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CN101467036B - 全血样品的差异溶血 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于全血的差异溶血的方法。其公开了在已知或怀疑含有红细胞并怀疑或已知含有真核细胞的液体样品中检测分析物的方法，该方法包括以下步骤：在适于裂解红细胞细胞膜且同时不引起样品成分沉淀的条件下用膜溶解剂处理所述液体样品，对已处理样品进行色谱分离，并检测分析物。红细胞差异溶血对在可包含红细胞以及有核细胞这二者的液体样品中检测分析物的方法有利。红细胞的差异溶解可易于与在线检测方法如LC-MS组合，并对许多分析物的检测有利，例如对叶酸检测或如他克莫司或西罗莫司的免疫抑制药物的检测有利。

Description

全血样品的差异溶血
本发明涉及一种用于在已知或怀疑含有红细胞并怀疑或已知含有真核细胞的液体样品中检测分析物的方法，该方法包括以下步骤：在适于裂解红细胞细胞膜且同时不引起样品成分沉淀的条件下用膜溶解剂处理所述液体样品，对已处理样品进行色谱分离，并检测分析物。红细胞差异溶血对在可包含红细胞以及有核细胞这二者的液体样品中检测分析物的方法有利。红细胞的差异溶解可易于与在线检测方法如LC-MS组合，并对许多分析物的检测有利，例如对叶酸检测或如他克莫司或西罗莫司的免疫抑制药物的检测有利。
发明背景
样品中存在的成分越多，分析其中包含的目标分析物就越困难。红细胞含有显著量的蛋白和小分子量成分，它们潜在干扰生物流体如全血中待检测的分析物。这就是为什么在临床常规中优选分别使用血浆(经常简称为血浆，即抗凝结的全血样品；没有细胞和红细胞)或血清(经常简称为血清，即凝结的全血；没有细胞、红细胞和凝血系统的大部分蛋白，尤其是没有血纤蛋白/血纤蛋白原)的主要原因之一。全血样品例如与血清或血浆相比还更难以操作。全血趋向于不稳定，红细胞的缓慢破裂损害相当多的目标分析物的可靠检测。
另外，恰好在这一点上，在许多现有的在线检测方法中使用全血样品似乎不可行。例如，在需要基于液相色谱(LC)的分离步骤的临床诊断常规程序中，不可能使用全血样品。常规液相色谱分离通常基于基本上由保护柱材料的过滤单元或滤头(a filter unity or frit)和分离目标分析物所需的柱材料组成的柱子。如果将全血施加于这样的柱子，则该柱将相当快地乃至立刻被阻塞，这取决于柱子大小和系统。该问题使得几乎不可能在与例如在临床常规诊断中优选的LC-法组合的在线检测方法中使用全血。目前，似乎必须通过例如离心、过滤、沉淀或分析物提取适宜地分离/处理血样，然后可以正确地和可靠地分析这些已处理样品。
如上所述，可由全血获得血清或血浆，并用于检测分析物。在理论上，细胞和红细胞还可以通过过滤或离心由全血中除去。然而，这些方法既不适用于常规诊断环境，又使它们不能正确检测至少部分地存在于红细胞中的那些分析物。
在另一种样品处理方式中，首先通过选择性沉淀或提取方法将目标分析物与大量潜在干扰物质分离。提取可以在液相中或在固相上进行。这将通过阐述用于检测免疫抑制药物的某些方法加以例证。
众所周知的免疫抑制药物为例如霉酚酸酯(MMF)、雷帕霉素(RAPA，也称为西罗莫司)和他克莫司(FK-506)。免疫抑制药物的治疗药物监测对移植患者以及罹患AIDS的患者尤其重要(参见例如：DrugTher.Perspect.17(22)(2001)8-12)。进行实体器官移植的大部分患者需要终身的免疫抑制治疗，以防止同种异体移植排斥。但是，因为许多免疫抑制剂的治疗范围狭窄，并伴有多种毒性和药物相互作用潜力，所以治疗药物监测(TDM)连同患者的临床评价一起使用可能特别重要。
霉酚酸酯是一种前药。在口服给药后，霉酚酸酯(MMF)在肠和血液中进行快速水解，形成其活性代谢物霉酚酸(MPA)。MMF可广泛应用，在美国和英国被批准用于与皮质类固醇和环孢菌素联合预防肾脏、肝脏或心脏同种异体移植排斥。该药物在降低肾脏同种异体移植的急性排斥发病率方面已证实优于咪唑硫嘌呤。治疗剂谷浓度在1-3.5mg/L的范围内。MMF可由血浆和全血检测。
他克莫司是大环内酯抗生素，首先由美国食品和药品监督管理局(FDA)于1994年批准用于预防肝脏同种异体移植排斥。其在体外的效力高达环孢菌素的100倍，在临床上，其与组织排斥发病率的大幅下降相关。他克莫司已在进行多个移植程序的患者中作为原发性免疫抑制治疗和作为拯救治疗用于肝脏或肾脏移植后难医治的急性同种异体移植排斥患者方面表现出功效。治疗剂谷浓度在5-20μg/L的范围内。
因为循环中存在的至少部分他克莫司被分隔在红细胞中，所以在该药物的临床常规检测中使用全血样品。他克莫司例如可以通过高效液相层析(HPLC)、HPLC质谱(MS)、放射性受体测定(RRA)或免疫测定(IA)检测。后两种方法检测他克莫司及其多种代谢物中的某一些的灵敏度不同。这可能对所用方法产生干扰(Murthy，J.N.等，Clin.Biochem.31(1998)613-617)。至少在多种他克莫司代谢物的检测中，HPLC-MS-法可被认为是金标准。然而，以上提及的所有方法均需要由全血提取他克莫司。通常，在临床常规中使用乙腈由全血提取他克莫司，似乎不存在会允许由全血样品在线检测他克莫司的方法。
西罗莫司和他克莫司一样，是一种大环内脂抗生素。其首先在1999年被US FDA批准用于预防肾脏移植后的同种异体移植排斥，实际上其在联合环孢菌素和皮质类固醇急性使用时在该方面已显示出有前景的结果。在体外，西罗莫司的效力高达环孢菌素的100倍，在临床上，其可以与环孢菌素表现出协同性，这可能使环孢菌素剂量下降。治疗剂谷浓度在5-15μg/L的范围内。
对于他克莫司，在红细胞中存在显著量的西罗莫司。因此，不论使用哪种检测方法，都需要提取全血样品。在临床常规中，对怀疑含有西罗莫司的样品进行HPLC，西罗莫司通过紫外线(UV)或通过MS/MS检测。最近，还已描述了一种微粒酶免疫测定(Jones，K.等，Clinical Therapeutics 22，增刊B(2000)B49-B61)。
叶酸是氧化状态不同的一类相关分子的共同名称。叶酸是水溶性维生素B族的组成部分，作为辅酶对高半胱氨酸代谢和在DNA复制所需的一碳基团的转移中很重要。叶酸不足状态与神经管缺陷的风险增加相关，与心血管疾病、贫血、某些癌症和阿尔茨海默病有关联。血清或血浆叶酸浓度反映出近期的膳食摄取，而红细胞叶酸浓度更加表现出身体储备(Gunter，E.W.等，Clin.Chem.42(1996)1689-1694；Fazili，Z.等，Clin.Chem.51(2005)2318-2325；Pfeiffer，C.M.等，Clin.Chem.50(2004)423-432)。红细胞总叶酸(红细胞叶酸＝RBC-叶酸)是整个机体叶酸状态的最佳检测。近期的研究已表明，5-甲基四氢叶酸是循环红细胞中的优势叶酸类维生素。为了诊断叶酸缺乏，推荐不仅由血清或血浆进行测定，而且由红细胞进行测定，因为95％以上的叶酸定位于后者当中。红细胞中的浓度更真实地反映了实际叶酸状态。
众多方法可用于检测不同基质中的叶酸。主要的分析方法是微生物测定、放射免疫测定、化学发光、色谱法和质谱法。大部分方法基于与叶酸结合蛋白竞争性结合叶酸。
为了检测RBC-叶酸，使用溶血试剂明显是强制性的。例如，用于测定RBC叶酸的ElecsysTM测定(Elecsys是Roche Group成员的商标)使用抗坏血酸作为裂解试剂。Elecsys RBC-叶酸溶血试剂与Elecsys叶酸测定一起用于红细胞中叶酸(RBC-叶酸)的定量测定。用抗坏血酸溶液(0.2％)稀释用抗凝剂(肝素或EDTA)处理的全血，并于20-25℃温育约90分钟。红细胞发生裂解，释放胞内叶酸。然后，溶血产物用作“预稀释”样品(和血清类似)，用于随后在Elecsys叶酸测定中进行检测。在全血中测定的血细胞比容值和通过预处理样品产生的稀释作用在红细胞叶酸浓度计算中被补偿(Greiling，H.，Gressner，A.M.，Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie，第3版，Stuttgart-New York，Schattauer(1995)460-62页；Gunter，E.W.等，Clin.Chem.42(1996)1689-1694)。
通过用抗坏血酸处理产生的溶血产物不能用于常规色谱方法。为了在色谱方法或质谱测定中使用这样的溶血产物，必须在分析前除去细胞碎片和沉淀蛋白。
通常通过离心、离线过滤或固相提取由样品中除去碎片和沉淀蛋白。
固相提取(SPE)是一种广泛用于例如预浓缩和提纯分析样品、纯化多种化学物质和由水溶液中除去毒性物质或取出有价值物质的色谱技术。SPE通常使用含有适当树脂的柱或筒进行。已开发出使用吸附剂的SPE方法，所述吸附剂可通过疏水、离子交换、螯合、吸附和其它机制与分析物相互作用，以结合和除去流体中的分析物。因为用于不同类型分析物的不同SPE应用可能需要不同的吸附剂，所以伴随需要具有特定特性的吸附剂，其对目标分析物或目标分析物类型具有专一选择性。SPE材料和SPE柱的代表性实例分别可见于US6,322,695和US 6,723,236。
血红蛋白自身的浓度以及糖化血红蛋白(HbAlc)对非糖化血红蛋白的比率是血液学和糖尿病的重要分析物。在该评价中，包含在全血样品中的红细胞被裂解，然后检测血红蛋白。US 6,050,956描述了预填充标准化量的血液溶解液的溶血管。然而，全血首先被收集到常规采血管中。此后，将血液以1加100稀释入采血管中。由于血红蛋白的浓度非常高，所以全血的1加100稀释度是可以接受的，不需要差异溶血，即不需要溶血来避免如蛋白沉淀和/或DNA释放的不利副作用。然后，通常通过免疫测定检测HbAlc。
Coulter International Inc.的多个同族专利，如US 5,874,310、US5,882,934、EP 1 000 356、EP 0 874 988、EP 0 305 491或EP 0 185 048，涉及血液学领域，尤其涉及血细胞分析。在EP 0 794 435中，公开了在包含于血样中的真核细胞的分析中使用具有8-20个C-原子的烷基链的N-单烷基化吡啶鎓盐。US 5,316,951提到，可在包含于全血样品中的真核细胞的分析中使用具有10-20个C-原子的烷基链的N-单烷基化吡啶鎓盐。
Sarapuk，J.等，Z.Naturforschung 54c(1999)952-955提到，氯化3-氨甲酰基-1-癸基氧基甲基吡啶鎓可用于裂解红细胞。
EP 1 000 356例如描述了一种用于稀释血样的改善的稀释剂，其适于单个血样中的血细胞的计数和筛分、血红蛋白参数的测定和白细胞亚群的分化。分析使用适宜的电子设备进行。对于该分析，血液通常由医师收集，然后必须运输到临床实验室，最好是在分析前不久才加入裂解试剂。
本发明的发明人可得到的参考文献既没有公开也没有提示：溶血的全血样品可通过液相色谱法用于在线分离，例如用于检测通常存在于红细胞中的分析物。
与相当多的其它目标分析物类似，似乎没有可用的方法会允许在基于使用在线色谱方法的任何检测方法中检测全血样品中的叶酸、西罗莫司或他克莫司。
由上述现有技术状态显而易见的是，似乎没有由全血样品在线色谱分离和检测分析物的可用方法。即便在现今，所有的常规方法也似乎还需要由该样品的余下部分提取或分级分离目标分析物或含有目标分析物的某些化合物类型。
然而，如果全血可直接用作样品则应当是高度合乎需要的。这应当尤其有利于利用液相色谱(LC)分离步骤的在线检测方法。还显而易见的是，由全血直接在线检测免疫抑制药物对临床常规实验室应当是一个重大的进步。
令人惊奇的是，现在已发现并可以确认，有可能借助于适宜的膜溶解剂处理全血样品，例如使其成为通过LC进行直接分离和通过MS进行分析物检测的适宜样品。还有可能检测此已处理样品中的分析物。这对于在红细胞中也以相关程度存在的分析物尤其有价值，所述分析物例如为免疫抑制药物西罗莫司和他克莫司，或者例如为叶酸。
发明概述
在第一个实施方案中，本发明涉及一种在已知或怀疑含有红细胞并怀疑或已知含有真核细胞的液体样品中检测分析物的方法，该方法包括以下步骤：在适于裂解红细胞细胞膜且同时不引起样品成分沉淀的条件下用膜溶解剂处理所述液体样品，对在第一个步骤中获得的已处理样品进行色谱分离，并检测分析物。
在又一个优选实施方案中，本发明涉及膜溶解剂在用于液相色谱的全血样品处理中的用途和通过用本发明的膜溶解剂差异溶血获得的已处理血样在基于液相色谱的分析中的用途。
发明详述
本发明的方法在体外进行，即不在人或动物身体上进行。
在一个优选实施方案中，本发明涉及一种在已知或怀疑含有红细胞并怀疑或已知含有真核细胞的液体样品中检测分析物的方法，该方法包括以下步骤：a)在适于裂解红细胞细胞膜且同时不引起样品成分沉淀的条件下用膜溶解剂处理所述液体样品，b)对在步骤(a)中获得的已处理样品进行色谱分离，和c)检测分析物。
在本发明意义上，“红细胞”为没有细胞核的红细胞。这类没有细胞核的红细胞例如为存在于哺乳动物循环中的成熟红细胞。本发明不涉及有核红细胞，例如已知得自鸟类物种的有核红细胞。后者应满足有核细胞或真核细胞的标准。
用于本发明用途的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园动物、竞赛动物或宠物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选所述哺乳动物为人。
在本发明意义上，“真核细胞”或“有核细胞”为来源于真核生物的细胞，并仍具有其细胞核。真核细胞的实例为来源于有核组织的细胞、有核组织培养细胞和有核血细胞。在一个优选实施方案中，真核细胞为有核血细胞，如血小板、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或白细胞。低等生物如细菌的细胞，尽管含有遗传物质，但不是真核细胞。
本文使用的冠词“一种”或者没有翻译出不定冠词的名词是指一个或一个以上(即至少一个)的冠词语法宾语。作为实例，没有译出不定冠词的“红细胞”意指一个红细胞或一个以上的红细胞。
已通过使用全血样品确认了如在本发明中证实的差异溶血的有利特性，即在适宜裂解红细胞细胞膜且同时不引起样品成分沉淀的条件下用膜溶解剂处理液体样品的有利特性。然而，现在还确认该方法可以相同方式使用和处理其它液体样品。因此，本发明的液体样品可以为在临床诊断常规中研究的任何样品，如尿、脑脊液、血清、血浆或血液。
优选用适宜的膜溶解剂进行差异溶血的液体样品含有红细胞，并可能含有或含有有核细胞。进一步优选的液体样品含有红细胞和有核细胞这二者。优选本发明的液体样品将为全血。要认识到的是，全血样品含有无核红细胞以及有核红细胞这二者。
优选直接处理全血样品，即在采样后按照本发明的方法直接处理。优选血样在根据本发明进行差异溶血前根本不处理。还优选用适宜的抗凝剂收集/处理全血，以产生抗凝结的全血样品，之后其差异溶血。在临床诊断常规中常用的众所周知的抗凝剂为肝素、柠檬酸盐和EDTA。优选本发明的样品是抗凝结的全血样品，尤其是柠檬酸盐化的全血样品或EDTA抗凝的全血样品。
在本发明的方法中，以满足以下两种要求的方式用膜溶解剂处理液体样品：a)如果存在红细胞，则红细胞膜破裂和b)同时不引起样品成分沉淀。该处理被称为差异溶血。假如该方法实施于全血样品，则得到含有裂解的红细胞但同时不沉淀的已处理样品。
优选本发明的膜溶解剂将使样品中存在的红细胞的至少95％裂解。进一步优选的差异溶血试剂将使样品中存在的红细胞的至少97％、98％、99％、99.5％裂解。
不想受限于以下理论，人们可以假定，在本发明框架内发现和建立的有利平衡(在该平衡时红细胞膜破裂，但同时不引起样品成分沉淀)是克服本领域已知的至少某些问题所必需的。通过在适宜的条件下应用合适的膜溶解剂，细胞膜失去完整性，该完整性是例如屏蔽红细胞内容物和血浆所必需的。红细胞内容物(例如血红蛋白，还有某些目标分析物)被释放到周围液体中。同时不引起样品成分沉淀。
本领域技术人员会意识到，可干扰后者分析的样品成分特别地可分别为DNA和变性蛋白。只要真核细胞(例如淋巴细胞或单核细胞)的核不被破坏，则这些核不释放DNA。只要没有蛋白沉淀，包含在进行差异溶血的样品中的蛋白将不干扰(至少未达到显著程度)色谱步骤或分析。
例如通过适宜的活体染色可易于评价红细胞的完整性。在本发明的一个优选实施方案中，使用锥虫蓝，以便评价红细胞膜的完整性。完整的红细胞不累积锥虫蓝，而膜破裂的红细胞确实被锥虫蓝染色。在用锥虫蓝染色样品后，红细胞的膜完整性易于在显微镜下评价。破裂红细胞的百分率如下计算：计数处理之前和之后的完整红细胞，然后用前一数目除后一数目，之后将该值乘以100。溶解的红细胞被称为裂解红细胞。
适宜的处理将足以裂解红细胞，但同时不引起样品成分沉淀。预期适于本发明方法的溶血处理还将影响真核细胞的外膜。然而，能够而且必须注意的是，包含在细胞核中的DNA不能释放到样品中。所用的溶血试剂和溶血条件优选不影响核膜，并由此使核在宏观上完整，或者至少DNA不会由环绕其周围的稳定DNA的核蛋白中释放出来。如果DNA会被显著程度地释放，则该DNA可能乃至会干扰样品的进一步操作。释放的DNA例如趋向于使液体非常粘稠。那么，就不再可能移取或转移这些样品或使其通过某些滤器或柱子。
此外，能够而且必须注意的是，不要发生蛋白沉淀。本领域技术人员知晓，在生物样品(例如全血样品)中存在许许多多不同的蛋白。所有这些蛋白都具有影响它们沉淀或聚集的趋势的不同特性。
现已发现，可以描述和定义是否可以在合适的条件下用膜溶解剂进行样品处理，以便一方面裂解红细胞细胞膜，而且同时不引起样品成分沉淀。未裂解的红细胞以及沉淀的样品成分这二者对这些样品的特性都具有负面影响。
差异溶血的条件是否适合可容易地并优选通过使用以下标准化步骤确定。1:10稀释血细胞比容为40的全血样品，并与候选溶血试剂1:1混合。目测观察产生差异溶血的试剂的效率。在红细胞裂解时，混合物变得澄清。如果发生样品成分沉淀，则样品变得混浊或粘稠或二者兼有。
如上所述，可容易地目测评价用于本发明的差异溶血方法的条件。如果全血样品与适宜的候选差异溶血试剂温育，则溶解红细胞所需的最小浓度可被认为是使混浊血样透明或澄清的浓度。最高的可能浓度是仍产生透明且不粘稠的样品的浓度。
确定候选溶血试剂的适宜的最小终浓度已变得相当容易，因为该浓度导致所处理的全血样品的透明度改变。该透明度变化与这些已处理样品对通过HPLC直接分析的适用性良好关联。然而，为了明确定义，优选溶血试剂的最小浓度通过如下所述的HPLC法证实。
溶血试剂的最大浓度可能是仍未引起DNA释放和/或蛋白沉淀的浓度。由此，样品会变得粘稠或混浊或二者兼有，不再适于直接HPLC应用。而粘度和混浊度可目测跟踪，优选通过如下所述的HPLC法检验溶血试剂的最大浓度。
仍含有太多未裂解的红细胞的全血样品以及含有沉淀的样品成分的已处理全血样品将不适于任何色谱步骤。这就是为什么优选通过以标准化方式将用候选差异溶血试剂处理的全血样品施加于HPLC柱来确定适于产生差异溶血的条件的原因。
通过将50×10μl已处理全血样品施加至HPLC柱，评价不完全的溶血和/或样品成分沉淀。为了评价候选溶血试剂是否适于差异溶血，将所述溶血试剂与全血样品混合。优选使用已用生理盐水1:10预稀释的EDTA-血液。其与候选溶血试剂以1:1比率混合，混合物于20℃温育30分钟。该混合物中全血的最终稀释度因此为1:20。将50等份的10μL该混合物，即处理过的全血样品，施加至为HPLC系统组成部分的滤器，该滤器直径为2mm，孔径为0.5μm。如果滤头(frit)为HPLC柱的组成部分，则必须对固定相进行选择，以便不引起任何干扰或阻塞。监测反压。如果第50次注射的反压和第1次注射的反压彼此相比，用于差异溶血的候选试剂会引起20bar以上的反压增加，则该候选试剂应被认为是不合适的。这样，用于差异溶血的适宜试剂的最小以及最大终浓度均易于鉴定。最小浓度是如在上述环境中评价的导致差异溶血的候选溶血试剂的最低浓度。最大浓度是如在上述环境中评价的导致差异溶血但不引起样品成分沉淀的候选溶血试剂的最高可能浓度。
优选用于以上候选差异溶血试剂评价的滤器为HPLC滤头。还优选该滤头为20mm长的HPLC柱的组成部分，该柱装填孔径为100
Figure G2007800212732D0011172653QIETU
的3.5μm Symmetry
Figure G2007800212732D0011172711QIETU
 C18粒子作为床料，柱内径为2mm。
技术人员容易认识到，用于该评价的全血样品得自健康个体，即没有已知疾病并具有正常范围的生物化学值的个体。
在本发明中业已发现并确认，可确定对相当多的试剂适宜的条件，以便满足差异溶血的两种要求。
本发明的膜溶解剂优选基于水作为溶剂，其含有产生如上所述的差异溶血的化学物质或试剂，还优选其可含有缓冲剂和/或防腐剂。用于差异溶血的溶解剂优选基于具有膜溶解活性的化学物质或试剂，其分子量低于1000道尔顿。
膜溶解剂优选基于一种或多种以下化学物质的膜裂解作用：KBr；KJ；和KSCN，或基于由一种或多种以下的阳离子和阴离子组成的盐：
阳离子优选选自
其中m为0或1，n为4或6。
阴离子优选选自氯离子、四氟硼酸根、辛基硫酸根、碘离子和硫氰酸根。还有可能使用以上提及的化学物质的混合物。技术人员会认识到，就是这些化学物质促进差异溶血，而溶血试剂的其它成分可起不同作用，并可以例如用作缓冲剂或防腐剂。
优选包含在差异溶血试剂中的化学物质为一种盐，其中阳离子优选选自
Figure G2007800212732D00122
其中m为0或1，n为4或6，其中阴离子优选选自氯离子、四氟硼酸根、辛基硫酸根、碘离子和硫氰酸根。
包含在膜溶解剂中的适宜的膜裂解化学物质优选选自：四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓、四氟硼酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、辛基硫酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓、氯化1-己基吡啶鎓、氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓、氯化N-辛基吡啶鎓、氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓、KBr、KJ和KSCN，以及其组合。
优选包含在膜溶解剂中的膜裂解化学物质选自四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓、四氟硼酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、辛基硫酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓、氯化1-己基吡啶鎓、氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓、氯化N-辛基吡啶鎓和氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓。还优选使用一种这些试剂的混合物和KSCN的混合物。
对技术人员显而易见的是，一旦已在以上定义的基于1:20稀释度的全血样品的候选溶血试剂溶液的方法中鉴定出候选差异溶血试剂的适宜浓度，则可根据需要使用全血样品与调整后的溶血试剂的另一个比率。
如果预期目标分析物在所研究血样中是高度浓缩的，则溶血试剂的终浓度可保持与以上环境中鉴定的终浓度相同，并可以使用低比率的全血对溶血试剂，例如1:30、1:40或1:50。优选地，在本发明的膜溶解剂中，以如上确定的足以达到差异溶血的至少最小浓度使用差异溶血试剂。
如果目标分析物以相当低的浓度存在，则可不必1:20稀释全血样品，而是以低于1:20的稀释度稀释全血样品。切实可行的方法为相应地调整溶血试剂的浓度，使得在溶血试剂和全血样品的混合物中溶血试剂对全血的最终相对浓度保持在对如在上述评价中确定的溶血试剂的所需最小和最大浓度分别鉴定的比率范围中。
作为实例：业已发现，氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN如果在本发明的膜溶解剂中分别以1％和0.4％的终浓度使用，则适于实现所需结果，即以最终的1:20稀释度差异溶血全血样品。如果例如该溶血试剂的浓度被分别调整到2％(针对氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓)和0.8％(针对KSCN)，则分析物在已处理血样中的稀释度可以降低。含有此调整浓度的溶血试剂的膜溶解剂如果以后与1:5稀释的全血样品以1:1混合，也导致全血样品差异溶血。因为全血对溶血试剂的比率保持恒定，所以该处理过的血样仅以1:10稀释。如果1ml分别含有10％氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓和4％ KSCN的膜溶解剂与1ml用PBS以1:1稀释的全血混合，则也观察到差异溶血。或者，可将1ml全血加入到2ml分别含有10％氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓和4％KSCN的膜溶解剂中。
对于许多常规应用，预期全血样品对膜溶解剂的理想比率在10:1至1:50之间。在本发明方法中，优选全血样品以5:1至1:20的比率与溶血试剂混合。更优选该比率介于2:1至1:10之间，还优选1:1至1:5。用于临床常规的已调整溶血试剂的最终浓度，即最高可能浓度，取决于溶解性还有该试剂的价格。
优选地，适宜的差异溶血试剂的特征还在于，破裂红细胞膜所需的化学物质的(最小)浓度以及所述化学物质容许的(最大)浓度(于该浓度同时不引起样品成分沉淀)至少为2倍间隔。引起差异溶血的试剂的最小和最大浓度之间的窗口越宽，该试剂就越容易用于临床诊断常规。
进一步优选在差异溶血试剂中含有的膜裂解化学物质以某一浓度使用，使得在所述试剂与样品混合后，该膜裂解化学物质的终浓度分别对应于平均值加最小浓度的30％和平均值减最大浓度的30％。进一步优选对在差异溶血试剂中含有的膜裂解化学物质的浓度进行调整，使得在其与样品混合后，其分别在最小和最大浓度的平均值的正或负25％、20％或15％之内。
还优选在差异溶血试剂中包含的膜裂解化学物质以某一浓度使用，使得在其与样品混合后，其导致该溶血化学物质的终浓度对应于1-4倍最小浓度之间的浓度，还优选在1.5倍至3倍如上所述测定的最小浓度之间。
优选在本发明的膜溶解剂中的差异溶血试剂以不超过75％重量/体积的浓度使用，还优选以不超过50％重量/体积的浓度使用。
优选通过本发明的膜溶解试剂处理液体样品的方法后接在线液相色谱(LC)步骤。
在进一步优选的实施方案中，本发明涉及在液体样品中检测分析物的方法，该方法包括以下步骤：获得所述液体样品，对所述液体样品实施通过膜溶解剂进行样品处理的方法，其中溶解剂适于破裂红细胞膜，且不破坏真核细胞核，对所述已处理样品进行液相色谱，并通过适宜方法分析所研究的分析物。优选还对已处理样品直接(在线)实施分析方法。
液相色谱(LC)是一种极为重要的分析技术，用于分离、鉴定和定量目标分析物，即便目标分析物存在于不同样品成分的复杂混合物中。在LC当中，混合物中的化学组分借助液体流动相的流动通过固定相。利用分析物与流动相和固定相这二者的相互作用的差异实现在液相色谱中的分离。技术人员会认识到，必须选择对所研究分析物均适合的固定相和流动相。另外，用户将确定在样品通过固定相柱向检测器移动的同时适于保持分析物条带清晰度的色谱条件。
高效液相色谱，也称为高压液相色谱，缩写为HPLC，是一种特殊形式的液相色谱，现今经常用于生物化学和分析化学。分析物在高压下于液体(流动相)中被强行通过柱子的固定相，这减少了分离组分保留在固定相上的时间，由此减少了它们必须在柱子内扩散的时间。这在所获的色谱图中产生窄峰，由此产生与LC相比更好的分辨率和灵敏度。
选择流动相，以确保样品溶质的溶解性。对于固定相，优选使用微粒二氧化硅(无修饰的或化学修饰的)，因为其高表面积增强了溶液相-固定相相互作用的差异。使用相对于溶质流动相相互作用与溶质强相互作用的固定相产生非常长的保留时间，这是一种在分析上没有用的情况。因此，必须选择固定相，以便提供相对于在流动相中的溶质相互作用弱至中等的溶质相互作用。因此，溶质的性质决定选定的LC类型。在流动相中应发生较强的相互作用，以确保样品溶解性和预备洗脱，而固定相应对溶质之间更细微的差别有反应。例如，通常使用极性流动相连同分辨溶质分散特征的细微差别的非极性固定相更好地分析极性中性化合物。HPLC的强有力方面之一在于可改变流动相，以改变保留机制。可向流动相加入修饰物，以控制保留。例如，pH是水性流动相的一个重要变量。
可以区分5种一般类型的LC：
1.正常相色谱要求使用极性固定相连同非极性(分散的)流动相。
2.反相色谱，相反的可能性，要求使用非极性固定相和极性流动相(由一种或多种极性溶剂组成，例如水、甲醇、乙腈和四氢呋喃)。
3.离子交换色谱涉及离子相互作用。在此情况下，流动相必须支持离子化，以确保离子溶质的溶解性。固定相必须也是部分离子化的，以促进一定的保留。因此，与固定相的相互作用强，这通常反映为较长的分析时间和宽峰。
4.大小排阻色谱法包括基于单独的分子大小的分离，理论上需要溶质与固定相没有有力的相互作用。
5.亲和色谱基于特异性相互作用，例如特异性结合对成员之间的相互作用，例如抗原和对应的抗体或者受体和对应的配体。例如，结合对的首个配偶体结合适宜的固定相，并用于捕获结合对的第二个配偶体。第二个配偶体可通过适宜的方法被释放和分离。
以上给出的分离原理的一般分类不一定是详尽的，因此是非限制性的，存在可用于分离液体样品的其它分离原理，例如疏水作用色谱、亲水作用色谱、离子对色谱和基于分子印迹材料的分离。
在常规应用中，将RP-HPLC应用中的固定相(所谓的床料，例如二氧化硅颗粒)装填到适宜的柱子中，并由滤头保护。通常选择与床料孔径相比具有更小孔径的滤头材料。
在HPLC法中，固定相颗粒的直径通常在1-10μm的范围内。这些小颗粒迫使在HPLC中使用高压。床料通常由滤头保护。典型的滤头具有1μm、0.45μm或0.2μm的孔径。颗粒越小，通常滤头的孔径就越小。如果样品包含能够阻塞HPLC滤头的成分，则这对任何常规分析都是有害的。全血样品以及含有样品成分沉淀的“过处理”全血样品使任何常规的HPLC滤头或柱子快速阻塞。技术人员会认识到，滤头孔径越低，固定相颗粒的直径越小，柱子直径越小，用于HPLC柱的滤头就越快发生阻塞。如果没有适宜地选择滤头，即孔径太大，则柱填料的颗粒大小也将是个问题，颗粒越小，柱子本身就会越快阻塞。
通过用本发明的膜溶解剂处理样品(例如全血样品)，现在有可能将这些已处理的样品直接施加至HPLC柱，而不会形成阻塞柱子的风险。在一个优选实施方案中，本发明涉及处理液体样品的方法，其中所述样品首先用本发明的膜溶解剂进行处理，此后实施HPLC步骤。优选该HPLC步骤用通过用膜溶解剂处理获得的样品在线进行。优选用于此HPLC步骤的固定相颗粒的直径在1-10μm的范围内，还优选在2-7μm的范围内。优选用于此HPLC步骤的滤头的孔径为0.5μm，或者还优选0.2μm。
目标分析物可通过任何适宜的方法检测。适宜的和优选的检测器感应通过的化合物的存在情况，并提供电信号至记录仪或计算机数据站。输出通常为色谱图的形式，目标物质通常存在于某一个峰中。峰面积或峰高度可用于定量所研究样品中存在的分析物的量。
用于HPLC系统的检测器是由于洗脱样品化合物而发射应答并随后在色谱图上发出峰信号的组件。其紧邻固定相后方定位，以便检测由柱中洗脱出来的化合物。峰的带宽和高度通常可以使用粗调和微调控制来调节，技术人员还可以控制检测参数和灵敏度参数。有许多类型的检测器可与HPLC一起使用。一些更常见的检测器包括：折射率(RI)、紫外线(UV)、荧光、放射化学、电化学、近红外(Near-IR)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)和光散射(LS)。
折射率(RI)检测器测量样品分子变向或折射光的能力。每种分子或化合物的该特性都被称为其折射率。对于大多数RI检测器，光穿过双模流动池到达光探测器。流动池的一个通道引导流动相通过柱，而另一个仅引导流动相。当光由于样品由柱中洗脱出来而变向时发生检测，这被读作两个通道之间的差异。
荧光检测器检测化合物于给定波长吸收然后再发射光的能力。每种化合物都具有特征荧光。激发源通过流动池到达光检测器，同时单色器测量发射波长。
放射化学检测包括使用放射性标记的物质，通常为氚(3H)或碳-14(14C)。其通过检测与β-粒子离子化相关的荧光来运行，其在代谢物研究中最常见。
电化学检测器测量经历氧化或还原反应的化合物。这通常通过在迁移样品于给定电位差在电极之间通过时测量它们获得或失去的电子来完成。
质谱法是一种用于检测离子的质荷比(m/z(或m/q))的分析技术。其通过产生代表样品组分质量的质谱最常用于分析实际样品的组成。该技术有几种用途，包括：通过化合物和/或其片段的质量鉴定未知的化合物；确定化合物中的一种或多种元素的同位素组成；通过观察化合物的片段化确定化合物的结构；使用精心设计的方法定量样品中化合物的量(质谱法不一定是定量的)；研究气相离子化学的基本原理(离子化学和真空中的中性)；用多种其它方法确定化合物的其它物理、化学乃至生物特性。
质谱仪是一种用于质谱法的装置，并产生样品的质谱，以分析其组成。这通常如下实现：离子化样品，并分离不同质量的离子，通过检测离子流的强度记录它们的相对丰度。典型的质谱仪包括3个部分：离子源、质量分析器和检测器。
离子源的种类是强烈影响质谱法可分析什么类型样品的影响因素。电子电离和化学电离用于气体和蒸汽。在化学电离源中，分析物通过在所述源中碰撞的过程中的化学离子-分子反应被电离。经常使用液体和固体生物样品的两种技术包括电喷雾电离(ESI)和基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)。其它技术包括快原子轰击(FAB)、热喷雾、大气压化学电离(APCI)、二次离子质谱(SIMS)和热电离。
在一个优选的实施方案中，用本发明的方法检测分析物是通过质谱进行。
核磁共振(NMR)检测基于以下事实：某些原子核具有奇数质量，包括H和13C，以随机方式在轴附近自旋。然而，当处于强磁铁的磁极之间时，自旋与磁场平行与反向平行排列，平行方向有利的，因为其能量稍低。然后用电磁辐射照射核，电磁辐射被吸收，并将平行核置于较高能态；结果，它们现在与辐射“共振”。每个H或C将根据它们的位置和邻近的分子或化合物中的元素产生不同的谱，因为分子中所有的核都被电子云围绕，电子云改变环绕的磁场，由此改变吸收频率。
当某个光源发射出的平行光束遇到溶液中的粒子时，光被反射、吸收、透射或散射。这些现象可以通过光散射(LS)检测器来检测。最主要的LS检测形式被称为浊度测定和浊度分析。浊度测定被定义为检测颗粒溶液散射的光。该方法能检测以一定角度散射的部分光。浊度分析被定义为检测由于溶液中的颗粒而透射光的减少。其检测由于透射过颗粒溶液的光的减少的光散射。因此，其定量透射过的残余光。
近红外检测器通过在700-1100nm的光谱中扫描化合物来操作。于特定波长检测每个分子中的具体化学键的伸缩振动和弯曲振动。
在本发明的一个优选实施方案中，用如在本发明中所述的膜溶解剂对来源于哺乳动物的全血样品或来源于哺乳动物的抗凝结的全血样品进行处理，并在线检测包含在此处理样品中的目标分析物，即没有任何额外的步骤，如过滤、沉淀或离心。在一个优选的实施方案中，本发明由此涉及分析全血样品的方法，包括以下步骤：在适于破裂所述红细胞膜的条件下用膜溶解剂处理样品，且不破坏真核细胞的细胞核，对所述已处理样品实施HPLC步骤，并检测所述样品中的目标分析物。优选在以上分析中的3个步骤在线进行。
本发明的分析物可以为任何无机或有机分子，包括生物分子，不包括核酸。分析物不会为核酸，尤其是不会为DNA。优选分析物选自多肽、碳水化合物和无机或有机药物分子。优选目标分析物的分子量为10,000Da以下，还分别优选9kDa以下、8kDa以下、7kDa以下、6kDa以下或5kDa以下的分子量。
多肽或蛋白是基本上由氨基酸组成的分子，其具有至少两个通过肽键连接的氨基酸。就本文公开的方法中研究的目标分析物而言，多肽优选由至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25和30个至多达约100个氨基酸组成。优选多肽包含5-100个氨基酸，还优选包含10-40个氨基酸。适宜的目标肽分析物为例如肽激素，以及在循环中存在的其它多肽，尤其是由于用本发明的膜溶解剂处理而由红细胞释放的多肽。
优选本发明的方法用于在线检测全血样品中的分析物，其中所述分析物至少部分地位于红细胞中。
本发明的优选的目标分析物选自滥用药物和免疫抑制药物。
优选的目标分析物为滥用药物。滥用药物优选选自安非他明、可卡因和可卡因代谢物，如苯甲酰芽子碱、去氧麻黄碱、鸦片剂和鸦片剂衍生物、大麻类物质如四氢大麻醇和苯环己哌啶。
进一步优选的目标分析物为叶酸，尤其是包含在血浆和红细胞这二者中的总叶酸。
优选的目标分析物为免疫抑制药物。免疫抑制药物优选选自环孢菌素(CsA)、霉酚酸酯(MMF)、雷帕霉素(RAPA，也称为西罗莫司)、他克莫司(FK-506)、咪唑硫嘌呤(AZA)和甲基强的松龙(MP)。
还优选在红细胞中存在的目标分析物。差异溶血的全血样品中要检测的优选分析物为西罗莫司、他克莫司和叶酸。
提供以下的实施例和附图是为了帮助理解本发明，本发明的真实范围由随附的权利要求陈述。要理解的是，可在不偏离本发明宗旨的情况下对所陈述的方法进行修改。
附图简述
图1用水溶血的1:10稀释的全血的光学显微镜检查。已应用了May-Grünwald染色。红细胞膜和细胞核是可见的。
图2用四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓(25％)溶血的1:10稀释的全血的光学显微镜检查。已应用了May-Grünwald染色。没有剩下红细胞或膜，细胞核仍是完整的。
图3用水溶血的1:10稀释的全血的光学显微镜检查。已使用锥虫蓝染色。
图4用四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓(25％)溶血的1:10稀释的全血的光学显微镜检查。已应用了锥虫蓝染色。a)2.5分钟温育时间：只剩下少量残余红细胞，b)15分钟温育时间：没有剩下红细胞或膜。
图5掺入雷帕霉素的1:10稀释的全血的LC-MS/MS色谱图。
图6掺入5-甲基四氢叶酸的全血的LC-MS/MS色谱图。5-甲基四氢叶酸于17.5分钟洗脱。
实施例1
多种候选溶血试剂的评价
实施例1.1 溶血的目测评价
溶液A：用0.15摩尔氯化钠溶液以1:10比率稀释新鲜EDTA-稳定的全血(50μL EDTA-血液加450μL氯化钠溶液)。
溶液B：制备候选溶血试剂在0.15摩尔氯化钠中的溶液，其中溶血试剂的浓度为溶血产物中所需终浓度的2倍，例如得到25％四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓的终浓度，制备50％溶液(50mg盐加50mL0.15摩尔氯化钠的水溶液)。
在加入第二种化合物如碘化钾的情况下，所述盐(氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓/KJ)以大约等摩尔的量加入。
通过将溶液A和溶液B等量混合，例如500μL溶液A加500μL溶液B，制备溶血产物。
在混合后立即、混合后1分钟、2分钟、5分钟、6分钟、7分钟、20分钟和40分钟目测检查溶血产物的混浊度和澄清度。记录观察到澄清溶液的时间。
表1：目测评价候选试剂的差异溶血
 
溶血试剂 终浓度(重量/体积)        (分钟)后澄清        
四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓 25％ 20分钟
四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓 12.5％ 40分钟
四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓 6％ 混浊
四氟硼酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓 25％ 20分钟
辛基硫酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓 25％ 立即
氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓 25％ 混浊
氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓/KJ 25％/22％ 20分钟
氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓/KSCN 25％/13％ 5分钟
氯化1-己基吡啶鎓/KSCN 25％/12％ 立即
氯化1-己基吡啶鎓/KSCN 12.5％/6％ 1分钟
氯化1-己基吡啶鎓/KSCN 6.25％/3％ 6分钟
氯化1-己基吡啶鎓/KSCN 3.12％/1.5％ 混浊
氯化1-己基吡啶鎓 25％ 7分钟
氯化1-己基吡啶鎓 12.5％ 混浊
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 25％/10％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 12.5％/5％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 6.25％/2.5％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 3.12％/1.25％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 2.5％/1％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 1.25％/0.5％ 2分钟
 
溶血试剂 终浓度(重量/体积)        (分钟)后澄清        
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 0.62％/0.25％ 混浊
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓 25％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓 2.5％ 混浊
氯化N-辛基吡啶鎓 25％ 2分钟
氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓 12.5％ 立即
氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓 6.25％ 立即
氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓 1.5％ 立即
由上表清楚可见，通过目测评价可以目测鉴定良好的差异溶血候选试剂。
实施例1.2 溶血的显微镜评价
溶液A：用0.15摩尔氯化钠溶液以1:10比率稀释新鲜的EDTA-稳定的全血(50μL EDTA-血液加450μL氯化钠溶液)。
溶液B：制备溶血试剂在0.15摩尔氯化钠中的溶液，其中溶血试剂的浓度为溶血产物中所需终浓度的2倍，例如得到25％四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓的终浓度，制备50％溶液(50mg盐加50mL 0.15摩尔氯化钠的水溶液)。在加入第二种阴离子如碘化物的情况下，所述盐(氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓/KJ)以大约等摩尔的量加入。
通过将溶液A和溶液B等体积混合，例如20μL溶液A加20μL溶液B，制备溶血产物。
May-Grünwald染色和显微镜检查：
在溶血产物混合后，在显微镜载玻片上涂布液滴，于室温风干，并用May-Grünwald染色试剂(Merck目录号：1.01424 May-Grünwald的曙红亚甲基蓝溶液)染色。在May-Grünwald染色的核染色至可变的紫色阴影之后，可见蓝色调至浅粉色色调的胞质，在某些细胞类型的胞质中可存在精美的微红色至淡紫色颗粒，嗜碱细胞在胞质中表现为深蓝黑色颗粒，嗜酸细胞在胞质中表现为鲜橙色颗粒，而红细胞被染色为粉色至橙色。
通过油浸光学显微镜(放大倍率x630)进行显微镜检查
比较结果：图1，通过水获得的裂解物，图2，按照本发明获得的裂解物，表明，在几分钟内加入适宜的溶血试剂将导致红细胞完全裂解。
锥虫蓝染色和显微镜检查：
将处理过的全血样品(1:1)与锥虫蓝溶液(Merck目录号1.11732；Trypanblau C.I.23850)混合，并分配入显微镜的Neugebauer-室中。显微镜检查通过油浸光学显微镜进行(放大倍率x630)。
比较结果-图3，通过水获得的裂解物，以及图4a)和b)，按照本发明获得的裂解物，表明，在几分钟内加入适宜的溶血试剂将导致红细胞完全裂解。
实施例2
通过HPLC评价多种候选溶血试剂
为评价裂解效率，将按照实施例1制备的已溶血的全血样品注射入HPLC系统中，并监测系统的反压。
HPLC系统由配有DR5溶剂输送系统的HP 1090液相色谱仪(Agilent)、配备自动取样器的自动调温器和自动进样器组成。通过将50×10μL已处理全血样品施加至HPLC柱评价裂解效率，该HPLC柱以5μm Symmetry C18颗粒作为床料，柱内径为2mm，柱长为20mm，滤头为0.5μm孔径。洗脱液为5分钟内含0.1％甲酸的水至含0.1％甲酸的乙腈的梯度，流速为0.2mL/分钟。在50次注射后观察到的反压增加低于20bar。
如果裂解仅用蒸馏水实现，则在以上HPLC条件下观察到的反压增加大于100bar。
实施例3
全血样品的雷帕霉素检测
向全血样品掺入雷帕霉素，并与溶血试剂混合。向450μL新鲜EDTA-血液加入50μL的400μg/mL雷帕霉素在50％甲醇/水中的溶液，匀化后于室温温育1小时。
用950μL的四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓在0.15摩尔氯化钠水溶液中的25％溶液稀释50μL等份的该掺入的全血样品。将25μL溶血产物注射入HPLC中。
HPLC系统由配有DR5溶剂输送系统的HP 1090液相色谱仪(Agilent)、配备自动取样器的自动调温器、自动进样器以及HPLC和质谱仪之间的转向阀组成。检测器为线性离子阱质谱仪、ThermoElectron LTQ，采用电喷雾电离。对于色谱分离，使用以5μm VydacC18颗粒作为床料、柱内径为2mm、柱长为250mm以及滤头为0.5μm孔径的HPLC柱。洗脱液为30分钟内含0.1％甲酸的水(A)至含0.1％甲酸的乙腈(B)的梯度，此后10分钟以100％B等度洗脱。流速为0.2mL/分钟。雷帕霉素于大约26分钟时洗脱下来(参见图5)。
实施例4
全血样品中的5-甲基四氢叶酸检测
向全血样品掺入5-甲基四氢叶酸，并与溶血试剂混合，将10μL含1％抗坏血酸的10μg/mL 5-甲基四氢叶酸的水溶液(用4M氢氧化钠溶液调节至pH 7)加入90μL新鲜EDTA-血液中。用90μL 0.15摩尔氯化钠的水溶液稀释10μL该掺入的血液，并与100μL的2mg氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN在1％抗坏血酸中的溶液(用4M氢氧化钠溶液调节至pH 7)混合。该溶血产物用于HPLC分析。
HPLC系统由配有DR 5溶剂输送系统的HP 1090液相色谱仪(Agilent)、配备自动取样器的自动调温器、自动进样器以及用于预置柱和分析型HPLC柱之间的柱转换的6通转向阀组成。对于预置柱的注射和加样，使用Waters HPLC 515泵。检测器为线性离子阱质谱仪、Thermo Electron LTQ，采用电喷雾电离。对于色谱分离，使用预置柱ADS-C18，25×4mm(Merck)，以及以5μm Vydac C18颗粒作为床料、柱内径为2.1mm、柱长为250mm以及滤头为0.5μm孔径的分析型HPLC柱。溶剂A为含0.5％乙酸的水，溶剂B为含0.5％乙酸的甲醇。
将20μL掺入的和溶血的样品与洗脱液A以1.5mL/分钟流速注射到预置柱ADS-C18上。在4分钟后，应用由水(含0.5％乙酸)(A)至甲醇(含0.5％乙酸)(B)的梯度，使用0％B直至第5分钟，在5-30分钟之间至100％B的梯度，流速0.2mL/分钟，以反洗模式以0.2mL/分钟的流速将捕获的分析物洗脱到分析型柱Vydac C18上。分析物5-甲基四氢叶酸于大约17分钟时洗脱下来(参见图6)。

Claims (9)

1.一种检测已知或怀疑含有红细胞并怀疑或已知含有真核细胞的全血样品中分析物的方法，其中所述分析物至少部分位于红细胞中并且不包括核酸，其中红细胞为没有细胞核的红细胞，所述方法包括以下步骤：
a)在适于裂解红细胞细胞膜且同时不引起样品成分沉淀的条件下用膜溶解剂处理所述全血样品，
b)对步骤(a)中获得的已处理样品进行色谱分离，其中所述色谱分离是利用高效液相层析，和
c)检测分析物，
其中，将所述膜溶解剂以1∶1比率与1∶10稀释的全血样品混合并温育30分钟导致50等份的10μL已处理全血样品可施加于直径2mm和孔径0.5μm的滤头，且其中第50次注射的反压与第一次注射的反压彼此相比，所述膜溶解剂不会引起20bar以上的反压增加，
其中所述膜溶解剂包括由一种或多种以下的阳离子和阴离子组成的盐，其中所述阳离子选自：
其中m为0或1，n为4或6，其中所述阴离子选自氯离子、四氟硼酸根、辛基硫酸根、碘离子和硫氰酸根。
2.权利要求1的方法，其中所述膜溶解剂还包括KBr、KJ或KSCN。
3.权利要求1或2的方法，其中所述色谱分离基于柱色谱，并通过使用含有滤头和床料的柱子或通过使用整体柱进行。
4.权利要求3方法，其中所述床料为颗粒，所述颗粒的直径为1-10μm。
5.权利要求1或2的方法，其中所述分析物通过质谱法检测。
6.权利要求1或2的方法，其中所述分析物为免疫抑制药物。
7.膜溶解剂在用于高效液相层析的全血样品处理中的用途，所述膜溶解剂包括由一种或多种以下的阳离子和阴离子组成的盐，其中所述阳离子选自：
Figure FSB00001028447300021
其中m为0或1，n为4或6，其中所述阴离子选自氯离子、四氟硼酸根、辛基硫酸根、碘离子和硫氰酸根。
8.权利要求7的用途，其中所述膜溶解剂还包括KBr、KJ或KSCN。
9.根据权利要求1-6中任一项的方法用膜溶解剂通过差异溶血获得的已处理血样用于基于液相色谱的分析中的用途。
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