CN101415723B - 具有改良生物学特性的hiv融合抑制肽 - Google Patents
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Abstract
提供了具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15中任一氨基酸序列的HIV融合抑制肽。还提供了含有HIV融合抑制肽和一种或多种药学上可接受的载体和大分子载体的药物组合物，以及这些组合物的用途和治疗方法。
Description
本申请要求2006年2月2日提交的美国临时申请60/764,674号的利益，其全文引为参考。
技术领域
本发明涉及衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)gp41的氨基酸序列的合成肽。更具体地，本发明涉及与HIV gp41的天然氨基酸序列相比具有某些氨基酸差异的HIV融合抑制肽，这些氨基酸差异使得该HIV融合抑制肽具有有益的生物学特性。
背景技术
众所周知，细胞可以通过细胞膜和病毒膜间的融合过程而被HIV感染。该过程普遍接受的一个模型是病毒包膜糖蛋白复合物(gp120/gp41)与目标细胞膜的细胞表面受体间发生相互作用。当gp120与细胞受体(例如，与趋化因子共受体如CCR-5或CXCR-4结合的CD4)结合后，诱导gp120/gp41复合物的构象改变，从而使得gp41插入到该目标细胞的膜中并介导膜融合。
gp41的氨基酸序列，以及其在不同HIV毒株之间的变体为公众所知。图1为普遍接受的gp41的功能域示意图(注意氨基酸序列数根据HIV毒株不同可能略有变化)。所述膜融合域被认为参予向目标细胞膜的插入以及目标细胞膜的破裂。含有跨膜锚序列的跨膜域位于该蛋白质C端。在膜融合域和跨膜域间是两个独特区域，称为七肽重复序列(HR)区域，每个区域有多个七肽。含HR1区域的氨基酸序列和含HR2区域的氨基酸序列在HIV-1包膜蛋白中各自是高度保守区域。HR2区域被普遍描述为含有SEQ ID NO：1氨基酸残基，或其多态性氨基酸残基(例如，参见图2)。如在图1进一步所示，该HR区域具有多个7氨基酸残基延伸链或“七肽”(每个七肽中的7个氨基酸以“a”到“g”表示)，第一(“a”)和第四(“d”)位置主要被疏水残基占据，而带电荷残基通常在第五(“e”)和第七(“g”)位置。在HIV gp41氨基酸序列中还存在含有以异亮氨酸或亮氨酸开始并结束的8氨基酸序列的亮氨酸拉链样基序。如图1所示，该HR2区域只有一个亮氨酸拉链样基序，而HR1区域有五个亮氨酸拉链样基序。该七肽和拉链样基序被认为是对形成gp41卷曲螺旋结构有贡献的氨基酸序列特征。
人们发现衍生自HIV gp41的HR1区域(“HR1肽”)或HR2区域(“HR2肽”)天然序列的肽在体外实验和体内临床研究中抑制HIV向宿主细胞的传播。例如，HR2肽，以DP178(也称为T20，恩夫韦地，和Fuzeon；SEQ IDNO：2)、T651(SEQ ID NO：3)、T649(SEQ ID NO：4)为例，分别以0.5ng/ml(EC50抗HIV-1LAI)、5ng/ml(IC50；HIV-1IIIB)、和2ng/ml(IC50；HIV-1IIIB)的量阻断目标细胞的感染。人们已经努力提高HIV gp41衍生肽的生物活性，如设法稳定肽的螺旋结构。例如，本发明人在PCT公开WO2005/067960号中公开了具有螺旋稳定性的合成肽，并在本文以SEQ ID NO：5-7示例。能够抑制HIV融合(在HIV感染目标细胞过程中HIV gp41介导病毒膜和细胞膜之间融合的过程)的合成肽为通常称为HIV融合抑制肽的一类肽。
与合成肽相关的另一个缺陷涉及在水基药学上可接受的载体中的溶解性和稳定性，如在制备HIV融合抑制肽的注射溶液配方的过程中。例如，很难得到含SEQ ID NO：2的氨基酸序列合成肽浓度超过100mg/ml的可注射水性溶液，而不遇到溶解性问题(其中该配方象一种凝胶，而不是一种溶液，或者超过一个预定期间该肽沉淀而析出溶液)和稳定性问题(超过一个预定时间该肽降解)，和不需要在该配方中添加附加成分来促进稳定性和/或溶解性。期望研制一种具有改善的溶解性和稳定性，同时还具有改善的药理性质的HIV融合抑制肽。
因而，需要HIV融合抑制肽：(a)当以有效量加入时，能够干扰HIV gp41介导的病毒融合过程，更优选地，干扰实现融合所必需的gp41构象变化，从而抑制HIV gp41对目标细胞膜的融合；(b)在水性溶液中显示改善的溶解性和稳定性；和(c)显示改善的药理性质。本发明实现了上述需求。
发明概述
本发明涉及是HIV融合抑制肽的分离肽。
一方面，本发明涉及衍生自具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的基本氨基酸序列(“基本序列”)的HIV融合抑制肽，但其中每个HIV融合抑制肽在其氨基酸序列中具有多个亮氨酸拉链样基序，且在其氨基酸序列中具有至少一个额外的、形成亮氨酸拉链样基序所非必需的亮氨酸(即在序列中亮氨酸拉链样基序的氨基酸位置1或8处之外的氨基酸，如SEQ ID NO：5中示例的在氨基酸位置21处用亮氨酸取代异亮氨酸)，从而与基本序列不同。
本发明涉及衍生自具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的基本氨基酸序列(“基本序列”)的HIV融合抑制肽，但是其中每个HIV融合抑制肽在其氨基酸序列中具有两个以上亮氨酸拉链样基序而与基本序列不同。
本发明还涉及一系列HIV融合抑制肽，其中每个HIV融合抑制肽：(a)含有衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列；(b)含有具有不少于2个但不多于5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列；(c)在其氨基酸序列中在亮氨酸拉链样基序的氨基酸位置1或8处之外具有至少一个额外的亮氨酸(例如与SEQ ID NO：5-7的任意一个或多个基本序列相比较)；和(d)优选地显示出一种或多种生物学性质的改善。在某些实施方案中，该HIV融合抑制肽的长度介于15至60个氨基酸残基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽进一步包含N末端基团或C末端基团，或者两者；这些末端基团可以包括但不限于：在N末端的氨基或乙酰基；和在C末端的羧基或氨基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽可以自聚而形成多聚体，例如三聚体，或合成为多聚形式，例如三聚体。
在某些实施方案中，本发明的HIV融合抑制肽的长度介于15至60个氨基酸，只要这些肽显示有至少两个亮氨酸拉链样基序，并显示有至少一个额外的、形成亮氨酸拉链样基序所非必需的异亮氨酸或亮氨酸(例如在SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：16的位置21处)。
例如，氨基酸长度长于或短于SEQ ID NO：16的肽认为是在本发明的范围内，只要这些肽显示有至少两个亮氨酸拉链样基序，并显示有至少一个额外的、形成亮氨酸拉链样基序所非必需的异亮氨酸。当本发明中的肽比SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：16的长度长时，该额外的氨基酸残基可以，例如，来自与通过标准比对技术通常与SEQ ID NO：5相对应的gp41区域邻接(氨基和/或羧基邻接)的HIV gp41氨基酸序列。
本发明还涉及一系列HIV融合抑制肽，其中每个HIV融合抑制肽：(a)含有衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列；(b)含有具有大于2个但不超过5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列；和(c)在其氨基酸序列中在亮氨酸拉链样基序的氨基酸位置1或8处之外具有至少一个额外的亮氨酸(例如与SEQ ID NO：5-7的任意一个或多个基本序列相比较)；和(d)优选地显示出一种或多种生物学性质的改善。在某些实施方案中，该HIV融合抑制肽的长度介于15至60个氨基酸残基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽进一步包含N末端基团或C末端基团，或者两者；这些末端基团可以包括但不限于：在N末端的氨基或乙酰基；和在C末端的羧基或氨基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽可以自聚而形成二聚体或多聚体，例如三聚体，或合成为多聚形式，例如三聚体。
此外，本发明涵盖提高源自HIV gp41的HR2区域，更优选地源自基本氨基酸序列SEQ ID NO：5的肽的一种或多种生物学性质的方法，其中该方法包括制备HIV融合抑制肽，该肽具有类似于SEQ ID NO：5的氨基酸序列，不同之处在于该HIV融合抑制肽氨基酸序列：(a)有多个亮氨酸拉链样基序，且具有除形成亮氨酸拉链样基序所需的亮氨酸外的至少一个额外的亮氨酸(即除亮氨酸拉链样基序位置1或8处之外)；或(b)有超过两个的亮氨酸拉链样基序；和其中该HIV融合抑制肽，且优选地，显示出一种或多种生物学性质的改善。在某些实施方案中，该HIV融合抑制肽长度介于15至60个氨基酸残基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽进一步包括N末端基团或C末端基团，或者两者；这些末端基团可以包括但不限于：在在N末端的氨基或乙酰基；以及在末C端的羧基或氨基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽可以自聚形成二聚物或多聚体，例如三聚体，或合成为多聚形态，例如三聚体。
优选地，经证实通过本发明的HIV融合抑制肽改善(与基本氨基酸序列相比较)的一种或多种生物学性质可选自：生物半衰期(例如，使该HIV融合抑制肽在血流中被降解和/或被去除之前能在体内存活更长时间)，在水性溶液中的溶解性，在水性溶液中的稳定性，更强的对抗已经对衍生自HIVgp41HR2区域自然序列(例如SEQ ID NO：2)的合成肽形成耐受性的HIV毒株的能力(更强的抗病毒活性)，或者其组合。
本发明还提供了药物组合物或药剂，其包含本发明的HIV融合抑制肽和至少一种附加成分，包括药学上可接受的载体、大分子或其组合。
本发明还提供了使用本发明的HIV融合抑制肽的方法。在一个实施方案中，HIV融合抑制肽用作包含一种或多种附加抗病毒剂的治疗方案的一部分。这种治疗方案用于治疗HIV感染。在另一个实施方案中，提供了使用本发明的HIV融合抑制肽来抑制HIV向目标细胞传播的方法，该方法包括向病毒和细胞中加入抑制细胞被病毒感染的有效量的本发明的HIV融合抑制肽。该方法可用于治疗HIV感染的个体。在优选实施方案中，抑制HIV向目标细胞传播包括抑制gp41介导的HIV-1与目标细胞的融合，和/或抑制HIV感染细胞与目标细胞的合胞体形成。本发明还提供了治疗HIV感染(优选地，HIV-1感染)的方法，该方法包括向HIV感染个体给予包含本发明的HIV融合抑制肽的药物组合物。优选地，该药物组合物为抑制HIV向目标细胞传播的有效量，和/或为抑制gp41介导的HIV与目标细胞融合的有效量。还提供了抑制HIV融合的方法，该方法包括在细胞存在下将病毒与抑制HIV融合有效量的本发明的HIV融合抑制肽接触。这些方法可用于治疗HIV感染个体。
本发明还提供了本发明的HIV融合抑制肽在制备治疗HIV感染的药物中的用途(例如用于抑制HIV传播的方法中，抑制HIV融合的方法中，和/或治疗HIV感染的方法中)，该用途如本文所述。该药物优选为包含本发明的HIV融合抑制肽与药学上可接受的载体的药物组合物的形式。
本发明的HIV融合抑制肽可以根据公知的方法常规地制备，包括重组表达编码所述肽的核酸。例如，可以将构建成重组表达HIV融合抑制肽的细胞在合适的条件下培养合适的时间，以使该肽表达，并从中获得该肽。
本发明还提供了编码本发明的HIV融合抑制肽的分离的核酸分子，以及包含该核酸分子的载体，包括表达载体。本发明还提供了含这种载体的细胞，如大肠杆菌或哺乳动物细胞，其中该细胞能表达核酸以制备所述HIV融合抑制肽。
本发明的HIV融合抑制肽也可以通过例如合成方法制备。例如，提供特定的肽片断，每个肽片断能作为中间体与一组肽片断中的一个或多个其它肽片断共价连接从而得到具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15中任一氨基酸序列的HIV融合抑制肽。在优选的实施方案中，本发明的一组肽片断中的该肽片断以能够得到具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的氨基酸序列的目标HIV融合抑制肽的方式在液相中连接。还提供了制备HIV融合抑制肽的方法，该方法包括合成其组成性肽片断，然后组装该肽片断而形成该HIV融合抑制肽，其中该HIV融合抑制肽具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQID NO：14、或SEQ ID NO：15任一种的氨基酸序列。在一个实施方案中，使用合成方法来形成该HIV融合抑制肽的二聚体或多聚体，例如三聚体。在一个实施方案中，使用重组方法和/或接头来形成该HIV融合抑制肽的二聚体或多聚体。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽形成的多聚体为线性多聚体；在另一个实施方案中，该多聚体是非线性的，例如聚集体。
本发明的上述以及其它目标、特征和优点通过结合附图并阅读下述本发明的详细描述将会变得清楚。
附图简要说明
图1为HIV-1gp41的示意图，显示了七肽重复1区(HR1)和七肽重复2区(HR2)，以及gp41的其它功能区。为了说明的目的显示了与gp160HIVIIIB毒株相关的HR1和HR2相对应的示例性天然氨基酸序列，以及该氨基酸位置编号。
图2是为了说明的目的非限制性地显示了以不同实验室毒株和临床分离株确定的HIV-1gp41的HR2区所含有的天然氨基酸序列的比较，其中以单字母氨基酸代码表示一些氨基酸序列的变化(例如多态性)。
图3是具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽SEQ ID NO：9的合成示意图，该合成使用包括3个肽片断装配的片断缩合方法。
图4是具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽SEQ ID NO：9的合成示意图，该合成使用包括2个肽片断装配的片断缩合方法。
发明详细描述
定义
“个体”，当被用于本说明书和权利要求的目的时，指哺乳动物，且优选人。
“目标细胞”，当被用于本说明书和权利要求的目的时，指能够被HIV感染的细胞。优选地，该细胞为人细胞；更优选地，能通过一种过程，包括膜融合被HIV感染的人细胞。
“药学上可接受的载体”，当被用于本说明书和权利要求的目的时，指不显著改变所加入的活性成分(例如，本发明的HIV融合抑制肽)的生物活性的载体介质。药学上可接受的载体包括但不限于下列物质的一种或多种：水、缓冲水、生理盐水、0.3％的甘氨酸、醇溶液、等渗水溶液；还可包括一种或多种物质如甘油；油；盐，如钠盐、钾盐、镁盐和铵盐、磷酸盐；碳酸酯；脂肪酸；糖类(例如甘露醇)；多糖；聚合物；赋形剂；和防腐剂和/或稳定剂(增加保存期限或是该组合物的制备和分布所必需的和适合的)。优选地，该药学上可接受的载体适合静脉给药、肌肉给药、皮下给药或肠胃外给药。
除非另外特别指明，“含异亮氨酸或亮氨酸的氨基酸”，当被用于本说明书和权利要求的目的而涉及本发明的HIV融合抑制肽时，分别指异亮氨酸或亮氨酸，或者它们各自天然存在的氨基酸(例如L-氨基酸)，非天然存在的氨基酸(例如D-氨基酸)，异构形式(例如正亮氨酸、异亮氨酸异构体等等)或者衍生形态(例如叔亮氨酸)。氨基酸异亮氨酸或亮氨酸的优选形式可用于排除不是优选氨基酸形式的氨基酸形式。本发明的HIV融合抑制肽在其氨基酸序列中还可包含存在于其来源HIV gp41的HR2区序列中的一种或多种多态性(例如参见图2)，除了在本文所教导的氨基酸序列的一个或多个位置处包含含异亮氨酸或亮氨酸的氨基酸。
“HIV”指人免疫缺陷病毒，优选HIV-1。
术语“分离的”，当涉及到本发明的HIV融合抑制肽、或者肽片断时，指基本上不含不构成该肽自身整体结构部分的成分，如基本上不含化学合成、制备或用生物、生物化学或化学方法修饰时的化学前体或其它化学物质。
“1至3个氨基酸替代”，当涉及到本发明的HIV融合抑制肽时，指本发明的HIV融合抑制肽还可以具有SEQ ID NO：9-15中的任一氨基酸序列，不同之处在于与SEQ ID NO：9-15中任一相比具有不少于一个且不多于三个氨基酸差异；并且还具有：(a)多个亮氨酸拉链样基序，除形成亮氨酸拉链样基序所需的亮氨酸外的至少一个额外的亮氨酸(即除亮氨酸拉链样基序位置1或8处外)，或者(b)3到5个亮氨酸拉链样基序；并具有抗HIV的抗病毒活性(抑制HIV-介导的融合的活性)。在此方面，具有替代的HIV融合抑制肽的氨基酸差异(当与SEQ ID NO：9-15相比时)位于氨基酸序列中本发明的HIV融合抑制肽所示的亮氨酸和/或异亮氨酸残基之外的位置上(参见例如本文中的图示(I)和(II))。该不少于一个且不多于三个氨基酸差异包括但不限于：保守氨基酸替代(公知地包括与被取代的氨基酸具有实质上相同的电荷、大小、亲水性、和/或芳香性的氨基酸替代；例子包括但不限于：甘氨酸-丙氨酸-缬氨酸、色氨酸-酪氨酸、天冬氨酸-谷氨酸、精氨酸-赖氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺、和丝氨酸-苏氨酸)和/或多态性(例如如图2中所示，或者如在实验室、不同的分化枝、和/或HIV-1临床分离株中所观察到的)。例如，当涉及到SEQ ID NO：11、12或13时，HIV融合抑制肽在SEQ ID NO：11、12、或13任一的氨基酸残基10、17、24、31和38之外处有1至3个氨基酸差异。例如，当涉及到SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：14时，HIV融合抑制肽在SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：14的氨基酸残基10、17、21、24和38之外处有1至3个氨基酸差异。例如，当涉及到SEQ ID NO：10或SEQID NO：15时，HIV融合抑制肽在SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：15的氨基酸残基10、17、21、31和38处之外有1至3个氨基酸差异。该实施方案的示例性例子包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO：16，其中可以为一至三个氨基酸替代的氨基酸差异的位置用Xaa表示(代表任何氨基酸，天然或非天然发生的；即在该氨基酸位置上可以使用多种可能的氨基酸)。同样，可以具有一个或多个保守氨基酸替代，例如赖氨酸被精氨酸或组氨酸替代、精氨酸被赖氨酸或组氨酸替代、谷氨酸被天冬氨酸替代，或天冬氨酸被谷氨酸替代。为了说明的目的，氨基酸位置10、17、24、31和38用下划线表示。参考SEQ ID NO：9-15，注意在SEQ ID NO：16中“Zaa”表示可以为亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸，而Baa用于表示优选为亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸，但也可能为Xaa，前提是至少一个Baa为亮氨酸或异亮氨酸。
SEQ ID NO：16：
XaaXaaXaaEAXaaDRAZaaAEXaaAARZaaEAZaaZaaRABaaXaaEXaaXaaEKBaaEAAZaaREZaa
在一个实施方案中，与SEQ ID NO：16所需相对应的HIV融合抑制肽在每个氨基酸位置3、10、17、24、31和/或38处具有异亮氨酸或亮氨酸，从而使该肽表现出2、3、4或5个亮氨酸拉链样基序。在另一个实施方案中，在肽的位置21处该肽还具有非亮氨酸拉链样基序亮氨酸或异亮氨酸，优选亮氨酸。本发明的HIV融合抑制肽还包括衍生自与存在于实验室、HIV分化枝或临床分离株中的SEQ ID NO：5(通过序列比对)相对应的HIV gp41的HR2区的肽，只要该HIV融合抑制肽满足SEQ ID NO：16的氨基酸需求。在一个实施方案中，这种HIV融合抑制肽与SEQ ID NO：9-15的任一相比具有1到3个氨基酸替代。在某些实施方案中，该HIV融合抑制肽为15到60个氨基酸残基长。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽还包含N末端基团或C末端基团，或者两者；且该末端基团可以包含但不限于：在N末端的氨基或乙酰基；和在C末端的羧基或氨基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽可以自聚成二聚体或多聚体，例如三聚体，或者例如可被合成、表达成或连接成二聚体或多聚体形态，例如三聚体。
本发明的HIV融合抑制肽还可包括具有美国专利2006/0247416所公开的肽的变体氨基酸序列的肽(其全部内容以参照的方式并入本文)，只要该HIV融合抑制肽满足SEQ ID NO：16的氨基酸需求。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：9-15中的任一相比，这种HIV融合抑制肽具有1到3个氨基酸替代。在某些实施方案中，该HIV融合抑制肽为15到60个氨基酸残基长度。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽还包括N末端基团或C末端基团，或者两者；且该末端基团可以包含但不限于：在N末端的氨基或乙酰基；和在C末端的羧基或氨基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽可自聚成二聚物或多聚物，例如，三聚物，或者例如可被合成、表达成或连接成二聚物或多聚物形态，例如三聚物。
术语“反应官能团”，当被用于本说明书和权利要求的目的时，指能与另一种化学基团或化学部分形成化学键的化学基团或化学部分。关于化学基团，本领域技术人员公知的反应官能团包括这些基团，包括但不限于马来酰亚胺、巯基、羧酸、氢、磷酰基、酰基、羟基、乙酰基、疏水性(基团)、胺、氨基、丹磺酰基、磺基、丁二酰亚胺、硫醇反应(基)、胺反应(基)、羧基反应(基)等。用于本发明时，优选的反应官能团能用于排除优选的反应官能团之外的反应官能团。
术语“接头”，当被用于说明书和权利要求的目的时，指作为分子桥可操作地连接两个不同分子的化合物或部分(例如接头的第一反应官能团与大分子载体的反应官能团共价结合，该接头的第二反应官能团与HIV融合抑制肽的反应官能团共价结合)。该接头可以是氨基酸，如在制备含有本发明的HIV融合抑制肽的一个或多个拷贝的重组融合蛋白质中。可选择地，所述两种不同分子可通过分步方式连接到接头上(例如通过化学耦合)。通常，对接头的大小或组成没有特别的限制，只要其能满足作为分子桥的目的。本领域技术人员公知的接头包括但不限于：化学链、化合物(例如试剂)、氨基酸等。如现有技术公知，该接头可包括但不限于：同型双功能接头、异型双功能接头、生物稳定接头、水解接头和生物降解接头。本领域技术人员公知的异型双功能接头含有一末端和相对末端，该一末端具有特异性连接第一分子的第一反应官能团，该相对末端具有特异性连接第二分子的第二反应官能团。对本领域技术人员来说很明显，可以将多种单功能、双功能、和多功能试剂(如那些在the Pierce Chemical Co.目录中描述的，Rockford，III.)用作本发明中的接头。根据待连接分子、进行连接的条件、以及给药时预期的药代动力学等因素，所述接头在长度和组成上可以不同，从而优化如下属性：生物活性和功能的保持、稳定性、对某些化学物质和/或温度参数的耐受性、体内裂解的易感性、和充分的立体选择性或大小。
术语“大分子载体”，当被用于本说明书和权利要求的目的时，指连接、结合、或融合(例如化学地或通过使用基因表达的重组方式)本发明的一种或多种肽的分子，因而相对于没有该分子的一种或多种肽，该分子引起一种或多种如下属性：对一种或多种肽稳定、增加一种或多种肽的生物活性、或延长一种或多种肽的血浆半衰期(例如，延长一种或多种肽在体内的存留)。这种大分子载体为现有技术公知，包括但不限于：血清蛋白、聚合物、碳水化合物、和脂质-脂肪酸结合物。典型用作大分子载体的血清蛋白包括但不限于：铁传递蛋白、白蛋白(优选人)、免疫球蛋白(优选人IgG或其一种或多种链)、或激素。典型用作大分子载体的聚合物包括但不限于：聚赖氨酸或聚(D-L-丙氨酸)-聚(L-赖氨酸)、或多羟基化合物。优选的多羟基化合物包括水溶性聚(环氧烷)聚合物，且可具有直链或支链。优选的聚合物为支链多羟基化合物(如PEG，具有多(例如3或更多)链，每个链可直接或通过接头连接到HIV融合抑制肽上)；更优选在体内条件下可生物降解的、和/或随时间而被裂解的支链多羟基化合物。适合的多羟基化合物包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、和PEG-PPG共聚物。优选的多羟基化合物包括具有平均分子大小约1,000道尔顿到20,000道尔顿之间的PEG。通常分子量大于20,000道尔顿的其它类型可用大分子载体为公知技术。
术语“化学保护基”或“CPG”，当被用于本说明书和权力要求的目的时，指用于阻断包含胺基的反应官能团与另一种反应官能团的化学反应的化学部分。在肽合成中公知的化学保护基包括但不限于：tBu(叔丁基)、trt(三苯甲基(trity))、OtBu(叔丁氧基)、Boc或t-Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc(9-芴甲氧羰基)、Aoc(叔戊氧基-羰基)、TEOC(β-三甲基乙氧基羰基)、CLIMOC(2-氯-1-茚满基甲氧基羰基)、BIMOC(苯-[f]-茚-3-甲氧基羰基)、PBF(2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-璜酰基)、2-Cl-Z(氯苄基-氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)、Cbz(苄氧基羰基)、Adoc(金刚氧基-羰基)、Mcb(1-甲基环丁氧基羰基)、Bpoc(2-(p-连苯基)丙基-2-氧羰基)、Azoc(2-(p-苯基偶氮苯基)丙基-2-氧羰基)、Ddz(2，2-二甲基-3，5-二甲氧基苄基-氧羰基)、MTf(4-甲氧基-2，3，6-三甲氧苯磺酰基)、PMC(2，2，5，7，8-五甲基色满-6-璜酰基)、Tos(对甲苯璜酰基)、Hmb(2-羟基-4-甲氧基苄基)、Poc(2-苯丙基-2-氧羰基)、Dde(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己基-1-亚基)乙基)、ivDde(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代-环己基-1-亚基)-3-甲基丁基)、苄基、丹磺酰基、对-硝基苄酯等等。用于本发明时，优选的化学保护基可用来排除优选的化学保护基之外的化学保护基。
术语“去保护”，当被用于本说明书和权利要求的目的时，指本领域公知的从含有一个或多个化学保护基的分子中去除一个或多个化学保护基的过程，其中该分子包括氨基酸、肽片断、或者本发明中的HIV融合抑制肽。通常，该去保护过程包括将被一个或多个化学保护基保护的分子与去除该化学保护基的化学试剂反应。例如，被化学保护基保护的N末端α氨基可与碱反应以去除碱敏感化学保护基(例如Fmoc等等)。化学保护基(例如Boc、TEOC、Aoc、Adoc、Bopc、Ddz、Cbz等)通过酸去除。其它化学保护基，尤其是那些衍生自羧酸的化学保护基，可通过酸或碱去除。
术语“第一”、“第二”、“第三”等等在本文中可用于：(a)表明顺序；或(b)区别多个分子或分子的多个反应官能团；或者(c)(a)和(b)的组合。然而，该术语“第一”、“第二”、“第三”等不能解释为对本发明的限制。
术语“肽片断”和“中间体”在本文中意思相同，当涉及到本发明的HIV融合抑制肽且被用作说明书和权利要求书的目的时，指含有不少于约5个氨基酸和不多于约30个氨基酸残基长度的氨基酸序列的肽，且包括HIV融合抑制肽的氨基酸序列的至少一部分(作为邻接氨基酸)。参见实施例4-7和本文的表格4、5、7和8，其示例了用于制备SEQ ID NO：9和10的肽片段。进一步地，尽管在优选实施方案中，合成肽片段(单独地或组合成一组以形成HIV融合抑制肽)使得氨基酸残基之间形成肽键，采用本领域技术人员公知的反应(例如亚胺基、酯、酰肼、偶氮、氨基脲等)可以形成非肽键，这对本领域技术人员是显而易见的。
术语“药代动力学性质”，当被用于本说明书和权利要求的目的时，指在随时间而被系统地利用的药物组合物中活性成分(例如本发明的HIV融合抑制肽)的总量。药代动力学性质可通过测量体内给药后HIV融合抑制肽随时间的总系统浓度来确定。例如，药代动力学性质可表达成曲线下面积(AUC)、生物半衰期、和/或清除率。AUC是系统活性成分浓度随时间的积分测量值，以质量-时间/体积为单位。在给予一定剂量的活性成分后，从给药时到体内没有活性成分时的AUC为个体暴露于活性成分(和/或活性成分代谢产物)的测量值。当本发明的HIV融合抑制肽与不是本发明的HIV融合抑制肽的HIV融合抑制肽相比具有(a)延长(“增加”)的生物(最终消除相)半衰期(“t1/2”)，和(b)生物(全身)清除率(Cl)降低中的一种或多种时，则其具有“改进的”或“增加的”药代动力学性质(参见例如本文实施例2中的表1和2)。在优选的实施方案中，改善的药代动力学可意味着相对于比较肽清除率降低，如通常降低2倍到10倍。在另一优选的实施方案中，改善的药代动力学可以意味着相对于用于比较的肽其生物半衰期增加约10％到约60％。改善的药代动力学也可包括清除率的降低和生物半衰期的增加。用于计算血浆浓度对时间曲线下的面积(AUC)、全身清除率(Cl)、和最终消除相半衰期(t1/2)的公式在本文实施例1中有描述。
术语“溶液中”，作为本领域中的标准术语在涉及溶解了一种或多种固体的水溶液并用于本说明书和权利要求的目的时，指含HIV融合抑制肽的水溶液，该HIV融合抑制肽在本文所详细描述的和本领域已知用于注射用药物配方标准的实际使用浓度和温度条件下溶解于其中。相对于配制悬浮液，本领域中有多种公知的方式来区分配制的溶液，如检查视觉澄清度(溶液透明而悬浮液混浊)、光传递等。“溶解度”通过存在于溶液的水性流体中的HIV融合抑制肽的量(例如重量百分比)来确定，该溶液没有观察到析出溶液的沉淀或含有所述HIV融合抑制肽的水性流体产生胶凝。“稳定性”通过溶液中随时间降解的HIV融合抑制肽的量来确定。
术语“处理”或“治疗”当可交换的用于HIV感染，为了说明书和权利要求的目的时，指HIV融合抑制肽(或者含有该HIV融合抑制肽作为活性药物成分的药物组合物)可用于影响与HIV感染相关的一种或多种过程，或者影响用作指征以作为确定这种处理或治疗(例如“治疗应用”)的治疗效果的一种或多种参数或终点。例如，该HIV融合抑制肽可用于抑制下述一种或多种过程：对目标细胞的HIV传播；HIV与目标细胞的融合(“HIV融合”)；病毒进入(在感染过程中HIV或其遗传物质进入目标细胞的过程)；和合胞体形成(例如HIV感染细胞和目标细胞的融合)。在评价药物在处理和治疗HIV感染的功效时，病毒抑制(通过本领域公知的测定体液或组织中的HIV病毒载量方法确定)是常用的主要终点，血液中循环CD4+细胞数量的增加为常用的次要终点；每个均是抑制HIV向目标细胞传播的可测效果。因而，本发明的HIV融合抑制肽可用于实现治疗应用，包括病毒抑制和/或循环CD4+细胞相对数量增加。
本发明涉及HIV融合抑制肽，该HIV融合抑制肽的氨基酸序列与基本氨基酸序列SEQ ID NO：5相似，不同之处在于，与该基本氨基酸序列相比，该HIV融合抑制肽氨基酸序列具有：(a)在其氨基酸序列中的多个亮氨酸拉链样基序；和(b)除形成亮氨酸拉链样基序所需的亮氨酸外的至少一个额外的亮氨酸(即除在亮氨酸拉链样基序的位置1或8处外)；其中该HIV融合抑制肽表现出一种或多种生物性质的改进。更具体地，本发明涉及以SEQ IDNO：9、10、14和15示例的肽的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：9、10、14和15中的任一相比具有一至三个氨基酸差异的HIV融合抑制肽；它们作为HIV融合抑制肽和在药物组合物中的用途；和肽片断以及获得上述HIV融合抑制肽的合成方法。在本发明的另一个实施方案中，本发明还涉及HIV融合抑制肽，该HIV融合抑制肽的氨基酸序列与基本氨基酸序列SEQ ID NO：5相似，不同之处在于与该基本氨基酸序列相比，该HIV融合抑制肽氨基酸序列在其氨基酸序列中具有多于两个的亮氨酸拉链样基序；其中该HIV融合抑制肽表现出一种或多种生物性质的改进。更具体地，本发明涉及以SEQ ID NO：11-13示例的肽的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：11-13中任一相比含有一至三个氨基酸差异的HIV融合抑制肽；它们作为HIV融合抑制肽和在药物组合物中的用途；和肽片断以及获得上述HIV融合抑制肽的合成方法。
实施例1
在下述实施例中，评价了各种生物物理参数和生物学参数。确定这些参数的一般方法如下所述。
肽，包括本发明的HIV融合抑制肽和基本序列，在肽合成仪上用标准固相合成技术和用标准FMOC肽化学法，或本文实施例4所详细描述的固相合成与液相合成的组合来合成。在该实施例中，该HIV融合抑制肽可进一步包含反应官能团，即大多数在N末端用乙酰基和/或在C末端用氨基阻断。从树脂上裂解后，将该肽沉淀并冻干该沉淀物。然后用反相高效液相层析纯化该肽；该肽的身份通过电喷雾质谱确认。
生物物理参数的评价包括测量螺旋度和热稳定性。螺旋度通过如下的圆二色谱(“CD”)评价。简要地，CD光谱采用装有热电温度控制器的光谱仪获得。该光谱在25℃下获得，从200nm到260nm，步长为0.5纳米(nm)，带宽1.5nm，且典型的平均时间为4秒/步长。在减去细胞/缓冲空白后，用具有保守窗口尺寸(conservative window size)的三次最小平方多项式拟合给出随机残差来平滑光谱。原始椭圆度值用标准方法转化为平均残基椭圆率，并以波长(从200到260nm)对[θ]×10-3(度数cm2/dmol)作图。然后用标准方法计算百分比螺旋度值(通常表示为在10μM、25℃下的百分比螺旋度)。热稳定性的评价通过监测当温度以2℃步长上升，平衡时间为1分钟时CD信号在222nm的改变来进行。以Tm值表示的每个样本(例如HIV融合抑制肽)的稳定性，为对应于热相变一阶导数最大值的温度。
生物学性质的评价包括测量抗HIV-1毒株的抗病毒活性。在确定本发明的HIV融合抑制肽的抗病毒活性(如，一种测量是抑制HIV向目标细胞传播的能力)中，使用已经表明可通过衍生自HIV gp41的HR区的肽所产生的数据来预测体内观察到的抗病毒活性的体外试验。更具体地，已经表明用体外感染试验(“Magi-CCR5感染试验”，参见美国专利6,258,782号)观察的抗病毒活性与相同HIV gp41衍生肽在体内的抗病毒活性合理相关(参见Kilby等，1998，Nature Med.4：1302-1307)。这些试验使用表达衍生的cMAGI的指示细胞系MAGI或CCR5对感染病毒滴度的减少评分。两种细胞系都具有HIV-1tat的反式激活所述HIV-LTR驱动的β-半乳糖苷酶报告基因的表达的能力。该β-gal报告子已被修饰而定位在细胞核内且能够在感染几天内用X-gal底物进行强核染色而检测。因而，如果在染色之前仅有一轮感染，则染色的核数可认为与用于感染的接种体中的感染病毒粒子数相等。感染细胞用CCD-成像仪计数，初始和实验室适应后的分离株均显示出病毒输入与成像仪显示的感染细胞数量的线性关系。在MAGI和cMAGI试验中，感染滴度50％减少(Vn/Vo＝0.5)是显著的，且提供了评估抗病毒活性初始临界值(“IC50”定义为导致感染病毒滴度减少50％的活性成分的浓度)。将测试抗病毒活性的肽稀释成不同的浓度，一式两份或一式三份地测试其对抗在48孔微量滴定板上调节成约1500-2000感染细胞/孔的HIV接种体。将该肽(在各自的浓度下)加入到cMAGI或MAGI细胞中，随后进行病毒接种，24小时后，加入感染和细胞-细胞融合抑制剂(例如T20(SEQ ID NO：2；恩夫韦地))，以防止第二轮HIV感染和细胞-细胞病毒传播。将该细胞再培养2天，然后固定并用X-gal底物染色以测量HIV感染细胞。每个对照组以及肽稀释液中感染细胞的数量用CCD-成像仪确定，然后计算IC50(以μg/ml表达)。
对基本序列组成的肽的抗病毒活性有耐受力的病毒可用标准实验方法制备。基本上，在计算IC50和IC90后，将细胞与病毒和所述肽(例如以接近IC90的浓度)在培养基中混合(包括将细胞在此后分开)。保持和监控培养直至合胞体产生。从第一轮培养中收获的病毒用于在第二轮培养中感染细胞，且肽浓度比第一轮培养中所用的肽浓度更高(2到4倍)。保持和监控第二轮培养以得到对所述肽的抗病毒活性有耐受力的病毒。还可需要随后轮次的培养以最终产生对所述肽的抗病毒活性有耐受力的病毒分离株(以所述肽抗这种分离株的预定IC50水平)。
为确定药代动力学性质，对食蟹猴(Macacafasicularis)静脉给予HIV融合抑制肽或衍生HIV融合抑制肽的基本序列(如本领域公知，其它动物模型也可用于确定药代动力学性质)。在给药后的不同时间点，抽取血液样品并通过离心分离血浆。将血浆样品冻存直至在电喷雾、阳离子模式中进行LC-MS分析(液相色谱/质谱)。用pH6.8，10mM醋酸铵缓冲液中的乙腈梯度液将HIV融合抑制肽或基本序列从C18或C8HPLC柱中洗脱。分析时，血浆样品用两体积或三体积的含0.5％甲酸的乙腈去蛋白。与样品同时准备两个食蟹猴血浆样品标样并在含HIV融合抑制肽或基本序列样品之前和之后进行分析。药代动力学性质用单指数或双指数数学模型从血浆浓度-时间数据计算得到。模型用非线性最小平方优化导出。1/C2浓度权重被使用。下述方程式用于计算血浆浓度对时间曲线下的面积(AUC)、全身清除率(Cl)和最终消除半衰期(t1/2)。
AUC＝A/-a+B/-b
其中A和B为截距，a和b分别是描述传播阶段和消除阶段指数方程的速度常数。当用单指数模型时，“A”和“a”性质被消除。
Cl＝剂量/AUC(以L/K/hr表示)
t1/2＝-0.6903/b(以hr表示)
实施例2
为了说明本发明的目的，所述基本序列具有如下氨基酸序列：(SEQ IDNO：5)
TTWEAWDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL
在一个实施方案中，与衍生该HIV融合抑制肽的基本序列相比，本发明的HIV融合抑制肽含有多于2个的亮氨酸拉链样基序。这种HIV融合抑制肽的例子包括但不限于：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；或者与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13任一相比具有一至三个氨基酸差异(至少92％的一致性)的氨基酸序列；每个HIV融合抑制肽具有3到5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列。下述图示(I)显示了本发明的HIV融合抑制肽的氨基酸序列，其具有氨基酸差异(与基本序列相比较)，该差异在基本序列氨基酸位置的下方(用“|”对齐)用单字母氨基酸代码(“L”代表亮氨酸，“I”代表异亮氨酸)表示，且具有亮氨酸拉链样基序相关的异亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉链样基序的位置1或8处，或者在亮氨酸拉链样基序的位置8和相邻的亮氨酸拉链样基序的位置1处)，如下划线所示。亮氨酸拉链的位置1或8处还可作为序列中另一亮氨酸拉链样基序的相对末端位置，即作为一基序的位置8和另一相邻基序的位置1。
在另一个实施方案中，与衍生该HIV融合抑制肽的基本序列相比，本发明的HIV融合抑制肽含有多于一个的亮氨酸拉链样基序，和与形成亮氨酸拉链样基序不相关的额外的亮氨酸。这些HIV融合抑制肽的例子包括但不限于：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、和SEQ ID NO：15；或者与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、和SEQ ID NO：15任一相比具有一至三个氨基酸差异(至少92％的一致性)的氨基酸序列；每个HIV融合抑制肽不同于SEQ ID NO：5的基本序列，因为其含有多于一个的亮氨酸拉链样基序和与亮氨酸拉链样基序形成不相关的额外的亮氨酸(即在亮氨酸拉链样基序的位置1或8处之外)。在一个优选的实施方案中，非亮氨酸拉链样基序亮氨酸替代取代了SEQ ID NO：5基本序列氨基酸21位置处的异亮氨酸。下述图示(II)显示了本发明的HIV融合抑制肽的氨基酸序列，其具有氨基酸差异(与基本序列相比较)，该差异在其基本序列氨基酸位置的下方(用“|”对齐)用单字母氨基酸代码(“L”代表亮氨酸，“I”代表异亮氨酸)表示，且具有亮氨酸拉链样基序相关的异亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉链样基序的位置1或8处，或者在亮氨酸拉链样基序的位置8和相邻的亮氨酸拉链样基序的位置1处)，如下划线所示。斜体指与亮氨酸拉链样基序不相关的亮氨酸。
图示(III)显示了“基本序列”SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9-15的全序列。SEQ ID NO：9-15中的每一个相对于SEQ ID NO：5碱基序列的氨基酸替代加下划线且加粗。
(III)
SEQ ID NO:5
T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L I R A A Q E Q Q E K N E A A L R E L
SEQ ID NO：9
T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L L R A L Q E Q Q E K N E A A L R E L
SEQ ID NO：10
T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L L R A A Q E Q Q E K L E A A L R E L
SEQ ID NO：11
T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L I R A L Q E Q Q E K L E A A L R E L
SEQ ID NO：12
T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L I R A I Q E Q Q E K L E A A L R E L
SEQ ID NO：13
T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L I R A L Q E Q Q E K I E A A L R E L
SEQ ID NO：14
T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L L R A I Q E Q Q E K N E A A L R E L
SEQ ID NO：15
T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L L R A A Q E Q Q E K I E A A L R E L
参见表1，将本发明中的HIV融合抑制肽与具有相同基本序列，但氨基酸序列不同(与SEQ ID NO：9-15相比较)且具有抗HIV活性的合成肽相比较。该比较包括用本文实施例1中描述的方法确定的生物物理参数和生物活性参数。在通过抗病毒活性评估来确定生物活性时，使用对一些对已知抑制HIV介导的融合的肽的抗病毒活性有耐受力的病毒分离株(有耐受力的病毒分离株在表格1中称为“Res”)。
表1：生物物理和生物学(抗病毒活性)参数
| SEQ ID NO： | 螺旋度(％) | Tm(℃) | 抗病毒活性(μg/ml)HIV-IIIBIC50 | 抗病毒活性(μg/ml)HIV-ResIC50 |
| 5 | 71 | 42 | <0.10 | <0.10 |
| 6 | 97 | 65 | <0.10 | ≥0.10 |
| 7 | 84 | 75 | <0.10 | >0.10 |
| 8 | 99 | 46 | <0.10 | 未检 |
| 9 | 61 | 62 | <0.10 | <0.10 |
| 10 | 77 | 75 | <0.10 | <0.10 |
SEQ ID NO：6在位置24处有单一替代而与SEQ ID NO：5不同。SEQ IDNO：7在位置31处有单一替代而与SEQ ID NO：5不同。这些替代导致半衰期的提高(参见下表2)。SEQ ID NO：6与本发明具有SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽相似，不同之处在于该SEQ ID NO：9的氨基酸序列在氨基酸位置21处还具有一个氨基酸差异，即亮氨酸(而SEQ ID NO：6在氨基酸位置21处为异亮氨酸)。参见表1，与SEQ ID NO：6相比，SEQ ID NO：9中亮氨酸替代异亮氨酸导致螺旋度的降低(从97％到61％)，但保持了抗病毒活性，包括良好的耐药性(对抗耐药性病毒分离株“Res”的活性)。相似地，SEQID NO：7是与本发明具有SEQ ID NO：10的HIV融合抑制肽相似的氨基酸序列，不同之处在于SEQ ID NO：10的氨基酸序列在氨基酸位置21处还具有一个氨基酸差异，即亮氨酸(而SEQ ID NO：7在氨基酸位置21处为异亮氨酸)。参见表1，与SEQ ID NO：7相比，SEQ ID NO：10中亮氨酸替代异亮氨酸导致螺旋度的降低(从84％到77％)，但保持了抗病毒活性，包括良好的耐药性(对抗耐药性病毒分离株“Res”的活性)。因而，表1表明了SEQ IDNO：9和10相对于SEQ ID NO：6-7具有改善的属性。
本实施方案阐述了与基本氨基酸序列相比本发明的HIV融合抑制肽的药代动力学性质。所用的评价药代动力学性质的方法如实施例1所详细表述，表2显示了SEQ ID NO：5-10肽的药代动力学性质。
表2
| SEQ ID NO： | 清除率(L/Kg/hr) | 半衰期(t1/2；hr) |
| 5 | >0.04 | 6 |
| 6 | <0.02 | 15 |
| 7 | <0.02 | 17 |
| 8 | >0.04 | 7 |
| 9 | <0.02 | 12 |
| 10 | <0.02 | 21 |
如表2所示，每个SEQ ID NO：6、7、9和10显示出增加的生物半衰期(“t1/2”)。SEQ ID NO：8，其在氨基酸位置21处含有亮氨酸，但在氨基酸位置24或31处不含亮氨酸，没有显示出如SEQ ID NOS：6、7、9和10的肽所显示出的半衰期的显著增加。
为了将HIV融合抑制肽配制到药学上可接受的载体中而制备药物组合物，在水性溶液中的稳定性是重要的参数，尤其是在该药物组合物是通过肠胃外给药时。需要注意的是本发明的HIV融合抑制肽在生理pH下在水性溶液中显示出稳定性提高。例如，分别测定具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5的合成肽，和具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽的溶解性，测定方法如下：向磷酸盐缓冲液(PBS)中加入浓度为10mg/ml的肽，并在约pH7.3到pH7.5，37℃下在一周期间(168小时)内的不同的时间点测量保留在溶液中的肽的含量。含有SEQ ID NO：2的溶液在仅仅几小时后就变得不稳定了(在溶液中测到少量的肽)。相反，在一周时在溶液中仍可检测到大于等于90％的具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽，在一周时在溶液中仍可检测到少于80％的具有氨基酸序列SEQ IDNO：5的肽。
实施例3
已将本发明的HIV融合抑制肽的生物学性质与其它公知的、有效的抗病毒剂，包括SEQ ID NO：2(恩夫韦地)进行了比较。具体地，体外抗性比较研究在新的SEQ ID NO：9目标化合物与确定的抗病毒剂SEQ ID NO：2之间进行，详细描述如下：MT2细胞用病毒分离株(IIIB、030、060和098)感染，并在渐增浓度的SEQ ID NO：2(恩夫韦地)或SEQ ID NO：9中培养以进行抗性选择。初始肽浓度大约为每种肽对抗相应的野生型分离株的IC50的2倍。每1-3天加入新鲜肽以维持肽的浓度。用标准技术监测培养基中的细胞病理效应(CPE)，且当获得最大CPE时，将小份的病毒用于下一轮感染。当与野生型病毒的生长速率相比时肽的浓度根据培养时间的长度增加了2到4倍。在选择过程中，也收集不含肽的病毒储备物。该不含肽的病毒储备物通过双脱氧测序化学法对gp41基因型改变进行表征，并用cMAGI感染测定确定表型易感性。
用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9进行体外选择的比较结果如表3所示。这些数据表明在培养基中的SEQ ID NO：9选择平均比SEQ ID NO：2选择长3倍，因而具有较低倍数的IC50改变(与SEQ ID NO：9的24倍相比，SEQ ID NO：2为42倍)。SEQ ID NO：9选择(几何均数3.6)比SEQ ID NO：2(几何均数1.7)需要更多的突变以获得上述较低倍数的改变。在培养基中的天数更久、倍数变化更小且需要更多数量的突变来实现更低倍数的改变，所有这些均显示与SEQ ID NO：2相比SEQ ID NO：9对体外形成抗性具有更大的阻碍。也就是说，HIV对SEQ ID NO：9比对SEQ ID NO：2需要花更长的时间才能形成抗性。基于之前对其它肽，例如SEQ ID NO：2和T1249进行的HIV抗性形成研究，可以预期此处所示的体外结果应该与体内结果合理相关。(例如参见Melby等，2006，AIDS Research and Human Retroviruses22(5)：375-385；Greenberg&Cammack，2004，J.Antimicrobial Chemotherapy54：333-340；Sista等，2004，AIDS18：1787-1794)。
表3：SEQ ID NO：2(恩夫韦地)和SEQ ID NO：9的体外选择比较
| 起始病毒分离株 | 肽(SEQ IDNO) | 培养天数 | 初始IC50(ng/mL) | 结束IC50(ng/mL) | IC50的倍数改变 | 所需的突变# |
| IIIB | 2 | 62 | 6 | 163 | 27 | 2 |
| 584.000030 | 2 | 46 | 42 | 798 | 19 | 2 |
| 584.000060 | 2 | 46 | 10 | 68 | 7 | 2 |
| 584.000098 | 2 | 45 | 50 | 45575 | 912 | 1 |
| 几何均数 | 2 | 49 | 19 | 797 | 42 | 1.7 |
| 起始病毒分离株 | 肽(SEQ IDNO) | 培养天数 | 初始IC50(ng/mL) | 结束IC50(ng/mL) | IC50的倍数改变 | 所需的突变# |
| IIIB | 9 | 168 | 12 | 2768 | 231 | 4 |
| 584.000030 | 9 | 77 | 28 | 113 | 4 | 2 |
| 584.000060 | 9 | 173 | 8 | 208 | 26 | 4 |
| 584.000098 | 9 | 173 | 37 | 521 | 14 | 5 |
| 几何均数 | 9 | 140 | 18 | 429 | 24 | 3.6 |
实施例4
通常，本发明的HIV融合抑制肽可以通过两种方法中的任意一种合成。第一种方法是用标准固相合成技术和标准Fmoc肽化学或其它标准肽化学(用CPGs)线性合成。更优选的合成本发明的HIV融合抑制肽的方法为通过片断缩合方法。简要地，合成2个或多个片段，每个片断含有待制备的HIV融合抑制肽的完整氨基酸序列的各个部分。如果需要，在片断合成时，可以插入其游离胺(例如侧链胺)被化学保护剂化学地保护的氨基酸。然后装配这些片断(以一定的方式和顺序共价连接)从而制备得到该HIV融合抑制肽(具有正确的氨基酸序列)。
关于肽合成，可以用本领域技术人员公知的肽序列合成技术各自制备各个肽片段本身，和组合一组本发明的肽片段而制备的本发明的HIV融合抑制肽。例如，在优选的方法中，肽片段可在固相中合成，然后在液相中组合，经过组装过程从而制备得到最终的HIV融合抑制肽。在另一方法中，可以使用液相合成法来制备肽片段，然后在固相中组合，经过组装过程从而制备得到HIV融合抑制肽。在另一方法中，每个肽片段可用固相合成法合成，然后在固相中组合，经过组装过程从而制备得到完整氨基酸序列的HIV融合抑制肽。在优选实施方案中，每个肽片段用本领域技术人员公知的固相合成法合成。在优选实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽使用本发明的一组肽片段通过使用组装过程来制备，该组装过程组合了固相和液相技术。例如，一组肽片段包括2到4个肽片段，其被合成，然后装配以完成本发明的HIV融合抑制肽的合成。基于本说明书的教导，这种片断装配的方法可以用于而且已经用于具有SEQ ID NO：9-16中任一氨基酸序列的一些HIV融合抑制肽对本领域技术人员来说是显而易见的。
为描述通过片断缩合方法制备本发明的HIV融合抑制肽，在合成具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽的方法中，将一组肽片断中的肽片断在装配该肽片断过程中共价结合。本发明中的肽片断可包括但不限于：具有下表4中描述的氨基酸序列的片断。优选的肽片断可用于本发明中以排除优选肽片断之外的肽片断。还显示了每个肽片断在SEQ ID NO：9中相应的氨基酸；因而，这表明每个肽片断是由SEQ ID NO：9氨基酸序列的多个相邻氨基酸组成。
表4
| SEQID NO： | 氨基酸序列 | SEQIDNO:9中的氨基酸位置 |
| 17 | TTWEAWDRAIAE | 1-12 |
| 18 | YAARIEALLRALQE | 13-26 |
| 19 | QQEKNEAALRE | 27-37 |
| 20 | QQEKNEAALREL | 27-38 |
| 21 | TTWEAWDRAIA | 1-11 |
| 22 | EYAARIEALLRALQE | 12-26 |
| 23 | TTWEAWDRAI | 1-10 |
| 24 | AEYAARIEALLRALQE | 11-26 |
| 25 | TTWEAWDRA | 1-9 |
| 26 | IAEYAARIEALLRALQE | 10-26 |
| 27 | TTWEAWDR | 1-8 |
| 28 | AIAEYAARIEALLRALQE | 9-26 |
| 29 | TTWEAWDRAIAEYAARIEAL | 1-20 |
| 30 | LRALQEQQEKNEAALRE | 21-37 |
| 31 | LRALQEQQEKNEAALREL | 21-38 |
| 32 | TTWEAWDRAIAEYAARIE | 1-18 |
| 33 | ALLRALQEQQEKNEAALRE | 19-37 |
| 34 | ALLAALQEQQEKNEAALREL | 19-38 |
| 35 | YAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL | 13-38 |
| 36 | EYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL | 12-38 |
| 37 | AEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL | 11-38 |
| 38 | IAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL | 10-38 |
| 39 | AIAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL | 9-38 |
| 40 | TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE | 1-26 |
本发明还包括在合成具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽的方法中用作中间体的具体肽片段组。本发明的该肽片断组包括组1-16，如表5中所示(对组的编号仅为了描述方便)。优选的肽片断组可用于本发明中以排除优选肽片断组之外的肽片断组。
表5
| 组号 | 肽片断 | SEQIDNO：9中的氨基酸位置 |
| 1 | TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)YAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：18)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19) | 1-1213-2627-37 |
| 2 | TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)YAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：18)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20) | 1-1213-2627-38 |
| 3 | TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)LRALQEQQEKNEAALRE(SEQ ID NO：30) | 1-2021-37 |
| 4 | TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)LRALQEQQEKNEAALREL(SEQ ID NO：31) | 1-2021-38 |
| 5 | TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)EYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：22)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19) | 1-1112-2627-37 |
| 6 | TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：24)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19) | 1-1011-2627-37 |
| 7 | TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)IAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：26)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19) | 1-910-2627-37 |
| 8 | TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)AIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：28)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19) | 1-89-2627-37 |
| 9 | TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)EYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：22)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20) | 1-1112-2627-38 |
| 10 | TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：24)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20) | 1-1011-2527-38 |
| 11 | TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)IAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：26)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20) | 1-910-2627-38 |
| 12 | TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)AIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：28)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20) | 1-89-2627-38 |
| 13 | TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)ALLRALQEQQEKNEAALRE(SEQ ID NO：33) | 1-1819-37 |
| 14 | TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)ALLRALQEQQEKNEAALREL(SEQ ID NO：34) | 1-1819-38 |
| 15 | TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：40)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19) | 1-2627-37 |
| 16 | TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：40)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20) | 1-2627-38 |
因而，本发明的一个实施方案涉及可用于合成具有氨基酸序列SEQ IDNO：9的HIV融合抑制肽的方法、肽片断、和肽片断组。通过本文的描述，很清楚这些方法、肽片断、和肽片断组可用于合成具有氨基酸序列SEQ IDNO：9的HIV融合抑制肽，其中该HIV融合抑制肽含有一个或多个化学基团：
其中一个或多个氨基末端、羧基末端、或者侧链自由反应基团(例如内部赖氨酸的ε胺)被化学基团(B、U、Z；其中B、U和Z可以是相同的化学基团或不同的化学基团)修饰，该化学基团可以包括但不限于：一个或多个反应官能团、化学保护基(CPG)和接头。用于向肽片断N末端、或肽片断C末端、在内部氨基酸的游离胺处或其组合引入化学基团的技术为本领域公知的。涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽的制备的保护肽片断的说明性例子(具有一个或多个化学基团的肽片断)包括但不限于列于表6中的肽片断。
表6
| SEQID NO： | 氨基酸序列 | SEQIDNO:9中的氨基酸位置 |
| 17 | Ac-TTWEAWDRAIAE | 1-12 |
| 18 | CPG-YAARIEALLRALQE | 13-26 |
| 19 | CPG-QQEKNEAALRE | 27-37 |
| 19 | CPG-QQEKNEAALRE|U | 27-37 |
| 20 | QQEKNEAALREL-NH2 | 27-38 |
| 29 | Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIEAL | 1-20 |
| 30 | CPG-LRALQEQQEKNEAALRE | 21-37 |
| 31 | LRALQEQQEKNEAALREL-NH2 | 21-38 |
| 21 | Ac-TTWEAWDRAIA | 1-11 |
| 22 | CPG-EYAARIEALLRALQE | 12-26 |
| 23 | Ac-TTWEAWDRAI | 1-10 |
| 24 | CPG-AEYAARIEALLRALQE | 11-26 |
| 25 | Ac-TTWEAWDRA | 1-9 |
| 26 | CPG-IAEYAARIEALLRALQE | 10-26 |
| 27 | Ac-TTWEAWDR | 1-8 |
| 28 | CPG-AIAEYAARIEALLRALQE | 9-26 |
| 32 | Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIE | 1-18 |
| 33 | CPG-ALLRALQEQQEKNEAALRE | 19-37 |
| 34 | ALLRALQEQQEKNEAALREL-NH2 | 19-38 |
Ac-乙酰基、NH2-酰胺基(也可以是本文“定义”部分详细描述的其它化学基团)；CPG为化学保护基团(例如Fmoc或其它N端化学保护基，如在本文“定义”部分详细描述)；U为如上定义。
实施例5
参照表5(组1或组2)和图3，说明了合成具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽的方法，该方法使用3种特定的肽片断(例如SEQ ID NO：17-19+Leu；或SEQ ID NO：17、18和20)，并采用包括组合该3种肽片断的肽缩合方法，从而制备该HIV融合抑制肽。这些肽片断的每一种具有的物理性质和溶解性质使之成为合成高产率和高纯度的具有氨基酸序列SEQID NO：9的HIV融合抑制肽的优选肽片断(相对于两片断方法)，并且还只需要一种加载树脂作为起始原料(简化了合成方法)。具有氨基酸序列SEQID NO：17，并包含SEQ ID NO：9的前12个氨基酸的肽片断(参见图3，“AA(1-12)”)通过标准固相合成方法合成(用超酸敏感树脂；例如4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基-丁酸树脂、或者2-氯三苯甲基氯树脂-“CTC”，图3)，其中N末端被乙酰化(“Ac”，一种化学基团)，而在C末端有羟基(-OH)(参见图3，“Ac-AA(1-12)-OH”)。具有氨基酸序列SEQ ID NO：18，并包含SEQ ID NO：9的第13-26个氨基酸(参见图3，“AA(13-26)”)的肽片断通过标准固相合成方法合成，其在N末端有Fmoc(作为化学保护基团)，在C末端有-OH(参见图3，“Fmoc-AA(13-26)-OH”)。具有氨基酸序列SEQ ID NO：19，并包含SEQID NO：9的第27-37个氨基酸(参见图3，“AA(27-37)”)的肽片断通过标准固相合成方法合成，其在N末端有Fmoc(作为化学保护基团)，在C末端有-OH(参见图3，“Fmoc-AA(27-37)-OH”)。每种肽片断通过本领域技术人员熟知的裂解试剂、溶剂和技术从用于其固相合成的树脂上裂解。然后每种肽片段通过蒸馏除去大部分上述溶剂并在加入或不加含乙醇的助溶剂下加入水析出该肽片断而分离。所得的固体通过过滤分离、洗涤、在水或乙醇/水中再浆化、再过滤，并在真空电炉中干燥。
如图3所示，通过液相合成法制备肽片断，其中具有氨基酸序列SEQ IDNO：19的肽片断(参见图3，“Fmoc-AA(27-37)-OH”)化学偶联到Leu，SEQ IDNO：9的氨基酸38上，该Leu已在液相中酰胺化，从而得到具有氨基酸序列SEQ ID NO：20的肽片断(包含SEQ ID NO：9的氨基酸27-38)，其中C末端被酰胺化(作为化学基团)(参见图3，“Fmoc-AA(27-38)-NH2”)。在优选的合成方法中，本发明的酰胺化的肽片断，包括但不限于肽片断H-AA(27-38)-NH2，可用酰胺树脂直接合成。简述上述液相反应，在DIEA(二异丙基乙胺)和亮氨酰胺(例如偶合试剂和外消旋抑制剂的组合)存在下，分离的肽片断Fmoc-AA(27-37)-OH的羧基末端分别用HBTU(O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐)、或TBTU(O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐)和HOBT、6-Cl HOBT、或HOAT转化为HOBT(1-羟基苯并三唑水合物)6-Cl HOBt、或HOAT(1-羟基-7-氮杂苯并三唑)的活性酯。该反应在0到30℃在极性、非质子溶剂，如DMF(二甲基甲酰胺)或NMP(N-甲基吡咯烷酮)中进行。偶联反应完成后，在有或没有额外的助溶剂下向反应中加入哌啶、碳酸钾、DBU或其它本领域公知的碱以实现末端Fmoc保护基的去除。该反应完成后，加入醇或水溶性溶剂和/或水析出C末端酰胺化的具有氨基酸序列SEQ ID NO：20的肽片断(H-AA(27-38)-NH2)。
如在图3所示，为了在液相方法中用肽片断Fmoc-AA(27-37)-OH与亮氨酰胺(参见图3，“H-Leu-NH2-”)组合制备肽片断H-AA(27-38)-NH2时，将肽片断Fmoc-AA(27-37)-OH(571g，205mmol，1当量)、H-Leu-NH2(32.0g，246mmol，1.2当量)、和6-Cl HOBT(41.7g，246mmol，1.2当量)加入到DMF中(4568ml，8体积)，用DIEA(53.6ml，307.5mmol，1.5当量)处理并在室温下搅拌直至溶解(约20分钟)。冷却该溶液并加入TBTU(79.0g，246mmol，1.2当量)。0℃下搅拌反应物，然后在25℃下搅拌。当HPLC分析显示该反应结束时，加入哌啶(81ml，820mmol，4当量)以除去肽片断Fmoc-AA(27-38)-NH2的Fmoc保护基(其它碱如碳酸钾、DBU等也可使用)。反应在30℃下搅拌直到HPLC显示结束。然后将反应混合物冷却至5℃以下，并缓慢加入预冷却水(8体积，4568mL)保持所得的料浆的温度低于10℃。搅拌该悬浮液30分钟，然后过滤并用25％的乙醇/水洗涤两次(2284mL，每次4体积)。残留的哌啶和哌啶二苄基富烯通过在乙醇/水(有或没有稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它类似的溶剂混合物中再浆化去除。如图3显示，最终制备出分离肽片断H-AA(27-38)-NH2。
如图3显示，随后进行液相反应，其中将肽片断H-AA(27-38)-NH2(SEQID NO：20)与肽片断Fmoc-AA(13-26)-OH(SEQ ID NO：18)组合，并去保护，从而得到肽片断H-AA(13-38)-NH2(在每个N末端和C末端均有化学基团的SEQ ID NO：35)。
将肽片断Fmoc-AA(13-26)-OH(460g，167mmol，1当量)、肽片断H-AA(27-38)-NH2(460g，172mmol，1.03当量)和6-Cl HOBT(34g，200mmol，1.2当量)加入到DMF(6900ml，15体积)中，用DIEA(47mL，267mmol，1.6当量)处理，并搅拌溶解所有固体。所得溶液冷却至5℃下。向反应中加入TBTU(64g，200mmol，1.2当量)，在0℃，然后在25℃下搅拌该反应。一旦HPLC分析显示反应完成，加入哌啶(58ml，668mmol，4当量)以除去Fmoc，然后搅拌该反应直到HPLC显示完成。该溶液冷却至5℃下并以温度不超过10℃的速度缓慢加入水(6900mL，15体积)。搅拌所得的悬浮液30分钟后，固体通过过滤收集、用水洗涤(两次，2300mL，每次5体积)并干燥。残留的哌啶和哌啶二苄基富烯通过在乙醇/水(有或没有稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它类似的溶剂混合物中再浆化去除。所述固体通过过滤收集、洗涤、并干燥，从而得到H-AA(13-38)-NH2(SEQ ID NO：35)，用高效液相色谱(HPLC)纯度分析测定为基本纯的白色固体。
如图3显示，随后肽片断H-AA(13-38)-NH2(SEQ ID NO：35)在液相反应中与肽片断Ac-(1-12)-OH(SEQ ID NO：17)装配，从而得到具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽(例如参见图3，Ac-(1-38)-NH2)。将肽片断Ac-AA(1-12)-OH(130g，58.5mmol，1当量)磨成细粉并与肽片断H-AA(13-38)-NH2(303g，58.5mmol，1当量)混合。将该混合物缓慢加入到2：1DCM/DMF(20体积，2600mL)和DIEA(25.5mL，146mmol，2.5当量)的热溶液中。加入HOAT(15.9g，117mmol，2.0当量)并且搅拌该混合物以溶解所有固体。将所得溶液冷却至5℃以下并加入TBTU(28.2g，87.8mmol，1.5当量)。该溶液在0℃，然后在25℃下搅拌30分钟，直到HPLC显示反应结束。加热该溶液至30-35℃并加入额外的DCM(13体积，1740mL)，接着加入水(1820mL，14体积)。搅拌该混合物5分钟后进行分层。去除水层并用新鲜H2O(1820mL，14体积)替换。该分离共重复5次。将有机层蒸馏至约1/3初始体积并加入异丙醇(IPA；1820mL，14体积)。继续蒸馏除去残留的DCM。将所得的浆料冷却至5℃下并缓慢加入水(1820mL，14体积)。形成的固体通过过滤收集，用H2O洗涤两次(520ml，每次4体积)并干燥，从而得到分离的HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2(SEQ ID NO：9)的制品，纯度用HPLC分析测定。
如图3所示，HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2的侧链化学保护基可通过酸解或其它本领域技术人员公知的通过去除侧链化学保护基来去除肽保护的方法去除。在本实施例中，HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2(60g，8.1mmol)用TFA(三氟醋酸)：DTT(二硫苏糖醇)：水(90：10：5；570ml)处理并在室温下搅拌6小时。将该溶液冷却至10℃以下，并以温度保持在10℃以下的速度缓慢加入预冷却的MTBE(25体积，1500ml)。所得的固体通过过滤收集，用MTBE洗涤，并干燥。然后将所得粉末在乙腈(ACN；10体积，600mL)中浆化并用DIEA和醋酸调节pH值到4至5以脱除该肽的羧基。一旦通过HPLC确定完成，固体通过过滤收集，用ACN洗涤，并干燥，从而得到去保护和去羧基肽的制品，其然后通过HPLC或其它适合的层析技术提纯，得到具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的分离的HIV融合抑制肽制品。
实施例6
对于表5(组3和组4)以及图4，说明了合成具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽的方法，该方法使用2个特定的肽片断(例如SEQ ID NO：29和30+Leu；或SEQ ID NO：29和31)，并采用包括组合2个肽片断并使它们化学耦合(“装配”)的片断装配方法，从而制备出具有氨基酸序列SEQ IDNO：9的HIV融合抑制肽。这些肽片断中的每一个具有的物理性质和溶解性质使之成为用2个肽片断来高产率和高纯度地合成具有氨基酸序列SEQID NO：9的HIV融合抑制肽的优选肽片断。在选择用于两肽装配方法的肽片断时，发现在待装配到一起的两肽之间的结合点处(如具有氨基酸序列SEQ ID NO：29的肽片段的C末端氨基酸，和具有氨基酸序列SEQ ID NO：31的肽片段的N末端氨基酸)具有亮氨酸和/或谷氨酸残基有利于获得高产量和高纯度的装配。
具有氨基酸序列SEQ ID NO：29，并含有SEQ ID NO：9前20个氨基酸(“AA(1-20)”)的肽片断通过标准固相合成法制备，其N末端被乙酰化(“Ac”，作为化学基团)，而在C末端具有羟基(-OH)(参见表6，也称为“Ac-AA(1-20)-OH”)。具有氨基酸序列SEQ ID NO：30，并包含SEQ ID NO：9第21-37个氨基酸(“AA(21-37)”)的肽片断通过标准固相合成法合成，其在N末端有Fmoc(作为化学保护基)，在C末端有-OH(参见表6；也称为“Fmoc-AA(21-37)-OH”)。
如表5、组3和组4、和图4所示，通过液相合成法制备肽片断，其中肽片断Fmoc-AA(21-37)-OH化学偶联到Leu，SEQ ID NO：9的氨基酸38上，该Leu已在液相中酰胺化，从而得到具有氨基酸序列SEQ ID NO：31的肽片断(包含SEQ ID NO：9的氨基酸21-38)，其中C末端被酰胺化(作为化学基团)(“Fmoc-AA(21-38)-NH2”)。为了用肽片断Fmoc-AA(21-37)-OH与亮氨酸(“H-LeuNH2”)在液相方法中组合制备肽片断Fmoc-AA(21-38)-NH2，将肽片断Fmoc-AA(21-37)-OH(30g，7.43mmol，1.0当量)、H-Leu-NH2*HCl(1.36g，8.16mmol，1.2当量)、和HOAT(1.52g，11.2mmol，1.5当量)溶解于DMF(450ml，15体积)中，用DIEA(6.5ml，37.3mmol，5当量)处理，并在室温下搅拌直至溶解(约30分钟)。冷却该溶液至0±5℃，并加入TBTU(2.86g，8.91mmol，1.2当量)，在0±5℃下搅拌5分钟，然后在25±5℃下反应2小时或直到HPLC显示反应完成。
然后在分离所述片断H-AA(21-38)-NH2之前去除肽片断Fmoc-AA(21-38)-NH2的Fomc化学保护基。加入哌啶(7.3mL，73.8mmol，10当量)并在25±5℃下搅拌1小时或直至HPLC分析显示绝大多数Fmoc已从该肽片断中去除。冷却反应器，并加入水(1000ml，30体积)，将该自由流动浆料在低于10℃下搅拌30分钟，然后过滤分离。收集的固体用1:1EtOH/水洗涤并在35±5℃下用真空电炉干燥。然后将该肽片断在1:1EtOH/水(450mL，15体积)中再浆化3小时。收集固体并干燥。然后将该肽片断在3：1的己烷：MTBE(450mL，15体积)中浆化一夜，然后过滤分离并再干燥。如果需要去除额外的哌啶可以重复MTBE再浆化。所得为分离的肽片断H-AA(21-38)-NH2(参见图4)的制品。
然后进行液相反应，其中将肽片断H-AA(21-38)-NH2(SEQ ID NO：31)与肽片断Ac-AA(1-20)-OH(SEQ ID NO：29)结合以产生具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽(参见图4，Ac-(1-38)-NH2)。将肽片断H-AA(21-38)-NH2(3.40g，0.86mmol，1当量)、肽片断Ac-AA(1-20)-OH(3.00g，0.86mmol，1.0当量)、和HOAT(0.177g，1.3mmol，1.5当量)以及DIEA(0.599ml，3.44mmol，4当量)溶解于DMAc(二甲基乙酰胺；100ml，33体积)中，冷却至0±5℃。向该反应中加入TBTU(0.331g，1.03mmol，1.2当量)。该反应在0±5℃下搅拌5分钟并在25±5℃下搅拌3小时或直到HPLC显示该反应完成。冷却该反应器，并缓慢加入水(200ml，66体积)。形成浆料并在低于10℃下搅拌至少30分钟。固体通过过滤分离并用额外的水洗涤。收集的固体用真空炉在35±5℃下干燥。所得到的为完全保护的、分离的HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2(SEQ ID NO：9)，其纯度通过HPLC分析测定。然后用实施例5中描述的方法，或本领域技术人员公知的任何其它去保护和脱羧基的方法对该HIV融合抑制肽进行去保护(通过除去侧链化学保护基)和脱羧(在色氨酸残基处)，然后提纯(例如通过HPLC)。所得到的为具有SEQ ID NO：9(在该说明中，N末端被乙酰化，C末端被酰胺化)的氨基酸序列的HIV融合抑制肽的制品(去保护和脱羧的)。
用相似的技术和条件，另外的片断装配方法，包括2片断装配或3片断装配法已被用于制备具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽(参见，例如表4和5)。根据本文描述可以知道，用于本发明方法制备具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽的优选肽片断可用于排除优选肽片断之外的肽片断。同样，用于本发明方法制备具有氨基酸序列SEQ IDNO：9的HIV融合抑制肽的优选肽片断组可用于排除优选肽片断组之外的肽片断组。
实施例7
本发明的另一个实施方案涉及可用于合成具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的HIV融合抑制肽的方法、肽片断、和肽片断组。通过本文描述也非常明显上述方法、肽片断、和肽片断组可用于合成具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的HIV融合抑制肽，其中该HIV融合抑制肽含有一个或多个化学基：
其中氨基端和羧基端其中之一或全部通过化学基修饰(B、U、Z；其中B、U、和Z可以是相同的化学基或不同的化学基)，该化学基包括但不限于：一种或多种反应官能团、化学保护基(CPG)和接头。涉及制备具有氨基酸序列SEQ IDNO：10的HIV融合抑制肽的肽片断、肽片断组、和保护肽片断(具有一个或多个化学基的肽片断)的说明性的例子包括但不限于分别列于表7、8和9中的那些。
表7
| SEQIDNO： | 氨基酸序列 | SEQIDNO：10中的氨基酸位置 |
| 17 | TTWEAWDRAIAE | 1-12 |
| 41 | YAARIEALLRAAQE | 13-26 |
| 42 | QQEKLEAALRE | 27-37 |
| 43 | QQEKLEAALREL | 27-38 |
| 21 | TTWEAWDRAIA | 1-11 |
| 44 | EYAARIEALLRAAQE | 12-26 |
| 23 | TTWEAWDRAI | 1-10 |
| 45 | AEYAARIEALLRAAQE | 11-26 |
| 25 | TTWEAWDRA | 1-9 |
| 46 | IAEYAARIEALLRAAQE | 10-26 |
| 27 | TTWEAWDR | 1-8 |
| 47 | AIAEYAARIEALLRAAQE | 9-26 |
| 29 | TTWEAWDRAIAEYAARIEAL | 1-20 |
| 48 | LRAAQEQQEKLEAALRE | 21-37 |
| 49 | LRAAQEQQEKLEAALREL | 21-38 |
| 32 | TTWEAWDRAIAEYAARIE | 1-18 |
| 50 | ALLRAAQEQQEKLEAALRE | 19-37 |
| 51 | ALLRAAQEQQEKLEAALREL | 19-38 |
| 52 | YAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL | 13-38 |
| 53 | EYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL | 12-38 |
| 54 | AEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL | 11-38 |
| 55 | IAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL | 10-38 |
| 56 | AIAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL | 9-38 |
本发明还包括在合成具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的HIV融合抑制肽方法中用作中间体的肽片断组。本发明的上述肽片断组包括组1-14，如表8中所示(对组的编号仅仅为了描述方便)。优选的肽片断组可用于本发明中排除优选肽片断组之外的肽片断组。
表8
| 组号 | 肽片断 | SEQIDNO：10中的氨基酸位置 |
| 1 | TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)YAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：41)QQEKLEAALRE(SEQ ID NO：42) | 1-1213-2627-37 |
| 2 | TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)YAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：41)QQEKLEAALREL(SEQ ID NO：43) | 1-1213-2627-38 |
| 3 | TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)LRAAQEQQEKLEAALRE(SEQ ID NO：48) | 1-2021-37 |
| 4 | TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)LRAAQEQQEKLEAALREL(SEQ ID NO：49) | 1-2021-38 |
| 5 | TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)EYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：44)QQEKLEAALRE(SEQ ID NO：42) | 1-1112-2627-37 |
| 6 | TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：45)QQEKLEAALRE(SEQ ID NO：42) | 1-1011-2627-37 |
| 7 | TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)IAEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：46)QQEKLEAALRE(SEQ ID NO：42) | 1-910-2627-37 |
| 8 | TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)AIAEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：47)QQEKLEAALRE(SEQ ID NO：43) | 1-89-2627-37 |
| 9 | TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)EYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：44)QQEKLEAALREL(SEQ ID NO：43) | 1-1112-2627-38 |
| 10 | TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：45)QQEKLEAALREL(SEQ ID NO：43) | 1-1011-2627-38 |
| 11 | TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)IAEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：46)QQEKLEAALREL(SEQ ID NO：43) | 1-910-2627-38 |
| 12 | TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)AIAEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：47)QQEKLEAALREL(SEQ ID NO：43) | 1-89-2627-38 |
| 13 | TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)ALLRAAQEQQEKLEAALRE(SEQ ID NO：50) | 1-1819-37 |
| 14 | TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)ALLRAAQEQQEKLEAALREL(SEQ ID NO：51) | 1-1819-38 |
表9
| SEQID NO： | 氨基酸序列 | SEQIDNO：10中的氨基酸位置 |
| 17 | Ac-TTWEAWDRAIAE | 1-12 |
| 41 | CPG-YAARIEALLRAAQE | 13-26 |
| 42 | CPG-QQEKLEAALRE | 27-37 |
| 42 | CPG-QQEKLEAALRE|lvDde | 27-37 |
| 43 | QQEKLEAALREL-NH2 | 27-38 |
| 29 | Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIEAL | 1-20 |
| 48 | CPG-LRAAQEQQEKLEAALRE | 21-37 |
| 49 | LRAAQEQQEKLEAALREL-NH2 | 21-38 |
| 21 | Ac-TTWEAWDRAIA | 1-11 |
| 44 | CPG-EYAARIEALLRAAQE | 12-26 |
| 23 | Ac-TTWEAWDRAI | 1-10 |
| 45 | CPG-AEYAARIEALLRAAQE | 11-26 |
| 25 | Ac-TTWEAWDRA | 1-9 |
| 46 | CPG-IAEYAARIEALLRALQE | 10-26 |
| 27 | Ac-TTWEAWDR | 1-8 |
| 47 | CPG-AIAEYAARIEALLRAAQE | 9-26 |
| 32 | Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIE | 1-18 |
| 50 | CPG-ALLRAAQEQQEKLEAALRE | 19-37 |
| 51 | ALLRAAQEQQEKLEAALRE L-NH2 | 19-38 |
参见表8(组3和组4)，说明了合成具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的HIV融合抑制肽的方法，该方法使用2个特定的肽片断(例如SEQ ID NO：29和48+Leu；或者SEQ ID NOS：29和49)，并采用包括组合2个肽片断并使它们化学耦合(“装配”)的片断装配方法，从而制备出具有氨基酸序列SEQID NO：10的HIV融合抑制肽。为了在液相反应中采用具有氨基酸序列SEQID NO：48的肽片断(“Fmoc-AA(21-37)-OH”)组合亮氨酸(“H-Leu NH2”)来制备具有氨基酸序列SEQ ID NO：49的肽片断(“Fmoc-AA(21-38)-NH2”)，将肽片断Fmoc-AA(21-37)-OH(30.01g，7.98mmol，1.0当量)、H-Leu-NH2*HCl(1.48g，8.78mmol，1.1当量)、和HOAT(1.63g，11.97mmol，1.5当量)溶解于DMF(450ml，15体积)中，用DIEA(7.0ml，39.91mmol，5当量)处理并在室温下搅拌直至溶解(约30分钟)，将该溶液冷却至0±5℃，并加入TBTU(3.09g，9.58mmol，1.2当量)，在0±5℃下搅拌5分钟，然后在25±5℃下反应2小时或直到HPLC显示反应完成。
在分离片断H-AA(21-38)-NH2前去除肽片断Fmoc-AA(21-38)-NH2的Fomc化学保护基。加入哌啶(8.0mL，79.8mmol，10当量)并在25±5℃下搅拌1.5小时或直至HPLC分析显示所有Fmoc已完全从肽片断中去除。冷却反应器，加入水(1000ml，30体积)，将该自由流动的浆料在低于10℃下搅拌30分钟，然后过滤分离。收集的固体用1:3EtOH/水洗涤并用真空炉在35±5℃下干燥。然后将该肽片断在1:3EtOH/水(400mL，13体积)中再浆化3小时。收集固体并干燥，然后该肽片断在3:1的己烷：MTBE(400mL，13体积)中浆化一夜，过滤分离，并干燥。如果需要除去额外的哌啶可重复进行MTBE再浆化。所得到的为分离的肽片断H-AA(21-38)-NH2制品(参见表9，SEQ ID NO：49)。
然后进行液相反应，其中肽片断H-AA(21-38)-NH2(SEQ ID NO：49)与肽片断Ac-AA(1-20)-OH(SEQ ID NO：29，表9)组合，从而产生具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的HIV融合抑制肽(参见，例如Ac-(1-38)-NH2)。将肽片断H-AA(21-38)-NH2(3.14g，0.86mmol，1当量)、肽片断Ac-AA(1-20)-OH(3.00g，0.86mmol，1.0当量)、和HOAT(0.18g，1.3mmol，1.5当量)以及DIEA(0.599ml，3.44mmol，4当量)溶解于DMAc(100ml，33体积)中，冷却至0±5℃。向反应中加入TBTU(0.331g，1.03mmol，1.2当量)。该反应在0±5℃下搅拌5分钟并在25±5℃下搅拌3小时或直到HPLC显示反应完成。冷却反应器，缓慢加入水(250ml，83体积)。形成浆料并在低于10℃下搅拌至少30分钟。固体通过过滤分离并用额外的水洗涤。收集的固体用真空炉在35±5℃下干燥。所得到的为完全保护的、分离的HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2(SEQ ID NO：10)制品，其纯度通过HPLC分析测定。然后用实施例4中描述的方法，或者本领域技术人员公知的去保护和脱羧的其它任何方法对HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2进行去保护(通过除去侧链化学保护基)和脱羧(在色氨酸残基处)。提纯之后，所得的为HPLC确定的具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的分离HIV融合抑制肽(N末端被乙酰化而C末端被酰胺化)制品(去保护和脱羧的)。
用相似的技术和条件，另外的片断装配方法，包括2片断装配或3片断装配法可用于制备具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的HIV融合抑制肽(参见，例如表8和9)。根据本文描述可以知道，用于本发明方法制备具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的HIV融合抑制肽的优选肽片断可用于排除优选肽片断之外的肽片断。同样，用于本发明方法制备具有氨基酸序列SEQ IDNO：10的HIV融合抑制肽的优选肽片断组可用于排除优选肽片断之外的肽片断组。
实施例8
本发明提供了在处理、治疗HIV感染和/或AIDS中，或作为HIV感染和/或AIDS的治疗方案的部分给予本发明的HIV融合抑制肽自身，或作为本发明药物组合物的活性药物成分给予的方法。HIV融合抑制肽的抗病毒活性可用于抑制HIV向目标细胞传播的方法中，该方法包括向病毒和细胞中加入抑制该细胞被HIV感染有效量的，优选地，抑制病毒和目标细胞之间的HIV介导融合有效量的本发明的HIV融合抑制肽。该方法可用于治疗HIV感染的个体(治疗性)或治疗与HIV新接触或处于高接触风险中(例如通过药物使用或高风险性行为)的个体(预防性)。因而，例如在个体感染HIV-1的情况下，有效量的HIV融合抑制肽(单独使用和/或与一种剂量方案结合)将是减少所治疗个体中的病毒载量的足够剂量。如本领域技术人员公知，有多种测量HIV病毒载量的标准方法，包括但不限于：通过外周血单核细胞的定量培养和通过血浆HIV RNA测定。本发明的HIV融合抑制肽可以单次给药、间歇给药、周期给药或连续给药，这可以由医师，如通过监测病毒载量来决定。根据包含HIV融合抑制肽的配方，和该配方是否还包含药学上可接受的载体和/或大分子载体等因素，本发明的HIV融合抑制肽可以从几天到几周甚至可能更长时间内周期地给药。进一步的，在抗病毒治疗中，当组合使用或用于治疗方案中时，本发明的HIV融合抑制肽可与其它用于治疗HIV的抗病毒药物或预防药物一起使用(例如同时使用，或在循环开始时用一种药物而循环结束时用另一种)。
已知一种涉及抗病毒剂组合的常用治疗是HAART(高效抗逆转录病毒治疗)。HAART通常组合三种或更多具有抗HIV抗病毒活性的药物，并通常涉及多类药物(“类”是指作用机理、或所述药物靶定的病毒蛋白或者过程)。因而，本发明的治疗方法、HIV融合抑制肽和药物组合物可以单独给药(例如作为单一疗法)或在治疗方案中给药、或是涉及与治疗HIV感染和/或AIDS的额外的治疗剂组合的共给药，这在本文中有详细描述。
例如，在一优选实施方案中，在治疗中可以将一种或多种治疗剂与本发明的HIV融合抑制肽(本身、或在药物组合物中)组合。典型地，该组合包括两种或多种抗病毒剂，以通过例如降低病毒对该治疗中所使用的抗病毒剂形成耐受性的能力(相比于单一疗法)来增加疗效。这种组合物可用有效量的现已批准或将来会批准的抗病毒剂(对治疗HIV感染有用的)来制备，该抗病毒剂包括但不限于一种或多种选自下列的治疗剂：逆转录酶抑制剂，包括但不限于阿巴卡韦、AZT(齐多夫定)、ddC(扎西他滨)、奈韦拉平、ddl(去羟肌苷)、FTC(恩曲他滨)、(+)和(-)FTC、reverset、3TC(拉米夫定)、GS840、GW-1592、GW-8248、GW-5634、HBY09、delaviridine、施多宁、d4T(司他夫定)、FLT、TMC125、阿德福韦、替诺福韦、和阿洛夫定；蛋白酶抑制剂，包括但不限于安普那韦、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、茚地那韦、奈非那韦、PNU-140690、利托那韦、沙奎那韦、替利那韦、tipranovir、atazanavir、洛匹那韦；病毒进入抑制剂，包括但不限于融合抑制剂(恩夫韦地、T1249、其它融合抑制肽和小分子)、趋化因子受体拮抗剂(例如CCR5拮抗剂，例如ONO-4128、GW-873140、AMD-887、CMPD-167、maraviroc(UK-427857)；CXCR4拮抗剂，如AMD-070)、影响病毒结合相互作用的试剂(例如影响gp120和CD4受体相互作用，如BMS806、BMS-488043；和/或PRO542、PRO140；抗CD4抗体；或脂质和/或胆固醇相互作用，如盐酸普鲁卡因(SP-01和SP-01A))；整合酶抑制剂，包括但不限于L-870、和810；RNAseH抑制剂；rev或REV抑制剂；vif抑制剂(例如vif衍生的脯氨酸富集肽、HIV-1蛋白酶N端衍生肽)；病毒处理抑制剂，包括但不限于白桦脂醇、和二氢白桦脂醇衍生物(例如PA-457)；和免疫调节剂，包括但不限于AS-101、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-2、丙戊酸、和胸腺五肽。HIV感染和/或AIDS治疗领域技术人员知道，组合药物治疗可包含两个或多个具有相同作用机理(作为靶的病毒蛋白或过程)的治疗剂、或包含两个或多个具有不同作用机理的治疗剂。
可用于与本发明的HIV融合抑制肽、或药物组合物组合的这些说明性的额外治疗剂的有效剂量为本领域公知技术。这种组合可包含许多抗病毒剂或治疗剂，该抗病毒剂或治疗剂可通过一个或多个途径给药，根据给药途径和期望的药理作用可顺序或同时给药，这是本领域技术人员熟知的。本发明的HIV融合抑制肽或药物组合物的有效给药剂量可通过本领域公知程序确定；例如通过测定效力、生物半衰期、生物利用度和毒性来确定。在优选的实施方案中，本发明HIV融合抑制肽的有效量和其剂量范围由本领域技术人员用本领域技术人员公知的常规体外和体内研究数据确定。例如，如本文所述，本领域技术人员能从抗病毒活性的体外感染试验中确定所述化合物的平均抑制浓度(IC)，其是作为唯一的活性成分或与其它活性成分的组合来抑制预定量的病毒感染(例如50％抑制作用，IC50；或90％抑制作用，IC90)或病毒复制所必需的。然后本领域技术人员可以利用一个或多个标准模型得到的药代动力学数据来选择适当的剂量，从而获得该活性成分的最小血浆浓度(C[min])，其等于或超过抑制病毒感染或病毒复制的预定值。由于剂量范围通常取决于给药时所选择的给药途径和剂型，本发明的化合物作为活性成分的示例性剂量范围可以为约1mg/kg体重到约100mg/kg体重；优选不少于1mg/kg体重且不超过10mg/kg体重，所述给药途径包括但不限于皮下给药、肠胃外给药、皮内给药或口服。
本发明的HIV融合抑制肽可以通过任何能够使该活性剂到达目标细胞(能被HIV感染的细胞)的任何方式对个体给药。因而，本发明的HIV融合抑制肽可以通过任何合适的技术给药，包括口服、肠胃外给药(例如肌内内、腹腔内、静脉内、或皮下注射或输注、皮内、或植入)、鼻腔、肺部、阴道、直肠、舌下、或局部途径给药，并可制备成适合各种给药途径的剂型。特定的给药途径取决于，例如个体的用药史，包括这种给药中任何预知的或预期的副作用，以及给予的HIV融合抑制肽的配方(例如药物载体和/或大分子载体的性质)。更优选地，通过注射给药(例如采用静脉或皮下方式)，也可通过连续输注给药(例如采用缓释设备或如渗透泵的微泵，等等)。在优选的实施方案中，本发明的HIV融合抑制肽还可以包含药学上可接受的载体；并可以取决于所需的配方、传送地点、给药方法、给药方案、以及医师公知的其它因素。
因而，本发明提供了抑制HIV向细胞传播的方法，该方法包括施用抑制所述细胞被HIV感染有效量的本发明的HIV融合抑制肽、或含HIV融合抑制肽的药物组合物。该方法还包括通过对个体施用包含有效量的本发明的HIV融合抑制肽或药物组合物的治疗剂组合(同时或顺序给药，或作为治疗方案的一部分)，从而给予该个体本发明的HIV融合抑制肽或药物组合物与其它用于治疗HIV感染和/或AIDS的治疗剂的组合。还提供了抑制HIV进入的方法，该方法包括对需要治疗的个体给予抑制病毒进入目标细胞有效量的本发明的HIV融合抑制肽或药物组合物。该方法还包括给予有效量的本发明的HIV融合抑制肽或药物组合物与一种或多种有效量的用于治疗HIV感染的病毒进入抑制剂的组合。
为说明性的目的，前文对本发明的具体实施方案进行了详细描述。针对该描述和说明，本领域其它技术人员应用现有知识在不背离其基本理念的情况下可轻易地对本发明进行修改和/或改变以用于各种应用，因而，这些修改和/或改变也包括在所附权利要求书的含义和范围内。
序列表
<110>特里梅里斯公司
<120>具有改良生物学特性的HIV融合抑制肽
<130>7872-132-228(TRm-014-prov)
<140>
<141>
<150>60/764,674
<151>2006-02-02
<160>56
<170>PatentIn 3.2版
<210>1
<211>64
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>1
Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn
1 5 10 15
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
20 25 30
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
35 40 45
Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
50 55 60
<210>2
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>2
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1 5 10 15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
20 25 30
Trp Asn Trp Phe
35
<210>3
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>3
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1 5 10 15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Gln Glu Leu Leu
35
<210>4
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
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35
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<211>38
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<220>
<223>合成肽
<400>5
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1 5 10 15
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35
<210>6
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>6
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>7
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>7
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>8
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>8
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>9
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>9
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>10
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>10
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>11
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>11
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>12
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>12
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ile Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>13
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>13
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Ile Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>14
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>14
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ile Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>15
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>15
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Ile Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
35
<210>16
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>Xaa＝亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>Xaa＝亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>Xaa＝任何氨基酸，优选亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(25)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(27)..(28)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(31)
<223>Xaa＝任何氨基酸，优选亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(35)
<223>Xaa＝亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)..(38)
<223>Xaa＝亮氨酸或异亮氨酸
<400>16
Xaa Xaa Xaa Glu Ala Xaa Asp Arg Ala Xaa Ala Glu Xaa Ala Ala Arg
1 5 10 15
Xaa Glu Ala Xaa Xaa Arg Ala Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Glu Lys Xaa Glu
20 25 30
Ala Ala Xaa Arg Glu Xaa
35
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>17
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu
1 5 10
<210>18
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>18
Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu
1 5 10
<210>19
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>19
Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu
1 5 10
<210>20
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>20
Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
1 5 10
<210>21
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>21
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala
1 5 10
<210>22
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>22
Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu
1 5 10 15
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>23
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile
1 5 10
<210>24
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>24
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu
1 5 10 15
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>25
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala
1 5
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>26
Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln
1 5 10 15
Glu
<210>27
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>27
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg
1 5
<210>28
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>28
Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu
1 5 10 15
Gln Glu
<210>29
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>29
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu
20
<210>30
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>30
Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg
1 5 10 15
Glu
<210>31
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>31
Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg
1 5 10 15
Glu Leu
<210>32
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>32
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu
<210>33
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>33
Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Arg Glu
<210>34
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>34
Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Arg Glu Leu
20
<210>35
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>35
Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln
1 5 10 15
Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
20 25
<210>36
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>36
Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln
1 5 10 15
Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
20 25
<210>37
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>37
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu
1 5 10 15
Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
20 25
<210>38
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>38
Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln
1 5 10 15
Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
20 25
<210>39
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>39
Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu
1 5 10 15
Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
20 25 30
<210>40
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>40
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu
20 25
<210>41
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>41
Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu
1 5 10
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>42
Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu
1 5 10
<210>43
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>43
Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
1 5 10
<210>44
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>44
Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu
1 5 10 15
<210>45
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>45
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu
1 5 10 15
<210>46
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>46
Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln
1 5 10 15
Glu
<210>47
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>47
Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala
1 5 10 15
Gln Glu
<210>48
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>48
Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg
1 5 10 15
Glu
<210>49
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>49
Leu Arg Ala Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Arg Glu Leu
<210>50
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>50
Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Arg Glu
<210>51
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>51
Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Arg Glu Leu
20
<210>52
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>52
Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln
1 5 10 15
Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
20 25
<210>53
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>53
Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln
1 5 10 15
Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
20 25
<210>54
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>54
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu
1 5 10 15
Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
20 25
<210>55
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>55
Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln
1 5 10 15
Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
20 25
<210>56
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>56
Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala
1 5 10 15
Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Claims (17)
1.分离的肽，其序列为SEQ ID NO：9，其中该序列抑制HIV向靶细胞传播。
2.如权利要求1所述的肽，其中向所述肽添加选自下列的成分：一种或多种反应官能团、大分子载体、和其组合。
3.分离的核酸分子，其由编码如权利要求1所述的肽的核苷酸序列构成。
4.包含如权利要求3所述的核酸分子的载体。
5.如权利要求4所述的载体，其中该载体为表达载体。
6.含有如权利要求4或5所述的载体的分离细胞。
7.含有如权利要求2所述的肽的组合物。
8.如权利要求7所述的组合物，其中该组合物是无菌的。
9.组合物，其包含如权利要求1所述的肽和至少一种抗病毒剂，该抗病毒剂选自：HIV进入抑制剂、HIV整合酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、vif-抑制剂、病毒特异性转录抑制剂、病毒处理抑制剂、HIV成熟抑制剂，和其组合。
10.如权利要求7或9所述的组合物，其中该组合物进一步包含药学上可接受的载体。
11.有效量的如权利要求1的所述肽在制备用于抑制HIV向细胞传播的药物中的用途。
12.有效量的如权利要求1的所述肽在制备用于抑制HIV融合的药物中的用途。
13.有效量的如权利要求1所述的肽在制备用于治疗HIV感染个体的药物中的用途，其中该药物在治疗个体中实现的治疗效果选自：HIV病毒载量降低、循环CD4+细胞群增加，和其组合。
14.合成SEQ ID NO：9肽的方法，其中通过固相或液相合成法合成三肽片断组，该组由：
(a)SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和亮氨酸残基；或
(b)SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20所组成，
其中该组的成员然后采用片段缩合方法而被组合，从而制备出SEQ IDNO：9肽。
15.肽组，其中该组由：
(a)TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)、YAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：18)、QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)；
(b)TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)、YAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：18)、QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)；
(c)TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)、
LRALQEQQEKNEAALRE(SEQ ID NO：30)；
(d)TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)、
LRALQEQQEKNEAALREL(SEQ ID NO：31)；
(e)TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)、EYAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：22)、QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)；
(f)TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)、AEYAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：24)、QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)；
(g)TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)、IAEYAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：26)、QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)；
(h)TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)、AIAEYAARIEALLRALQE(SEQID NO：28)、QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)；
(i)TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)、EYAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：22)、QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)；
(j)TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)、AEYAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：24)、QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)；
(k)TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)、IAEYAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：26)、QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)；
(I)TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)、AIAEYAARIEALLRALQE(SEQ IDNO：28)、QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)；
(m)TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)、
ALLRALQEQQEKNEAALRE(SEQ ID NO：33)；
(n)TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)、
ALLRALQEQQEKNEAALREL(SEQ ID NO：34)；
(o)TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：40)、
QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)；或者
(p)TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：40)、
QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)所组成。
16.如权利要求15所述的肽组，其中至少一个肽的一个或多个侧链用保护基保护。
17.如权利要求16所述的肽组，其中该保护基选自：9-芴甲氧-羰基(Fmoc)、叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)、叔丁氧羰基(Boc)、碳苯氧羰基、丹磺酰基和对硝基苄酯基。
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