CN101525587B

CN101525587B - 一株链霉菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN101525587B
Application number: CN200910080902XA
Authority: CN
Inventors: 刘西莉; 卢晓红; 袁善奎; 李健强; 朱春雨; 刘鹏飞; 卢志军; 王红梅; 韩平; 黄中乔
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2009-03-25
Filing date: 2009-03-25
Publication date: 2011-06-01
Anticipated expiration: 2029-03-25
Also published as: CN101525587A

Abstract

本发明公开了一株链霉菌菌株及其应用。本发明提供的菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)YL04 CGMCC No.2884。本发明提供的菌株YL04具有理想的生防效果和开发价值，可于田间大面积推广，重点解决蔬菜、瓜类等作物苗期猝倒病和立枯病等危害日益加重，造成严重的减产或降低产品质量的问题。本发明对丰富我国用于生物防治的菌株资源具有重要的科学意义和应用价值，为实现高产优质现代农业提供了有效措施。本发明符合我国农产品安全生产标准的要求和无公害、绿色和有机农业生产基地建设需要，具有一定的经济和社会效益。

Description

一株链霉菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株链霉菌菌株及其应用。

背景技术

几个世纪以来，化学农药在植物病虫草鼠害的防治工作中发挥着积极的作用，为农业的稳产、增产、挽回损失和提高品质做出了重要贡献。但过量施用和滥用农药也导致了地力衰退、环境污染、影响非靶标生物和有害生物的抗药性等严重问题。尤其近年来，农产品中农药残留超标造成的人畜中毒事件不断发生，严重威胁着人民的生活质量，也限制了我国农产品的外贸出口。土传病害的猖獗发生和化学杀菌剂的潜在污染已成为农业安全生产中的首要关键问题。

随着社会文明的发展，农业可持续发展问题使人类对资源与环境的认识有了新的飞跃，对农药提出了高效、低毒、环境友好型的要求。世界各国也在采取实际步骤减少化学合成农药的使用，如美国EPA在20世纪90年代宣布撤消91种化学农药的登记，荷兰、丹麦在1990年制定了减少一半农药使用量的五年和十年计划，欧盟也制定了类似的计划，我国已撤消十几种化学农药的登记。为了解决提高农产品产量和保证农产品质量之间的矛盾，达到综合防治重大病虫害、减少化学农药使用量的目的，发展生物防治技术越来越受到各国政府、科技工作者和民众的关注。

生物菌剂(BCA)具有低毒、环境兼容性好、具有在作物幼苗根际建群的能力、持效期长、有害生物不易对其产生抗药性等特点，因而得到了广泛的关注和重视。目前国际上先进的农化公司大多积极参与了生物菌剂的研究和市场化，有益细菌对土传、种传病害的防治已取得了一定进展，并有系列产品得到了成功的应用，取得了显著的经济和生态效益。生物防治作为综合防治的一项重要措施，在植物病虫害综合治理中发挥着愈来愈重要的作用。

生防菌作为生物防治的重要一环，一直是植物病害生物防治的研究热点。生防菌的种类繁多，生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌、病毒等。其中放线菌是人们最早被研究并应用到生产中的生防微生物。放线菌(Actinomycete)是一类具有丝状分枝细胞的革兰氏阳性细菌，因菌落呈放射状而得名，大多数有发达的分枝菌丝。放线菌菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1μm，可分为营养菌丝和气生菌丝：营养菌丝又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝一般叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝，在气生菌丝上分化出可产生孢子的孢子丝，孢子丝的形状和排列方式因种而异，成熟的孢子丝上产生成串的分生孢子，孢子的表面结构、形状及颜色在一定条件下比较稳定，是鉴定菌种的重要依据。放线菌以无性孢子和菌体断裂方式繁殖，绝大多数为异养型需氧菌，有的种类可在高温下分解纤维素等复杂的有机质。放线菌在自然界分布很广，绝大多数为腐生，少数寄生，并可产生种类繁多的抗生素。据估计，已发现的6000多种抗生素中有2/3是放线菌产生的。放线菌重要的属包括链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。

放线菌是抗生素的重要生物来源，放线菌目中，链霉菌属(Streptomyces)分布广泛、产生代谢物质能力强，由它产生的抗生素占了所有放线菌抗生素数量的2/3，因此最为重要。由链霉菌产生的目前在生产中得到广泛应用的抗生素主要包括：(1)井冈霉素：在北方是防治小麦纹枯病的主要农药，目前还没发现对井冈霉素产生抗性的菌株或株系；(2)多效霉素：据试验，对苹果腐烂病菌、苹果果实腐烂病菌和葡萄白腐病菌等具有较强的抑菌作用；(3)农抗120：近年来曾得到广泛应用，用于防治小麦白粉病，水稻纹枯病，苹果树腐烂病，花生叶斑病和西瓜枯萎病等(王光亮，于金友，石玉萍，等，2004)。

经过40多年的不断探索，目前国际上已筛选出了10多种最具生防价值的链霉菌，并在不同的历史阶段起到了巨大的作用。至今寻找和研究不同的放线菌及其产生的抗生素的活性仍是植物病害防治中一个重要的领域，对于生态农业的持续发展具有重要的意义。

附图说明

图1为菌株YL04基因组总DNA电泳图谱。

图2为对YL0416SrRNA的PCR扩增产物的电泳图。

发明内容

本发明的目的是提供一株链霉菌菌株及其应用。

本发明所提供的链霉菌(Streptomyces sp.)，名称为YL04，属于放线菌目(Actinomycete)链霉菌属(Streptomyces)，已于2009年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2884。

本发明还保护所述链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884的代谢物。

所述链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884和/或其代谢物可应用于抑制真菌，具体可应用于抗植物真菌病害中，如应用于抗蔬菜苗期猝倒病、小麦纹枯病或小麦全蚀病等。

本发明还保护一种链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884的培养方法，是用如下培养基培养链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884：硫酸铵2g，磷酸氢二钾1g，可溶性淀粉10g，七水合硫酸镁1g，氯化钠1g，碳酸钙3g，琼脂粉10g，用水定容至1000ml。培养所述链霉菌(Streptomyces sp.)YL04 CGMCC No.2884的条件具体可为：pH 5.0-8.0、7-10天、24-28℃。

本发明还保护一种制备链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884代谢物的方法，是用如下培养基培养链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884：酵母膏5g，七水合硫酸镁0.05g，碳酸钙0.2g，氯化钠0.4g，淀粉10g，大豆粉10g，蛋白胨5g，用水定容至1000ml。培养所述链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884具体可采用液体培养，所述液体培养的条件为：pH 5.08.0、转速120-200rpm、3-7天、24-28℃、1％接菌量、10-40％装瓶量(体积百分含量)。所述液体培养的条件优选为：pH8.0、转速180rpm、3天、温度26℃、1％接菌量、20％装瓶量(体积百分含量)。

本发明还保护一种真菌抑制剂，其活性成分为链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884和/或培养链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884得到的代谢物。所述真菌抑制剂可为抗植物真菌病害的生防制剂。

所述真菌具体可为瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、小麦全蚀病菌(Geaumanomyces graminis)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、小麦立枯丝核菌(Rhizoctonia cerealisbv)、稻瘟菌(Pyricularia grisea)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、水稻纹枯病菌(Rhizoc tonia solani)或番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)。

本发明通过研究证明，菌株YL04对所有供试植物病原真菌都有不同程度的抑制作用，其中对苹果腐烂病菌的活性最高，抑制率达89.7％；对瓜果腐霉的抑制率达73.18％；对小麦立枯丝核菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉和稻瘟菌的抑制率将近60％；但对所有供试植物病原细菌都没有活性，说明YL04具有较广谱的抗真菌活性。

本发明还在温室条件下研究了YL04菌株通过喷雾接种法，灌根接种法和浸种法三种不同方法接种黄瓜、番茄及甜椒后对其幼苗和植株生长的影响。结果表明，该菌株对三种作物安全，均无致病性，且有促进生长的作用。该研究为YL04在生产中的进一步应用推广提供理论依据。

本发明通过田间小区试验，明确了YL04菌株接种几种蔬菜和小麦种子后对其生产中腐霉菌引起的猝倒病，立枯丝核菌引起的立枯病和全蚀病菌引起的全蚀病均具有良好的预防和控制作用，并可促进植株生长和增产作用，具有显著的防病保苗效果。

本发明提供的菌株YL04具有理想的生防效果和开发价值，可于田间大面积推广，重点解决蔬菜、瓜类等作物苗期猝倒病和立枯病等危害日益加重，造成严重的减产或降低产品质量的问题。本发明对丰富我国用于生物防治的菌株资源具有重要的科学意义和应用价值，为实现高产优质现代农业提供了有效措施。本发明符合我国农产品安全生产标准的要求和无公害、绿色和有机农业生产基地建设需要，具有一定的经济和社会效益。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中，牛津杯的直径为10mm。

实施例1、链霉菌菌株YL04的分离和鉴定

一、菌株的分离

链霉菌菌株YL04是2004年对采自黑龙江克山县马铃薯基地的马铃薯早疫病叶进行菌株分离时发现的一株具有潜在生防作用的菌株，具体分离步骤如下：

1、剪取样本病健交界的部位，用无菌水冲洗2次后在70％酒精中浸5秒进行表面消毒，再用无菌水冲洗1次，放于灭菌的吸水滤纸上，自然晾干。

2、将消毒后的病样接种于黑麦蔗糖琼脂培养基上，20℃培养7天。7天后发现其中的一个培养基上早疫病菌菌丝生长的同时，有另一种菌落生成，在该菌落周围的培养基上可产生明显的抑菌圈，对番茄早疫病菌表现出一定的抑制作用。该菌株生长非常缓慢，形成很小的菌落，多皱褶，致密，干燥，可形成根毛状基生菌丝，形态特征类似放线菌。在离体条件下该菌株的代谢产物对多种病原菌具有良好的抑菌活性，将该菌株命名为YL04。

二、菌株鉴定

(一)菌株YL04的形态和生理特征鉴定

参考《一般细菌常用方法》和《放线菌分类基础》(阮继生，1977)中的方法，采用形态学观察、多项生理生化指标检测对YL04的生物学特性进行系统研究。

菌株YL04的形态特征：菌落小、表面崎岖、多皱、密致、干燥，且菌落结构可随植株年龄和生长条件而变化。基生菌丝根毛状、不断裂；气生菌丝很快变成孢子丝，孢子丝微曲，断裂成球形孢子。气生菌丝体覆盖在菌落表层，呈粉状。

菌株YL04的生理特征：接触酶试验产生气泡、反应阳性；水解淀粉出现透明带；产生硫化氢测定为阴性；不产生黑色素；产生纤维素酶；还原硝酸盐成亚硝酸盐；液化明胶，石蕊牛奶反应显示石蕊变蓝，牛奶澄清透明，表明该菌产碱、胨化等。

形态和生理特征鉴定结果表明，菌株YL04属于链霉菌属(Streptomyces)。

(二)菌株YL04的分子鉴定(YL04菌株的16SrRNA基因序列分析)

1、基因组DNA的提取

应用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取菌株YL04的基因组。取5μL DNA样品进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，260nm紫外灯下观察并照相。电泳结果如图1所示，图1中，1：YL04全基因组DNA；M：DNA Marke(DL2000Plus DNA Marker：5000，3000，2000，1000，750，500，250，100bp)。由图可见，DNA呈一条特异性条带，无明显的降解片段产生，说明所提取的基因组DNA完整，可以作为PCR反应的模板。

2、PCR扩增

采用已报道的引物序列(徐平，2003)，以YL04基因组DNA为模板在Techne PCR仪上进行PCR反应，反应程序为94℃变性5min；94℃变性1min，56℃复性1min，72℃延伸2min进行35个循环；72℃延伸5min。取3μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，260nm紫外灯下观察并照相。引物序列如下：

引物A(正向引物)，8-27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

引物B(反向引物)，1523-1504r：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

PCR反应体系(50μL)：

10×PCR buffer 6μL

10mmol/L dNTP 4μL

正向引物(20μmol/L)1μL

反向引物(20μmol/L)1μL

基因组DNA ＜100ng

Taq酶(5U/μL) 1μL

H₂O 补至50μL

电泳结果如图2所示。图2中，1：对YL0416SrRNA基因的PCR扩增产物；2泳道为PCR无模板对照；M：DNA Marke(DL2000Plus DNA Marker：5000，3000，2000，1000，750，500，250，100bp)。扩增出了1500bp左右清晰特异的条带。

3、PCR产物的回收

用Easypure Quik Gel Extraction Kit(TransGen Biotech)回收PCR产物。

4、PCR产物的克隆及测序

(1)连接

用pGM-T Vector试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行连接。

连接体系(10μL)：

pGM-T Vector(约50ng/μL) 1μL

2×T4DNA Rapid Ligation Buffer 5μL

T4DNA Ligase(3U/μL) 1μL

目的片段 1-3μL

补水至 10μL

混匀后置于4℃连接过夜。

(2)转化

(a)冰上冻融50μL感受态大肠杆菌(Escherichia coli)Top10；

(b)加入5μL连接产物，轻轻混匀；

(c)冰上放置30min以上；

(d)42℃热击90s；

(e)于冰上静置2min，加500μL LB培养基；

(f)37℃，1500rpm摇培45min；

(g)取40μL 2％X-gal和7μL 20％IPTG均匀涂布在含有50μg/mL的氨苄青霉素LB平板上(37℃放置1小时以上)，然后涂布100μL转化物于LB平板，37℃培养过夜，经蓝白斑筛选阳性克隆。

(3)阳性克隆的鉴定

PCR反应体系(25μL)：

10×PCR buffer 3μL

10mmol/L dNTP 2μL

20μmol/L正向引物 0.5μL

20μmol/L反向引物 0.5μL

Taq酶(5U/μL) 0.5μL

H₂O 18.5μL

用无菌枪头蘸取抗生素阳性菌落于PCR体系中，PCR阳性克隆由北京三博远志生物技术有限责任公司测序。测序结果表明，扩增片段长度为1519bp，其DNA序列如序列表的序列1所示。

5、16SrRNA基因序列分析

将菌株YL04的16SrRNA核苷酸序列输入到NCBI网站进行相似性比对后，发现YL04的16SrRNA核苷酸序列与链霉菌属(Streptomyces)多个种的序列相似性达99.4％以上，所以确定YL04属于链霉菌属(Streptomyces)。

通过菌株YL04的分子鉴定结果，进一步确认菌株YL04为链霉菌属(Streptomyces)。将链霉菌(Streptomyces sp.)YL04保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2884。

实施例2、菌株YL04的培养基及培养条件筛选

常用的放线菌培养基有多种，如高氏一号培养基、燕麦片琼脂培养基、察氏培养基等，但针对不同种属的放线菌和不同的培养目的，最适培养基不同。本试验选择44种培养基作为供试培养基，从中筛选出1-2种最适合YL04的生长和产素培养基；同时，确定了以产素为目的培养菌株YL04时，最适的装瓶量、pH值、摇培转速和培养时间。为进一步研究YL04产生的抗菌物质的理化性质、结构特点、作用机制及其工业化发酵生产提供参考。

一、生长培养基的筛选

1、将在低温条件下保存的菌株YL04转接至高氏一号培养基斜面，28℃下培养5d，活化菌株。向菌株生长良好的试管中加适量无菌水，充分振荡，制成浓度为10⁸cfu/ml孢子悬浮液，然后10倍逐级稀释，制成系列梯度的孢子悬浮液备用。

2、将配制好的44种培养基，121℃下湿热灭菌20min，将熔化的培养基按照15ml/皿的量倒入已灭菌的培养皿中，制成培养基平板备用。

3、吸取浓度为10³cfu/ml的孢子悬浮液，按照100μl/皿的量分别加入44种培养基平板上，涂布均匀，在超净工作台中晾干平板表面的水分后，将其置于26±2℃的培养箱中暗培养，10天后记录每皿上生长的单菌落数及测量菌落直径。

试验设置三次重复，结果取平均值。结果表明，44种供试培养基中，有25种可供YL04菌株生长，其中编号1、2、4、5、20、35、37、38、40、44的十种培养基上菌株生长情况良好，因此初步选定其为供试培养基。进一步进行二次筛选，二次筛选的结果表明，2号培养基上单菌落数高于其他培养基；在35号培养基上放线菌生长较快，表现为单菌落直径最大，但是单菌落数量较少；所以选定2号培养基(淀粉铵培养基)为最适合菌株YL04生长的培养基。

2号培养基的配制方法为：硫酸铵2g，磷酸氢二钾1g，可溶性淀粉10g，七水合硫酸镁1g，氯化钠1g，碳酸钙3g，琼脂粉10g，蒸馏水1000ml。

二、产素培养基的筛选

1、向菌株YL04生长良好的试管斜面中加适量无菌水，充分振荡，制成浓度为10⁸cfu/ml孢子悬浮液备用。

2、将配制好的44种液体培养基加入容积为450ml的组培瓶中，每瓶100ml，121℃湿热灭菌20min，备用。

3、分别将步骤1制备的孢子悬浮液接种入44种培养基中，1mL/瓶，26℃、150rpm摇床培养。分别在1、2、3、5、7d取样，将样品培养液离心(10000gpm，2min)，取上清液备用。

4、制作PDA平板，在平板上以中心点为对称点放置两个牛津杯，牛津杯距平板中心3cm，在每个牛津杯中加入100μl步骤3制备的上清液(以加入无菌水的处理作为对照)，每个处理设3个重复，静置，24h后在平板中心点位置接入直径为5mm的靶标菌(苹果腐烂病菌)的菌饼。将培样皿放置在26±2℃的培养箱中暗培养，3d后测量菌落的半径，计算生长抑菌率。

试验结果表明，菌株YL04培养1d后，未检测到培养液对靶标菌具有抑菌活性，2d后可检测到11种培养基的培养液具有抑菌活性，3d后大部分培养基的培养液均具有抑菌作用，其中编号为1、4、9、13、17、30、36、38、40、47的培养基的培养液的抑菌活性较强，因此选定其为供试培养基。进一步进行二次筛选，二次筛选试验结果表明，36号培养基的培养液在3d时抑菌效果较好，在4、5、6、7d时培养液的抑菌活性均优于其它供试培养基，所以拟定36号培养基为最适合菌株YL04产生抗菌物质的培养基。

36号培养基配制方法为：酵母膏5g，七水合硫酸镁0.05g，碳酸钙0.2g，氯化钠0.4g，淀粉10g，大豆粉10g，蛋白胨5g，用蒸馏水定容至1000ml。

三、装瓶量和pH值的筛选

以36号培养基为供试培养基，设置10％、20％、30％、40％四个不同的装瓶量处理，同时，在每个装瓶量处理设置pH值分别为4、5、6、7、8、9、10七个不同处理，共计28个处理。

于28℃、180rpm的转速下培养菌株YL04，分别于3、4、5d后取上清检测抑菌效果。采用带毒平板法检测抑菌效果：将100μl上清液加到100ml PDA培养基中充分混匀，倒平板，在平板中央接种直径为5mm的苹果树腐烂病菌菌饼；同时，设置添加100μl无菌水的PDA平板作为对照。将培样皿放置在26±2℃的培养箱中暗培养，3d后测量菌落的半径，计算生长抑制率。

试验设3次重复，结果取平均值。结果见表1。

表1不同培养条件下菌株发酵液的抑菌率

试验结果表明，不同的装瓶量和pH值对YL04产素影响较大。pH值为5至10，各种装瓶量的培养液均具有抑菌效果。起始pH值为7和8，装瓶量为20％时培养液的抑菌效果最优。

四、转速的筛选

以装瓶量和pH值的筛选试验结果为基础，即在pH值为8，20％装瓶量，1％接菌量时进一步筛选培养条件。26℃下设置120rpm、160rpm、180rpm和200rpm四个不同的转速处理。分别于1、2、3d后取样，检测抑菌效果，检测方法同步骤三。试验设3次重复，结果取平均值。结果见表2。

表2不同转速条件菌株发酵液的抑菌率

	120rpm	160rpm	180rpm	200rpm
					1d	-0.79	0.00	0.36	2.97
2d	80.29	51.41	59.17	79.04
					3d	85.33	82.71	88.10	75.27

试验结果表明，不同的转速对YL04的产素具有一定的影响，转速由低到高时培养液的抑菌作用也表现为逐渐增强，当转速达到一定程度后，培养液的抑菌活性却随着转速的增加而降低，转速为180rpm、培养时间为3d的条件下培养液的抑菌效果表现最为明显。

实施例3、菌株YL04的抑菌活性(抑菌谱测定)

一、菌株YL04代谢液对病原真菌的抑制效果

本实验选择了13个属中的15个种的植物病原真菌，采用牛津杯法检测YL04代谢液对病原真菌的抑制效果，以明确YL04菌体和代谢产物的抑菌生防作用和防治谱，为该菌株进一步的研发及田间应用提供依据。

供试病原真菌如下：瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、黄瓜疫霉病菌(Phytophthora melonis)、甜椒疫病菌(Phytophthora copsici)、小麦全蚀病菌(Geaumanomyces graminis)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、水稻纹枯病菌(Rhizoc tonia solani)、小麦立枯丝核菌(Rhizoc tonia cerealisbv)、稻瘟菌(Pyricularia grisea)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)。以上病原菌均可从发病植株上采用常规方法分离获得，或者从中国农业大学植病系种子病理实验室直接获取。

具体检测方法如下：

1)将供试真菌25℃活化5-7天(黄瓜疫霉病菌采用白云豆培养基，其它真菌采用PDA培养基)，使其形成直径为7～8cm的菌落，用打孔器(直径5mm)制取菌饼备用。

2)制备菌株YL04的发酵液：将菌株YL04接种于36号液体培养基(酵母膏5

g、七水合硫酸镁0.05g、碳酸钙0.2g、氯化钠0.4g、淀粉10g、大豆粉10

g、蛋白胨5g、蒸馏水1000ml)中，26℃、180rpm培养3d，取发酵液10000g/min离心2min，上清液即为YL04的无菌代谢液。

3)抑菌作用测定：制取PDA平板，在平板中以中心为对称点放置两个牛津杯，牛津杯距离平板中心3cm，在每个牛津杯中加入步骤2)制备的上清液100μl(以加入无菌水的平板作为对照CK)，每个处理设3个重复，静置，24h后在平板中心接入直径为5mm的靶标菌菌饼，放置在25±2℃的培养箱中暗培养，根据不同供试菌的生长情况，培养不同天数后分别测量真菌菌落直径，计算生长抑制率。结果见表3。

表3YL04代谢液对供试病原真菌的抑制作用

试验结果表明，YL04对供试的15种病原真菌均具有抑菌活性。对苹果腐烂病菌的抑制率将近90％，对瓜果腐霉的抑制率达73.18％，对小麦立枯丝核菌、全蚀病菌、番茄灰霉和稻瘟菌的抑制率达60％左右，对棉花黄萎病菌、小麦赤霉以及棉花枯萎病菌的抑制率在40％以上，对番茄早疫病菌、水稻纹枯病菌、玉米大斑病菌和玉米小斑病菌抑制率达30％以上，对黄瓜疫霉、甜椒疫病菌抑制作用较差。

二、YL04代谢液对病原细菌的抑制效果

本实验选择了3个属中的5个种的植物病原细菌，采用双层平板培养法和牛津杯检测法检测YL04代谢液对病原细菌的抑菌活性和抑菌谱。

供试病原细菌如下：布克氏菌属(Ralstonia)茄青枯病菌(Ralstoniasolanaecearum)；假单胞菌属(Pseudomonas)黄瓜角斑病菌(Pseudomonassyringae)；黄单胞菌属(Xanthomonas)棉花角斑病菌(Xanthomonas mtvacearum)、辣椒疮痂病菌(Xanthomonas campestris)；厚壁菌门棒形杆菌属(Clavibacter)番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganense)。以上病原菌均可从发病植株上采用常规方法分离获得，或者从中国农业大学植病系种子病理实验室直接获取。

1)YL04发酵液的制备：将YL04接种于36号液体培养基(酵母膏5g、七水合硫酸镁0.05g、碳酸钙0.2g、氯化钠0.4g、淀粉10g、大豆粉10g、蛋白胨5g、蒸馏水1000ml)，在26℃、180rpm培养3d，取发酵液于10000g/min的速度下离心2min，上清液即为YL04的无菌代谢液。

2)下层培养基的制备：在直径为9cm的培养基中倒入10ml已灭菌的水琼脂培养基(1000ml的蒸馏水中加入10g琼脂粉)，即为下层培养基，4次重复。

3)上层带菌培养基的制备：将5ml无菌水加入到病原菌试管中，用振荡器充分振荡，制取成浓度为10⁸cfu/ml的菌悬液；将40μl初始菌悬液加入40ml已灭菌的水琼脂中，混匀，分别倒入4个已制备好的下层水琼脂培养基上，凝固后即形成了带菌的上层培养基。

3)抑菌作用测定：将牛津杯均匀摆放在水琼脂双层培养基(1000ml的蒸馏水中加入10g琼脂粉)平板上，每皿摆放2个点；每个牛津杯中加入步骤1)制备的上清液100μl，同时设置无菌水对照(CK)，用无菌水代替步骤1)制备的上清液，等上清液完全渗入培养基后再倒入步骤2)制备的带菌水琼脂，每个处理3个重复，28℃暗培养数天后分别测量抑菌圈的直径。结果见表4。

表4YL04代谢液的杀细菌谱

试验结果表明，YL04代谢液对供试的5种病原细菌均无抑制作用。

实施例4、菌株YL04及其代谢产物对作物生长的安全性测定

采用喷雾接种法，灌根接种法和浸种法三种不同方法检测菌株YL04对黄瓜、番茄及甜椒生长的影响，为YL04在生产中的进一步应用推广提供理论依据。以下试验每个处理均设置三次重复，结果取平均值。

一、喷雾接种法

(1)YL04菌悬液的制备：将在2号培养基(硫酸铵2g，磷酸氢二钾1g，可溶性淀粉10g，七水合硫酸镁1g，氯化钠1g，碳酸钙3g，琼脂粉10g，蒸馏水1000ml)平板上培养7d后的YL04用接种环刮下，并使其悬浮在无菌水中，在振荡器上充分振荡混匀，取一部分测其OD600值，使YL04菌悬液浓度达10^8-10cfu/ml。

(2)供试植物的准备：将甜椒种子置于28℃恒温培养箱里催芽，发芽率达到80％以上后，播种于温室育苗盘里，经常观察，适时浇水，以备接种使用。

(3)喷雾接种：苗子长到4片真叶，将步骤(1)制备的菌悬液均匀喷洒在植物叶片表面，注意雾滴尽量小，尽量喷到每片叶子上，喷雾量以叶片沾满液滴为止，以喷洒自来水为对照，以后每隔7d观察一次，记录植物的生长状况，并及时浇水，待供试作物二叶一心期，进行植株生长相关指标的测定。试验结果如表5。

表5YL04菌悬液喷雾处理对二叶一心期黄瓜和甜椒植株生长的影响

结果表明，YL04菌株的悬浮液喷雾处理甜椒和黄瓜幼苗后，植株生长良好，其平均根长、平均茎长、单株鲜重和干重均高于对照，表明YL04菌株对供试作物生长安全，并有一定的促进供试植株生长作用。

二、灌根接种法

(1)YL04菌悬液的制备：将在2号培养基(硫酸铵2g，磷酸氢二钾1g，可溶性淀粉10g，七水合硫酸镁1g，氯化钠1g，碳酸钙3g，琼脂粉10g，蒸馏水1000ml)平板上培养7d后的YL04用接种环刮下，并用无菌水浮载，在振荡器上充分振荡混匀，取一部分测其OD600值，使YL04菌悬液浓度达10^8-10cfu/ml。

(2)供试植物的准备：将黄瓜和甜椒种子置于28℃恒温培养箱里催芽，发芽率达到80％以上后，播种于温室育苗盘里，经常观察，适时浇水，以备接种使用。

(3)灌根接种：用进样器将步骤(1)制备的菌悬液定量加入到步骤(2)的育苗盘里，每穴10ml，并以加自来水作为对照。每隔7d观察一次，记录植物的生长状况，并及时浇水，待供试作物一叶一心期，进行植株生长相关指标的测定。试验结果如表6。

表6YL04菌悬液灌根处理对甜椒和黄瓜植株生长的影响

结果表明，YL04菌株的悬浮液灌根接种后，甜椒和黄瓜植株生长良好，其平均根长与对照相当，平均茎长，单株鲜重和干重均高于对照，表明YL04菌株对三种供试作物生长安全，并有一定的促进供试植株生长作用。

三、浸种处理

(1)YL04菌悬液的制备：将在2号培养基(硫酸铵2g，磷酸氢二钾1g，可溶性淀粉10g，七水合硫酸镁1g，氯化钠1g，碳酸钙3g，琼脂粉10g，蒸馏水1000ml)平板上培养7d后的YL04用接种环刮下，并用无菌水浮载，在振荡器上充分振荡混匀，取一部分测其OD600值，使YL04菌悬液浓度达10^8-10fu/ml。

(2)供试植物的准备：先用1％次氯酸钠进行种子表面消毒3分钟，用无菌水冲洗3遍后，用步骤(1)制备的菌悬液浸种，黄瓜浸种12小时，番茄和甜椒均浸种16小时，同时设用无菌水浸种为对照，浸种时间与菌悬液浸种时间相同。

(3)无菌河沙的准备：河沙用10目的筛子过筛，160℃干热灭菌8h，河沙中加水拌匀，含水量以手攥沙子不散开为标准，然后分装到瓷盘里，平整后以备播种用。

(4)播种步骤(2)处理后的种子，用塑料薄膜封口，以保证湿度达到要求，3d后检测发芽势，7d后检测发芽率，每天观察，适时补水，防止河沙干燥影响种子发芽。结果如表7所示。

表7用YL04菌悬液浸种对甜椒、番茄和黄瓜发芽情况的影响

结果表明：YL04菌株的悬浮液处理种子后，甜椒种子的发芽率与清水对照相比增加了23.30％，番茄和黄瓜种子的发芽率与清水对照相比没有显著差异。表明YL04菌株对三种供试作物种子发芽安全，对幼苗生长均没有致病性。

实施例5、菌株YL04对蔬菜苗期猝倒病、小麦纹枯病和小麦全蚀病的防治效果

参照《农业部农药田间试验准则，GB/T 17980-2004》的试验要求，通过温室盆栽试验，进一步测定YL04对蔬菜苗期猝倒病、小麦纹枯病和小麦全蚀病的防病效果。为YL04菌株在田间的大面积推广应用提供参考。

一、菌株YL04对小麦全蚀病和小麦纹枯病的防治效果

选择新麦18和周麦18两个小麦品种，采用浸种法和蘸根法检测YL04对小麦纹枯病和小麦全蚀病的防治效果。两种方法均为每处理20粒，5次重复。

1、将用玉米砂扩大繁殖的小麦纹枯病菌(R..cerealis)(该病原菌可从发病植株茎基部分离获得，或者从中国农业大学植病系种子病理实验室直接获取)接种于灭菌土中(接种比例为0.6％)，得到小麦纹枯病菌土；将用玉米砂扩大繁殖的小麦全蚀病菌(G..graminis)(该病原菌可从发病植株茎基部分离获得，或者从中国农业大学植病系种子病理实验室直接获取)接种于灭菌土中(接种比例0.6％)，得到小麦全蚀病菌土。

2、采用两种方法检测防治效果

1)浸种法

①将小麦种子在浓度为10⁸cfu/ml YL04孢子悬浮液中浸泡24h后分别播种于带有小麦纹枯病菌菌土和小麦全蚀病菌的菌土中；将小麦种子在无菌水中浸泡24h后分别播种于小麦纹枯病菌菌土和小麦全蚀病菌菌土，作为对照(CK)。

②温室条件下培养小麦，15d时调查小麦纹枯病和全蚀病的发病率和病情指数。

2)蘸根法

①小麦种子出苗后10d，选取大小均匀的小麦苗，洗净根部的泥土，用吸水纸吸干苗上附着的水分。

②将苗浸入10⁸cfu/ml YL04的孢子悬浮液中10min，然后分别移栽入含有小麦纹枯病菌菌土和全蚀病菌的菌土中；将苗浸入无菌水中10min，然后分别移栽入小麦纹枯病菌菌土和全蚀病菌菌土中，作为对照(CK)。

③温室条件下培养小麦，15d时调查小麦纹枯病和全蚀病的发病率和病情指数。

小麦纹枯病病情严重程度的分级标准(Lipps等，1982)如下：

0级：无症状；1级：叶鞘稍有变褐；2级：叶鞘外侧病斑直径＜0.5cm；3级：叶鞘外侧有1到多个病斑，病斑直径＞0.5cm；4级：叶鞘内外都有病斑；5级：叶鞘、茎秆都有病斑或病株枯死。

小麦全蚀病菌病情严重程度的分级标准(陈怀谷等，2000)如下：

0级：无症状；1级：受害根面积占总面积1/4以下；2级：受害根面积占总面积1/4-1/2；3级：受害根面积占总面积的1/2-3/4；4级：受害根面积占总面积的3/4以上；5级：苗期出现矮化、死苗现象。

结果见表8。

表8YL04对小麦纹枯病和小麦全蚀病的防治效果

试验结果表明，YL04蘸根或浸种处理对小麦纹枯病和小麦全蚀病均具有较好的防效，其中浸种处理的防效为62.18-71.84％，蘸根处理防效达72.03～84.57％，蘸根处理的效果略优于浸种处理。表明YL04是一株理想的防治土传病菌的生防菌株。

二、YL04对瓜菜猝倒病的防治

选择津优4号黄瓜品种和合作908番茄品种，采用浸种法和蘸根法检测YL04对瓜菜猝倒病的防治效果。两种方法均为每处理20粒，5次重复。

1、将瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)接种于灭菌土中(接种比例为0.6％)，得到瓜菜猝倒病菌土。

2、采用两种方法检测防治效果

1)浸种法

①将种子在10⁸cfu/ml YL04的孢子悬浮液中浸泡16h后播种于瓜菜猝倒病菌土；将黄瓜种子在无菌水中浸泡16h后播种于瓜菜猝倒病菌土，作为对照(CK)。

②温室条件下培养，10d记录出苗数，20d记录各处理的发病率。

2)蘸根法

①种子出苗后10d，选取大小均匀的幼苗，洗净根部的泥土，用吸水纸吸干苗上附着的水分。

②将苗浸入10⁸cfu/ml YL04的孢子悬浮液中10min，然后移栽入瓜菜猝倒病菌土中；将苗浸入无菌水中10min，然后移栽入瓜菜猝倒病菌土中，作为对照(CK)。

③温室条件下培养，25d时调查发病率。

结果见表9。

表9YL04对黄瓜猝倒病的防治效果

结果表明，YL04处理种子或幼苗根部后，可明显提高黄瓜和番茄的出苗率，幼苗期病苗率显著降低，YL04处理对猝倒病的防效可达70～90％，增产幅度达9.68～37.24％，具有显著的防病保苗效果。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一株链霉菌菌株及其应用

<130>CGGNARY92169

<160>1

<210>1

<211>1519

<212>DNA

<213>链霉菌(Streptomyces sp.)

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60

gatgaaccgc tttcgggcgg ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg 120

ccctgcactc tgggacaagc cctggaaacg gggtctaata ccggatatga ccgtctgccg 180

catggtggat ggtgtaaagc tccggcggtg caggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt 240

ggtgaggtag tggctcacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca 300

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca 360

atgggcgaaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac 420

ctctttcagc agggaagaag cgaaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540

agagctcgta ggcggcttgt cacgtcggtt gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg 600

cagtcgatac gggcaggcta gagttcggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg 660

aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccgatactga 720

cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780

aaacggtggg cactaggtgt gggcaacatt ccacgttgtc cgtgccgcag ctaacgcatt 840

aagtgccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc 900

cgcacaagcg gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct 960

tgacatacac cggaaacgtc tggagacagg cgcccccttg tggtcggtgt acaggtggtg 1020

catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080

cttgtcccgt gttgccagca ggcccttgtg gtgctgggga ctcacgggag accgccgggg 1140

tcaactcgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg ccccttatgt cttgggctgc 1200

acacgtgcta caatggccgg tacaatgagc tgcgataccg tgaggtggag cgaatctcaa 1260

aaagccggtc tcagttcgga ttggggtctg caactcgacc ccatgaagtc ggagtcgcta 1320

gtaatcgcag atcagcattg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacgtcacg aaagtcggta acacccgaag ccggtggccc aaccccttgt gggagggagc 1440

tgtcgaaggt gggactggcg attgggacga agtcgtaaca aggtagccgt accggaaggt 1500

gcggctggat cacctcctt 1519

Claims

1.链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884。

2.链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884在抑制真菌中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为在抗植物真菌病害中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植物真菌病害为蔬菜苗期猝倒病、小麦纹枯病或小麦全蚀病。

5.链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884的培养方法，是用如下培养基培养链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCC No.2884：硫酸铵2g，磷酸氢二钾1g，可溶性淀粉10g，七水合硫酸镁1g，氯化钠1g，碳酸钙3g，琼脂粉10

g，用水定容至1000ml。

6.一种真菌抑制剂，其活性成分为链霉菌(Streptomyces sp.)YL04CGMCCNo.2884。

7.如权利要求6所述的真菌抑制剂，其特征在于：所述真菌抑制剂为抗植物真菌病害的生防制剂。

8.如权利要求6或7所述的真菌抑制剂，其特征在于：所述真菌为瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、小麦全蚀病菌(Geaumanomyces graminis)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、小麦立枯丝核菌(Rhizoctonia cerealisbv)、稻瘟菌(Pyricularia grisea)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)或番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)。