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CN101351546B - 治疗播散性癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过施用可以从一个或多个引流转移肿瘤的转移瘤引流淋巴结(转移哨淋巴结)获得的被增殖的肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞，来治疗患有播散性癌症的患者的免疫治疗方法。该方法包括在患者中鉴定一个或多个转移哨淋巴结、切除一个或多个淋巴结和任选全部或部分的转移瘤、从所述淋巴结中分离转移肿瘤反应性T淋巴细胞、体外增殖该转移瘤反应性T淋巴细胞、以及将这样获得的T淋巴细胞施用于患者，其中T淋巴细胞是CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞。

Description

治疗播散性癌症的方法
发明领域
本发明涉及用于治疗罹患播散性癌症的患者的免疫治疗方法，通过施用可以从一个或多个引流转移瘤的转移哨(metinel)淋巴结获得的增殖的肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞，其中T淋巴细胞不是CD4+CD25+Hi淋巴细胞，即本发明不涵盖调节性T淋巴细胞。 
发明背景 
淋巴系统含有脉管网络，携带有源自组织间液的无色、水样流体，淋巴。这些脉管将过量的流体运出身体组织中的组织间隙，并将其返回到血流中，同时防止淋巴液的回流。三种主要类型的淋巴管是毛细淋巴管、淋巴管和淋巴导管。毛细淋巴管连接形成更大的脉管，被称为淋巴管或淋巴静脉。它们类似引导血液的静脉，但是壁较薄和管腔相对较大，并且它们具有更多的瓣膜。在皮肤中，淋巴管位于皮下组织中，与静脉的路径相同。在内脏中，淋巴管一般随着动脉，并在它们周围形成丛(网络)。在某些位置，淋巴管进入淋巴结。它们是淋巴组织构成的小的、特化的器官。淋巴在进入静脉循环之前通过至少一个淋巴结过滤(Moore)。淋巴结作为滤器，具有内部的蜂窝状结缔组织，其中充满了收集和破坏例如细菌和病毒的淋巴细胞。在淋巴结中，淋巴与血液循环相接触，并有大约一半的流体在通过传出淋巴管离开淋巴结之前被排入血液中(Renkin)。一种逐渐被接受的观点认为，实际上所有来自上皮肿瘤的恶性细胞的扩散，在通过淋巴结中的淋巴-静脉连接进入总血液循环之前，都首先通过薄的有孔淋巴管发生(通过也被白细胞使用的活化机制)。在腋窝、腹股沟、颈部、胸部和腹部发现有成簇的淋巴结。 
原发肿瘤或原发肿瘤区流向一个或多个所谓的前哨淋巴结，前哨淋巴结被定义为第一个或第一批接受来自肿瘤的淋巴流出液的淋巴结，也被称为“前哨淋巴结概念(sentinel node concept)″。这也是转移的第一个站点，并且在几种类型的实体瘤中已经显示，如果前哨淋巴结不含肿瘤细胞，那么淋巴结转移的风险几乎可以忽略。前哨淋巴结可以在外科手术过程中通过在肿瘤周围注射示踪物或染料物质来鉴定。这些物质在毛细淋巴管中运输，通过巨噬细胞的吞噬作用被积累在前哨淋巴结中，从而鉴定了肿瘤引流淋巴结。本发明人最近显示了引流原发肿瘤的前哨淋巴结是天然肿瘤反应性T淋巴细胞体外增殖的潜在的丰富来源，因为前哨淋巴结可能含有显著量的已经对肿瘤抗原致敏并在淋巴结中经历了体内增殖的T淋巴细胞(Marits等，手稿；Karlsson等，Eur J Urol，已接受)。 
但是，迄今为止，还不知道涉及某个单独的淋巴结的连续淋巴引流也可应用于转移，即，对于转移来说，可以检测流向转移区的一个或多个淋巴结。 
发明公开 
原发肿瘤的转移被定义为由于原发肿瘤的扩散导致的癌症。转移依赖于获得了两种分开的能力的癌细胞——的活动性和浸润性增加。转移的细胞基本上与原始的肿瘤中的细胞是同样的类型。如果癌症发生于例如结肠并转移到例如肝脏，肝脏中的癌细胞是结肠癌细胞。但是，细胞已经获得了增加的活动性和侵入另一个器官的能力。 
理论上原发肿瘤源自发生肿瘤的器官或组织中存在的细胞。因为在这些器官或组织中的细胞已经与先前存在的淋巴引流系统相连接，淋巴将通过现有的淋巴管从原发肿瘤排出。到目前为止，还没有人显示出原发肿瘤的“前哨淋巴结概念也同样适用于转移瘤，即对于肿瘤转移来说可以鉴定出一个或多个接受转移瘤的引流液的第一淋巴结。还没有任何人显示出转移瘤诱导了淋巴管生成，此外，也不明确转移 瘤将发展出与淋巴系统的连接。 
本发明人已经发现，在例如淋巴结或器官例如肝脏或组织如肠系膜脂肪组织中的转移瘤，已经发展出了与淋巴系统的连接并向淋巴结引流，并且可以鉴定一个或多个所谓的“转移哨”淋巴结，即第一个(批)接受来自转移瘤的淋巴引流的淋巴结。 
理论上说，肿瘤细胞从转移瘤的扩散可以通过由肿瘤引发的血管形成活性所形成的血管而发生。据信自胚胎发育起，淋巴系统得到了相当好的保存，并且它是独立于血管血液系统而发育的。因此，本发明人没有预料到能够发现可以使用与已经开发用于各种不同的原发实体瘤的相同的技术来研究上皮实体瘤的转移瘤进行淋巴引流作图。在研究位于皮下组织、淋巴组织、腹内和内部器官中的不同类型的转移瘤的淋巴引流时，本发明人鉴定了转移瘤引流淋巴结(转移哨淋巴结)。转移哨淋巴结是独立定位的，并且转移哨淋巴结、即从转移瘤接受淋巴引流的第一批淋巴结，通常不是与转移瘤的解剖距离最短的淋巴结。 
本发明人对这种转移哨淋巴结的进一步分析显示出它们含有对相应的转移瘤中的肿瘤细胞具有特异性活性的T淋巴细胞。本发明人还显示出从转移哨淋巴结获得的T淋巴细胞可以被增殖并用于播散性癌症疾病的治疗。 
本申请具体涉及下列第1-89项具体实施方案： 
1.治疗患有播散性癌症的患者的方法，该方法包括 
i)在患者中鉴定一个或多个转移哨淋巴结， 
ii)切除一个或多个淋巴结以及任选全部或部分转移瘤， 
iii)从所述淋巴结中分离转移瘤反应性T淋巴细胞， 
iv)体外增殖所述转移瘤反应性T淋巴细胞， 
v)将这样获得的T淋巴细胞施用于患者， 
其中T淋巴细胞是CD4+辅助性和/或CD8+T淋巴细胞。 
2.项目1中的方法，其中癌症是任何解剖学位置中上皮、间质或胚胎学来源的任何实体肿瘤，例如对于上皮瘤来说，例如乳腺、结肠、胰腺、膀胱、小肠、前列腺、子宫颈、外阴、卵巢中的腺癌；对于间质肿瘤来说，例如关节、骨骼、肌肉和腱中的肉瘤以及一些血液肿瘤例如淋巴瘤；对于胚胎学肿瘤来说，例如畸胎瘤。 
3.项目1或2中的方法，其中转移哨淋巴结在步骤i)中通过将一种或多种淋巴结定位剂注射到患者中来鉴定。 
4.前述项目任何一项中的方法，其中一种或多种淋巴结定位剂是基于亲和性的。 
5.项目1-4任何一项中的方法，其中一种或多种淋巴结定位剂是基于非亲和性的。 
6.前述项目任何一项中的方法，其中一种或多种淋巴结定位剂被注射到转移肿瘤之中、之上、周围、附近和/或之下。 
7.前述项目任何一项中的方法，其中一种或多种淋巴结定位剂通过单次注射进行注射。 
8.项目1-6任何一项中的方法，其中一种或多种淋巴结定位剂通过多次注射进行注射。 
9.前述项目任何一项中的方法，其中一种或多种淋巴结定位剂通过非外科程序进行注射。 
10.项目1-9任何一项中的方法，其中一种或多种淋巴结定位剂作为外科程序的一部分进行注射。 
11.前述项目任何一项中的方法，其中体外增殖步骤iv)包括 
i)第一阶段，用肿瘤来源的抗原与至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质一起刺激肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞，以促进肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞的存活，以及 
ii)第二阶段，激活和促进肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞的生长，其中当CD25细胞表面标记(或IL-2R标记)在T淋巴细胞上被下调时起动第二阶段ii)。 
12.项目11中的方法，其中下调被定义为5％以下的T淋巴细胞种群表达CD25。 
13.项目11或12中的方法，其中T淋巴细胞存在于培养基中。 
14.项目13中的方法，其中培养基是无血清培养基，例如AIMV培养基。 
15.前述项目任何一项中的方法，其中第一阶段i)通过加入至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质来起动。 
16.项目15中的方法，其中对IL-2受体具有激动活性的物质是IL-2。 
17.项目16中的方法，其中IL-2以低剂量被加入，例如从大约100IU/ml培养基到大约700IU/ml培养基，从大约100IU/ml培养基到大约600IU/ml培养基、从大约100IU/ml培养基到大约500IU/ml培养基、从大约100IU/ml培养基到大约400IU/ml培养基、从大约100IU/ml培养基到大约300IU/ml培养基和从大约100IU/ml培养基到大约200IU/ml培养基。 
18.前述项目任何一项中的方法，其中在整个阶段i)，定期加入额外量的至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质，例如阶段i)的每2天、每 3天或每4天。 
19.项目18中的方法，其中对IL-2受体具有激动活性的物质是IL-2。 
20.项目19中的方法，其中加入的IL-2的浓度是从大约100IU/ml培养基到大约700IU/ml培养基，从大约100IU/ml培养基到大约600IU/ml培养基、从大约100IU/ml培养基到大约500IU/rml培养基、从大约100IU/ml培养基到大约400IU/ml培养基、从大约100IU/ml培养基到大约300IU/ml培养基和从大约100IU/ml培养基到大约200IU/ml培养基。 
21.前述项目任何一项中的方法，其中在第一阶段i)第2天到(含)第5天，例如在第2天、第3天、第4天或第5天，加入肿瘤来源的抗原。 
22.项目11-20任何一项中的方法，其中肿瘤来源的抗原基本上在阶段i)起动的同时或最多直到其后的3天加入。 
23.前述项目任何一项中的方法，其中肿瘤来源的抗原是肿瘤的变性匀浆。 
24.前述项目任何一项中的方法，其中肿瘤来源的抗原是蛋白、多肽或肽。 
25.前述项目任何一项中的方法，其中第二阶段ii)从第一阶段i)的第17天到(含)第23天起动，例如第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天或第23天。 
26.前述项目任何一项中的方法，其中第二阶段通过向T淋巴细胞中加入肿瘤来源的抗原以活化肿瘤反应性CD25-阴性T淋巴细胞来起动。 
27.项目26中的方法，其中肿瘤来源的抗原是肿瘤的变性匀浆。 
28.项目26中的方法，其中肿瘤来源的抗原是肿瘤蛋白、多肽或肽。 
29.项目26-28任何一项中的方法，还包括向T淋巴细胞中与肿瘤来源的抗原一起加入抗原呈递细胞。 
30.项目20中的方法，其中抗原呈递细胞是辐射过的含有抗原呈递B细胞和/或单核细胞的外周血白细胞。 
31.前述项目任何一项中的方法，其中第二阶段ii)包括加入至少一种能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质。 
32.项目31中的方法，其中能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质是对干扰素受体具有激动活性的物质。 
33.项目32中的方法，其中对干扰素受体具有激动活性的物质是干扰素。 
34.项目33中的方法，其中对干扰素受体具有激动活性的物质是α-干扰素。 
35.项目31-34中任一项的方法，其中能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质，例如对干扰素受体具有激动活性的物质，在IL-12的水平与阶段ii)的第1天的IL-12水平相比至少增加1倍、例如至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍时被加入。 
36.项目31-35中任一项的方法，其中能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质，例如对干扰素受体具有激动活性的物质，在第二阶段ii)起动后的第2天到(含)第4天被加入，例如在第2天、第3天或第4天。 
37.前述项目任何一项中的方法，其中第二阶段ii)包括加入一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质。 
38.项目37中的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质是一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质。 
39.项目38中的方法，其中一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质是抗IL-4抗体、抗IL-5抗体和/或抗IL-10抗体。 
40.项目37到39任何一项中的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质，例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质，在第二阶段ii)的第1天加入。 
41.项目37到39任何一项中的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质，例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质，是在加入了能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质之后的后续步骤中加入的。 
42.项目41中的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质，例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5和/或IL-10的物质，是在加入能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质后1天加入的。 
43.前述项目任何一项中的方法，其中在整个阶段ii)，定期加入额外量的一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质，例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质。 
44.项目43中的方法，其中额外量的一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质，例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质，在阶段ii)的每2天、每3天或每4天被加入。 
45.前述项目任何一项中的方法，其中在整个阶段ii)定期加入额外量的对IL-2受体具有激动活性的物质。 
46.项目45中的方法，其中对IL-2受体具有激动活性的物质在阶段ii)的每2天、每3天或每4天被加入，例如每3天。 
47.项目45或46中的方法，其中对IL-2受体具有激动活性的物质是IL-2。 
48.前述项目任何一项中的方法，其中第二阶段ii)包括加入一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质。 
49.项目48中的方法，其中一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质是对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质。 
50.项目49中的方法，其中一种或多种物质选自IL-7、IL-12、IL-15和IL-21。 
51.项目48-50任何一项中的方法，其中一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质，例如对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质，在IFN-γ的水平与第二阶段ii)起动时IFN-γ的水平相比增加时被加入。 
52.项目51中的方法，其中IFN-γ的水平增加被定义为与第二阶段ii)起动时IFN-γ的水平相比，IFN-γ的水平增加了至少1倍，例如增加了至少2倍、至少3倍、至少4倍。 
53.项目48-52任何一项中的方法，其中一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质，例如对IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质，在CD25和/或CD69下调时被加入。 
54.项目48-53任何一项中的方法，其中加入的一种或多种促进Th 1型T淋巴细胞发育的物质，例如对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质中的每种的浓度，从每毫升培养基大约150IU到每毫升培养基大约300IU，例如每毫升培养基250IU。 
55.项目48-54任何一项中的方法，其中一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质，例如对IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质，在第二阶段ii)起动后的第5天到(含)第8天被加入，例如在第5天、第6天、第7天或第8天。 
56.前述项目任何一项中的方法，用于制备CD4+辅助性T淋巴细胞。 
57.前述项目任何一项中的方法，用于制备效应性T淋巴细胞。 
58.前述项目任何一项中的方法，用于制备记忆性T淋巴细胞。 
59.前述项目任何一项中的方法，用于制备Th1型T淋巴细胞。 
60.前述项目任何一项中的方法，还包括在第一阶段i)和第二阶段ii)期间连续地监控T淋巴细胞上细胞表面标记例如CD25和/或CD69的表达。 
61.项目60中的方法，其中T淋巴细胞在第二阶段ii)中T淋巴细胞上的CD25下调时被收获。 
62.项目61中的方法，其中在T淋巴细胞上的CD25下调时，T淋巴细胞进行至少一轮额外的阶段ii)。 
63.项目61或62中的方法，其中下调被定义为5％以下的CD4阳性T淋巴细胞种群表达CD25。 
64.前述项目任何一项中的方法，其中肿瘤反应性T淋巴细胞在第二阶段ii)起动后的第10天到(含)第14天被收获。 
65.项目64中的方法，其中肿瘤反应性T淋巴细胞在收获后被纯化。 
66.前述项目任何一项中的方法，还包括将在第二阶段ii)中获得的肿瘤反应性T淋巴细胞进行冷冻的步骤。 
67.前述项目任何一项中的方法，其中T淋巴细胞来源于引流原发性肿瘤和/或转移瘤的淋巴结，或它们来源于血液。 
68.前述项目任何一项中的方法，其中在步骤iv)中肿瘤反应性T淋巴细胞被静脉内、动脉内或鞘内、腹膜内施用。 
69.前述项目任何一项中的方法，其中施用的肿瘤反应性T淋巴细胞的量为至少1千万，例如至少2千万、至少3千万、至少4千万、至少5千万、至少6千万、至少7千万、或至少8千万。 
70.前述项目任何一项中的方法，其中施用的肿瘤反应性T淋巴细胞是效应性T淋巴细胞和记忆性T淋巴细胞的组合。 
71.项目70中的方法，其中效应性T淋巴细胞的百分率从大约10％到大约65％，例如从大约20％到大约50％或从大约30％到大约40％。 
72.前述项目任何一项中的方法，其中肿瘤反应性T淋巴细胞是自体的。 
73.前述项目任何一项中的方法，其中肿瘤反应性T淋巴细胞是非自体的。 
74.按照项目1-73任何一项中定义的方法制备的肿瘤反应性T淋巴细胞。 
75.项目74中的肿瘤反应性T淋巴细胞，其是CD4+T淋巴细胞。 
76.项目74或75中的肿瘤反应性T淋巴细胞，其是效应性T淋巴细胞。 
77.项目74-76任何一项中的肿瘤反应性T淋巴细胞，其是记忆性T淋巴细胞。 
78.项目74-77任何一项中的肿瘤反应性T淋巴细胞，其是Th1型T淋巴细胞。 
79.项目74-78任何一项中的肿瘤反应性T淋巴细胞的应用，用于制备治疗播散性癌症的药物。 
80.用于项目1-73任何一项中的方法的试剂盒，所述试剂盒包含培养T淋巴细胞的培养基。 
81.项目80中的试剂盒，还包含一种或多种刺激、活化和引导肿瘤反应性T淋巴细胞的物质。 
82.项目80或81中的试剂盒，其中培养基是无血清培养基，例如AIMV、RPMI 1640、DMEM或MEM。 
83.项目80-82任何一项中的试剂盒，其中一种或多种用于刺激、活化和引导肿瘤反应性T淋巴细胞的物质选自肿瘤来源的抗原、对IL-2受体具有激动活性的物质、能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质、能够对 抗Th2型T淋巴细胞发育的物质和促进Th1型T淋巴细胞发育的物质。 
84.项目80-83任何一项中的试剂盒，其中一种或多种用于刺激、活化和引导肿瘤反应性T淋巴细胞的物质选自IL-2、α-干扰素、抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-10抗体、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21。 
85.项目80-84任何一项中的试剂盒，含有适合静脉内给药的药物组合物。 
86.用于检测转移哨淋巴结的试剂盒，所述试剂盒包含注射器和淋巴结定位剂。 
87.用于检测转移哨淋巴结的试剂盒，所述试剂盒包含预先装有淋巴结定位剂的注射器。 
88.项目80-87任何一项中的试剂盒，还包括使用说明书。 
89.项目88中的试剂盒，其中所述说明书是计算机软件的形式。 
在继续进行本发明方法的步骤的详细描述之前，定义了下列的术语： 
术语“肿瘤反应性T淋巴细胞”是指带有特异性针对和识别肿瘤抗原的T细胞受体(TCR)的T淋巴细胞。在这里的术语肿瘤反应性T淋巴细胞也倾向于涵盖带有特异性针对和识别转移瘤抗原的TCR的T淋巴细胞。即术语肿瘤反应性T淋巴细胞与转移瘤反应性T淋巴细胞可以互换使用。 
术语“辅助性T细胞”是指在激活时促进适应性免疫反应的T淋巴细胞。 
术语“Th1细胞”是指在激活时促进细胞介导的免疫反应的辅助性T细胞，使用细胞因子例如IFN-γ。 
术语“Th2细胞”是指在激活时促进体液免疫反应的辅助性T细胞，使用细胞因子例如IL-4。 
术语“CD4+辅助性T淋巴细胞”是指表达CD4但不表达转录因子FoxP3的T淋巴细胞。 
术语“CD8+T淋巴细胞”是指表达CD8的T淋巴细胞。 
术语“调节性T淋巴细胞”是指抑制适应性免疫反应、表达转录因子FoxP3的T淋巴细胞。 
术语T淋巴细胞的“特异性激活”是指抗原特异性和MHC限制性的T细胞受体介导的激活。相反，术语T淋巴细胞的“非特异性激活”是指所有T细胞的一般性激活，不论T细胞受体的特异性。 
术语“肿瘤来源的抗原”旨在涵盖肿瘤细胞、肿瘤的匀浆液(其中匀浆液可以变性)、或肿瘤蛋白、多肽或肽，例如纯化的、天然的、合成的和/或重组的蛋白、多肽或肽形式。请注意本文的术语肿瘤也倾向于涵盖原发肿瘤的转移瘤。肿瘤来源的抗原可以是完整的分子、其片段或完整的分子和/或片段的多聚体或聚集物。适合的多肽和肽的例子是包括从大约5到大约30个氨基酸、例如从大约10到25个氨基酸、从大约10到20个氨基酸或从大约12到18个氨基酸的多肽和肽。如果使用肽，可以使用在培养物中的终摩尔浓度从大约0.1到大约5.0μM，例如，从大约0.1到大约4.0μM、从大约0.2到大约3.0μM、从大约0.31到大约2.0μM或从大约0.3到大约1.0μM。肿瘤来源的抗原可以是自体的也可以是异源的，即可以来自待治疗的患者、或从患有癌症的另一个对象获得。在本文的实施例中，本发明人使用了自体的变性肿瘤提 取物，但是，正如上面所述，其它来源的肿瘤来源的抗原用于本发明的方法可能也是可行的。 
术语“第一阶段的第1天”或例如“第二阶段的第5天”应该做如下理解：收获淋巴细胞的天被定义为第0天(零时)。第一阶段的第1天被定义为通过加入至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质、以及可能的培养基和/或肿瘤来源的抗原来启动增殖的当天。增殖阶段i)可以在收获淋巴细胞之后第0天(零时)或最高直到2天起始。在全文中，通过加入肿瘤来源的抗原而起始第二阶段的当天被描述为“第二阶段的第1天”。 
术语“前哨淋巴结”是指从肿瘤接受淋巴引流的第一个(批)淋巴结。原发肿瘤或原发肿瘤区被引流到一个或多个所谓的前哨淋巴结。前哨淋巴结也是转移的第一个站点，并且在数种类型的实体瘤中已经显示出如果前哨淋巴结不含有肿瘤细胞，那么淋巴结转移的风险几乎是可以忽略的。术语“转移哨淋巴结”是指从转移的肿瘤或转移瘤区接受淋巴引流的第一个(批)淋巴结。 
本方法的第一步是鉴定一个或多个引流转移瘤的转移哨淋巴结。正如上面提到的那样，定位转移哨淋巴结不一定是容易的工作，因为第一个接受转移瘤的引流液通常不是解剖距离最短的淋巴结。但是，因为本发明人已经发现，转移哨淋巴结与淋巴系统中距转移瘤更远的淋巴结、或肿瘤反应性T淋巴细胞含量基本上为零的无关淋巴结相比，含有更高量的肿瘤反应性T淋巴细胞，因此鉴定一个或多个转移哨淋巴结的步骤i)对于本发明的方法来说是非常重要的。 
鉴定转移哨淋巴结的一种方法是通过将一种或多种淋巴结定位剂注射到患者中，即任何适合于定位淋巴结的物质。这样的定位剂优选为可药用的和/或生物相容的。定位剂可以是基于亲和性的也可以是基于非亲和性的。基于亲和性的淋巴结定位剂的例子是完整抗体或其片 段、纳米抗体、核酸例如RNA、DNA和PNA，它们都使用各种不同的检测方式再行标记。基于亲和性的淋巴结定位剂的检测可以通过用示踪剂和染料标记来进行，例如下面提到的那些。然后可以通过下列来显示：i)在用产生对比的物质例如含有碘的物质或放射性物质例如锝-99m标记后，放射性方法例如X-射线、计算机断层成像、闪烁造影法、正电子发射技术；ii)用磁性或顺磁性物质例如钆、含有颗粒的磁性树状聚合物(magnetodendromers)或氧化铁标记后的磁共振成像；iii)通过用供肉眼或光子检测装置例如CCD或CMOS传感器检测用的染料、荧光染料或化学发光染料标记，在红外-可见-紫外光谱范围中的光。 
基于非亲和性的淋巴结定位剂的例子包括示踪剂和染料。这些物质在毛细淋巴管中运输，并被巨噬细胞通过吞噬作用积累在前哨或转移哨淋巴结中，从而鉴定了肿瘤或转移瘤引流淋巴结。 
示踪剂的例子是放射性物质例如锝-99m，使用光子敏感的底片或传感器例如PET检测器进行基于放射性衰减的检测。此外，可以使用磁性、顺磁性或超顺磁性物质，例如含有对比剂的钆、氧化铁颗粒、磁性氧化物颗粒、用于基于磁共振检测的磁性树状聚合物、对比剂例如碘用于基于放射性检测如计算机断层成像或常规的X-射线。 
染料的例子包括通过发光、近红外、荧光、紫外或可见光下可见的例如偶氮染料、双偶氮染料、三偶氮染料、二芳基甲烷染料、三芳基甲烷染料、蒽醌染料、多环芳香族羰基染料、靛蓝染料。此外，染料还包括用于基于化学发光检测的发光物质和荧光物质，例如用于基于荧光检测的pico green、sybr green、red O oil、德克萨斯红。依赖于所选的波长，检测可以通过肉眼或光子检测装置例如CCD或CMOS传感器来进行。 
在一个实施方案中，染料具有的最大发射使得在正常光线下通过肉眼可见。在另一个实施方案中，染料具有的最大发射使得可以在紫 外光下通过肉眼可见。 
适合的染料或示踪剂的其它的例子出现在WO 04/045650中，在此合并引为参考。 
另一种但是更耗时的鉴定转移哨淋巴结的方法是切除和研究推测的转移瘤引流区中选择的淋巴结。然后可以使用来自实际患者的转移瘤的肿瘤提取物，通过增殖分析来鉴定含有肿瘤反应性T淋巴细胞的淋巴结。 
淋巴结定位剂被注射到患者的转移瘤之中、之上、周围、邻近和/或之下。然后定位剂将通过淋巴管扩散到转移哨淋巴结中，一个或多个淋巴结在一定的时间内将开始获得染色，例如在注射了定位剂物质之后5分钟到30分钟内，例如5分钟到15分钟内，，然后定位剂物质成像。正如上面描述的那样，定位剂的成像当然依赖于所用的定位剂物质。 
如果使用的染料具有的发射最大值允许在正常光线下通过肉眼可见，例如专利蓝(Patent Blue)，则一个或多个转移哨淋巴结被简单鉴定为首先积累有色染料的淋巴结，即，如果使用专利蓝，外科医生将寻找首先积累蓝色的淋巴结。 
定位剂可以通过单次注射或多次注射来注射，例如2次以上注射、3次以上注射、4次以上注射、5次以上注射或6次以上注射。 
如何进行淋巴结定位剂的注射依赖于转移瘤的位置。淋巴结定位剂可以通过非外科程序注射，即不涉及外科手术步骤的程序，其中外科步骤被定义为包括外科手术操作程序的步骤，即涉及用器械切割。在本文内容中，注射，即用针头刺入皮肤，不被认为是外科步骤。因此，通过说明淋巴结定位剂可以通过非外科程序注射，其目的是表示 淋巴结定位剂可以直接或通过皮肤注射到转移瘤之中、之上、周围、邻近和/或之下。 
其中淋巴结定位剂可以被注射到皮肤中或通过皮肤的情况的例子是例如转移瘤位于患者皮肤中的情况。在这种情况下，淋巴结定位剂优选应该被注射到转移瘤上方的皮肤中、或透过皮肤注射到转移瘤之中、周围、邻近、和/或之下。如果转移瘤位于患者的皮下组织中，淋巴结定位剂优选应该被注射到转移瘤上方的皮肤中、或透过皮肤注射到转移瘤之中、周围、邻近、和/或之下。 
正如上面提到的那样，转移哨淋巴结可能不总是位于距转移瘤最短或最符合逻辑的解剖距离上。这种情况的例子是本发明人在本文的实施例中描述的、吃惊地鉴定到在腹股沟淋巴结转移瘤远端和中位的转移哨淋巴结。根据淋巴系统的解剖学，腹股沟中淋巴结转移瘤的转移哨淋巴结的疑似位置应该在皮肤中或皮下脂肪中的近端或在沿着髂骨管的骨盆的深处。 
因此，因为转移哨淋巴结可以位于远离转移瘤的地方，在某些情况下不需要外科手术就注射淋巴结定位剂可能是很有好处的，因为预测这种转移哨淋巴结的位置可能非常困难。理论上，腹股沟中的转移瘤可能在腋窝处具有转移哨淋巴结，即预测在身体中进行切除转移哨淋巴结的外科手术的位置可能是非常困难的。在本发明的特定实施方案中，淋巴结定位剂是放射性物质例如锝-99m，其可以通过非外科程序注射，然后通过进行淋巴闪烁造影来成像。 
前哨淋巴结引流原发肿瘤，它们通常源于该特定个体自从胚胎发育以来就早已具有(priori)的组织好的淋巴引流系统的器官。引流的形式在个体之间可以是不同的。本发明人已经发现，位于不同位置(肝脏、肠系膜脂肪、淋巴结、皮下组织、肌肉等)的转移瘤与第一批引流淋巴结也具有淋巴引流。本发明人称这些淋巴结为“转移哨淋巴结”。 它们更可能通过转移瘤自身的产生淋巴管生成因子(例如VEGF-C)的能力而与淋巴相连。我们已经在这些转移哨淋巴结中鉴定到了肿瘤反应性淋巴细胞(它们已经经历了朝着转移瘤的克隆增殖)，并且我们显示了它们可以保留免疫学性质被增殖并用于细胞免疫治疗。 
淋巴结定位剂也可以涉及外科程序、即包括了切开的程序下被注射。可以包括外科程序的情况的例子是肿瘤的位置使得它不能用针头透过皮肤来达到的情况，或者不可能透过皮肤和组织对定位剂进行成像的情况。 
在这些情况下，外科医生将在转移瘤区域中进行切开，然后可以将淋巴结定位剂直接注射到转移瘤之中、之上、周围、邻近和/或之下，以便鉴定一个或多个转移哨淋巴结。淋巴结定位剂的注射可以包含外科程序的情况的例子是例如如果转移瘤位于腹内区域中、实质性器官中或位于患者的较深部位置的淋巴结中。 
有时转移哨淋巴结的鉴定可以包括通过非外科的和外科的步骤相结合来注射淋巴结定位剂。这样的例子是放射性淋巴结定位剂，例如锝-99m，可以使用针头注射，即不需要外科手术，而定位剂的积累，即转移哨淋巴结的鉴定可以使用γ检测器来进行。这给了外科医生关于转移哨淋巴结的位置的指示。此后，当患者经历外科手术切除转移哨淋巴结和至少一部分转移瘤时，可以注射有色的染料例如专利蓝染料。此外，如果在第一次注射后过去超过大约18到24小时的时间，根据放射性示踪剂的半衰期(通常为大约6小时)追加一次或多次放射性示踪剂的额外注射以在外科手术过程中鉴定转移哨淋巴结，可能是有利的。 
在通过一种或另一种方法定位了一个或多个转移哨淋巴结后，外科医生将切除它们以便研究转移哨淋巴结是否含有任何肿瘤细胞，并为了获得转移瘤反应性T淋巴细胞的培养物。 
从一个或多个转移哨淋巴结收获淋巴细胞可以通过将转移哨淋巴结材料匀浆来进行，以便获得淋巴细胞的单细胞悬浮液。然后可以将单细胞悬浮液用于体外增殖，以便获得转移瘤反应性T淋巴细胞。 
体外增殖 
本发明的方法的体外增殖步骤iii)包括 
i)第一阶段，用肿瘤来源的抗原与至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质一起刺激肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞，以促进肿瘤反应性T淋巴细胞的存活，以及 
ii)第二阶段，激活和促进肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞的生长，其中当T淋巴细胞上的CD25细胞表面标记(IL-2R标记)被下调时，开始第二个阶段ii)。 
i)阶段 
第一阶段i)的目的是获得含有显著高比例的肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞的培养物。第一阶段被认为是“护理阶段”，其中肿瘤反应性T淋巴细胞得到存活和分裂。依赖于T淋巴细胞的来源(用于体外增殖法的起始材料)，它们可能经历的相对严酷的阶段条件，例如被癌细胞分泌的因子阻遏或抑制。 
用于增殖方法的起始材料是从引流转移瘤的淋巴结获得的淋巴细胞的混合物。 
在培养中要增殖的T淋巴细胞可以从待治疗的对象获得，即获得的用于施用的特定肿瘤反应性T淋巴细胞可以是自体的。但是，T淋巴细胞也可以从不同于待治疗的对象的来源获得，例如另一个患有癌症的对象。在这种情况下，接受者与被增殖的肿瘤反应性T淋巴细胞优选为免疫相容的(或使接受者对于增殖的肿瘤反应性T淋巴细胞免疫耐受)。 
起始材料将最可能包含各种不同的淋巴细胞的混合物，例如T淋巴细胞、B-淋巴细胞、抗原呈递细胞、肿瘤反应性T淋巴细胞和未被激活的/无反应性的T淋巴细胞。为了促进肿瘤反应性T淋巴细胞的特异性存活，加入了肿瘤来源的抗原和一种或多种对IL-2受体具有激动活性的物质。 
正如上面提到的那样，第一阶段i)通过加入至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质而起始。这样的物质的功能是通过IL-2受体刺激T淋巴细胞以促进T淋巴细胞的细胞分裂，从而防止细胞死亡。 
T淋巴细胞的抗原特异的MHC限制的活化促进了特异性识别肿瘤细胞的有用的T淋巴细胞种群的克隆增殖。相反，T淋巴细胞的非特异性活化将导致识别不相关肽的T淋巴细胞的克隆的增殖，而与肿瘤细胞的识别没有任何关系，因此大部分非特异性增殖的T淋巴细胞将不识别肿瘤。 
本发明的目的是促进肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和CD8+T淋巴细胞的特异性活化和生长。针对某个肿瘤抗原的特异性活化，使得当将T淋巴细胞用于患有与T淋巴细胞的活化所针对的肿瘤类型相同的癌症患者时，T淋巴细胞具有治疗效果。 
在本发明的一个实施方案中，激动剂是对IL-2受体具有激动活性的物质。这样的物质的例子包括蛋白、多肽、肽、抗体、亲和体(affibodies)、及其片段、融合蛋白、合成的和/或有机的分子例如小分子、以及天然配体。在优选实施方案中，物质是IL-2受体的天然配体，即IL-2。 
如果使用IL-2，它优选以低剂量加入，以便减少淋巴细胞的凋亡和增加CD4阳性肿瘤反应性T淋巴细胞的种群。在本发明的具体实施 方案中，低剂量IL-2从大约100IU/ml培养基到大约700IU/ml培养基，例如从大约100IU/ml培养基到大约600IU/ml培养基、从大约100IU/ml培养基到大约500IU/ml培养基、从大约100IU/ml培养基到大约400IU/ml培养基、从大约100IU/ml培养基到大约300IU/ml培养基和从大约100IU/ml培养基到大约200IU/ml培养基。在具体的实施方案中，加入的IL-2的量是240IU/ml。 
在使用IL-2之外的、具有针对IL-2受体激动活性的物质的情况下，它们的具体的剂量应该使得产生与通过上面提到的剂量的IL-2获得的效果相应的效果。 
在阶段i)的整个过程中，可以定期加入其他量的对IL-2受体具有激动活性的至少一种物质，例如阶段i)的每2天、每3天或每4天，以维持促进细胞分裂的最适条件。术语每2天、每3天或每4天是指阶段i)的整个过程中，在第一次加入对IL-2受体具有激动活性的至少一种物质后，即阶段i)开始后，从第2天、第3天或第4天开始，每个第2天、第3天或第4天加入对IL-2受体具有激动活性的至少一种物质。 
在一个实施方案中，在阶段i)的整个过程中定期加入的物质是IL-2受体的激动剂。在优选的实施方案中，该物质是IL-2。 
被定期、例如每2天、每3天或每4天加入的对IL-2受体具有激动活性的物质、例如IL-2的其他剂量在上面提到的范围内。 
在增殖的第一阶段i)中的另一个重要步骤是加入肿瘤来源的抗原，以促进表达识别肿瘤抗原的T淋巴细胞受体的T淋巴细胞、即肿瘤反应性T淋巴细胞的细胞分裂。 
加入肿瘤抗原的最适时间点依赖于淋巴细胞的来源。当淋巴细胞发源于淋巴结时，淋巴细胞可能已经经历了肿瘤细胞的紧密接近并被 肿瘤细胞所免疫抑制，因此需要用对IL-2受体具有激动活性的物质例如IL-2孵育一些天，以便促进T淋巴细胞在肿瘤抗原呈递后增殖反应的能力。因此，在这样的情况下，肿瘤来源的抗原优选在第一阶段i)从第2天到第5天(含)加入，例如在第2天、第3天、第4天或第5天。 
肿瘤来源的抗原，例如肿瘤匀浆液，可能被起始材料中存在的抗原呈递细胞例如B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞所内吞和处理。在大多数情况下，肿瘤来源的抗原将被II类MHC分子所呈递，导致CD4+肿瘤反应性T淋巴细胞的细胞分裂。但是，通过交叉呈递，通过内吞作用被摄入的抗体可以被处理并呈递在I类袋中，导致CD8+T淋巴细胞的活化。正如上面描述的那样，增殖方法的一个目的是为了在某些方面起动患者自身免疫系统的天然途径，以及为了在一定程度上让患者免疫系统的成分根据抗原是被MHC I还是MHC II所呈递来决定产生CD4+还是CD8+淋巴细胞。在大多数情况下，抗原将被II类MHC分子呈递，引起CD4+T淋巴细胞产生，但是在某些情况下产生CD8+T淋巴细胞。 
阶段ii) 
第二阶段ii)的目的是活化和增殖通过第一阶段i)获得的肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞，并通过将它们导入所需的途径获得特定的肿瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞的亚群。 
本发明人已经发现，确定起动阶段ii)的最适时间点的一种方法是通过监测CD25细胞表面标记在T淋巴细胞上的表达，从而特异性地确定T淋巴细胞何时对重新刺激易感。本发明人已经发现第二阶段ii)优选应该在CD25在T淋巴细胞上的表达被下调时起动。CD25是一种活化标记，表明淋巴细胞已经接收到了活化信号。如果第二阶段在在淋巴细胞上CD25的表达高的时候起动，意味着淋巴细胞已经收到了信 号，将会发生细胞死亡。 
CD25的下调被定义为相当部分的T淋巴细胞种群仅表达非常少的或基本上不表达CD25标记。在优选的实施方案中，CD25的下调被定义为少于5％的T淋巴细胞种群表达CD25，即培养物中95％以上的T淋巴细胞完全不表达CD25。5％以下的表达CD25的T淋巴细胞更可能是调节性CD4+T淋巴细胞，它们具有高的、永久性的CD25表达。此外，T淋巴细胞种群优选应该仅表达非常少的或基本上不表达FoxP3标记，这是调节性T淋巴细胞的特异性标记。在优选的实施方案中，FoxP3的下调被定义为少于5％的T淋巴细胞种群表达FoxP3，即培养物中95％以上的T淋巴细胞完全不表达FoxP3。 
除了CD25之外，还有其它的标记，它们的表达与为了确定起动第二阶段的最适时间点的监控有关。这样的标记的例子是早期活化标记CD69，以及T淋巴细胞的活化标记MCH II。因为CD69和MCH II的表达表明T淋巴细胞的“活化程序”已经打开，这意味着细胞不能对其它的刺激作出反应，因此在第二阶段起动之前这两种标记优选都应该被下调。术语下调可以被定义为少于5-10％的T淋巴细胞种群表达CD69和/或MCH II。 
在本发明的另一个实施方案中，抗CD4抗体被用来在增殖方法的阶段ii)的增殖中，将辅助性T细胞与培养物中可能的肿瘤细胞分开。 
在本发明的其他或另一个实施方案中，产品例如带有抗CD3和抗CD28抗体的Dynabeads 
Figure G42407486150138000D000241
被用于促进增殖方法的阶段ii)中的增殖。使用Dynabeads CD3/CD28将为淋巴细胞提供活化信号，并也可以用于与培养物中的可能的肿瘤细胞的分离。Dynabeads 
Figure G42407486150138000D000243
CD3/CD28在阶段i)期间将与T淋巴细胞增殖抗原特异性结合，这样这些细胞现在可以磁性富集。因为最初的抗原特异性活化已经起动并导致了T淋巴细胞的克隆增殖，因此Dynabeads 
Figure G42407486150138000D000244
CD3/CD28的再刺激将进一步促进克隆增 殖，因为阶段i)不支持非特异性的T淋巴细胞克隆的活化。 
尽管阶段ii)的精确的起始点将依赖于淋巴细胞何时获得优选表达的特定标记而变化，但阶段ii)最通常从第一阶段i)的第17天到(含)第23天起动，例如在第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天或第23天。换句话说，淋巴细胞表达优选的标记的量和组合的时间点，最通常被发现是在第一阶段i)的第17天到第23天。 
T淋巴细胞的增殖，即阶段i)和ii)最通常发生在适合的培养基中。优选使用无血清的培养基或自体培养基以避免传播疾病给患者的风险。适合的标准培养基的例子包括AIMV培养基、RPMI1640、DMEM和MEM。但是，其它的含有适当混合的氨基酸、类固醇、维生素、生长因子、细胞因子和矿物质的培养基也可以使用。 
在增殖的两个阶段中，细胞可以被分到几个培养管中以便在培养物中维持适当的细胞密度。在增殖阶段中T淋巴细胞的密度优选应该为每毫升培养基大约3百万到大约6百万个细胞。 
在增殖过程中，可能还需要用新鲜的培养基更换培养物的步骤，这个步骤被命名为培养基的调制。培养物分份和调制培养基的时间点可以根据细胞的形态学和细胞培养物的密度(不应该超过每毫升大约6百万个细胞)来确定，或者培养基中可以含有适当的指示剂，例如苯酚指示剂。在培养基中含有指示剂的情况下，分份培养物和调制培养基的时间点可以根据培养基的颜色来确定。如果使用酚红指示剂，当培养基变黄时，表明培养物的pH正在变为酸性，应该对细胞分份或调制。适合用在本发明中的调制培养基的安排可以是每3-9天，例如一星期一次，替换四分之一到二分之一的培养基，例如三分之一的培养基 
除了这里描述的具体的条件之外，对于其它的参数将使用用于淋巴细胞培养物生长的标准条件，例如温度为37℃和5％的CO2。 
正如上面提到的那样，第二阶段ii)通过在T淋巴细胞中加入上面定义的肿瘤来源的抗原，用于活化肿瘤反应性的CD25阴性的T淋巴细胞，以促进肿瘤反应性T淋巴细胞的克隆增殖。 
在本发明的具体实施方案中，抗原呈递细胞(APC)与肿瘤来源的抗原一起被加入到T淋巴细胞中。抗原呈递细胞(APC)包括白细胞，例如单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，例如B细胞。这些不同的细胞类型都具有共同的能力，以被特异性T淋巴细胞受体识别的形式呈递抗原。白细胞制备物从例如从待治疗的患者获得的血液、淋巴液、骨髓、淋巴器官组织或组织培养液中分离。在优选的实施方案中，APC细胞是被辐射的含有抗原呈递B细胞和/或单核细胞的外周血白细胞。加入的APC的量在每毫升淋巴细胞培养物大约50万个APC到每毫升淋巴细胞培养物大约5百万个APC的范围内，例如从每毫升淋巴细胞培养物大约1百万个APC到每毫升淋巴细胞培养物大约4百万个APC、从每毫升淋巴细胞培养物大约1百万个APC到每毫升淋巴细胞培养物大约3百万个APC、或从每毫升淋巴细胞培养物大约1百万个APC到每毫升淋巴细胞培养物大约2百万个APC。 
除了在T淋巴细胞中添加肿瘤来源的抗原以促进肿瘤反应性T淋巴细胞的克隆增殖之外，第二阶段ii)还包括了向所需的亚种群中添加其功能是引导肿瘤反应性T淋巴细胞的增殖的特定成分。 
正如上面提到的那样，本发明提供了产生肿瘤反应性CD4+辅助性T淋巴细胞的方法。当肿瘤抗原与主要组织相容性复合物II类分子连接时，CD4+辅助性T淋巴细胞能够识别和结合抗原。活化的CD4+辅助性T淋巴细胞分泌刺激免疫系统的其它细胞例如其它淋巴细胞的细胞因子、蛋白和/或肽。分泌的最常见的细胞因子是白介素-2(IL-2)，它是有效的T淋巴细胞生长因子。活化的增殖CD4+辅助性T淋巴细胞可以分化成两种主要的细胞亚型，Th1和Th2细胞，它们是在产生的 特定的细胞因子的基础上定义的。Th1细胞产生γ-干扰素和白介素-12(IL-12)，而Th2细胞产生白介素-4、白介素-5和白介素-13。Th1 T淋巴细胞据信促进了细胞毒性T淋巴细胞(Tc)、自然杀伤细胞、巨噬细胞和单核细胞的活化，这些细胞都能攻击癌细胞并针对肿瘤起普遍防御作用。 
Th1和Th2类型的辅助性T淋巴细胞(CD4+)可以分化成记忆细胞和效应细胞。记忆性辅助性T淋巴细胞(CD4+)对于它们第一次遇到的抗原具有特异性，并在第二次免疫反应中可以被招起，产生对肿瘤抗原的更快速和更大的反应。在人类中有证据表明淋巴细胞存活至少20年，也许是终身。效应性CD4+T淋巴细胞是产生细胞因子和INF-γ的活性细胞。 
为了有效地治疗癌症，施用Th1型的肿瘤反应性T淋巴细胞是特别有益的，因为这种类型据信促进了细胞毒性T淋巴细胞(Tc)、自然杀伤细胞、巨噬细胞和单核细胞的活化，所有这些细胞都能攻击癌细胞并针对肿瘤起普遍防御作用。即，在特定的实施方案中，本发明涉及产生肿瘤反应性CD4+辅助性T淋巴细胞的方法，在另一个实施方案中，通过本方法产生的Th2型T淋巴细胞的百分数是30％以下，例如25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、5％以下或0％，即至少70％的肿瘤反应性CD4+T淋巴细胞是Th1型的，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。 
因此，第二阶段可以包括添加能够上调T淋巴细胞上IL-12R的物质。IL-12R的上调将增加T细胞接受和优化IL-12细胞因子活化的就绪性，产生最大的STAT-4信号，从而使淋巴细胞偏向于Th1细胞和INF-γ产生。 
能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质可以是对干扰素受体具有激动活性的物质。在本发明的一个实施方案中，对干扰素受体具有激 动活性的物质是激动剂。这样的物质的例子包括蛋白、多肽、肽、抗体、亲和体、及其片段、融合蛋白、合成的和/或有机的分子例如小分子、以及天然配体。在特定的实施方案中，该物质是干扰素受体的天然配体，即干扰素，例如干扰素-α。 
加入能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质的最适时间点，例如对于扰素受体具有激动活性的物质，可以通过测量培养基中的IL-12水平来确定。物质应该优选在IL-12的水平与阶段ii)的第1天的IL-12水平相比至少增加1倍、例如至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍的时候被加入。在大多数情况下，IL-12的水平的这种增加将在第二阶段ii)起动后的第2天到(含)第4天看到，例如在第2天、第3天或第4天。 
为了基本上避免产生Th2型的肿瘤反应性T淋巴细胞，第二阶段还可以包括加入一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞的发育的物质。这样的物质的例子是能够中和白介素IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β(后者不是白介素)的物质，所有这4种物质都是建立Th2细胞因子分布形式和下调Th1细胞因子产生所需要的。 
这样的物质的例子包括蛋白、多肽、肽、可溶性受体、抗体、亲和体、及其片段、融合蛋白、合成的和/或有机的分子例如小分子、以及天然配体。在具体的实施方案中，物质选自结合白介素从而中和它们的抗体，例如抗IL-4抗体、抗IL-5抗体和/或抗IL-10抗体，以及可溶性受体(例如TGF-β受体I和II)和TGF-β的结合蛋白(例如LAP和/或LTBP)。 
一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞的发育的物质，例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质，可以在第二阶段ii)的第1天加入。但是，因为，因为抗体是昂贵的，因此抗体的加入也可以在加入能够上调T淋巴细胞上IL-12R的物质之后，例如在加 入能够上调T淋巴细胞上IL-12R的物质之后1天、2天或3天的后续步骤中进行。 
中和性物质应该以足够中和白介素的量被加入，例如超过要中和的白介素的量的10-100倍(摩尔的)。当使用抗体时，一般需要终浓度为每毫升培养基大约2到大约4ng。对于其它类型的中和物质来说，应该使用与上述浓度的抗体产生同样效果的终浓度。 
为了维持对Th2型T淋巴细胞发育的抑制，在阶段ii)的整个过程中，可以定期、例如阶段ii)的每2天、每3天或每4天加入补充量的一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质，例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质。术语每2天、每3天或每4天应该被理解为是指阶段i)的整个过程中，在第一次加入至少一种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质之后的第2天、第3天或第4天开始，每2天、每3天或每4天加入至少一种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质。 
此外，与阶段i)一样，在阶段ii)的整个过程中，可以定期、例如阶段ii)的每2天到4天、即第2天、第3天或第4天加入补充量的对IL-2受体具有激动活性的物质，例如激动剂，以便维持促进细胞分裂的最适条件。被定期加入的物质的剂量在阶段i)中加入对IL-2受体具有激动活性的物质、例如IL-2时提到的最适范围之内。 
为了有利于Th1型肿瘤反应性T淋巴细胞的产生，第二阶段ii)可以包括加入一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质。这样的物质的例子是对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质。更具体来说，物质可以是IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动剂。这样的激动剂的例子包括蛋白、多肽、肽、抗体、亲和体、及其片段、融合蛋白、合成的和/或有机的分子例如小分子、以及天然配体。在具体的实施方案中，物质分别是IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的天 然配体，例如IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21。 
IL-12的效应是通过刺激IL-12R进而促进Th1淋巴细胞的活化来活化IFN-γ诱导的STAT途径。IL-21的功能是增强Th1型T淋巴细胞的增殖、活化和发育。 
IL-7和IL-15通过促进T淋巴细胞的稳态增殖，增强被活化的Th1程序化T淋巴细胞的计数起作用。 
加入一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质的最适时间点是在T淋巴细胞对修饰易感的时候。如果在T淋巴细胞对修饰不易感的时候加入物质，加入是无效的，即Th1型T淋巴细胞的发育将不会有利。为了确定促进Th1型T淋巴细胞发育的物质、例如对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质加入的最适时间点，可以监测T淋巴细胞产生的INF-γ。在优选的实施方案中，一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质，例如对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质，应该在INF-γ的水平与第二阶段ii)起动时的INF-γ水平相比增加的时候被加入。 
在具体的实施方案中，INF-γ水平增加可以被确定为与第二阶段ii)起动时的INF-γ水平相比，INF-γ的水平增加了至少1倍，例如至少2倍、至少3倍、至少4倍。通常这样的增加可以与下述情况相关：培养基中IFN-γ的含量应该为每毫升培养基至少100pg，例如每毫升培养基至少150pg、每毫升培养基至少200pg或每毫升培养基至少250pg。 
在确定促进Th1型T淋巴细胞发育的物质、例如对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质加入的最适时间点时，人们可以进一步观察CD4+T淋巴细胞上的活化标记CD25和CD69的表达，这些标记应该优选被上调。上调被理解为与阶段ii)的第1天时T淋巴细胞上的CD25和CD69的表达相比，至少大约40％到大约60％以上的 CD4+T淋巴细胞将表达CD25和CD69，这表明T淋巴细胞已经接受了活化信号。 
正常情况下，加入促进Th1型T淋巴细胞发育的物质的最适时间点将在加入能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质和能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质的步骤之后。更具体来说，加入促进Th1型T淋巴细胞发育的物质的最适时间点将在第二阶段ii)起动后的第5天到第8天之间，例如在第5天、第6天、第7天或第8天。 
在加入IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21的情况下，培养基中每种这些物质的浓度应该在每毫升培养物大约150IU到每毫升培养物大约300IU的范围内，例如每毫升培养物250IU。当使用上面提到的具体物质之外的物质时，它们应该以产生的效果与加入上面提到的具体范围之内的IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21时相同的终浓度被添加到培养物中。 
正如上面提到的那样，本方法优选用于增殖T淋巴细胞，以便获得Th1型CD4+肿瘤反应性T淋巴细胞。本发明的另一个方面是通过使用本文描述的用于增殖肿瘤反应性T淋巴细胞的方法，获得相对高含量的记忆型T淋巴细胞。在癌症的治疗中，待治疗的患者接受高含量的效应性肿瘤反应性CD4+T淋巴细胞当然是重要的，因为正如上面提到的那样，这促进了细胞毒性T淋巴细胞(Tc)、NK细胞、巨噬细胞和单核细胞的活化，所有这些细胞都能攻击癌细胞并针对肿瘤起普遍防御作用。 
但是，通过在同时施用大量的记忆性肿瘤反应性CD4+T淋巴细胞，患者获得了针对肿瘤复发或原发肿瘤转移的终生保护。 
因此，本发明涉及制备记忆性T淋巴细胞的方法。一般情况下，当按照本发明增殖肿瘤反应性T淋巴细胞的培养物时，将会获得大约 35％到大约90％的记忆型肿瘤反应性T淋巴细胞，例如大约40％到大约90％、大约50％到大约80％或大约60％到大约70％。本发明人推测，阶段i)中在加入肿瘤抗原之前使淋巴细胞再生的事实，以及相对缓慢的增殖阶段，导致了形成记忆性淋巴细胞与效应性淋巴细胞的高比例。 
正如上面提到的那样，T淋巴细胞上的细胞表面活化标记CD25和CD69的表达可以被用于确定何时起动本方法的重要步骤，例如，何时起动第二阶段ii)。因此，在阶段i)和阶段ii)的整个过程中，连续地监测CD25和CD69的表达可能是有益的，例如每2天、每3天或每4天。 
因为本发明方法的一个目的是为了获得大量的可以施用于患者的特异性CD4+肿瘤反应性T淋巴细胞，肿瘤反应性T淋巴细胞可以在某些点收获，导致增殖步骤的终止。收获肿瘤反应性T淋巴细胞的最适时间点是在T淋巴细胞上的CD25的表达被下调的时候，其中下调被定义为5％以下的CD4+T淋巴细胞种群表达CD25。收获的最适时间点也可以根据测量IFN-γ产生的量来确定。与初始的IFN-γ产生相比，IFN-γ的产生应该增加至少2倍，例如增加至少3倍、至少4倍或至少5倍，这一般相当于IFN-γ的水平为至少每毫升培养基100pg。 
一般情况下，该事件将在第二阶段ii)起动后的第10天到(含)第14天发生，即一般情况下细胞将在第二阶段ii)起动后的第10天到(含)第14天之间收获。 
因此，本发明的肿瘤反应性T淋巴细胞增殖的整个过程一般将花费从大约25天到(含)大约45天，例如大约26天到(含)大约44天、大约27天到(含)43天、大约27天到(含)42天、大约27天到(含)41天以及大约27天到(含)大约40天。 
当CD25标记被下调时，除了收获肿瘤反应性T淋巴细胞之外， 还可以将它们进行另外一轮或多轮的阶段ii)。如果通过表达方法获得的肿瘤反应性T淋巴细胞的量被认为不是施用给患有癌症的患者的有效量，或者如果患者在进行化疗治疗方案中、而推迟施用T淋巴细胞直到化疗治疗完成后被认为是有益的，则这样做被认为是有好处的。为了确定肿瘤反应性T淋巴细胞是否应该进行另外一轮或多轮的阶段ii)，人们可以观察产生的IFN-γ的水平、和/或获得的肿瘤反应性T淋巴细胞的总数和/或CD25的表达。在IFN-γ的水平是每毫升培养基30pg以下，例如每毫升培养基20pg以下、和/或T细胞的总数不令人满意的情况下，从大多数T细胞是CD25阴性(即少于5％的T淋巴细胞种群表达CD25)并从而对于再刺激易感的时候开始，可以起动其它轮的第二阶段ii)。 
收获后，肿瘤反应性T淋巴细胞可以通过任何常规的方法进行纯化，例如通过使用密度梯度，例如Ficoll培养基。在肿瘤反应性T淋巴细胞的收获和纯化之后，一部分肿瘤反应性T淋巴细胞可以通过冷冻在适合的冷冻培养基中储存。 
治疗方法 
通过改进的增殖方法获得的肿瘤反应性T淋巴细胞在这里被用于治疗患有播散性癌症的患者。 
施用的肿瘤反应性T淋巴细胞的有效量的定义依赖于淋巴细胞的具体类型、记忆性与效应性T淋巴细胞的比率以及疾病的严重性。但是，可以施用的平均最少值为至少1千万，例如至少2千万、至少3千万、至少4千万、至少5千万、至少6千万、至少7千万、或至少8千万个肿瘤反应性T淋巴细胞。本发明人对于在单剂中施用的肿瘤反应性T淋巴细胞的量没有鉴定出任何上限。 
在优选实施方案中，用于给药的肿瘤反应性T淋巴细胞含有效应性T淋巴细胞和记忆性T淋巴细胞的组合。更具体来说，记忆型肿瘤 反应性T淋巴细胞的量可以为大约35％到大约90％，例如大约40％到大约90％、大约50％到大约80％或大约60％到大约70％，效应性T淋巴细胞的百分率为大约10％到大约65％，例如大约20％到大约50％或大约30％到大约40％。 
肿瘤反应性T淋巴细胞可以被配制成适合于患者肠胃外给药的药物组合物，例如静脉内、动脉内、鞘内或腹膜内施用。 
当肿瘤反应性T淋巴细胞肠胃外施用时，它们可以配制在等渗培养基中，即在与血液具有相同的渗透压的培养基中，该培养基中含有一种或多种防止细胞聚集的物质。适合的培养基的具体例子是含有最多3％人血清白蛋白、例如最多2％人血清白蛋白或最多1％人血清白蛋白的0.9％NaCl溶液。对于静脉给药来说，要给药的组合物中的肿瘤反应性T淋巴细胞的浓度通常在每毫升培养基大约50万个淋巴细胞到每毫升培养基大约4百万个淋巴细胞的范围之内，例如每毫升培养基大约50万个淋巴细胞到每毫升培养基大约3百万个淋巴细胞、每毫升培养基大约50万个淋巴细胞到每毫升培养基大约2百万个淋巴细胞、或每毫升培养基大约1百万个淋巴细胞到每毫升培养基大约2百万个淋巴细胞。 
含有肿瘤反应性T淋巴细胞的组合物可以单剂也可以多剂给药。它可以用1到2小时输注。依赖于疾病的严重性，治疗方法可以进行1次或重复进行。此外，疾病复发后，治疗可以重复进行。 
本发明的治疗可以用播散性癌症的任何其它相关的治疗方法来补充。这样的补充治疗可以在施用淋巴细胞之前、同时或之后进行，并可以以这种治疗通常使用的频率来进行。补充治疗的适合的例子是化疗等。 
试剂盒 
本发明还涉及了用于本发明的方法的试剂盒，试剂盒含有用于培养T淋巴细胞的培养基。培养基可以是任何适合的无血清培养基，例如AIMV、RPMI1640、DMEM或MEM。 
试剂盒还含有一种或多种用于刺激、活化和引导肿瘤反应性T淋巴细胞的物质。这样的物质的例子可以是肿瘤来源的抗原、对IL-2受体具有激动活性的物质、能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质、能够对抗Th2型T淋巴细胞的发育的物质和/或促进Th1型T淋巴细胞的发育的物质。 
更具体来说，这样的物质可以是IL-2、α-干扰素、抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-10抗体、IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21。 
试剂盒还可以含有适合于静脉给药的药物组合物。药物组合物可以在给药前与肿瘤反应性T淋巴细胞的种群混合。 
试剂盒还可以含有一个或多个注射器和淋巴结定位剂。在一个实施方案中，注射器中预先装有淋巴结定位剂。 
试剂盒还可以含有使用说明书，例如计算机软件形式的说明书。 
附图说明
图1是显示了腹股沟淋巴结转移瘤远端和中部的转移哨淋巴结的淋巴闪烁造影。 
图2是显示了颈部淋巴结转移瘤远端和中部的转移哨淋巴结的淋巴闪烁造影。 
图3说明了肿瘤引流淋巴结的鉴定。图3A显示了蓝色染料如何被注射到肿瘤周围以及染料如何在毛细淋巴管中运输，从而指示了淋巴引流(用白色箭头标明)。图3B显示了在注射染料后几分钟肿瘤引流淋巴结如何变蓝。白色箭头标明肿瘤引流淋巴结。 
图4显示了最初的前哨淋巴结淋巴细胞被肿瘤抗原和低剂量的IL-2活化，导致了活化标记CD25的活化和表达(上图)。阶段I活化期的结束由表达CD25的CD4+T细胞的数量的减少来确定(下图)。当少于5％的CD4+T细胞表达CD25时，用抗原再次刺激来起动阶段II。 
图5说明了阶段I和阶段II的活化导致了CD4+辅助性T细胞的增殖和富集。 
图6说明了在阶段I中大部分的细胞是未接触抗原的CD62L+细胞或活化的CD69+CD62L+细胞。在阶段II后，大部分的细胞是CD62L-，并由记忆性和效应性CD4+辅助性T细胞组成。CD62L-T细胞不表达优选的淋巴结归巢分子，因此它们在非淋巴器官中寻找炎性区域。 
图7显示了来自肿瘤(肿瘤滤过性淋巴细胞)、转移哨淋巴结(SN)和无关的淋巴结(LN)的在阶段I被刺激的原代细胞，不产生或仅产生很少的IFN-γ。 
图8显示了在阶段ii)后的增殖后，抗原依赖性IFN-γ产生存在剂量依赖性增加。 
图9显示通过TCR Vβ表达的选择性富集研究，增殖和活化方案促进了抗原特异性T细胞克隆的增殖。 
下面的实施例用于说明本发明，但不以任何形式对本发明进行限制。 
实施例
实施例1 
鉴定转移瘤的转移哨淋巴结 
研究包括8名患者(4名男性和4名女性)(参见表1)；平均年龄为61.4岁。他们中的一个经历了两次手术，在两次过程中都定位了转移哨淋巴结。转移哨淋巴结通过三种原理不同的方法定位。淋巴结定位剂被注射到腹部复发肿瘤、实质性肝脏转移瘤或腹股沟淋巴结转移瘤的周围并与之接近。 
表1、研究中患者的概述 
  患者编  号   年  龄   性  别   原发肿瘤  部分   转移哨淋巴结  的来源   转移哨淋巴  结的数量   转移性疾病的阳  性/阴性
  1   48   男   盲肠   局部复发   3   阳性
  2   54   男   直肠   肝脏转移瘤   2   阴性
  3   77   女   乙状结肠   肝脏转移瘤   3   阴性
  4   73   男   升结肠   肝脏转移瘤   4   阴性
  5   66   男   升结肠   肝脏转移瘤   4   阴性
  6   51   女   卵巢癌   肝脏转移瘤   3   阳性
  7   63   女   卵巢癌   腹股沟淋巴结   转移瘤   2   阳性
  8   59   女   胰腺癌   局部复发   4   阳性
第一名患者是48岁的男性，以前因为盲肠癌进行了右侧结肠部分切除手术。1年后，他在吻合术区域旁边的肠系膜脂肪中发展出了5cm大的腹腔复发肿瘤。吻合区与复发肿瘤进行全部切除。将专利蓝染料注射到转移瘤周围，并鉴定了沿着中结肠动脉的3个转移哨淋巴结，包括一个在肠系膜根部的尖淋巴结。 
第二名患者是54岁的男性，因为直肠癌进行了腹腔会阴直肠切除手术，尽管在手术前没有发现远距离的转移，但本发明人在其左肝叶中发现了肝脏转移瘤。手术后进行了腹部CT扫描，转移瘤外径3厘米，位于第二和第三肝段之间。两个月后，他进行了部分左侧肝脏切除手术，将专利蓝染料注射到肝实质中转移瘤周围和附近。大约5分钟后，在肝十二指肠系带中发现了两个转移哨淋巴结。术中的超声没有能够证实肝脏中的任何其它转移瘤。在转移哨淋巴结中没有出现肿瘤细胞；但是转移哨淋巴结中的淋巴细胞显示出对转移瘤的特异性活性。 
尽管开始用肿瘤反应性淋巴细胞进行治疗并且总体情况良好，但是他在右侧肝叶中发展出了新的肝脏转移瘤，并进行了第二次肝切除 手术。在这次手术中，在2厘米大的转移瘤的周围注射专利蓝染料，鉴定出了位于肝门中的2个转移哨淋巴结。 
第三名患者是77岁的女性，两年前因为乙状结肠癌进行了乙状结肠切除手术。在随访时发现了CEA升高，并且用PET扫描和CT扫描进一步调查显示出在右侧肝叶的VI和VII段之间有4厘米的转移瘤。进行了右侧肝脏次全切除术，在注射专利蓝染料后在肝门发现了3个转移哨淋巴结。 
4号患者是73岁的男性，因为乙状结肠中的肿瘤进行了乙状结肠切除手术。1年多以后，他发展出了2厘米大小的孤立性肝脏转移瘤，手术部分切除V和VI段。在转移瘤的周围和附近的4个不同的位置注射了总共1.0ml专利蓝染料后，在肝门中鉴定了1个转移哨淋巴结。对淋巴结的分析表明它不具有转移疾病的迹象，但是它含有肿瘤反应性淋巴细胞。 
5号患者是66岁的男性，以前因为升结肠癌进行了右侧结肠部分切除手术。在常规的结肠癌术后随访中，CT扫描显示出在右侧肝叶的VII段中的2.5厘米孤立性转移瘤。在手术中，在转移瘤附近的肝组织中注射了1.0ml专利蓝染料，在肝十二指肠系带中定位了两个以及在肝门中定位了两个转移哨淋巴结。在摘除转移哨淋巴结的同时一起切除了VI-VIII段。 
6号病例是51岁的女性，6年前由于卵巢癌进行了子宫切除手术和双侧输卵管卵巢切除手术。随后，癌症播散到腹部和腹膜，仅进行了姑息治疗。她具有大的、部分坏死的肝脏转移瘤。手术时，在向肝脏转移瘤附近注射了专利蓝染料后，在腹部中央鉴定了3个转移哨淋巴结。转移哨淋巴结中都含有肿瘤细胞和肿瘤反应性淋巴细胞。 
7号患者是63岁的女性，因为卵巢癌进行了双侧卵巢切除手术。 在手术中发现她的病扩散到了网膜，在此后经历了几次消瘤手术，包括由于肿瘤转移切除了右结肠。1年后她在左腹股沟发展出了抗性，细针活组织检查证实了来自卵巢癌的转移瘤，在可触知的转移瘤附近的4个位置皮下注射了示踪剂锝99(4×0.25ml，50MBeq/ml)之后，淋巴闪烁造影惊奇地证实了两个靠近在一起的位于腹股沟淋巴结转移肿瘤的远端和中部的转移哨淋巴结(参见图1)。在淋巴闪烁造影几小时后的外科手术过程中，通过在示踪剂的同样位点注射专利蓝染料，该淋巴结被进一步鉴定为引流转移瘤的蓝色转移哨淋巴结。 
8号患者是59岁的女性，由于胰腺癌进行了Whipples手术。两年后诊断出局部复发肿瘤，进行了消瘤手术，在原位复发肿瘤附近和上方注射了专利蓝染料之后，其中发现了4个转移哨淋巴结。 
细胞角蛋白抗体被用于检测恶性细胞。没有转移瘤的淋巴结中的淋巴细胞被自发活化，正如在增殖分析中用肿瘤匀浆液刺激后它们分泌γ-干扰素的能力所显示的那样。来自转移瘤的转移哨淋巴结的淋巴细胞起初对这种刺激反应弱，表明它们被转移瘤免疫抑制了。但是，来自非转移瘤和转移瘤淋巴结的细胞都能在体外被增殖到很高的数量，如实施例2显示。 
实施例2 
肿瘤反应性T淋巴细胞的增殖 
使用本文描述的方法进行了转移哨淋巴结的鉴定。 
转移哨和非转移哨淋巴结被切成两半，一部分淋巴结被送去按照常规程序进行组织病理学检验。一部分包括浸润边缘的样品的转移瘤被取下用作其他程序中的抗原来源。 
细胞培养 
阶段I，初始活化 
将转移哨淋巴结材料放在冰上，立即使用AIM 
Figure DEST_PATH_GSB00000455915100021
培养基(Invitrogen)在所有时间对其进行护理。通过在松散安装的玻璃匀浆器中轻柔匀浆，然后将匀浆细胞在培养基中洗两次，获得转移哨淋巴结淋巴细胞的单细胞悬浮液。转移哨淋巴结淋巴细胞以每毫升4百万个细胞放置在细胞培养瓶中，加入白介素-2(IL-2) Chiron)到浓度为240IU/ml培养基。 
自体转移瘤提取物通过用Ultra Turrax在5倍体积(w/v)的2xPBS中匀浆、然后在97℃变性5分钟来制备。在开始细胞培养后3到4天，以1/100的浓度加入自体肿瘤提取物。对于长时间培养来说，细胞被保持在37℃和5％CO2的细胞培养箱中，每3-4天加入240IUIL-2/ml培养基。 
阶段II，活化和增殖 
18-22天后，监测细胞培养物中CD25的表达。当表达CD25的细胞的数量降低到5％以下时，通过加入浓度为1/100的自身转移瘤提取物，在阶段II中重新刺激细胞(图4)。为了有效的抗原呈递，使用Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences，GE Healthcare)收集自体的PBMC，用2500rad进行辐射，并加入到细胞培养物中。在重新刺激3天后，加入浓度为100-500IU/ml的α-干扰素(Introna)以及抗IL-4抗体，使浓度为2μg/ml。5到8天后，在增殖物中加入IL-12(4ng/ml)，以便促进对产生IFN-γ的Th1细胞的诱导。 
在注入患者的前一天，将细胞培养物用Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences，GE Healthcare)进行纯化，以便回收培养物中的活细胞。在注入当天，将细胞在盐水溶液(Natriumklorid Baxter Viaflo9mg/ml，Baxter)中洗两次，然后转移到含有100-200ml盐水溶液和1％人血清白蛋白(Baxter)的转移包中。在注入前检测微生物的存在。细胞的输注在专业医务人员的监督下在1-2小时过程中进行。 
免疫学评估 
使用氚标记的胸腺嘧啶掺入增殖分析进行了进一步的免疫学评估。设置了转移哨结淋巴细胞的等份试样用于该目的，非转移哨结淋巴细胞的单细胞悬浮液通过在松散安装的玻璃匀浆器中温和加压获得，外周血白细胞通过Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences，GEHealthcare)进行纯化。 
细胞在含有2.5％胎牛血清(FCS)(Life technologies)的RPMI1640(Life technologies)中重新悬浮并清洗两次。最后，将细胞重新悬浮在含有10％人类AB血清(Sigma)、1％青霉素-链霉素(Sigma)和1％谷氨酰胺(Sigma)的RPMI 1640增殖培养基中。淋巴结细胞和纯化的PBL以3×105个细胞/孔用在96孔板中，使用三份平行的1/100、1/10稀释的转移瘤匀浆液或10μg/ml的Con A(Sigma)进行刺激。在收获前18小时通过在每个孔中加入1μCi的3H-胸腺嘧啶，在第5、第6和第7天测量增殖。对样品进行闪烁计数。 
在细胞培养开始时，为了测量IFN-γ的分泌，淋巴结细胞和PBL的刺激以3×105个细胞/孔在96孔板中一式三份进行，使用了1/10、1/100稀释的肿瘤匀浆液、或10μg/ml的Con A(Sigma)。在三份的合并样品中，培养上清液中分泌的IFN-γ的量用ELISA(Human IFN-γDuoset，R&D Systems)进行测量(图7)。在细胞培养结束时，上清液样品被取出，IFN-γ和IL-4的分泌用ELISA(人类IFN-γDuoset和人类IL-4Duoset，R&D Systems)进行三份平行测量(图8A和8B)。 
流式细胞仪分析 
首先使用流式细胞仪对来自转移哨淋巴结、非转移哨淋巴结、PBMC和来自转移瘤的细胞进行了细胞的表征。培养样品中从转移哨淋巴结获得的淋巴细胞每2到3个星期被取出用于流式细胞仪分析。细胞在补充了2％FCS和0.05％NaN3的PBS中(FACS缓冲液)，与针对用于免疫细胞亚种群和用于淋巴细胞活化的标记物的抗体孵育30分钟(图5、6和7)。使用针对下列标记物的与荧光素异硫氰酸酯(FITC)偶联的抗体：CD69、HLA-DR、CD45RA、CD25，与藻红蛋白(PE)偶联的抗体：CD62L、CD19、CD45RO、CD56，与多甲藻素-叶绿素-蛋白(PerCP)偶联的抗体：CD8、CD3，与别藻蓝蛋白(APC)偶联的抗体：CD4、CD14、CD8。
使用Beta mark试剂盒(Beckman Coulter)检测了Vβ-所有组成成分，每管5×105个细胞在含有FITC、PE和双色FITC-PE偶联的TCRVβ抗体的混合物的8个不同的10μl小管中被染色，每个管中加入CD8PerCP和CD4 APC(图9)。 
实施例3 
通过施用增殖的转移瘤反应性T淋巴细胞治疗转移瘤 
下列三个病例用于表明从转移哨(metinal)淋巴结获得并增殖的T淋巴细胞可以用于治疗播散性癌症。 
47岁的男性，以前因为盲肠中的结肠癌进行过右侧结肠部分切除手术。1年后，他在吻合区域外部的肠系膜脂肪中发展出了5cm大的腹腔复发肿瘤。在外科手术中，将专利蓝染料注射到转移瘤周围的脂肪附近，沿着中结肠动脉鉴定了3个转移哨淋巴结，包括一个在肠系膜根部的尖淋巴结。吻合区与复发肿瘤被全部切除。转移哨淋巴结和转移瘤的浸润部分在手术后按照本文的描述被解剖并处理。转移瘤反应性淋巴细胞被增殖到高的数量。患者在手术后大约4周被注入了这些自体的CD4+T细胞。自从手术后他的健康状况良好，胸部和腹部CT扫描正常，没有转移瘤的迹象，CEA水平(肿瘤标记物)正常。到目前为止注入后随访了36个月。 
63岁的女性，因为卵巢癌已经进行过双侧卵巢切除手术。在手术中发现她有向网膜的播散性疾病，并经历了几次消瘤手术，包括由于肿瘤转移切除了右侧结肠。1年后她在左腹股沟发展出了抗性，细针活组织检查证实了来自卵巢癌的转移瘤。淋巴闪烁造影证实了两个靠近一起的腹股沟淋巴结转移瘤的远端和中部的转移哨淋巴结(参见图1)。使用锝99和γ射线检测管联合专利蓝染料定位了淋巴结。按照与上面相同的原理对淋巴结和转移瘤进行了处理。治疗后7个月，患者健康状况良好，全时工作。肿瘤标记物CA 135的数量已经从高降到了低。 
第三个例子是54岁的男性，他因为低位直肠癌已经进行了腹腔会阴直肠切除手术。在外科手术中在肝脏左肝叶中鉴定到了转移瘤(尽管手术前肝脏扫描为阴性)。再过6周后，他进行了左侧肝脏切除手术。将专利蓝染料注射到转移瘤周围的实质中，几分钟后在肝十二指肠系带中的两个转移哨淋巴结变蓝。在转移哨淋巴结中没有检测到转移瘤，但是它们都显示出对肿瘤的活性。患者用来源于转移哨淋巴结的增殖的肿瘤反应性淋巴细胞进行治疗。尽管开始用肿瘤反应性淋巴细胞进行治疗并且总体情况良好，但是他在右侧肝叶发展出了新的肝脏转移瘤，并进行了第二次肝脏切除手术。在这次手术中，在2厘米大的转移瘤周围注射的专利蓝染料鉴定出了位于肝门中的2个转移哨淋巴结。他再次以注入来自新的转移哨淋巴结的肿瘤反应性淋巴细胞进行治疗。患者完全康复，已经全时工作。根据CT照片，他在肝脏中还有一些残留的疾病以及略微高的肿瘤标记物(CEA)。自从第一次注入淋巴细胞开总体随访已经36个月。 
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Claims (26)

1.体外增殖的从转移哨淋巴结获得的转移瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞在制备用于治疗播散性癌症的药物中的应用，其中T淋巴细胞不是CD4+CD25+Hi淋巴细胞。
2.一种体外增殖方法，包括：
i)第一阶段，用肿瘤来源的抗原与至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质一起刺激从一个或多个转移哨淋巴结获得的转移瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞，以促进从一个或多个转移哨淋巴结获得的转移瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞的存活，以及
ii)第二阶段，激活和促进从一个或多个转移哨淋巴结获得的转移瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞的生长，其中当CD25细胞表面标记在T淋巴细胞上被下调时起动第二阶段ii)，
其中T淋巴细胞不是CD4+CD25+Hi淋巴细胞。
3.权利要求2的方法，其中下调被定义为5％以下的T淋巴细胞种群表达CD25。
4.权利要求2的方法，其中第一阶段i)通过加入至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质来起动。
5.权利要求4的方法，其中对IL-2受体具有激动活性的物质是IL-2。
6.权利要求2的方法，其中肿瘤来源的抗原是转移瘤的变性匀浆。
7.权利要求2的方法，其中第二阶段通过向T淋巴细胞中加入转移瘤来源的抗原以活化转移瘤反应性CD25-阴性T淋巴细胞来起动。
8.权利要求7的方法，还包括向T淋巴细胞中与肿瘤来源的抗原一起加入抗原呈递细胞。
9.权利要求8的方法，其中抗原呈递细胞是辐射过的含有抗原呈递B细胞和/或单核细胞的外周血白细胞。
10.权利要求2的方法，其中第二阶段ii)包括加入至少一种能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质。
11.权利要求2的方法，其中第二阶段ii)包括加入一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质。
12.权利要求11的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质是一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质。
13.权利要求12的方法，其中一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质是抗IL-4抗体、抗IL-5抗体和/或抗IL-10抗体。
14.权利要求2的方法，其中在整个阶段ii)，定期加入额外量的一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质。
15.权利要求14的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T淋巴细胞发育的物质是一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质。
16.权利要求2的方法，其中第二阶段ii)包括加入一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质。
17.权利要求16的方法，其中一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质是对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质。
18.权利要求17的方法，其中一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质选自IL-7、IL-12、IL-15和IL-21。
19.权利要求2-18任何一项的方法，用于制备记忆和/或效应型Th1型T淋巴细胞。
20.权利要求2-18任何一项的方法，还包括在第一阶段i)和第二阶段ii)期间连续地监控T淋巴细胞上细胞表面标记的表达，并且其中T淋巴细胞在第二阶段ii)中T淋巴细胞上的CD25下调时被收获。
21.权利要求20的方法，其中T淋巴细胞上细胞表面标记为CD25和/或CD69。
22.权利要求20的方法，其中在T淋巴细胞上的CD25下调时，T淋巴细胞进行至少一轮额外的阶段ii)。
23.权利要求2-18任何一项的方法，其中T淋巴细胞来源于引流转移瘤的转移哨淋巴结。
24.一种药物组合物，其包括体外增殖的从转移哨淋巴结获得的转移瘤反应性CD4+辅助性细胞和/或CD8+T淋巴细胞，其中T淋巴细胞不是CD4+CD25+Hi淋巴细胞。
25.权利要求24的药物组合物，还包含等渗培养基。
26.权利要求25的药物组合物，其中等渗培养基是0.9％氯化钠，并且所述培养基还含有最高3％的人血清白蛋白。
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