可通过本领域已知的通过吸入给予治疗药的各种吸入装置或鼻用装置的任一种递送至少一种本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体。能够将气溶胶化制剂沉积(dGLP-lsiting)在患者的鼻窦腔或肺泡中的这些装置包括定量吸入器、雾化吸入器、干粉发生器、喷雾器等。适于指导经肺或鼻给予GLP-1模拟体或特定部分或变体的其它装置也是本领域已知的。所有这类装置都可以使用适于将GLP-1模拟体或特部分或变体在气溶胶调配来给药的制剂。这类气溶胶可由溶液(水性和非水性)或固体颗粒组成。定量吸入器，如
Figure A200780034262D0095102301QIETU
定量吸入器，通常使用推进气体，吸气时需要驱动(参见例如WO 94/16970、WO 98/35888)。干粉吸入器，例如由Inhale Therapeutics公司销售的TurbuhalerTM(Astra)、
Figure A200780034262D0096102329QIETU
(Glaxo)、
Figure A200780034262D0096102334QIETU
(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)装置，以及粉末吸入器(Fisons)，使用混合粉末的呼吸驱动(breath-actuation)(US 4668218 Astra，EP 237507 Astra，WO 97/25086Glaxo，WO 94/08552 Dura，US 5458135 Inhale，WO94/06498 Fisons，这些都通过引用全部结合到本文中)。雾化吸入器从溶液产生气溶胶，而定量吸入器、干粉吸入器等则产生小颗粒气溶胶，雾化吸入器如AERxTM Aradigm、
Figure A200780034262D0096102419QIETU
雾化吸入器(Mallinckrodt)和Acorn 
Figure A200780034262D0096102435QIETU
雾化吸入器(Marquest Medical Products)(US 5404871Aradigm，WO 97/22376)(这些文献均通过引用全部结合到本文中)。市售吸入装置的这些具体实例往往代表了适于实施本发明的具体装置，并无意限制本发明的范围。优选通过干粉吸入器或者喷雾器递送含有至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的组合物。给予本发明的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的吸入装置有若干所需要的特征。例如，通过吸入装置递药方便可靠、可再现且准确。吸入装置任选可递送利于良好呼吸的干燥小颗粒，例如小于约10μm，优选约1-5μm。
[0208]GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物作为喷雾剂的给药。通过压力喷嘴给至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的混悬液或溶液施压，可产生包含GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的喷雾。可选择喷嘴大小和构造、施加的压力和液体进料速率，以获得所需输出量和粒径。例如，通过电场结合毛细管或喷嘴进料可以产生电喷雾。最好通过喷雾器递送的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的粒径小于约10μm，优选范围为约1μm至约5μm，最优选约2μm至约3μm。
[0209]适于使用喷雾器的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的制剂通常包括GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的水溶液，浓度为每ml溶液约1mg至约20mg至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白。该制剂可包含例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂等物质并优选包含锌。该制剂还可包括用于使GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白稳定的赋形剂或物质，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白质(bulk protein)或糖类。用于配制GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的填充蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等。用于配制GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的糖类通常包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白制剂还可包括表面活性剂，其可以在气溶胶形成时减小或者防止由溶液雾化引起的GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的表面诱导性聚集。可使用各种常用的表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。用量范围通常占制剂重量的0.001-14％。用于本发明的特别优选的表面活性剂为聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。本领域已知的用于配制蛋白质(例如模拟体或特定部分或变体)的其它物质也可包括在所述制剂中。
[0210]通过雾化吸入器给予GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物。可通过喷射式雾化器或超声波雾化器等雾化吸入器给予GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白。通常，在喷射式雾化器中，利用压缩气源通过喷孔产生高速空气喷射。当气体在喷嘴外膨胀时，产生低压区，其通过与储液器连接的毛细管抽吸出GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的溶液。来自毛细管的液流在脱离毛细管时被剪切成不稳定细丝或小滴，从而形成了气溶胶。可以采用各种构造、流速和折流板(baffle)类型以便由特定喷射式雾化器产生所需的性能特征。在超声波雾化器中，利用高频率电能产生振动的机械能，通常使用压电转换器。该能量被直接或者通过耦合流体传送至GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白制剂，从而形成了含有GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的气溶胶。通过雾化吸入器递送的GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的颗粒的粒径最好小于约10μm，优选范围为约1μm至约5μm，最优选约2μm至约3μm。
[0211]适于与喷射式雾化器或超声波雾化器一起使用的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的制剂通常包括至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体蛋白的水溶液，浓度为每ml溶液约1mg至约20mg至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白。该制剂可包含例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂等物质并优选包含锌。该制剂还可包括用于使至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白稳定的赋形剂或物质，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白质或糖类。用于配制至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的填充蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等。用于配制至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的糖类通常包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。所述至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体制剂还可包含表面活性剂，其可以在气溶胶形成时减小或防止由溶液雾化引起的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的表面诱导性聚集。可使用各种常用的表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。用量范围通常占制剂重量的0.001-4％。用于本发明的特别优选的表面活性剂为聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。本领域已知的用于制备蛋白质(例如GLP-1模拟体或特定部分或变体蛋白)的其它物质也可以包括在所述制剂中。
[0212]通过定量吸入器给予GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物。在定量吸入器(MDI)中，在罐中装有抛射剂、至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体以及任何赋形剂或其它添加剂，作为含有液化压缩气体的混合物。驱动计量阀释放出呈气溶胶的混合物，其优选含有大小范围小于约10μm、优选约1μm至约5μm、最优选约2μm至约3μm的颗粒。通过利用本领域技术人员已知的各种方法产生的GLP-1模拟体或特定部分或变体组成蛋白的制剂，可以获得所需的气溶胶粒径，所述方法包括喷射碾磨、喷雾干燥、临界点浓缩等。优选的定量吸入器包括由3M或Glaxo生产并使用氢氟烷抛射剂的定量吸入器。
[0213]与定量吸入器装置一起使用的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的制剂一般包括含至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的微细粉末，其为非水性介质中的混悬剂，例如借助表面活性剂悬浮于抛射剂中。抛射剂可以是用于此目的的任何常规材料，例如氯氟烃、氢氯氟烷、氢氟烷或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷烃-134a)、HFA-227(氢氟烷烃-227)等。优选抛射剂为氢氟烷。可以选择表面活性剂以稳定在抛射剂中作为混悬剂的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，保护活性剂免受化学降解等。合适的表面活性剂包括三油酸山梨坦、大豆卵磷脂、油酸等。在一些情况下，溶液型气雾剂优选使用乙醇等溶剂。用于配制蛋白质(例如本发明蛋白质)的本领域已知的其它试剂也可包括在所述制剂中。
[0214]本领域普通技术人员应了解的是，通过非本文未描述的装置经肺给予至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物也可实施本发明的方法。
[0215]黏膜制剂和黏膜给药。为了通过黏膜表面吸收，给予至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的组合物和方法包括含有大量亚微粒子、黏膜黏附大分子、生物活性肽和水性连续相的乳剂，其通过实现乳液剂颗粒的黏膜粘附来促进通过黏膜表面的吸收(美国专利第5,514,670号)。适宜应用本发明的乳液剂的黏膜表面可包括角膜、结膜、颊膜、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠给药途径。用于阴道或直肠给药的制剂(例如栓剂)，可含有例如聚亚烷基二醇类、凡士林、可可脂等作为赋形剂。用于鼻内给药的制剂可以是固体，并含有例如乳糖作为赋形剂，或者可以是滴鼻剂的水性或油性溶液剂。对于口腔给药，赋形剂可包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等(美国专利第5,849,695号)。
[0216]口服制剂和给药。口服制剂依赖于共同给予佐剂(例如间苯二酚和非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)以便人为增加肠壁通透性，以及共同给予酶抑制剂(例如胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFF)和特雷西洛(trasylol))以抑制酶降解。用于口服给药的固体剂型的活性组成化合物可与至少一种添加剂相混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、藻酸盐、壳多糖、脱乙酰壳多糖、果胶、西黄蓍胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂型还可含有其它类型的添加剂，例如无活性稀释剂、润滑剂(例如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯)、防腐剂(例如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚)、抗氧化剂(例如半胱氨酸)、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂等。
[0217]可将片剂和丸剂进一步加工成肠溶制剂。用于口服给药的液体制剂包括供医药用途的乳液剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂和溶液剂。这些制剂可含有常用于所述领域的无活性稀释剂，例如水。有研究披露了脂质体为胰岛素和肝素的递药系统(美国专利第4,239,754号)。最近，混合氨基酸的人工聚合物(类蛋白质)微球剂被用来递送药物(美国专利第4,925,673号)。此外，记载于美国专利第5,879,681号和美国专利第5,5,871,753号中的载体化合物被用于口服递送本领域已知的生物活性剂。
[0218]透皮制剂和透皮给药。对于透皮给药，将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体包封在递药装置中，所述递药装置例如脂质体或聚合纳米粒、微粒、微胶囊或微球体(除非另有说明，否则统称微粒)。多种合适的装置是已知的，包括由合成聚合物和天然聚合物及其组合制造的微粒，所述合成聚合物例如多羟基酸(例如聚乳酸)、聚乙醇酸及其共聚物、聚原酸酯、聚酐和聚磷腈，所述天然聚合物例如为胶原、聚氨基酸、白蛋白和其它蛋白质、藻酸盐和其它多糖(美国专利第5,814,599号)。
[0219]长期给药与制剂。有时可能需要长期(例如一次给药周期在一周至一年的长时间内)将本发明化合物给予受试者。可以利用不同的缓释、贮库(dGLP-1t)或植入剂型。例如，剂型可含有在体液中溶解度低的化合物的药学上可接受的无毒盐，例如(a)使用与多元酸的酸加成盐，多元酸为例如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、单宁酸、双羟萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘单磺酸或萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)与多价金属阳离子的盐，多价金属阳离子为例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或者与由例如N，N′-二苄基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子的盐；或(c)(a)和(b)的组合，例如单宁酸锌盐。此外，本发明的化合物或优选上文刚才描述过的相对难溶盐可配制在适宜注射的凝胶中，例如含有芝麻油的单硬脂酸铝凝胶。特别优选的盐为锌盐、单宁酸锌盐、双羟萘酸盐等。用于注射的另一类型的缓释贮库(slow release dGLP-1t formulation)制剂应含有经分散以包封在缓慢降解、无毒、非抗原性聚合物中的化合物或盐，所述聚合物例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物(例如参见美国专利第3,773,919号)。化合物或优选上述相对难溶盐还可以配制在胆固醇基质硅橡胶丸中，特别是用于动物。其它缓释、贮库(dGLP-1t)或植入制剂，例如气体或液体脂质体，在文献中已有记载(美国专利第5,770,222号和“Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems”，J.R.Robinson主编，MarcelDekker，Inc.，N.Y.，1978)。
[0220]已对本发明进行了一般性描述，通过参考下面的实施例将更易于理解本发明，实施例以举例说明的方式提供，但并非是限制性的。
[0221]实施例1：GLP-1模拟体在哺乳动物细胞中的克隆与表达。典型的哺乳动物表达载体含有至少一种介导mRNA转录起始的启动子元件、GLP-1模拟体或特定部分或变体编码序列以及转录物的转录终止和聚腺苷酸化所需的信号。其它元件包括增强子、Kozak序列和两侧是RNA剪接的供体和受体位点的间插序列。可以用SV40的早期和晚期启动子、反转录病毒(例如RSV、HTLVI、HIVI)的长末端重复序列(LTRS)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子实现高效转录。然而，也可以使用细胞元件(例如人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的合适表达载体例如包括诸如以下的载体：pIRES1neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs，Palo Alto，CA)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVca(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos1、Cos7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
[0222]或者，所述基因可以在含有整合到染色体的基因的稳定细胞系中表达。用选择标记(例如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素)共转染以便于鉴定和分离转染细胞。
[0223]还可以扩增所转染的基因，以大量表达所编码的GLP-1模拟体或特定部分或变体。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于开发携带目标基因的数百或甚至数千拷贝的细胞系。另一种有用的选择标记是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，Biochem.J.227：277-279(1991)；Bebbington等，Bio/Technology10：169-175(1992))。使用这些标记，使哺乳动物细胞在选择性培养基中生长，选出抗性最高的细胞。这些细胞系含有整合至染色体的扩增基因。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和NSO细胞常常用于产生GLP-1模拟体或特定部分或变体。
[0224]表达载体pC1和pC4含有劳斯肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))加上CMV增强子片段(Boshart等，Cell41：521-530(1985))。多克隆位点(例如具有限制性内切酶切割位点BamHI、XbaI和Asp718)促进目标基因的克隆。载体还含有大鼠前原胰岛素基因的3′内含子、聚腺苷酸化信号和终止信号。
[0225]CHO细胞中的克隆与表达。载体pC4用于表达GLP-1模拟体或特定部分或变体。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC保藏号37146)的衍生物。该质粒含有在SV40早期启动子控制之下的小鼠DHFR基因。通过在补充了化疗药物甲氨蝶呤的选择性培养基(例如α-MEM，Life Technologies，Gaithersburg，MD)中培养细胞，可筛选出用这些质粒转染的缺乏二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢细胞或其它细胞。已有文献详细记载了DHFR基因在甲氨蝶呤(MTX)抗性细胞中的扩增(参见例如F.W.Alt等，J.Biol.Chem.253：1357-1370(1978)；J.LHamlin和C.Ma，Biochem.et Biophys.Acta1097：107-143(1990)；以及M.J.Page和M.A.Sydenham，Biotechnology 9：64-68(1991))。在浓度递增的MTX中生长的细胞产生了抗药性，原因是由于DHFR基因扩增引起目标酶DHFR过度产生。如果将第二基因与DHFR基因连接，则第二基因通常共同扩增和过量表达。本领域已知该方法可用于开发携带1,000个以上拷贝的扩增基因的细胞系。随后，当去掉甲氨蝶呤时，便获得含有扩增基因的细胞系，该扩增基因已整合至宿主细胞的一条或多条染色体中。
[0226]质粒pC4含有用于表达目标基因的劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen等，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))加上从人巨细胞病毒(CMV)即时早期基因增强子分离的片段(Boshart等，Cell 41：521-530(1985))。该启动子的下游是允许基因整合的BamHI、XbaI和Asp718限制性内切酶切割位点。在这些克隆位点后，质粒含有大鼠前原胰岛素基因的3′内含子和聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可用于表达，例如人b-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或其它反转录病毒(如HIV和HTLVI)的长末端重复序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表达系统和类似系统可用于在哺乳动物细胞中以受控方式表达GLP-1(M.Gossen和H.Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992))。对于mRNA的聚腺苷酸化，还可使用其它信号，例如人生长激素基因或球蛋白基因的信号。也可与选择标记(如gpt、G418或潮霉素)共转染后，选出携带整合至染色体中的目标基因的稳定细胞系。开始时最好使用一种以上的选择标记，例如G418加上甲氨蝶呤。
[0227]通过本领域已知方法，使用限制性内切酶消化质粒pC4，然后使用小牛肠磷酸酶脱去磷酸。随后从1％琼脂糖凝胶中分离出载体。
[0228]根据已知方法步骤，使用编码完整GLP-1模拟体或特定部分或变体的DNA序列，其与本发明GLP-1模拟体的HC和LC可变区相对应。该构建体中也可使用编码合适人恒定区(即HC和LC区)的分离核酸。
[0229]然后，分离的可变区和恒定区编码DNA与脱磷酸化载体用T4DNA连接酶连接。接着，转化大肠杆菌HB101或XL-1Blue细胞，并采用例如限制性内切酶分析法鉴定出含有插入质粒pC4中的片段的细菌。
[0230]使用缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行转染。使用脂质转染试剂，将5μg表达质粒pC4与0.5μg质粒pSV20-neo共转染。质粒pSV2neo含有显性选择标记neo基因，该基因来源于Tn5，它编码赋予针对一组抗生素(包括G418)抗性的酶。将细胞接种在补充了1μg/ml G418的α-MEM中。2天后，细胞用胰蛋白酶消化，并接种到杂交瘤克隆板(Greiner，Germany)的α-MEM中，α-MEM中补充了10ng/ml、25ng/ml或50ng/ml甲氨蝶呤加上1μg/mlG418。大约10-14天后，单一克隆用胰蛋白酶消化后，接种到使用不同浓度甲氨蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)的6孔培养皿或10ml培养瓶中。随后，将在最高甲氨蝶呤浓度下生长的克隆转移到含有更高甲氨蝶呤浓度(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)的新6孔板中。重复同样的步骤，直至获得在100-200mM浓度下生长的克隆。通过例如SDS-PAGE和蛋白质印迹或者通过反相HPLC分析对所需基因产物的表达情况进行分析。
[0231]实施例2：本发明GLP-1模拟体的非限制性实例。GLP-1是一种37个氨基酸的肽，在口服葡萄糖激发后由肠L细胞分泌。预期掺入生物活性GLP-1(7-37)肽、变体或衍生物的模拟体构建体延长该肽的体内半衰期，为降低2型糖尿病患者的血糖提供了新的疗法。可将编码天然GLP-1(7-37)肽或抗DPP-IV类似物的肽掺入模拟体支架中。已经制备出这些分子中的若干个，所得模拟体在基于体外细胞的功能测定法中证明有活性。应当注意的是，在这些研究中可使用不同的体外测定法与体内模型，其功效彼此之间或者与本文提供的结果无可比性。
[0232]为了产生GLP-1模拟体变体，模拟体中的GLP-1肽、接头、铰链或CH2和CH3序列可缺失、添加、取代、突变或修饰，以改进表达、功效、稳定性或效应子功能。
[0233]可将野生型GLP-1序列(GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a))以及DPP-IV抗性GLP-1变体(例如GLP-1MMB(A2S)(SEQ ID NO：4c)或GLP-1MMB(A2G)(SEQ ID NO：4b))掺到模拟体支架中。可使肽发生突变，以改进GLP-1模拟体的性质。例如，氨基端残基的突变可改进信号转导，而螺旋结构域的突变可稳定螺旋，由此改进与受体的结合和/或模拟体的稳定性。
[0234]接头的长度和组成可发生突变，以改变GLP-1肽和Fc区之间连接的柔性或稳定性。可将不同的同种型掺到分子的铰链区。另外，可使模拟体铰链区发生突变，以稳定该分子。例如，可使人IgG4铰链突变，以产生Ser228→Pro变体，从而稳定模拟体的链间二硫键。可在模拟体Fc部分中进行改变，以改进分子的稳定性，改变效应子功能，例如FcR结合。例如，可使用人或鼠同种型(或这些分子的变体)，例如具有Ala/Ala突变的IgG4。
[0235]本发明的GLP-1模拟体。本发明的一个非限制性的具体实例是下式(I)的GLP-1模拟体构建体(SEQ ID NO：2)：
[0236]((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
[0237]其中P是单拷贝的生物活性GLP-1肽(7-36)，L是Gly-Ser或Gly-Gly-Gly-Ser柔性接头的串联重复，V是VH序列的C端，即天然存在的IgG的J区，H是完整IgG4铰链区，CH2和CH3属于IgG4同种型亚类。预期该构建体的半衰期将是仅GLP-1肽或其变体或衍生物的许多倍，类似于IgG的半衰期。
[0238]除上述基本结构外，还描述了具有潜在有利生物学特性的变体。这些变体包括自缔合倾向减弱、免疫效应子功能降低或免疫原性降低的构建体。可以预期赋予所需特性(例如生物活性肽构象改进)和穿越血脑屏障的其它修饰。所给出的变体和修饰可以任何方式组合，以得到具有所需活性的构建体。
[0239]应用重组DNA法，将GLP-1肽插入免疫球蛋白信号肽与人J序列之间的中间载体中。该操作使用互补合成寡核苷酸进行，所述寡核苷酸的末端与存在于该载体的限制位点相容。这些寡核苷酸包含GLP-1肽编码序列和由两个GGGS重复序列组成的柔性接头。含有上述功能元件的限制片段随后被转移到表达载体中。该载体含有抗CD4免疫球蛋白启动子和增强子以及人IgG4铰链序列的编码序列、HC恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)，还含有在细菌中进行质粒复制和选择以及选出在哺乳动物细胞内的稳定表达子的必需元件。
[0240]将该质粒导入HEK293E细胞中，在瞬时转染细胞中实现野生型GLP-1模拟体的表达。GLP-1模拟体的纯化通过标准A蛋白和Superose 12亲和层析法完成，得到约1.5mg/L的转染细胞。该蛋白是下述实验的起始材料。
[0241]GLP-1模拟体的氨基酸序列见图1。在肽编码序列之上标注了功能结构域。一般认为J序列可提供甚至更大的柔性，以使GLP-1区段呈正确构象，并使该肽从免疫球蛋白的球形结构中突出出来，从而能够以合适的方向与GLP-1受体结合。CH2区和CH3区构成了蛋白的大部分。一般认为免疫球蛋白血清半衰期长的一个原因是其结合FcRn的能力，FcRn通过使被胞饮的免疫球蛋白返回胞外空间而延长了血清半衰期。FcRn的结合位点与CH2区和CH3区的连接处重叠(Sheilds等，2001，J.Biol.Chem.，vol.276(9)，6591-6604)。
[0242]众所周知，两条IgG重链在细胞加工期间经位于铰链区的半胱氨酸之间的二硫键装配在一起，形成同二聚体。预期这也可发生在修饰肽之间，从而形成装配的GLP-1模拟体构建体。GLP-1模拟体的预期结构含有两个GLP-1肽。
[0243]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0244]实施例3：FACS结合试验。在体外FACS结合实验中测定了GLP-1模拟体的活性。为了测定GLP-1模拟体是否与GLP-1R结合，将过量表达GLP-1R的HEK293细胞(1×106个细胞)与GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)(20nM)在4℃下孵育2小时。洗涤细胞，在4℃下加入荧光标记的第二检测抗体(1μg/ml对Fcγ特异性的山羊抗人IgG)达30分钟。通过流式细胞术监测细胞的荧光强度。图2A表示GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)与过量表达GLP-1R的HEK293细胞结合(灰色，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)但无二抗；黑色，仅二抗；红色，阴性对照MMB和二抗；蓝色，GLP-1MMB和二抗)。图2B显示GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)不与对照HEK293细胞结合(灰色，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)但无二抗；黑色，仅二抗；蓝色，GLP-1MMB(SEQ IDNO：4a)和二抗)。图2C显示GLP-1肽类似物(A2S)能够与GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)竞争结合过量表达GLP-1R的HEK293细胞(灰色，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)但无二抗；黑色，GLP-1MMB(SEQ IDNO：4a)和二抗；橙色，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)，0.2nM竞争剂，二抗；蓝色，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)，20nM竞争剂，二抗；红色，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)，100nM竞争剂，二抗)。
[0245]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0246]实施例4：cAMP测定法。GLP-1与其受体G-蛋白偶联受体结合，导致信号分子3’，5’-环腺苷酸(cAMP)的剂量依赖性增加。可在GLP-1R表达细胞(Applied Biosystems)中通过体外测定法对cAMP进行测定。简单地讲，将Rinm细胞(1×105个细胞)与浓度递增的GLP-1肽(0-30nM)或GLP-1MMB(0-100nM)一起孵育。使细胞裂解，采用碱性磷酸酶标记的cAMP缀合物和化学发光底物(TropixCDPD)，用竞争测定法来测定cAMP的量。对于野生型GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)，依赖于浓度的cAMP活性(图3A)与GLP-1肽的(图3B)相当(分别为EC50＝11nM与0.4nM)。在同样的实验中，与IgG4支架结构中的野生型GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)相比，IgG4支架结构中的GLP-1MMB(A2G)(SEQ ID NO：4b)(图3C)和IgG4支架结构中的GLP-1MMB(A2S)(SEQ ID NO：4c)(图3D)，均使Rinm细胞中cAMP水平增加到显著较高的水平。
[0247]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0247.1]实施例5：通过cAMP测定GLP-1MMB的体外活性：采用LANCETM cAMP测定法来测定GLP-1MMB在INS-1E细胞中的功能活性，INS-1E细胞是一种表达大鼠GLP-1受体的大鼠胰岛瘤细胞系。
[0247.2]材料/方法：将INS-1E细胞在RPMI 1640/10％FBS/1％L-谷氨酰胺/1％丙酮酸钠/1％非必需氨基酸/50μMβ-巯基乙醇中进行培养，并维持在37℃、5％ CO2湿润培养箱中。LANCE cAMP试剂盒购自Perkin Elmer(Boston，MA)。GLP-1肽购自Sigma(St Louis，MO)。用GraphPad PRISM 4.03版对数据进行了分析。
[0247.3]cAMP测定法：按1×105个细胞/孔将INS-1E细胞接种到96孔板(Costar 3610)，使之在正常生长培养基中复原4天。从各孔吸出培养基，依次加入24μl Alexa Fluor647抗cAMP抗体(LANCEcAMP试剂盒，Perkin Elmer，Boston，MA)和24μl GLP-1MMB(SEQID NO：4)(溶于PBS/0.5％ BSA/0.5mM IBMX)。按生产商的方案，在室温下刺激细胞7分钟并使之裂解。将各板在室温下孵育1小时，并在665nm下测量荧光强度。用标准曲线确定cAMP浓度。
[0247.4]结果：将cAMP浓度对GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)浓度(nM)作图，将各数据点拟合为双曲线，得出EC50为8.7nM(图18A)。以同样方式，将用GLP-1肽得到的数据作图，得出EC50为0.11nM(图18B)。
[0248]实施例6：DPP-IV裂解测定法。因为GLP-1被DPP-IV快速钝化，所以建立了一种体外测定法来定量测定完整(即未裂解)GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)。简单地讲，将GLP-1MMB(SEQ IDNO：4a)或肽(1.2nM)在室温下与DPP-IV(1μg/mL，R&D Systems)温育。在不同时间(0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟)，加入DPP-IV抑制剂(100μM，Linco)猝灭反应物。采用GLP-1活性ELISA(Linco)和用于相应标准曲线的GLP-1MMB(SEQID NO：4a)或肽，测定完整GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)或肽的量。图4显示，相对于GLP-1肽，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4a)对DPP-IV裂解的抗性明显更强。
[0249]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0250]实施例7：人血清稳定性测定法。还测定了血清中GLP-1MMB的稳定性以确保其它血清蛋白酶不能裂解和钝化GLP-1MMB。简单地讲，在37℃下，将GLP1肽或GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)(30nM)在人血清中温育。在不同时间，用DPP-IV抑制剂(100μM，Linco)猝灭反应物，用得自Linco的GLP-1活性ELISA对样品进行了分析。图5显示，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)在人血清中保持稳定达24小时，而该肽则快速衰变。
[0251]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0252]实施例8：RINm细胞中GLP-1MMB引起胰岛素分泌。为了测定GLP-1MMB在胰岛素分泌中的作用，RINm细胞用浓度递增的GLP-1(7-36)肽(0-5nM)、毒蜥激动肽4(0-5nM)或各种GLP-1模拟体(5nM或50nM)处理，通过ELISA测定了胰岛素的分泌量。在RINm细胞中，所测的所有GLP-1MMB都具有刺激胰岛素分泌的活性(图6)。模拟体在50nM时的活性与野生型GLP-1(7-36)肽的活性相当。
[0253]
[0253.1]实施例9：通过胰岛素分泌测定的GLP-1MMB的体外活性。开发出另一种胰岛素分泌测定法来测定GLP-1MMB(SEQ IDNO：4)的体外功能活性。
[0253.2]细胞培养：将INS-1E细胞在RPMI1640/10％FBS/1％L-谷氨酰胺/1％丙酮酸钠/1％非必需氨基酸/50μMβ-巯基乙醇中进行培养，并维持在37℃、5％CO2湿润培养箱中。用GraphPad PRISM，4.03版对数据进行了分析。
[0253.3]胰岛素分泌测定法：按1×105个细胞/孔将INS-1E细胞接种到96孔板(Costar 3610)，使之在正常生长培养基中复原4天。将细胞洗涤两次后，加入0.1ml KRBH缓冲液/3mM葡萄糖。使细胞在该缓冲液中平衡2小时。除去培养基，每孔加入0.12ml溶于KRBH与6.5mM葡萄糖溶液的GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)。在T＝0时间点，从每孔中取出20微升上清液。在37℃、5％CO2下将细胞孵育2小时后，从每孔中取出20微升上清液。将上清液在-20℃下冷冻直到进行胰岛素ELISA。用超灵敏大鼠胰岛素ELISA试剂盒(Crystal Chem)，测得胰岛素浓度。
[0253.4]结果：对在GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)各个浓度下胰岛素分泌量的数据作图(图19)。GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)(25nM)显著增加分泌到上清液中的胰岛素量。
[0254]实施例10：GLP-1MMB降低db/db小鼠的葡萄糖水平。给6周龄的db/db小鼠禁食2小时后，静脉内给予溶媒、GLP-1肽或GLP-1MMB(A2S)(SEQ ID NO：4c)。给药后0.5小时、1小时、2小时、3小时和4小时监测血糖。在30分钟时GLP-1肽降低血糖，但到60分钟时，血糖开始再次升高，这很可能是由于GLP-1肽的半衰期短引起的。相比之下，GLP-1MMB(A2S)(SEQ ID NO：4c)在剂量比GLP-1肽剂量低100倍时，在整整4小时时间内引起血糖降低(图7A)。另外，血糖的降低是剂量依赖性的(图7B)。
[0255]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0256]实施例11：GLP-1MMB在小鼠和猕猴中的药代动力学特征。为了测定4种GLP-1模拟体(A2G、A2S、exedin-cap和野生型)(分别为SEQ ID NO：4b、SEQ ID NO：4c、SEQ ID NO：4d和SEQ IDNO：4a)的药代动力学特征，静脉内给予C57/B16小鼠1mg/kg MMB。在不同时间点处死小鼠后，通过心脏穿刺获得血浆。采用不同的ELISA测定了Fc、总MMB、活性MMB和活性肽，因为它们在动物体内发生了代谢。活性MMB显示，肽的整个N端仍然与模拟体的Fc区连接。肽中的第二个氨基酸(丙氨酸)被丝氨酸或甘氨酸取代后延长了活性MMB在循环中的寿命。
[0257]给猕猴静脉内注射1.0mg/kg4种不同的GLP-1MMB构建体，从给药后10分钟到5天的不同时间点，采集血清样品。通过ELISA对血清样品进行了评价，以定量测定完整的MMB。如图8所示，所有4种MMB均表现出一个快速分布相，接着为较慢的清除相。计算出显示T1/2约3天的各构建体的药代动力学常数，与从T＝0至T＝120小时的AUC确定的暴露近似。
[0258]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0258.1]实施例12：GLP-1MMB在大鼠和猴中的药代动力学特征。对GLP-1MMB进行了改造以便在扩展其药代动力学(PK)特征的同时维持GLP-1的生物活性。
[0258.2]大鼠的药代动力学特征：用单剂GLP-1MMB(SEQ IDNO：4)(3.0mg/kg，批号8833173)经皮下或静脉内对Sprague-Dawley衍生大鼠进行了治疗(1)。在给药后的不同时间，采集大约300μl血液加到含有蛋白酶抑制剂(Roche Complete EDTA free，Roche AppliedScience，Indianapolis，IN)和DPP4抑制剂(Linco，St.Charles，MO)的柠檬酸钠溶液(3.8％)中。分离出血浆并保存在-80℃下，直到可以对样品进行分析。应用MSD(mesoscale discovery)技术测定了完整GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)的浓度[3-7]。简单地讲，用BioMek Fx将血浆样品连续稀释成共4种稀释液，即纯血浆、1:8、1:64和1:512。每板包括了纯血浆中的相同标准曲线。在MSD各板中用生物素化单克隆抗体(CNTO1626)俘获GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，该生物素化单克隆抗体被设计成用来检测GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)的完整N端。添加识别GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)接头区的钌标记的单克隆抗体(CNTO712)以便检测，发光反应采用MSD扇形图像仪(sector imager)6000读数器测定。应用S形剂量反应曲线(GraphPad PRISM)计算出GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)水平。
[0258.3]猴的药代动力学特征：在美国迈阿密大学糖尿病研究院(Diabetes Research Institute，University of Miami)，由静脉内给予猕猴GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)(1.0mg/kg，批号8833013)(2)。在给药和采血前，用盐酸氯胺酮(100mg/ml，10mg/kg)对该猴进行化学约束。给予GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，剂量为2.2ml/kg，速率为1ml/分钟。在给药后的不同时间点，采集约2ml血液加到含有蛋白酶抑制剂(Roche Complete EDTA free，Roche Applied Science，Indianapolis，IN)和DPP4抑制剂(Linco，St.Charles，MO)的柠檬酸钠溶液(3.8％)中。分离血浆并保存在-80℃下，直到可以对样品进行分析。按照上述方法测定血浆中GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)的浓度。
[0258.4]数据分析：采用非区室分析法(Non-compartmentalanalysis，NCA)计算出GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)的药代动力学参数(WinNonlin，5.1版，Pharsight Corporation，Mountain View，CA)。分析血清浓度与时间分布，从中得出最大血清浓度Cmax和达到Cmax的时间(Tmax)。用可测量水平的GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)计算出从0时间点至最终时间点的浓度曲线下面积(AUC)(对于大鼠为AUC(0-7d)，对于猴为AUC(0-21d))及从0时间至无限的AUC。用线性梯形积分法得出AUC值。通过末期对数线性部分的最小二乘方回归分析法求出终点速率常数(λz)。由比率0.693和λz计算出终点半衰期t1/2。
[0258.5]结果：大鼠的药代动力学特征：一次皮下和静脉内给药后，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)在大鼠中的血浆药代动力学特征见图20A。得自大鼠数据的整体药代动力学分析概括于表1。GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)的终点半衰期被设定为在静脉内给药后1.5天和皮下给药后1.7天。皮下给药后，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)的生物利用度约为22％。
[0258.6]表2：GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)在一次皮下和静脉内给药(3mg/kg)后在SD大鼠中的药代动力学特征。
 
材料(途径) Cmaxμg/ml Tmax天 AUC(0-7天)天＊μg/ml AUCinf天＊μg/ml Clml/天/kg Vssml/kg t1/2天 F％
GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)(静脉内)平均sd％CV 53.915.039.3 无无无 23.611.114.7 23.861.064.4 125.905.594.4 110.077.326.7 1.480.4933.0 无无无
GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)(皮下)平均sd％CV 2.290.104.5 0.830.2934.6 5.040.204.0 5.200.305.7 无无无 无无无 1.731.1063.7 21.851.858.5
[0258.7]猴的药代动力学特征：GLP-1MMB在单剂静脉内给药后在猴中的血浆药代动力学特征见图20B。整体药代动力学分析概括于表2。GLP-1MMB在猴中的终点半衰期被设定为2.9天。
[0258.8]表3：GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)在单剂静脉内给药(1mg/kg)后在猕猴中的药代动力学特征。
 
PK参数 平均浓度(μg/ml)  sd    ％CV
Cmax        μg/mlAUC(0-21)   天*μg/mlAUCinf      天*μg/mlCl          ml/天/kgVss         ml/kgVz          ml/kgt1/2        天 40.09   9.28   23.141.92   10.25  24.442.05   10.29  24.524.81   6.38   25.750.18   19.07  38.0105.40  34.92  33.12.93    0.37   12.7
[0259]实施例13：糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量试验期间GLP-1MMB的作用。在皮下注射GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)(0.02-2mg/kg)之前，给8周龄糖尿病db/db小鼠禁食6小时。给药后，再给小鼠禁食6小时后，测得基线空腹血糖。在t＝0时，经口管饲法喂给小鼠1.0mg/g葡萄糖，在不同时间测定血糖。图9中所示结果表明，在口服葡萄糖耐量试验期间所有测试剂量的GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)有效降低了葡萄糖移动(glucose excursion)。
[0260]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0261]实施例14：GLP-1MMB在长期给予糖尿病小鼠后对空腹血糖的作用。每天将溶媒或GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)(1mg/kg)皮下给予10周龄糖尿病db/db小鼠达6周。在整个研究过程中，每周两次测定了空腹血糖。在整个研究中相对于对照，受治疗动物的空腹血糖降低(图10)，到第6周时，空腹血糖的差异超过200mg/dL(对照和受治疗动物分别为466mg/dL与221mg/dL)。
[0262]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0263]实施例15：GLP-1MMB在长期给予糖尿病小鼠后对口服葡萄糖耐量试验的作用。同实施例11一样，每天将溶媒或GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)(1mg/kg)给予10周龄糖尿病db/db小鼠达6周。在给药40天后，对小鼠进行口服葡萄糖耐量试验。简单地讲，在t＝0时，经口管饲法喂给小鼠1.0mg/g葡萄糖，在不同时间测定血糖。图11中所示结果表明，在口服葡萄糖耐量试验中，GLP-1MMB(SEQ IDNO：4c)有效降低了葡萄糖移动，这表明相对于对照动物，长期用GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)治疗的小鼠能够更有效地处置葡萄糖负载。
[0264]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0265]实施例16：GLP-1MMB在长期给予糖尿病小鼠后对降低HbA1c的作用。同实施例11和12一样，每天将溶媒或GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)(1mg/kg)给予10周龄糖尿病db/db小鼠达6周。在给药6周前后，采集全血样品并分析存在的HbA1c。如图12所示，在6周时间内，GLP-1治疗动物的HbA1C增加到109％，而对照治疗动物增加到142％。该数据表明，相对于对照，受治疗动物能够更好地长期调节它们的血糖。
[0266]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0267]实施例17：GLP-1MMB对正常猕猴口服葡萄糖耐量试验的作用。在单剂GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)(1mg/kg)之前和之后6天，在正常猕猴中进行了口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。简单地讲，在t＝0时，经口管饲法喂给该猴2.0mg/g葡萄糖，在不同时间测定血糖。在给药后6天进行的OGTT中，血糖水平显著降低(图13A)，胰岛素水平显著升高(图13B)。这就表明GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)在葡萄糖浓度升高时导致从胰腺分泌出胰岛素。
[0268]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0269]实施例18：GLP-1MMB在单剂量后对糖尿病小鼠(db/db)胰岛中胰岛素染色的作用。12周龄糖尿病小鼠(db/db)用单剂量的GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)(1.5mg/kg)经皮下处理，4周后切取胰腺。将胰腺切片和染色，以确定胰岛素的存在。如图14所示，相对于对照动物，受治疗动物的胰岛素染色更多。
[0270]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0271]实施例19：GLP-1MMB延迟正常狗的胃排空。在全身麻醉下，通过手术将胃管植入雌性猎犬(10-15kg)，使之恢复至少2周。给狗禁食24小时，之后提供任饮水。打开胃管，用40-50ml温水除去胃液和残余食物。在餐前60分钟，给每组各6只狗皮下注射利达脒(lidamidine)，α2激动剂(0.63mg/kg)，为延迟胃排空的阳性对照。给予溶媒对照或GLP-1MMB(SEQ ID NO：4b)(0.1mg/kg)的狗在餐前15分钟在头静脉中经静脉内给药。餐前5分钟，打开胃管以确定胃内存在的流体量作为基线值，将流体迅速再次导入胃中。然后，通过插管给予包含250ml葡萄糖溶液(5g/l)的试验餐，使之在胃中停留30分钟。30分钟后，从胃中引出胃内容物，测量总体积。保留1ml胃内容物用于分析，将其余的量通过插管再引入胃中。在60分钟、90分钟和120分钟时重复对胃内容物体积进行评价并提取样品。评价所收集样品的葡萄糖浓度，并用于确定各时间点留存在胃中的葡萄糖绝对量。由起始值和由各时间点的葡萄糖浓度确定胃中留存的葡萄糖的百分比，并作为时间的函数作图。通过拟合为一次指数曲线来确定胃内容物剩余50％的时间。如图15如示，给予溶媒的狗在12.35±3.69分钟后50％胃内容物被排空，而给予利达脒阳性对照和GLP-1MMB(SEQID NO：4b)的狗显示胃排空显著延迟(分别为30.60±6.47和59.23±14.46)。
[0272]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0273]实施例20：根据口服葡萄糖耐量试验(OGTT)GLP-1MMB降低饮食诱导的肥胖小鼠的血糖。为了建立饮食诱导的肥胖症鼠模型，用高脂肪饮食喂养小鼠至少27周。小鼠变肥胖，当空腹血糖值超过120mg/dl时，确定为糖尿病。为了评价GLP-1MMB疗法对餐后血糖水平的作用，给饮食诱导的肥胖小鼠禁食过夜，经皮下给予0.02mg/kg、0.2mg/kg或2mg/kg GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)或溶媒对照。给药6小时后，用胃管饲喂小鼠1.5mg/g葡萄糖。在给予MMB之前，在t＝0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟，用尾静脉血测定血糖水平。如图16所示，观察到在t＝0和所有其后的时间点上，空腹血糖值呈GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)剂量依赖性降低。计算出曲线下面积介于t＝0和t＝180之间，这表明在所有剂量下葡萄糖处理显著降低。
[0274]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0275]实施例21：GLP-1MMB在db/db小鼠腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)中降低血糖。根据空腹血糖水平，将约13-15周龄的雄性db/db小鼠随机分为每组6只小鼠的治疗组。在葡萄糖耐量试验之前6小时，给予小鼠0.02mg/kg或0.1mg/kg GLP-1MMB(SEQ IDNO：4c)或者0.1mg/kg阴性对照MMB。在葡萄糖耐量试验前5分钟，用手持血糖计由尾静脉血测得葡萄糖水平。然后经腹膜内给予小鼠1mg/g D-葡萄糖，在10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟时监测血液葡萄糖水平。如图17A所示，在整个时程内，用GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)治疗的两个组中血糖水平均显著降低。将以同样方式治疗的其它组动物处死，测定在t＝10分钟时的胰岛素水平。在GLP-1MMB(SEQ ID NO：4c)给药后10分钟释放出的胰岛素的量呈剂量依赖性增加。
[0276]对于GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)，重复进行了同样的实验，并得到同样的结果。
[0276.1]实施例22：GLP-1MMB的急性药效动力学研究。为了证实GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)的生物活性，在饮食诱导性肥胖(DIO)小鼠中进行了腹膜内葡萄糖耐量试验(ipGTT)。
[0276.2]材料/方法：D-葡萄糖购自Sigma。下述研究使用饮食诱导性肥胖(DIO)C57B1/6J小鼠，该小鼠在4周龄时便开始含60.9％脂肪的饮食(Purina TestDiets 58126)。在用于本研究前，测得所有动物连续3周的糖尿病空腹血糖值(>120mg/dL)。ipGTT：给35只小鼠禁食过夜(16小时)，根据其空腹葡萄糖浓度随机分到7个组(n＝5)。在葡萄糖耐量试验前10分钟，由静脉内给予小鼠PBS或GLP-1MMB(SEQID NO：4)(0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg和1.0mg/kg)。在葡萄糖耐量试验前5分钟，从尾静脉血测得空腹葡萄糖水平。在T＝0分钟，由腹膜内给予小鼠D-葡萄糖(1.0mg/g)。在15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟时，用尾静脉血测定血糖水平。
[0276.3]结果：把葡萄糖耐量试验期间测得的血糖水平作为时间的函数作图(图21A)。计算出曲线下面积，相对于PBS治疗组，用GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)(0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg)治疗的5组的曲线下面积以剂量依赖性方式显著降低(图21B)。将AUC对GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)浓度拟合成双曲线，得出ED50为14μg/kg(图21C)。把数据绘制成曲线，用GraphPad PRISM，4.03版进行分析。
[0277]实施例23：GLP-1MMB对GLP-1R-/-小鼠和野生型小鼠食物摄取、血糖控制和胃排空的作用。本研究的目的是为了评价GLP-1MMB是否以依赖GLP-1受体的方式影响血糖控制、食物摄取和胃排空。在野生型而非GLP-1受体敲除小鼠中，单剂静脉内(iv)给予GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)改善了葡萄糖耐量，减少了食物摄取并抑制胃排空。结果证实GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)对葡萄糖和能量代谢的作用是通过GLP-1受体介导的。
材料/方法：动物：根据体重和空腹血糖，将雄性GLP-1R-/-小鼠和年龄匹配的野生型小鼠随机分成3个治疗组(n＝5)。
食物摄取：给小鼠禁食过夜，静脉内(iv)注射单剂GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)(1mg/kg)、CNTO 1996(1mg/kg)(CNTO1996在研究中用作阴性对照，因为它缺乏GLP-1肽)和等摩尔浓度剂量的毒蜥激动肽4(0.07mg/kg，购自Sigma)。给药后4小时、6小时、24小时和48小时，对食物和水摄取进行测定。
葡萄糖耐量试验(ipGTT)：给小鼠禁食过夜，如上所述进行静脉内给药。用手持血糖计(LifeScan)从尾部切口测得空腹葡萄糖。在t＝0分钟时，经腹膜内给予小鼠D-葡萄糖(1.0mg/g，Sigma)，在15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟后，用尾静脉血测定血糖。
胃排空：给小鼠禁食过夜。次日上午，给小鼠重新进食1小时，记录食物摄取，在研究余下时间内给小鼠禁食。如上所述小鼠由静脉内给药。给药后2小时，小鼠处以安乐死。通过剖腹术露出胃，在幽门和贲门处结扎并切除。测得胃内容物湿重。方程式1用来计算胃中残留食物的百分比。
(胃内容物湿重(g)/食物摄取(g))*100          方程式(1)
结果和讨论
食物摄取：给药后24小时内对野生型和GLP-1R-/-小鼠的累积食物摄取绘制柱形图(图22)。与对照组CNTO1996相比，GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)(1mg/kg)和等摩尔浓度剂量的毒蜥激动肽4(0.07mg/kg)两者都导致野生型动物的食物摄取显著减少(图22A)。GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)和毒蜥激动肽4对GLP-1R-/-小鼠的食物摄取没有影响(图22B)。
葡萄糖耐量试验：在ipGTT试验中得到的野生型和GLP-1R-/-小鼠的数据按血糖浓度对时间绘图(图23A和图23B)。对于每条ipGTT曲线计算出曲线下面积(AUC)(图23C)。单剂给予GLP-1MMB(SEQID NO：4)和毒蜥激动肽4导致野生型而非GLP-1R-/-动物的AUC有统计显著性地减小。
胃排空：绘制出野生型和GLP-1R-/-小鼠给药后2小时胃残留食物百分比的柱形图(图24)。与对照CNTO1996相比，GLP-1MMB(SEQID NO：4)(1mg/kg)和等摩尔浓度剂量的毒蜥激动肽4(0.07mg/kg)导致野生型小鼠的胃内容物有统计显著性地增加。数据证实GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)和毒蜥激动肽4抑制野生型动物的胃排空。GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)和毒蜥激动肽4对GLP-1R-/-小鼠的胃排空没有影响。
实施例24：DIO小鼠中GLP-1MMB的药效动力学活性与其药代动力学特征的相关性。本研究的目的是在将GLP-1MMB在饮食诱导性肥胖(DIO)小鼠中调节葡萄糖耐量的作用与其药代动力学特征相关联。给予(静脉内)动物GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)(1mg/kg)，给药后在不同时间进行了葡萄糖耐量试验。同时采集血样以评价GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)水平。GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)改善了DIO小鼠的葡萄糖耐量，ED50约为370ng/ml。
材料/方法。动物/治疗：C57B1/6J小鼠在4周龄时开始含有60.9％脂肪的饮食(Purina TestDiets 58126)。在开始本研究时，测得所有动物连续3周的糖尿病空腹血糖值(>120mg/dL)。根据空腹血糖将DIO小鼠随机分成各治疗组，并且给予(静脉内)GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)(1mg/kg，批号8833173))或PBS。按如下所述在给药后不同的时间，进行了葡萄糖耐量试验，采集血样测得GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)血浆水平。
葡萄糖耐量试验(ipGTT)：试验前给小鼠禁食过夜(16小时)。次日上午用手持血糖计(LifeScan)经尾部切口测得空腹葡萄糖。在T＝0分钟时，经腹膜内给予小鼠D-葡萄糖(1.0mg/g，Sigma)。在15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟，用尾静脉血测定血糖。
GLP-1MMB血浆水平：ipGTT后通过心脏穿刺采集血样。采集约300μl血液加到含有蛋白酶抑制剂(Roche Complete EDTA free，Roche Applied Science，Indianapolis，IN)和DPP4抑制剂(Linco，St.Charles，MO)的柠檬酸钠溶液(3.8％)中。用MSD(mesoscale discovery)技术测定了完整GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)的浓度[2-5]。简单地讲，用BioMek Fx将血浆样品连续稀释成共4种稀释液，即纯血浆、1:8、1:64和1:512。每板包括以同样方式用血浆稀释的标准曲线。通过生物素化单克隆抗体(CNTO1626)将GLP-1MMB俘获至MSD各板，该生物素化单克隆抗体被设计成用来检测模拟体的完整N端。加入识别模拟体接头区的钌标记的单克隆抗体(CNTO712)以便检测，用MSD扇形图像仪6000读数器测定发光反应。应用S形剂量反应曲线(GraphPad PRISM)计算出GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)水平。
结果和讨论。GLP-1MMB的药效动力学：各时间点的ipGTT数据按血糖浓度对时间绘图(图25)。计算出每条ipGTT曲线的曲线下面积(AUC)(图26)。相对于阴性对照，一次给予GLP-1MMB(SEQ IDNO：4)导致注射后长达6天AUC呈统计显著性地减小。
GLP-1 MMB的药代动力学：将在每次葡萄糖耐量试验后DIO小鼠中GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)的血浆浓度绘图(图27)。
GLP-1 MMB的药效动力学活性与其血浆水平的相关性：在每次葡萄糖耐量试验后，将所有ipGTT数据的AUC对GLP-1MMB(SEQ ID NO：4)血浆水平绘图(图28)。将数据拟合成双曲线，得出ED50(370ng/ml)。
[0278]GLP-1模拟体的优势：使用这个新的分子作为治疗2型糖尿病的治疗药提供了若干优于其它GLP-1类似物的优势。例如，它很可能延长GLP-1肽的半衰期。同样，模拟体支架中的野生型GLP-1肽能抵抗蛋白酶降解，特别是能抵抗DPP-IV的降解。这可供用野生型GLP-1肽而不是突变型肽进行治疗。由于GLP-1是天然肽，因此用GLP-1模拟体治疗的患者比用突变的GLP-1类似物治疗的患者较少免疫应答。另外，可排除大尺寸的模拟体穿过血脑屏障。这可提供优势，因为恶心和焦虑与脑内结合GLP-1R的GLP-1相关。此外，模拟体平台导致各个模拟体分子上两种肽的表达。使可使得GLP-1肽彼此相互作用，形成可增加对细胞表面GLP-1受体亲和力的二聚配体。
[0279]应当清楚的是，可采用不同于上文和实施例中所具体描述的方法实施本发明。
[0280]在上述教导的基础上，本发明的多种修改和变化是可行的，因此，这些也都包括在本发明的范围内。
表1
Figure A200780034262D01221
Figure A200780034262D01222
序列表
<110>森托科尔公司(CENTOCOR，INC.)
     O’Neil，Karyn；Picha，Kristen
<120>人GLP-1模拟体、组合物、方法和用途
<130>CEN{INSERT
<140>
<141>
<160>68
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(2)..(2)
<223>Xaa为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(3)..(3)
<223>Xaa为Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(5)..(5)
<223>Xaa为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、His、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(6)..(6)
<223>Xaa为Phe、His、Trp或Tyr。
<220>
<221>其他特征
<222>(7)..(7)
<223>Xaa为Thr或Asn。
<220>
<221>其他特征
<222>(8)..(8)
<223>Xaa为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(9)..(9)
<223>Xaa为Glu或Asp。
<220>
<221>其他特征
<222>(10)..(10)
<223>Xaa为Val、Gln、His、Glu或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(11)..(11)
<223>Xaa为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(12)..(12)
<223>Xaa为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(13)..(13)
<223>Xaa为Tyr、Gln、His、Glu或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(14)..(14)
<223>Xaa为Leu、Gln、His、Glu或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(15)..(15)
<223>Xaa为Ala、Gly、Ser、Gln、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(16)..(16)
<223>Xaa为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、I le、Val、Gln、Asn、Arg、Cys、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(17)..(17)
<223>Xaa为Gln、Asn、Arg、His、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(18)..(18)
<223>Xaa为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(19)..(19)
<223>Xaa为Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(20)..(20)
<223>Xaa为Lys、Arg、His、Gln、Trp、Tyr、Phe、Glu或Asp。
<220>
<221>其他特征
<222>(21)..(21)
<223>Xaa为Glu、Leu、Ala、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、Gln、Thr、Ser、Gly、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(23)..(23)
<223>Xaa为Ala、Val、Leu或Glu。
<220>
<221>其他特征
<222>(24)..(24)
<223>Xaa为Ala、Gln、His、Glu或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(25)..(25)
<223>Xaa为Trp、Phe、Tyr、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(26)..(26)
<223>Xaa为Leu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(27)..(27)
<223>Xaa为Val、Gln、His、Glu或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(28)..(28)
<223>Xaa为Lys、Asn、Arg、His、Glu或Asp。
<220>
<221>其他特征
<222>(29)..(29)
<223>Xaa为Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、His、Glu、
Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(30)..(30)
<223>Xaa为Arg、His、Thr、Ser、Trp、Tyr、Phe、Glu、Asp或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(31)..(31)
<223>Xaa为Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、His、Glu、
Asp或Lys。
<400>1
Figure A200780034262D01251
<210>2
<211>278
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(10)..(10)
<223>Xaa为Gln、Glu、Lys、His或Ala。
<220>
<221>其他特征
<222>(13)..(13)
<223>Xaa为Gln、Glu、Lys、His或Ala。
<220>
<221>其他特征
<222>(14)..(14)
<223>Xaa为Gln、Glu、Lys、His或Ala。
<220>
<221>其他特征
<222>(24)..(24)
<223>Xaa为Gln、Glu、Lys或Ala。
<220>
<221>其他特征
<222>(27)..(27)
<223>Xaa为Gln、Glu、Lys、His或Ala。
<220>
<221>其他特征
<222>(44)..(44)
<223>Xaa为Asn或Gln。
<400>2
Figure A200780034262D01261
Figure A200780034262D01271
<210>3
<211>837
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(28)..(30)
<223>nnn为编码Gln、Glu、Lys、His或Ala的任何密码子。
<220>
<221>其他特征
<222>(37)..(39)
<223>nnn为编码Gln、Glu、Lys、His或Ala的任何密码子。
<220>
<221>其他特征
<222>(40)..(42)
<223>nnn为编码Gln、Glu、Lys、His或Ala的任何密码子。
<220>
<221>其他特征
<222>(70)..(72)
<223>nnn为编码Gln、Glu、Lys、His或Ala的任何密码子。
<220>
<221>其他特征
<222>(79)..(81)
<223>nnn为编码Gln、Glu、Lys、His或Ala的任何密码子。
<220>
<221>其他特征
<222>(130)..(132)
<223>nnn为编码Asn或Gln的任何密码子。
<400>3
Figure A200780034262D01272
Figure A200780034262D01281
<210>4
<211>275
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Figure A200780034262D01282
Figure A200780034262D01291
210>4
<211>275
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Figure A200780034262D01292
Figure A200780034262D01301
210>4a
<211>275
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4a
Figure A200780034262D01302
Figure A200780034262D01311
210>4b
<211>275
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4b
Figure A200780034262D01312
Figure A200780034262D01321
210>4c
<211>275
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4c
Figure A200780034262D01322
Figure A200780034262D01331
210>4d
<211>284
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4d
Figure A200780034262D01332
Figure A200780034262D01341
<210>5
<211>828
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
Figure A200780034262D01342
<210>6
<211>30
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(2)..(2)
<223>Xaa为Ala、Gly、Ser。
<220>
<221>其他特征
<222>(3)..(3)
<223>Xaa为Glu、Asp。
<220>
<221>其他特征
<222>(6)..(6)
<223>Xaa为Phe、His、Trp或Tyr。
<220>
<221>其他特征
<222>(7)..(7)
<223>Xaa为Thr或Asn。
<220>
<221>其他特征
<222>(8)..(8)
<223>Xaa为Ala、Ser、Thr。
<220>
<221>其他特征
<222>(9)..(9)
<223>Xaa为Glu或Asp。
<220>
<221>其他特征
<222>(10)..(10)
<223>Xaa为Va1、Gln、His、Glu或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(12)..(12)
<223>Xaa为Ser或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(13)..(13)
<223>Xaa为Tyr、Gln、His、Glu或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(14)..(14)
<223>Xaa为Leu、Gln、His、Glu或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(16)..(16)
<223>Xaa为Gly、Ala、Glu或Asp。
<220>
<221>其他特征
<222>(17)..(17)
<223>Xaa为Gln或Glu。
<220>
<221>其他特征
<222>(18)..(18)
<223>Xaa为Ala或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(19)..(19)
<223>Xaa为Ala、Leu、Ile、Val或Met。
<220>
<221>其他特征
<222>(21)..(21)
<223>Xaa为Glu或Leu。
<220>
<221>其他特征
<222>(23)..(23)
<223>Xaa为Ala、Val、Ile、Leu或Glu。
<220>
<221>其他特征
<222>(24)..(24)
<223>Xaa为Ala、Gln、His、Glu或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(27)..(27)
<223>Xaa为Val、Gln、His、Glu或Lys。
<220>
<221>其他特征
<222>(28)..(28)
<223>Xaa为Lys或Asn。
<220>
<221>其他特征
<222>(30)..(30)
<223>Xaa为Arg或Glu。
<400>6
Figure A200780034262D01361
<210>7
<211>63
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>7
Figure A200780034262D01362
<210>8
<211>63
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
Figure A200780034262D01371
<210>9
<211>63
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
Figure A200780034262D01372
<210>10
<211>63
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>10
Figure A200780034262D01373
<210>11
<211>63
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>11
Figure A200780034262D01374
Figure A200780034262D01381
<210>12
<211>52
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>12
Figure A200780034262D01382
<210>13
<211>43
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>13
Figure A200780034262D01383
<210>14
<211>72
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>14
Figure A200780034262D01384
Figure A200780034262D01391
<210>15
<211>31
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>15
Figure A200780034262D01392
<210>16
<211>4
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>16
Figure A200780034262D01393
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>17
<210>18
<2ll>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>18
Figure A200780034262D01395
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>19
Figure A200780034262D01401
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>20
Figure A200780034262D01402
<210>21
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>21
<210>22
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>22
Figure A200780034262D01404
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>23
Figure A200780034262D01405
<210>24
<211>4
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>24
<210>25
<211>4
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>25
Figure A200780034262D01411
<210>26
<211>23
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>26
<210>27
<211>20
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>27
<210>28
<211>20
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>28
Figure A200780034262D01414
SEQ ID NO：29
<210>29
<211>23
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>29
Figure A200780034262D01415
Figure A200780034262D01421
<210>30
<211>23
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>30
Figure A200780034262D01422
<210>31
<211>23
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>31
<210>32
<211>23
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>32
Figure A200780034262D01424
<210>33
<211>23
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>33
Figure A200780034262D01425
<210>34
<211>23
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>34
Figure A200780034262D01431
<210>35
<211>23
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>35
Figure A200780034262D01432
<210>36
<211>23
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>36
Figure A200780034262D01433
<210>37
<211>19
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>37
<210>38
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>38
Figure A200780034262D01435
Figure A200780034262D01441
<210>39
<211>20
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>39
Figure A200780034262D01442
<210>40
<211>20
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>40
Figure A200780034262D01443
<210>41
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>41
Figure A200780034262D01444
<210>42
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>42
Figure A200780034262D01445
<210>43
<211>102
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>43
Figure A200780034262D01446
Figure A200780034262D01451
<210>44
<211>106
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>44
Figure A200780034262D01452
<210>45
<211>102
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>45
Figure A200780034262D01453
Figure A200780034262D01461
<210>46
<211>107
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>46
<210>47
<211>125
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(125)
<223>Vh1重链可变区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(31)
<223>构架区1
<220>
<221>其他特征
<222>(32)..(32)
<223>X为任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(33)..(46)
<223>构架区2
<220>
<221>其他特征
<222>(47)..(47)
<223>X为任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(48)..(79)
<223>构架区3
<220>
<221>其他特征
<222>(80)..(80)
<223>X为任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(81)..(125)
<223>构架区4
<400>47
Figure A200780034262D01471
<210>48
<211>124
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(124)
<223>Vh2重链可变区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(30)
<223>构架区1
<220>
<221>其他特征
<222>(31)..(31)
<223>Xaa为任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(32)..(45)
<223>构架区2
<220>
<221>其他特征
<222>(46)..(46)
<223>Xaa为任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(47)..(78)
<223>构架区3
<220>
<221>其他特征
<222>(79)..(79)
<223>Xaa为任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(80)..(124)
<223>构架区4
<400>48
Figure A200780034262D01481
Figure A200780034262D01491
<210>49
<211>100
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(100)
<223>Vh3a重链可变区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(31)
<223>构架区1
<220>
<221>其他特征
<222>(32)..(32)
<223>互补决定区1(CDR1)，Xaa为任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(33)..(46)
<223>构架区2
<220>
<221>其他特征
<222>(47)..(47)
<223>互补决定区2(CDR2)，Xaa为10-30(18)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(48)..(79)
<223>构架区3
<220>
<221>其他特征
<222>(80)..(80)
<223>互补决定区3(CDR3)，Xaa为20-40(31)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(81)..(100)
<223>构架区4
<400>49
<210>50
<211>102
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(102)
<223>Vh3b重链可变区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(30)
<223>构架区1
<220>
<221>其他特征
<222>(31)..(31)
<223>互补决定区1(CDR1)，Xaa为3-20(5)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(32)..(45)
<223>构架区2
<220>
<221>其他特征
<222>(46)..(46)
<223>互补决定区2(CDR2)，Xaa为5-25(11)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(47)..(78)
<223>构架区3
<220>
<221>其他特征
<222>(79)..(79)
<223>互补决定区3(CDR3)，Xaa为15-40(23)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(80)..(102)
<223>构架区4
<400>50
Figure A200780034262D01511
<210>51
<211>101
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(101)
<223>Vh3c重链可变区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(30)
<223>构架区1
<220>
<221>其他特征
<222>(31)..(31)
<223>互补决定区1(CDR1)，Xaa为3-20(5)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(32)..(45)
<223>构架区2
<220>
<221>其他特征
<222>(46)..(46)
<223>互补决定区2(CDR2)，Xaa为10-30(19)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(47)..(79)
<223>构架区3
<220>
<221>其他特征
<222>(80)..(80)
<223>互补决定区3(CDR3)，Xaa为15-40(25)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(81)..(101)
<223>构架区4
<400>51
Figure A200780034262D01521
Figure A200780034262D01531
<210>52
<211>108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(108)
<223>Vh4重链可变区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(33)
<223>构架区1
<220>
<221>其他特征
<222>(34)..(34)
<223>互补决定区1(CDR1)，Xaa为3-20(7)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(35)..(48)
<223>构架区2
<220>
<221>其他特征
<222>(49)..(49)
<223>互补决定区2(CDR2)，Xaa为10-30(16)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(50)..(81)
<223>构架区3
<220>
<221>其他特征
<222>(82)..(82)
<223>互补决定区3(CDR3)，Xaa为20-45(32)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(83)..(108)
<223>构架区4
<400>52
Figure A200780034262D01532
Figure A200780034262D01541
<210>53
<211>132
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(132)
<223>Vh5重链可变区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(31)
<223>其他特征
<220>
<221>其他特征
<222>(32)..(32)
<223>互补决定区1(cDRl)，xaa为3-20(5)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(33)..(46)
<223>构架区2
<220>
<221>其他特征
<222>(47)..(47)
<223>互补决定区2(CDR2)，Xaa为10-30(17)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(48)..(79)
<223>构架区3
<220>
<221>其他特征
<222>(80)..(80)
<223>互补决定区3(CDR3)，xaa为15-40(23)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(81)..(132)
<223>构架区4
<400>53
Figure A200780034262D01551
<210>54
<211>125
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(125)
<223>Vh6重链可变区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(30)
<223>构架区1
<220>
<221>其他特征
<222>(31)..(31)
<223>互补决定区1(CDR1)，Xaa为3-20(7)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(32)..(45)
<223>构架区2
<220>
<221>其他特征
<222>(46)..(46)
<223>互补决定区2(CDR2)，Xaa为10-30(18)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(47)..(78)
<223>构架区3
<220>
<221>其他特征
<222>(79)..(79)
<223>互补决定区3(CDR3)，Xaa为5-30(13)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(80)..(125)
<223>构架区4
<400>54
Figure A200780034262D01561
<210>55
<211>91
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(91)
<223>Vh7重链可变区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(30)
<223>构架区1
<220>
<221>其他特征
<222>(31)..(31)
<223>互补决定区1(CDR1)，Xaa为3-20(5)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(32)..(45)
<223>构架区2
<220>
<221>其他特征
<222>(46)..(46)
<223>互补决定区2(CDR2)，Xaa为10-30(17)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(47)..(78)
<223>构架区3
<220>
<221>其他特征
<222>(79)..(79)
<223>互补决定区3(CDR3)，Xaa为5-30(13)任何氨基酸。
<220>
<221>其他特征
<222>(80)..(91)
<223>构架区4
<400>55
Figure A200780034262D01571
Figure A200780034262D01581
<210>56
<211>354
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(354)
<223>IgA1重链恒定区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(102)
<223>CH1
<220>
<221>其他特征
<222>(103)..(121)
<223>铰链区
<220>
<221>其他特征
<222>(122)..(222)
<223>CH2
<220>
<221>其他特征
<222>(223)..(354)
<223>CH3
<400>56
Figure A200780034262D01582
Figure A200780034262D01591
Figure A200780034262D01601
<210>57
<211>340
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(340)
<223>IgA2重链恒定区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(102)
<223>CH1
<220>
<221>其他特征
<222>(103)..(108)
<223>铰链区
<220>
<221>其他特征
<222>(109)..(209)
<223>CH2
<220>
<221>其他特征
<222>(210)..(340)
<223>CH3
<400>57
Figure A200780034262D01602
Figure A200780034262D01611
Figure A200780034262D01621
<210>58
<211>384
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(384)
<223>IgD重链恒定区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(101)
<223>CH1
<220>
<221>其他特征
<222>(102)..(135)
<223>铰链区1
<220>
<221>其他特征
<222>(136)..(159)
<223>铰链区2
<220>
<221>其他特征
<222>(160)..(267)
<223>CH2
<220>
<221>其他特征
<222>(268)..(384)
<223>CH3
<400>58
Figure A200780034262D01631
Figure A200780034262D01641
<210>59
<211>497
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(497)
<223>IgE重链恒定区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(103)
<223>CH1
<220>
<221>其他特征
<222>(104)..(210)
<223>CH2
<220>
<221>其他特征
<222>(211)..(318)
<223>CH3
<220>
<221>其他特征
<222>(319)..(497)
<223>CH4
<400>59
Figure A200780034262D01651
Figure A200780034262D01661
<210>60
<211>339
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(339)
<223>IgG1重链恒定区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(98)
<223>CH1
<220>
<221>其他特征
<222>(99)..(113)
<223>铰链区
<220>
<221>其他特征
<222>(114)..(223)
<223>CH2
<220>
<221>其他特征
<222>(224)..(339)
<223>CH3
<400>60
Figure A200780034262D01672
Figure A200780034262D01681
<210>61
<211>326
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(326)
<223>IgG2重链恒定区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(98)
<223>CH1
<220>
<221>其他特征
<222>(99)..(110)
<223>铰链区
<220>
<221>其他特征
<222>(111)..(219)
<223>CH2
<220>
<221>其他特征
<222>(220)..(326)
<223>CH3
<400>61
Figure A200780034262D01691
Figure A200780034262D01701
<210>62
<211>377
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(377)
<223>IgG3重链恒定区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(98)
<223>CH1
<220>
<221>其他特征
<222>(99)..(115)
<223>铰链区1
<220>
<221>其他特征
<222>(116)..(130)
<223>铰链区2
<220>
<221>其他特征
<222>(131)..(145)
<223>铰链区3
<220>
<221>其他特征
<222>(146)..(160)
<223>铰链区4
<220>
<221>其他特征
<222>(161)..(270)
<223>CH2
<220>
<221>其他特征
<222>(271)..(377)
<223>CH3
<400>62
Figure A200780034262D01711
Figure A200780034262D01731
<210>63
<211>327
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(327)
<223>IgG4重链恒定区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(98)
<223>CH1
<220>
<221>其他特征
<222>(99)..(110)
<223>铰链区
<220>
<221>其他特征
<222>(111)..(220)
<223>CH2
<220>
<221>其他特征
<222>(221)..(327)
<223>CH3
<400>63
Figure A200780034262D01732
Figure A200780034262D01741
Figure A200780034262D01751
<210>64
<211>476
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(476)
<223>IgM重链恒定区
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(104)
<223>CH1
<220>
<221>其他特征
<222>(105)..(217)
<223>CH2
<220>
<221>其他特征
<222>(218)..(323)
<223>CH3
<220>
<221>其他特征
<222>(324)..(476)
<223>CH4
<400>64
Figure A200780034262D01752
Figure A200780034262D01761
Figure A200780034262D01771
<210>65
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>65
<210>66
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>66
Figure A200780034262D01781
<210>67
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>67
Figure A200780034262D01782
<210>68
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>68
Figure A200780034262D01783

Claims (38)

1.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体核酸，其包含至少一种编码氨基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多核苷酸或与其互补的多核苷酸，所述GLP-1 CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
2.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体核酸，其包含至少一种编码包含选自SEQ ID NO：2、4、6或7-14中的至少一个的氨基酸序列的多核苷酸或与其互补的多核苷酸，其中所述GLP-1 CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
3.权利要求2的至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体核酸，其包含至少一种编码氨基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多核苷酸或与其互补的多核苷酸，其中所述GLP-1 CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
4.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体核酸，其包含至少一种编码下式(I)多肽的多核苷酸：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P包含至少一种选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6的生物活性GLP-1肽，L是至少一个包含Ser和Gly的接头序列，V是免疫球蛋白可变区C端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1 CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
5.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的所有连续氨基酸，其中所述GLP-1 CH1缺失模拟体多肽在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
6.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，其包含SEQ IDNO：7-14中至少一个的所有连续氨基酸，其中所述GLP-1 CH1缺失模拟体多肽在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
7.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，其包含下式(I)的多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6的至少一种生物活性GLP-1肽，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO：16)、GSGGGS(SEQID NO：17)、GGSGGGS(SEQ ID NO：18)、GGSGGGSGG(SEQ IDNO：19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO：20)，V选自GTLVTVSS(SEQID NO：21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO：22)、GTAVTVSS(SEQ IDNO：23)、TVSS(SEQ ID NO：24)和AVSS(SEQ ID NO：25)，H是EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：26)，CH2是SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO：43)，CH3是GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：44)，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
8.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，其包含下式(I)的多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是SEQ ID NO：6的至少一种生物活性GLP-1肽，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO：16)、GSGGGS(SEQ ID NO：17)、GGSGGGS(SEQ ID NO：18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO：19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO：20)，V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO：21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO：22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO：23)、TVSS(SEQ ID NO：24)和AVSS(SEQ ID NO：25)，H是ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(SEQ IDNO：27)，CH2是SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO：45)，CH3是GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：46)，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
9.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，其包含下式(I)的多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是SEQ ID NO：6的至少一种生物活性GLP-1肽，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO：16)、GSGGGS(SEQ ID NO：17)、GGSGGGS(SEQ ID NO：18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO：19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO：20)，V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO：21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO：22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO：23)、TVSS(SEQ ID NO：24)和AVSS(SEQ ID NO：25)，H是ESKYGPPCPPCPAPEAAGGP(SEQ IDNO：28)，CH2是SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO：45)，CH3是GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：46)，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1 CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
10.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，其包含下式(I)的多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一个接头序列，该接头序列可以是通过使模拟体具有选择性方向和结合特性从而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO：43)，CH3是GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：44)，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1 CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
11.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，其包含下式(I)的多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一个接头序列，该接头序列可以是通过使模拟体具有选择性方向和结合特性从而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO：45)，CH3是GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：46)，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1 CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
12.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，其包含下式(I)的多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是SEQ ID NO：6的至少一种生物活性GLP-1肽，L是至少一个接头序列，该接头序列可以是通过使模拟体具有选择性方向和结合特性从而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1 CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
13.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，所述多肽包含下式(I)的多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO：16)、GSGGGS(SEQ ID NO：17)、GGSGGGS(SEQ ID NO：18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO：19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO：20)，V是免疫球蛋白可变区C端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
14.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，其包含下式(I)的多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一个接头序列，该接头序列可以是通过使模拟体具有选择性方向和结合特性从而提供结构柔性的多肽，V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO：21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO：22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO：23)、TVSS(SEQ ID NO：24)和AVSS(SEQ ID NO：25)，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
15.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，其包含下式(I)的多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一个接头序列，该接头序列可以是通过使模拟体具有选择性方向和结合特性从而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C端的至少一部分，H选自EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：26)、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(SEQ ID NO：27)和ESKYGPPCPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO：28)，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
16.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，其包含下式(I)的多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一个接头序列，该接头序列可以是通过使模拟体具有选择性方向和结合特性从而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C端的至少一部分，H选自EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO：29)、EPKSADKTHTCPPCPAPELAGGP(SEQ ID NO：30)、EPKSADKTHTCPPCPAPEALGGP(SEQ ID NO：31)、EPKSADKTHTCPPCPAPELEGGP(SEQ ID NO：32)、EPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGP(SEQ ID NO：33)、EPKSADKTHACPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：34)、EPKSADKAHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：35)和EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：36)、ADKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：37)、THTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：38)、ESKYGPPCPSCPAPEAAGGP(SEQ ID NO：39)、ESKYGPPCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：40)、CPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：41)和CPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO：42)，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
17.至少一种下式(I)的GLP-1CH1缺失模拟体多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一个接头序列，该接头序列可以是通过使模拟体具有选择性方向和结合特性从而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，其中所述GLP-1CH1缺失模拟体在体外或体内具有至少一种GLP-1生物活性并且还包含至少一个N-联糖基化位点。
18.权利要求1-17中任一项的GLP-1 CH1缺失模拟体核酸或GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，其中所述多肽具有至少一种P多肽的至少一种活性。
19.一种抗独特型单克隆或多克隆抗体、融合蛋白或它们的片段，其特异性地结合权利要求4-17中任一项的至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽。
20.权利要求1-3中任一项的GLP-1 CH1缺失模拟体核酸或与其互补的多核苷酸、或编码权利要求4-17中任一项的至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽或GLP-1 CH1缺失模拟体抗体的GLP-1 CH1缺失模拟体核酸或与其互补的多核苷酸。
21.一种GLP-1 CH1缺失模拟体载体，其包含权利要求20的至少一种分离核酸。
22.一种GLP-1 CH1缺失模拟体宿主细胞，其包含权利要求20的分离核酸。
23.权利要求21的GLP-1 CH1缺失模拟体宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、NSO、DG44CHO、CHO K1、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞或其任何衍生细胞、无限增殖化细胞或转化细胞中的至少一种。
24.一种产生至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽或GLP-1 CH1缺失模拟体抗体的方法，该方法包括在体外、体内或原位条件下翻译权利要求20的核酸，从而以可检测或可回收量表达GLP-1 CH1缺失模拟体或抗体。
25.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-20中任一项的至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体核酸、至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽或至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体抗体。
26.权利要求25的组合物，其中所述组合物还包含至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
27.权利要求25的组合物，所述组合物还包含至少一种包含治疗有效量的至少一种选自以下的至少一种的化合物、组合物或多肽的组合物：糖尿病或胰岛素代谢相关药物、可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、抗感染药、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素类药物、用于体液或电解质平衡的药物、血液系统药物、抗肿瘤药、免疫调节药、眼、耳或鼻用药物、局部用药物、营养药、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
28.权利要求25的组合物，所述组合物呈至少一种选自以下的形式：液体制剂、气体制剂或干的制剂、溶液剂、合剂、混悬剂、乳液剂或胶体、冻干制剂或粉剂。
29.一种用于在细胞、组织、器官或动物中诊断或治疗GLP-1相关疾病的方法，该方法包括：
(a)使包含有效量的权利要求1-19中任一项的至少一种GLP-1CH1缺失模拟体核酸、多肽或抗体的组合物与所述细胞、组织、器官或动物接触，或者将包含有效量的权利要求1-19中任一项的至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体核酸、多肽或抗体的组合物给予所述细胞、组织、器官或动物。
30.权利要求29的方法，其中所述GLP-1相关疾病是糖尿病或充血性心力衰竭。
31.权利要求29的方法，其中所述有效量为每千克所述细胞、组织、器官或动物0.0001-50mg GLP-1CH1缺失模拟体抗体、0.1-500mg所述GLP-1 CH1缺失模拟体或0.0001-100μg所述GLP-1 CH1缺失模拟体核酸。
32.权利要求29的方法，其中所述接触或所述给予通过至少一种选自以下的方式进行：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、损害内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮。
33.权利要求29的方法，该方法还包括在所述(a)接触或给予之前、同时或之后给予至少一种包含有效量的至少一种化合物或多肽的组合物，其中所述化合物或多肽选自糖尿病或胰岛素代谢相关药物、可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、抗感染药、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素类药物、用于体液或电解质平衡的药物、血液系统药物、抗肿瘤药、免疫调节药、眼、耳或鼻用药物、局部用药物、营养药、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。
34.一种装置，所述装置包括权利要求1-20中任一项的至少一种分离的GLP-1 CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸，其中所述装置适于通过至少一种选自以下的方式接触或给予所述GLP-1 CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸中的至少一种：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、损害内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮。
35.一种用于人用药物或诊断用途的制造品，所述制造品包括包装材料和装有权利要求1-20中任一项的至少一种分离的GLP-1 CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸的容器。
36.权利要求35的制造品，其中所述容器是以下形式的递药装置或系统的构件：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、损害内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递药装置或系统。
37.一种制备权利要求1-20中任一项的至少一种分离的GLP-1CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸的方法，该方法包括提供至少一种能够以可检测或可回收量表达所述多肽、抗体或核酸的宿主细胞、转基因动物、转基因植物、植物细胞。
38.通过权利要求37的方法制备的至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸。
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