Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN101341247A - 对hcv进行基因分型的方法和试剂 - Google Patents

对hcv进行基因分型的方法和试剂 Download PDF

Info

Publication number
CN101341247A
CN101341247A CNA200680048422XA CN200680048422A CN101341247A CN 101341247 A CN101341247 A CN 101341247A CN A200680048422X A CNA200680048422X A CN A200680048422XA CN 200680048422 A CN200680048422 A CN 200680048422A CN 101341247 A CN101341247 A CN 101341247A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hcv
ns5b
seq
zone
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA200680048422XA
Other languages
English (en)
Inventor
J·赫纳蒂塞恩
M·G·H·M·贝尔德
T·格托赫
R·古夫
C·B·M·范德米尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Original Assignee
Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Siemens Healthcare Diagnostics Inc filed Critical Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Publication of CN101341247A publication Critical patent/CN101341247A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用于测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的基因型的方法和试剂。本发明更特别地涉及简并扩增和测序引物的混合物，以及使用这种引物的方法，所述引物与多种HCV种互补，并且能够产生HCV的NS5B的一个区域的核苷酸序列信息，对于每个种而言，所述HCV的NS5B区域指示是在样品中存在的种的型和/或亚型。

Description

对HCV进行基因分型的方法和试剂
相关申请的交叉引用
本申请要求于2005年12月23日提交的美国临时专利申请No.60/753,761的申请日的权益，该美国临时专利申请的公开内容通过此引用全文纳入。
发明的技术领域
本发明一般地涉及对测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种进行基因分型的方法和材料。
发明背景
据估计，全世界有大约1亿7千万人感染丙型肝炎病毒(HCV)，并且该病毒会引起慢性肝病，还提高了肝硬化和肝细胞癌的风险。HCV的治疗主要局限于抗病毒疗法，它的效力主要受到几个生物学参数例如病毒基因型的影响。因而，HCV基因分型被广泛地用于预测对于抗病毒治疗的反应性，并用于优化治疗的持续时间。HCV基因分型也已经成为流行病学研究和示踪HCV污染源的重要工具。
正链HCV RNA基因组长度是大约9600个核苷酸，编码大约3010个氨基酸的至少一个开放阅读框。在被感染的细胞中，这种多聚蛋白被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶在多个位点裂解，从而产生结构蛋白和非结构(NS)蛋白。HCV分离物的特征在于高度的遗传变异性，原因在于HCVRNA依赖性RNA聚合酶缺乏保真性，该聚合酶由非结构5B(NS5B)基因编码。此外，由于内源突变或被多个种感染，还在单一患者内产生遗传变异的HCV准种。已经描述了六种主要的HCV基因型和一百多种亚型。
HCV的遗传变异性使得扩增、测序和基因分型的过程复杂化。这些过程一般依靠使用寡核苷酸引物和探针(例如，PCR扩增引物、测序引物和位点特异性探针)，所述寡核苷酸引物和探针与HCV基因组的相应核酸序列互补，并且能与之杂交。由于HCV基因组的高度变异性，与HCV的一个种互补的寡核苷酸引物和探针可能不与另一个种互补。因而这样的引物和探针必须根据对高度保守区域的特异性来设计。作为选择，分析必须使用对所有种互补的简并引物和探针的混合物。
某些基因分型方法着眼于于5′非编码(5′NC)区。HCV的5′非编码(NC)区高度保守，但却含有可被利用来区分基因型的型特异性多态性。迄今为止，大多数商购5′NC区基因分型分析是通过RFLP或与寡核苷酸探针的杂交基于PCR扩增和片段分析的。这些分析类型是快速的，但是不像基于测序的分析那么精确。为此，已经提出了可选择的基因组区域用于对HCV进行基因分型，包括NS5B区域。
对HCV进行基因分型的最精确和直接的方法是对某一区域的病毒基因组进行测序，所述区域在各个种之间不同到可区分病毒型和亚型。同样重要地，系统发生分析的数据库必须是可容易获得的，以分析从这些区域产生的序列。
商业上可获得的基于测序的HCV基因分型分析包括，例如，TRUGENE HCV5′NC基因分型试剂盒(Bayer HealthCare)，它是利用HCV的5′NC区的快速的基于测序的分析。这种分析产生的序列数据利用系统发生5′NC区数据库(TRUGENE HCV5′NC软件模块v3.1.1)来直接分析。早先，5′NC数据库已经包括了来自从未被完全验证的各种来源的序列，在某些情况下，当分析5′NC或NS5B序列时特定株系的亚型分配是不一致的。
存在着改进基于测序的HCV分析的持续的需求，以为了临床分析和治疗介入的目的改善HCV型和亚型的鉴定。
发明概述
本发明一般地涉及对测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种进行基因分型的方法和试剂。更具体而言，本发明涉及扩增和测序样品中HCV种的NS5B区域的一部分并确定它的基因型的改进的方法。
本发明的一个方面涉及通过测序HCV的NS5B区域的至少一部分来测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的基因型的方法，对于多种HCV种中的每一种而言，所述NS5B区域指示该种的型和/或亚型。
在一个实施方案中，所述方法包括(a)测定指示测试样品中存在的HCV种的基因型的所述HCV的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列，其中多种HCV种的相应核苷酸序列指示所述HCV种的特有基因型；并且(b)将(a)中测定的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与所述多种HCV种之一的基因型相关联。
在另一个实施方案中，所述方法包括(a)测定指示存在于所述测试样品中的所述HCV种的基因型的HCV的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6的多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示所述HCV种的特有基因型；以及(b)将(a)中测定的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相关联。
在又一个实施方案中，所述方法包括(a)测定指示存在于测试样品的所述HCV种的基因型和亚型的HCV的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6以及表1中所列的每一种HCV亚型的相应核苷酸序列指示所述HCV种的特有基因型和亚型；以及(b)将(a)中测定的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与所述HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1中所列所述HCV亚型之一相关联。
在上述方法的一个特定实施方案中，HCV的NS5b区域的部分基本上由SEQ ID NO：1的从核苷酸位置大约8344到大约8547的区域组成。
在上述方法的另一个特定实施方案中，HCV的NS5b区域的部分基本上由SEQ ID NO：1的从核苷酸位置8344到8547的区域组成。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括(a)提供能够产生多种HCV种的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示所述HCV种的特有基因型；(b)测定指示存在于测试样品中的所述种的基因型的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列；并(c)将(b)中测定的所述HCV种的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与所述多种HCV种之一的基因型相关联。
在又一个实施方案中，本发明的方法包括(a)提供能够产生多种HCV种的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一；(b)测定指示存在于测试样品中的所述HCV种的基因型的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列；并(c)将(b)中测定的所述HCV种的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相关联。
在又一个实施方案中，本发明的方法包括(a)提供能够产生多种HCV种的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一和表1中所列亚型之一；(b)测定作为所述种的基因型的指示的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列；并(c)将(b)中测定的所述HCV种的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与HCV基因型和亚型[HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1所列亚型之一]相关联。
在一个具体实施方案中，所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从大约核苷酸8256到大约8278互补的简并核苷酸序列[CLIP测序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互补物，和与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的大约核苷酸8611到大约8633互补的简并核苷酸序列[CLIP测序引物M-NS5b-Cy5]或它的互补物。
在另一个具体实施方案中，所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从核苷酸8256到8278互补的简并核苷酸序列[CLIP测序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互补物，和与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的核苷酸8611到8633互补的简并核苷酸序列[例如，CLIP测序引物M-NS5b-Cy5]或它的互补物。
在再另一个具体实施方案中，所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含由一个或多个下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：1：5′-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3′；和
SEQ ID NO：2：5′-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3′。
本发明的另一个方面涉及通过扩增HCV的NS5B区域的至少一部分来测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的基因型的方法，对于多种HCV种中的每一种而言，所述NS5B区域指示该种的型和/或亚型。
在一个实施方案中，所述方法包括(a)提供简并寡核苷酸PCR引物的混合物，所述简并寡核苷酸PCR引物包含与多种HCV种的NS5b区域从大约核苷酸8245到大约8269互补的简并核苷酸序列[例如，正向引物FF1和/或FF2]或其互补物；以及与多种HCV种的NS5b区域从SEQID NO：1的大约核苷酸8616到大约8641互补[例如，反向引物RR1]的简并核苷酸序列或其互补物；以及(b)扩增NS5b区域的所述部分的核苷酸序列。
在具体实施方案中，所述简并寡核苷酸PCR引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从核苷酸8256到8278互补的简并核苷酸序列[例如，CLIP测序引物M-NS5b-Cy5.5]或其互补物；以及与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的核苷酸8611到8633互补的简并核苷酸序列[例如，CLIP测序引物M-NS5b-Cy5]或其互补物。
在另一个具体实施方案中，所述简并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由一个或多个下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：6：5′-TGG SBT TYK CNT AYG AYA CYM GNT G-3′
SEQ ID NO：5：5′-GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA-3′
在又一个具体实施方案中，所述简并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由一个或多个下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：3：5′-TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GCT G-3′
SEQ ID NO：4：5′-TGG GGT TCK CIT ATG AYA CYM GIT G-3′
SEQ ID NO：5：5′-GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA-3′
附图的简要说明
附图1是显示本发明的特定实施方案中利用的HCV NS5b结构域和相关区域的示意图。
附图2显示了在GenBank Accession No.M67463中所列的HCV的NS5b结构域的核苷酸序列。引物区域是高亮的，并在边缘指出。附图2与SEQ ID NO：12相对应。
发明的详细说明
定义
虽然在本申请中使用的术语是本领域中标准的，但还是提供了某些术语的以下定义来确保清楚。
单位、前缀和符号可以按它们SI接受的形式来表示。除非另有陈述，核酸按照5′到3′方向从左到右书写。在此叙述的数值范围包括定义该范围的数字，并且包括和支持所定义的范围内的每个整数。氨基酸在此可以通过它们公知的三字母符号或通过IUPAC-IUBMB命名委员会建议的单字母符号来指代。同样地，核苷酸可以通过它们公认的单字母代码来指代。除非另作说明，术语“一(a)”或“一(an)”被看作意味着“至少一个”。在此使用的小节标题仅是为了组织的目的，不能被认为是限制所描述的主题。在本申请中引用的所有文件或文件的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书和论文)基于任一目的通过引用完整地将它们明确地合并在此。若本申请中的任何氨基酸或核酸序列不一致，则以附图为准。
如在此使用的术语“扩增”是指提高反应混合物中一种或多种特定基因或基因片段相对于其他基因的相对丰度的过程。
提及具体的核苷酸序列使用时，术语“基本上由......组成”是指具体的序列和任何其他序列，所述其他序列并不会显著影响所述序列的互补性和所述序列杂交多种HCV型或亚型的能力。
如在此使用的，“样品”是指含有或怀疑含有核酸例如RNA或DNA的任何物质，包括从一个个体或多个个体分离的组织或液体的样品，包括但不限于，例如，皮肤、血浆、血清、脊液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官、肿瘤以及体外细胞培养物成分的样品(包括但不限于细胞在细胞培养基中生长所得到的条件培养基、重组细胞和细胞组分)。
术语“核苷酸”是指核苷酸腺苷酸、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶，分别由它们的单字母代码A、C、G和T表示。在简并引物的表述中，符号R是指G或A，符号Y是指T/U或C，符号M是指A或C，符号K是指G或T/U，符号S是指G或C，符号W是指A或T/U，符号B是指“非A”，符号D是指“非C”，符号H是指“非G”，符号V是指“非T/U”，符号N是指任何核苷酸。符号I代表肌苷，它是一般将与任何C、T或A配对的中性碱基。在本申请的说明书和权利要求中，简并引物是指碱基选择的任一或所有组合，并且指DNA或相应的RNA序列(即，T被U替代)。因而，简并引物可以代表单个种、落入选择内的两个种的混合物、或落入选择内的三种选择的混合物，以及诸如此类直到含有所有可能组合的混合物。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指引物、探针、要检测的寡聚物片段、寡聚物对照以及未标记的封闭寡聚体，并且应当属于多聚脱氧核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、属于多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、属于为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或经修饰的嘌呤或嘧啶碱基的任何其他类型的多核苷酸。在术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间没有预定的长度区别，这些术语将可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因而，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。寡核苷酸包含与指定核苷酸序列的区域相对应的大约至少6个核苷酸、优选地至少约10-12个核苷酸、更优选地至少约15-25个核苷酸的序列。在此使用来定义参考核苷酸序列形式的核酸序列时，术语“相对应”是指匹配所有或部分参考序列的核苷酸序列，以及作为所有或部分参考序列的互补物的核苷酸序列。
寡核苷酸不必完全来自于任何现有的或天然的序列，而可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。术语“寡核苷酸”或“核酸”意指基因组DNA或RNA、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，就其来源或操作而言，所述多核苷酸：(1)与其在自然中相关的所有或部分多核苷酸不相关；和/或(2)与不同于其在自然中连接的多核苷酸的多核苷酸连接；和(3)在自然中不存在。
由于单核苷酸以某一形式反应来产生寡核苷酸，从而使得一个单核苷酸戊糖环的5磷酸在一个方向上经由磷酸二酯键连接到与之相邻的3′氧上，若其5′磷酸没有连接到单核苷酸戊糖环的3′氧，则寡核苷酸的末端被称为“5′末端”，而若其3′氧没有连接到随后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸，则寡核苷酸的末端称为“3′末端”。即便处于较大寡核苷酸内部，在此使用的核酸序列也可以被认为具有5′和3′末端。
当两个不同的、非重叠的寡核苷酸退火到同一线性互补核酸序列的不同区域，并且一个寡核苷酸的3′末端指向另一个的5′末端时，前者可以被称为“上游”寡核苷酸，后者被称为“下游”寡核苷酸。
术语“引物”可以指不止一个引物，并且可以指天然存在(经纯化的限制性酶切产物形式)或合成产生的寡核苷酸，使其处于与核酸链互补的引物延伸产物的合成被催化的条件下时，所述寡核苷酸能够作为沿互补链的合成起点。这些条件包括存在四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸盐和聚合诱导试剂例如DNA聚合酶或逆转录酶，在适合的缓冲剂中(“缓冲剂”包括作为辅助因子、或影响pH、离子强度等等的替代物)，以及在适合的温度下。
为使扩增效力最大，引物优选地是单链的，但作为选择可以是双链的。如果是双链的，在用于制备延伸产物之前，引物首先被处理从而将其链分开。优选地，引物是寡聚脱氧核糖核苷酸。引物必需足够长以在存在聚合试剂的情况下启动延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度和引物的来源以及方法的使用。例如，根据目标序列的复杂度，寡核苷酸引物一般含有15-25个核苷酸，而它可以含有更多或更少的核苷酸。短的引物分子一般需要更低的温度来与模板形成足够稳定的杂交复合物。
术语“延伸引物”是指与模板序列互补、并且能够在聚合酶链式反应条件下杂交并延伸序列的多核苷酸序列。
在提及两个核酸序列时所使用的术语“互补”和它相关的形容词形式“互补的”是指，当两个核酸序列以反向平行连接方式排列时(一个序列的5′末端与另一个序列的3′末端配对)，序列相应的G和C核苷酸碱基是配对的，相应的A和T核苷酸碱基是配对的。通常在天然核酸中不存在的某些碱基可以被包括在本发明的核酸中，包括，例如，肌苷和7-去氮鸟嘌呤。
术语基因座中核苷酸的“位置”或“位点”是指在基因中分配给核苷酸的编号，一般取自基因的基因组序列的cDNA序列。
术语“寡核苷酸引物”是指包含三个以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。它的确切长度将取决于与寡核苷酸引物的最终功能和用途相关的许多因素，包括退火反应的温度以及引物的来源和组成。扩增引物必需足够长以在存在聚合试剂的情况下启动延伸产物的合成。使其处于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时，寡核苷酸引物能够作为合成起点。条件可以包括在适合的温度和pH下核苷酸和诱导试剂例如DNA聚合酶的存在。在优选的实施方案中，引物是足够长度的单链寡聚脱氧核糖核苷酸，以在存在诱导试剂的情况下启动延伸产物从特定序列的合成。在本发明的一个方面，寡核苷酸引物长度是约15到约30个核苷酸，然而引物可以含有更多或更少的核苷酸。寡核苷酸引物长度优选地是至少15、16、17、18、19或20个核苷酸。更优选地，引物将含有约20-25个核苷酸。寡核苷酸引物的敏感性和特异性由引物长度和给定的模板核酸样品内序列的独特性来决定。例如，太短的引物可能表现出对多个序列的非特异性结合。
除非另有陈述，否则本发明的实施将采用常规的分子生物学、微生物学、重组DNA技术、寡核苷酸合成技术，所有这些都处在本领域技术人员的能力范围内。这些技术在文献中有完整说明。根据厂家的说明书或如本领域通常实现的或如在此描述的进行酶反应和纯化技术。上述技术和方法通常根据本领域公知的常规方法以及如多篇一般性参考文献和更具体的参考文献的描述进行，这些参考文献在整个本说明书中被引证和讨论。参见，例如Sambrook et al.Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins，eds.，1984)；A PracticalGuide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)；以及Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.)系列，所有这些文献的内容通过引用合并在此。
术语“逆转录”是指产生与RNA分子互补的DNA的过程，一般借助于逆转录酶来实现。引物可以用于启动聚合；这种引物可以是稍后用于PCR扩增的引物对之一。然后将RNA分子与拷贝的DNA(“cDNA”)相分离，或通过具有RNAse H活性的酶来降解，从而容许cDNA的第二链通过模板依赖性DNA聚合酶产生。在Current Protocols in MolecularBiology，Eds.Ausubel，F.M.et al，(John Wiley&Sons；1995)的3.7和15.4单元中公开了这种方法，其内容通过引用合并在此。
术语“测序”是指确定至少部分基因中核苷酸的顺序。
除非另有陈述，否则本发明的实施将采用常规的分子生物学、微生物学、重组DNA技术、寡核苷酸合成技术，所有这些都处在本领域技术人员的能力范围内。这些技术在文献中有完整说明。根据厂家的说明书或如本领域通常实现的或如在此描述的进行酶反应和纯化技术。上述技术和方法通常根据本领域公知的常规方法以及如多篇一般性参考文献和更具体的参考文献的描述进行，这些参考文献在整个本说明书中被引证和讨论。参见，例如Sambrook et al.Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins，eds.，1984)；A PracticalGuide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)；和Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)系列，所有这些文献的内容通过引用合并在此。
DNA的来源
在本发明的一个方面，所述方法包括首先从患者样品获得包含所研究突变的双链多核苷酸模板。双链多核苷酸模板起初可以包含基因组DNA、基因组DNA的片段或者从RNA逆转录得到的cDNA。这种模板将不仅包含所研究突变，还可能包含含有产生多种准种的长度多态性的区域。
双链多核苷酸模板一般从患者样品制备，这通过处理含有DNA的患者样品从而使得样本中全部或部分DNA能与寡核苷酸引物杂交，与寡核苷酸引物杂交的、所述样品中的所有或部分DNA，例如通过裂解、离心来除去细胞碎屑以及蛋白水解消化来暴露DNA。因而DNA模板可以仅含有通过从组织样品分离获得的核DNA，仅含有线粒体DNA或核DNA或线粒体DNA的某些子片段。DNA模板也可以通过将总mRNA制品或RNA病毒的基因组转化为cDNA例如通过逆转录来制备，可为从在平板上生长的单个菌落或从富集的细菌培养物分离的DNA，并且可为其中分离了基本上整个病毒基因组的病毒DNA制品。
DNA可以通过多种技术中的任何一种从液体样品例如血液、尿液或组织样品制备，这通过多种技术的任何一种，这些技术包括包括裂解、离心来除去细胞碎屑以及蛋白水解消化来暴露DNA；盐沉淀反应或标准的SDS-蛋白酶K-苯酚提取。样品也可以使用试剂盒例如Pure Gene DNAIsolation试剂盒(Gentra)来制备。
核酸的扩增
本发明包括用于DNA扩增以提供用于随后的测序的丰富DNA资源的方法和试剂。
一般地，在测序之前，通过首先扩增包含要测序的目标区域的DNA区域来制备测序模板。要扩增的序列不必首先以纯的形式存在；它可以是复合混合物的较小的部分或一部分核酸序列。起始核酸可以含有一个以上相同或不同的期望的特定核酸序列。因而，本方法不仅可用于产生大量的一种特定核酸序列，而且如果在序列中存在超过一个的碱基对变异，该方法也可用于同时扩增位于相同或不同核酸分子上一种以上不同的特定核酸序列。
本发明涉及用于对HCV进行基因分型的方法和试剂，包括扩增和测序引物。本发明利用了使用聚合酶链式反应(即PCR)技术或某些其他基于引物延伸的方法来扩增特定核酸序列的公知方法。聚合酶链式反应(PCR)方法是本领域广泛已知的。例如，在美国专利NO.4,683,195、4,683,202和4,800,159；K.Mullis，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51：263-273(1986)；和C.R.Newton&A.Graham，Introduction toBiotechniques：PCR，2.sup.nd Ed.，Springer-Verlag(New York：1997)中描述了这些方法，它们的公开内容通过引用合并在此。PCR涉及使用引物对，每一引物针对双链DNA的每一互补链(其中编码链被称为“有义链”，它的互补链被称为“反义链”)，其将在位于基因中所研究区域任一侧的位置上杂交。然后在重复的循环中进行链延伸聚合，从而以指数方式提高所研究区域的拷贝数量。简言之，在PCR反应的第一步中，样品的核酸分子被短暂地加热，然后冷却，以使双链分子变性。正向和反向引物以相对于样品目标过量的浓度存在于扩增反应混合物中。当样品在有助于杂交和聚合的条件下孵育时，引物在希望扩增的区域的序列的3′位置处与核酸分子的互补链杂交，所述互补链是希望扩增的序列的互补物。一旦发生杂交，引物的3′末端被聚合酶延伸。引物的延伸引起DNA分子的合成，所述DNA分子具有希望的核酸样品目标的互补物的确切序列。PCR反应能够指数扩增期望的核酸序列，在每个循环中具有期望序列的分子的数量几乎翻倍。因而，通过允许杂交、聚合和变性的循环，则可以实现期望的核酸分子其浓度呈指数增长。扩增得到的多核苷酸可以用作测序反应的模板。Gelfand等人描述了来自有机体水生栖热菌(Thermus aquaticus)的热稳定酶“Taq聚合酶”，该酶可用于这种扩增方法中(参见美国专利NO.4,889,818；5,352,600；和5,079,352，通过引用将它们合并在此)。可选择的扩增技术例如NASBA、3SR、Qb Replicase和支链扩增是本领域技术人员已知的和可获得的。术语“RT-PCR”一般指包括可扩增RNA序列的逆转录步骤在内的扩增。
多核苷酸扩增模板的制备
本发明涉及HCV和它的变体形式的扩增和测序。例如，本发明的方法可以采用DNA或RNA(包括信使RNA)，所述DNA或RNA可以是单链的或双链的。此外，可以利用含有DNA和RNA各一条链的DNA-RNA杂合体。也可以采用任何这些核酸的混合物，或者也可以利用在此使用相同或不同的引物从早先的扩增反应产生的核酸。要扩增的特定核酸序列可以只是较大分子的一部分，或可以首先作为分立的分子存在，从而所述具体的序列构成整个核酸。
要扩增的序列不必首先以纯的形式存在；它可以是复合混合物的较小的部分或一部分核酸序列。起始核酸可以含有一个以上相同或相异的期望的特定核酸序列。因而，本方法不仅可用于产生大量的一种特定核酸序列，而且如果在序列中存在超过一个的碱基对变异，该方法也可用于同时扩增位于相同或不同核酸分子上一种以上的不同的特定核酸序列。
核酸模板可以从任何来源获得，例如，来自质粒如pBR322，来自克隆的DNA或RNA，或来自来自任何来源的天然DNA或RNA。DNA或RNA可以通过多种技术例如由Maniatis et al.，Molecular Cloning(1982)，280-281所描述的技术从血液、组织材料或羊膜细胞提取。
如果细胞悬浮在低渗缓冲液中，则细胞可以直接使用而不用纯化核酸，并加热到约90℃-100℃，直到出现细胞裂解且细胞内组分分散出来，一般约1到15分钟。在加热步骤之后，可以直接向裂解的细胞添加扩增试剂。这种直接的细胞检测方法可以用于外周血淋巴细胞和羊水细胞。
样品中含有的目标核酸起初可为RNA的形式，优选地被逆转录成cDNA，然后使用本领域技术人员已知的任何适合的变性方法，包括物理的、化学的或酶学的方法来变性。链分离的优选的物理方法包括加热核酸直到它完全地(＞99％)变性。典型的热变性包括从约80℃到约105℃的温度范围，几秒到数分钟的时间范围。作为对变性的选择，目标核酸可以在样品中以单链形式存在，例如，单链RNA或DNA病毒。
变性的核酸链然后在便于引物和探针与单一核酸链结合的条件下与预选的寡核苷酸引物孵育，任选地，与标记的寡核苷酸(在此称为“探针”)孵育，以检测扩增的序列。如本领域已知的，选择引物使得它们沿双链体序列的相对位置是这样的：当延伸产物从它的模板(互补物)分离时，从一个引物合成的延伸产物充当了另一个引物的延伸的模板来产生预定长度的复制链。
HCV的扩增
本发明的一个方面涉及通过扩增HCV的NS5B区域的至少一部分来测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的基因型的方法，对于多种HCV种的每一种而言，所述NS5B区域指示该种的型和/或亚型。
在一个实施方案中，所述方法包括(a)提供简并寡核苷酸PCR引物的混合物，所述简并寡核苷酸PCR引物包含与多种HCV种的NS5b区域从大约核苷酸8245到大约8269互补的简并核苷酸序列[例如，正向引物FF1和/或FF2]或其互补物，以及与多种HCV种的NS5b区域从SEQID NO：1的大约核苷酸8616到大约8641互补[例如，反向引物RR1]互补的简并核苷酸序列或其互补物，以及(b)扩增NS5b区域的所述部分的核苷酸序列。
在具体实施方案中，所述简并寡核苷酸PCR引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从核苷酸8256到8278互补的简并核苷酸序列[例如，CLIP测序引物M-NS5b-Cy5.5]或其互补物；以及与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的核苷酸8611到8633互补的简并核苷酸序列[例如，CLIP测序引物M-NS5b-Cy5]或其互补物。
在另一个具体实施方案中，所述简并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由一个或多个下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：6：5′-TGG SBT TYK CNT AYG AYA CYM GNT G-3′
SEQ ID NO：5：5′-GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA-3′
在又一个具体实施方案中，所述简并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由一个或多个下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：3：5′-TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GCT G-3′
SEQ ID NO：4：5′-TGG GGT TCK CIT ATG AYA CYM GIT G-3′
SEQ ID NO：5：5′-GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA-3′
核酸的测序
以上描述的DNA的扩增将产生用于测序的丰富的DNA资源。如上所述制备的多核苷酸模板使用本领域技术人员可用和已知的用于测序核苷酸的多种方法的任一种来测序。
用于测序核苷酸的多种方法是本领域技术人员可用和已知的，其中的任何一种都可以用于本发明的方法中。一种公知的测序方法是Sangeret al.，PNAS(USA)74(12)：5463-5467(1977)首先描述的“链终止”法，在
Figure A20068004842200201
2.0产品资料(Amersham Life Sciences，Cleveland)中得到详细描述，并且近来在欧洲专利EP-B1-655506中得到更为仔细地描述，它们的内容通过引用全部合并在此。在该方法中，要测序的DNA被分离，变为单链的，并置入四个容器中。在每个容器中有复制DNA链的必需组分，包括模板依赖性DNA聚合酶、与要测序的DNA的测序起始位点互补的短引物分子以及每种碱基A、C、G和T的脱氧核糖核苷酸三磷酸盐，处在有助于引物和要测序的DNA之间的杂交以及杂交的引物的链延伸的缓冲剂中。此外，每个容器含有少量的一种双脱氧核苷酸三磷酸盐，例如双脱氧腺嘌呤核苷三磷酸盐(“ddA”)、双脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸盐(“ddG”)、双脱氧胞嘧啶核苷三磷酸盐(“ddC”)、双脱氧胸腺嘧啶核苷三磷酸盐(“ddT”)。在每个容器中，每段分离的DNA均与引物杂交。然后延伸引物，一次一个碱基来形成与模板DNA互补的新的核酸聚合物。当双脱氧核苷酸被掺入延伸聚合物中时，就阻止了聚合物的进一步延伸。因而，在每个容器中，形成了一组特定长度的经延伸的聚合物，这指出与该容器中双脱氧核苷酸相应的核苷酸的位置。然后使用凝胶电泳评估这些组次的聚合物来确定序列。
多核苷酸的测序可以使用单链或双链DNA来进行。用于引物延伸的聚合酶的使用需要单链DNA模板。在优选的实施方案中，本发明的方法使用双链DNA以获得测序结果的确证性相反链确认。双链DNA模板可以使用碱或热变性来将两条互补DNA模板分离成单链来测序。在聚合期间，每个DNA模板分子被复制一次形成互补的经引物延伸的链。利用热稳定的DNA聚合酶(例如，Taq、Bst、Tth或Vent DNA聚合酶)容许双链DNA模板在测序反应中通过热变性、引物退火、延伸和双脱氧终止的交替周期反复循环。该循环过程有效地扩增了少量的输入DNA模板来产生用于测序的足够的模板。
测序也可以对PCR扩增反应产物直接进行。虽然对经扩增的DNA的克隆是相对直接，但是PCR产物的直接测序便于并加快了序列信息的获取。只要PCR反应产生分立的扩增产物，它将可用于直接测序。与克隆PCR产物并测序单独的克隆的方法相比，直接分析PCR产物的序列的方法一般地不受Taq DNA聚合酶的相对高差错率的影响。差错可能随机地分布在整个分子上。因而，扩增产物的绝大多数将由正确的序列组成。PCR产物的直接测序相对于测序克隆的PCR产物具有的优势在于(1)它容易标准化，因为它是不取决于活细胞的使用的简单的酶过程，以及(2)对于每个样品仅需要测定单个序列。
本发明中使用的扩增方法也可以同时地连同测序来使用。同时地扩增和测序的方法是本领域公知的，包括联合的扩增和序列(CAS)(由Ruano and Kidd，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)88(7)：2815-2819(1991)以及在美国专利No.5,427,911中描述，通过引用将它们合并在此)，以及CLIP扩增和测序(在美国专利NO.6,007,983和J.Clin.Microbiology41(4)；1586-1593(April 2003)中描述，通过引用将它们合并在此)。CLIP测序使得早先产生的PCR扩增片段同时进行PCR扩增和直接测序。在CAS测序中，在第一反应阶段用两个引物处理样品，并进行多个循环的扩增来实现10,000到100,000倍扩增。然后在扩增反应的指数期添加ddNTP，继续反应持续另外的热循环数来产生链终止的测序片段。CAS法要求中途添加试剂(ddNTP试剂)，这引入了差错或污染的机会并提高了将用于自动化的任何设备的复杂度。因而CAS方法优选地与CLIP测序联合起来，这使得早先产生的PCR扩增片段同时进行PCR扩增和直接测序。例如，利用
Figure A20068004842200211
方法的同时扩增和测序可以使用在此描述的试剂，在类似于商业上可获得的试剂盒如
Figure A20068004842200212
HCV基因分型试剂盒(Bayer HealthCare LLC)中描述的条件下来实现。
在特定的方面，本发明涉及HCV的测序。在本发明的方法中使用的双链DNA模板可以来自例如单链或双链的DNA或RNA(包括信使RNA)。此外，DNA模板可以是含有DNA的一条链和RNA的一条链的DNA-RNA杂合体的形式。也可以采用任何这些核酸的混合物，或者也可以利用在此使用相同或不同的引物从早先的扩增反应产生的核酸。要扩增的特定核酸序列可以只是较大分子的一部分，或可以首先作为分立的分子存在，从而所述具体序列构成整个核酸。
对HCV进行基因分型
本发明包括用于对怀疑含有或已知含有HCV的样品中的HCV进行基因分型的新的方法和试剂。
本发明通过提供包含HCV的区域的引物解决了上述难题。
本发明的测序引物由特异于HCV的NS5b区域的寡核苷酸组成，它可以用于扩增和测序一部分HCV。根据本领域技术人员已知的方法，从怀疑感染HCV的个体获得的样品被用于回收RNA或DNA形式的病毒RNA。从样品获得的病毒HCV RNA被逆转录成cDNA。然后利用聚合酶链式反应或其他基于引物延伸的方法来扩增cDNA模板。产生的扩增片段然后首先利用循环测序方法或CLIP双向测序来用一组引物测序，所述引物包含期望的HCV的NS5b区域。
本发明的一个特定的方面是扩增和基因分型怀疑含有HCV的样品中的HCV的一部分NS5b区域的方法。
HCV的测序
本发明一般地涉及用于对测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种进行基因分型的改进的方法和试剂。在本发明的某些方面，本发明涉及扩增和测序样品中HCV种的NS5B区域的一部分并确定它的基因型的方法。
一般地，本发明涉及通过测序HCV的NS5B区域的至少一部分来测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)的基因型的方法，对于多种HCV种的每一种而言，所述NS5B区域指示该种的型或亚型。
本发明还包括用于测定HCV的NS5b区域的序列或其部分的方法和引物。本发明的测序引物包含正向引物和反向引物，它可以用可检测标记来标记。对于最常见的测序仪器，荧光标记是期望的，然而也可以采用其他标记类型，包括有色的、产色的、发荧光的(包括化学发光的)和放射性标记。引物组合可以包括适合于逆转录、扩增或测序的其他试剂，并且当然地可以包括用于分析的HCV遗传物质。
虽然以下公开的本发明的测序引物优选地选自具有以下公开的相同序列的引物，但是还是认为本发明包括具有等价的特异性和功能的简并序列，其可以根据本领域的技术来设计和构建。具体而言，测序引物包括具有15或更多个核苷酸的上述引物的片段。测序引物也可以包含具有16、17、18、19或20或更多个核苷酸的上述引物的片段。这种简并序列的设计和构建是本领域技术人员公知的。
与扩增引物相反，由于如果测序引物相对于3′碱基不具有相同位置，则它们不能被混合在一起，因此只有特定的简并碱基被标注出来，然而要理解的是也可以对3′位置进行修饰。例如，5′长度可以被改变以包括序列保守性更高的区域，或者以改变解链温度和结合严格度。如果使用原始的引物(primary primer)发现成功率是足够的，非简并的引物对是优选的。反应条件也可能显著地影响性能。测序引物的可能的修饰在以下的小节和实施例中说明。
在一个实施方案中，本发明的方法包括首先测定指示所述HCV种的基因型的HCV的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列。指示其基因型的HCV的NS5b区域的部分是与多种HCV种的核苷酸序列相对应的相同区域，所述核苷酸序列指示多种HCV种的每一种的基因型。因而，本发明的一个方面是鉴定在HCV种之中共有的、指示特定HCV种的型和/或亚型的区域。因而通过将上述步骤中测定的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与已知序列/基因型的多种HCV种之一的基因型相关联，任何HCV种的这个区域的测序能够确定该种的型和亚型。
在另一个实施方案中，所述方法包括(a)测定指示所述HCV种的基因型的HCV的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有基因型1、2、3、4、5和6的每种HCV种的相应核苷酸序列指示所述种的基因型；以及(b)将(a)中测定的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相关联。
在又一个实施方案中，所述方法包括(a)测定指示所述HCV种的基因型和亚型的HCV的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有基因型1、2、3、4、5和6以及表1中所列每种亚型的每种HCV种的相应核苷酸序列指示所述种的基因型和亚型；以及(b)将(a)中测定的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1中所列亚型之一相关联。
在上述方法的一个特定实施方案中，HCV的NS5b区域的部分基本上由SEQ ID NO：1的从核苷酸位置大约8344到大约8547的区域组成。
在上述方法的另一个特定实施方案中，HCV的NS5b区域的部分基本上由SEQ ID NO：1的从核苷酸位置8344到8547的区域组成。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括(a)提供能够产生多种HCV种的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示所述种的基因型；(b)测定指示所述种的基因型的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列；并(c)将(b)中测定的所述HCV种的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与所述多种HCV种之一的基因型相关联。
在又一个实施方案中，本发明的方法包括(a)提供能够产生多种HCV种的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一；(b)测定指示所述种的基因型的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列；并(c)将(b)中测定的所述HCV种的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相关联。
在又一个实施方案中，本发明的方法包括(a)提供能够产生多种HCV种的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一和表1中所列亚型之一；(b)测定指示所述种的基因型的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列；并(c)将(b)中测定的所述HCV种的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与HCV基因型和亚型[例如，HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1所列亚型之一]相关联。
在一个具体实施方案中，所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从大约核苷酸8256到大约8278互补的简并核苷酸序列[例如，CLIP测序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互补物，和与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的大约核苷酸8611到大约8633互补的简并核苷酸序列[例如，CLIP测序引物M-NS5b-Cy5]或它的互补物。
在另一个具体实施方案中，所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从核苷酸8256到8278互补的简并核苷酸序列[例如，CLIP测序引物M-NS5b-Cy5.5]或它的互补物，和与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的核苷酸8611到8633互补的简并核苷酸序列[例如，CLIP测序引物M-NS5b-Cy5]或它的互补物。
在再另一个具体实施方案中，所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含由一个或多个下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：1：5′-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3′；和
SEQ ID NO：2：5′-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3′。
可以利用以上序列的其他变体来实现其他HCV变体的检测。
实施例1-通过测序的HCV NS5b基因分型
以下的这个实施例描述了为了确定基因型和亚型而产生丙型肝炎病毒的NS5b区域中的204个碱基对的片段的双向序列的实验室方案。
一般地，如厂家描述的使用Qiagen QIAamp Viral RNA Mini试剂盒从血浆样品提取病毒HCV RNA。简要地，使用随机六聚体逆转录提取的RNA样本。
在cDNA合成之后，使用特异性引物扩增10μL cDNA模板来产生398个碱基对的扩增子。
在PCR扩增之后，进行染料-引物CLIP测序反应。CLIP反应通过使用各自用不同的荧光染料(Cy 5.5，Cy 5)标记的正向(有义)和反向(反义)引物、链延伸试剂和四种链终止双脱氧核苷酸三磷酸盐(ddNTP)之一：双脱氧腺嘌呤核苷(ddATP)、双脱氧胞嘧啶核苷(ddCTP)、双脱氧鸟嘌呤核苷(ddGTP)或双脱氧胸腺嘧啶核苷(ddTTP)三磷酸来同时地测序DNA的两条链。通过添加样品和具有对ddNTP的高亲和性的热稳定DNA聚合酶来启动反应。随着反应混合物被热循环，引物与模板DNA杂交并被延伸，然后通常在沿着目标DNA序列的某处终止。四个CLIP反应产生在两个CLIP引物之间的目标的正向和反向序列。反应进行40个循环，从每个引物产生高水平的链终止反应产物。在完成循环程序之时，终止加载染料溶液被添加到每个反应管，加热反应来分离双链DNA片段。每个反应的一部分然后加载到MicroCel 500盒的顶部，其含有具有特定孔径大小的成形基质的超薄的垂直聚合的聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶含有高浓度的尿素来将DNA片段维持在单链的变性状态。缓冲溶液保持与超薄凝胶的顶部和底部接触。施加高压电场，促使带负电的DNA片段迁移穿过凝胶走向阳极。DNA片段的迁移速度与聚丙烯酰胺基质形成的孔洞大小以及DNA片段大小相关，更小的片段迁移更快。接近聚丙烯酰胺凝胶的底部，激光束激发与移动通过激光的DNA片段连接的荧光染料，检测器测量荧光染料产生的光线数量和波长。然后测序仪收集这种光学测量值并传输到保存数据的工作站。每个测序反应需要四条泳道，每个泳道对应四种链终止双脱氧核苷酸(ddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTP)的每一种。组合正向和反向CLIP序列，并与“最佳匹配的”参考序列(W)的序列比较。操作员检查标志位置处的比对并根据需要编辑碱基。软件为每个样品生成HCV NS5b报告。
逆转录(cDNA合成)
根据以下方案从来自样品的基因组RNA合成cDNA。
以下描述的RT试剂(除了SuperScript和RNase抑制物)被涡旋和微离心来回收体积。制备HCV NS5b RT主混合物，使用根据以下式子计算的体积：
HCV NS5b RT主混合物
  RT试剂   终浓度   体积/样品
  无核酸酶的水   3.90μL
  10X PCR缓冲液II   1X   2.50μL
  MgCl2溶液(25mM)   5mM   5.00μL
  dNTP′s(100mM)   8mM   2.00μL
  随机六聚体   60pg/μL   1.00μL
  RNase抑制物(20U/μL)   0.4U/μL   0.50μL
  SuperScript III逆转录酶(200U/μL)   0.8U/μL   0.10μL
  总RT试剂   15.00μL
RT试剂(15μL)等分到每个标记的PCR试管中。试管转移到扩增后区域静止空气通风橱中。从冷藏箱中取出样品和对照RNA提取物在室温下解冻。解冻的RNA提取物(10μL)添加到装有RT试剂的合适的试管中。通过轻轻地敲打托架来混合试剂和RNA。
试管置于被编程进行以下步骤的热循环仪中：
HCV NS5b RT程序
 #循环   分钟   温度℃   过程
 1   10   25   随机六聚体退火
 1   30   50   逆转录
 1   15   75   SuperScript去活化
 1   永久   4   保持
从热循环仪上取出RT样品并保存在4℃。
PCR扩增
聚合酶链式反应(PCR)的扩增如下进行。制备PCR试管并对样品标记。以下描述的PCR试剂(除了AmpliTaq Gold酶)被涡旋和微离心来回收体积。制备简并引物的混合物，该简并引物被设计来扩增多个临床相关的HCV种，具有以下的核苷酸序列：
正向PCR引物(FF-1)：5′-TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GCTG-3′(SEQ ID NO：7)
正向PCR引物(FF-2)：5′-TGG GGT TCK CIT ATG AYA CYM GITG-3′(SEQ ID NO：8)
反向PCR引物(RR1)：5′-GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTRAA-3′(SEQ ID NO：9)
使用试剂体积的工作表来制备PCR主混合物。根据以下公式计算体积：
HCV NS5b PCR主混合物
  PCR试剂   终浓度   每样品的体积
  无核酸酶的水   23.25μL
  10X PCR缓冲液II   0.8X   4.00μL
  25mM MgCL2溶液   1mM   2.00μL
  M-NS5B-FF1(10μM)   0.3μM   1.50μL
  M-NS5B-FF2(10μM)   0.6uM   3.00uL
  M-NS5B-RR1(10μM)   1.2μM   6.00μL
  AmpliTaq Gold(5U/μL)   0.025U/μL   0.25μL
  总PCR试剂   40.00μL
PCR主混合物(40μL)等分到每个标记的PCR试管中。RT cDNA(10μL)添加到装有PCR试剂的适当标记的试管中，将试管置于被编程以进行以下步骤的热循环仪中：
HCV NS5b PCR程序
Figure A20068004842200281
从热循环仪取出PCR样品，可在4℃保存最长到两周或进行如下所述的CLIP测序。
CLIP测序
制备简并测序引物的混合物，该简并测序引物被设计来对多个临床相关HCV种进行测序，具有以下的核苷酸序列：
正向CLIP引物：5′Cy5.5-5′TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAYTC-3′(SEQ ID NO：10)
反向CLIP引物：Cy5-5′-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3′(SEQ ID NO：11)
将必需数量的PCR螺纹管和帽子装配在托架上并置于冷块中。对每个样品和对照的0.5mL管进行标记并置于冷块中。从冷藏箱取出CLIP试剂(除了Thermo Sequenase酶)，并在室温下解冻。涡旋每种组分(除了Thermo Sequenase酶)并快速旋转来回收体积。使用10μL可调整吸移管，将3μL合适的CLIP终止混合物直接转移到每个PCR管中各个孔柱底部。
制备Thermo Sequenase酶在Thermo Sequenase稀释缓冲液中的1∶10稀释液。使用由以下公式计算得到的试剂体积制备CLIP主混合物。
HCV NS5b CLIP主混合物
  CLIP试剂   终浓度   每份样品的体积
  无核酸酶的水   6.50μL
  7-去氮-dGTP Cy5/Cy5.5染料引物循环测序试剂盒(100个测试)Thermo Sequenase稀释缓冲液(520μL)Thermo Sequenase酶(57μL)测序缓冲液(320μL)A终止混合物(375μL)C终止混合物(375μL)G终止混合物(375μL)T终止混合物(375μL)停止加载染料(2750μL)   1X   2.50μL
  M-NS5B正向CLIP引物   0.4μM   2.50μL
  M-NS5B反向CLIP引物   0.1μM   2.50μL
  DMSO   8％   2.00μL
  Themo Sequenase酶1∶10稀释液   0.512U/μL   4.00μL
  总CLIP试剂   20.00μL
20μL CLIP主混合物等分到每个标记的试管中，并转移到装有CLIP试剂的试管中。PCR扩增子(2μL)添加到装有CLIP主混合物的合适的试管中，短暂涡旋并微离心来收集试管底部的体积。将CLIP混合物(5μL)添加到冷块中的4个终止试管的每一个中。
CLIP扩增/测序反应在热循环仪上根据以下方案进行：
HCV NS5b CLIP
Figure A20068004842200301
从热循环仪取出试管，向每个试管添加停止加载染料(6μL)，涡旋混合。试管放回热循环仪并经历变性条件，如下：
HCV NS5b变性
 #循环   时间   温度℃   过程
 1   2分钟   80   变性
 1   永久   4   保持
从热循环仪取出试管，保存或进行凝胶电泳，如下所述。
如厂家所描述的使用Long-Read Tower测序仪进行凝胶电泳，使用以下的测序仪控制设置：
凝胶温度(℃)              60℃
凝胶电压(V)               1800V
激光功率(％)              50％
运行时钟(采样间隔)        0.5秒
运行时钟(运行持续时间)    50分钟
分析配备有样品和对照信息。
实施例2-通过测序的HCV NS5b基因分型的性能特征评估
使用以下试剂，基本上根据以上在实施例1中描述的基因分型分析，评估了HCV NS5b基因分型分析的性能特征。
HCV NS5b特定试剂
  描述   批号#
  M-NS5b-FF1   10/27/04
  M-NS5b-FF2   12/27/04
  M-NS5b-RR1   10/27/04
  M-NS5bSes-Cy5.5   10/27/04
  M-NS5bSeq-Cy5   10/27/04
通用试剂的
  描述   批号#
  PCR缓冲液II   E10896
  25mM MgCl2   E10900
  dNTP 100mM   36227107050
  随机六聚体   F06662
  RNase抑制物   F07872
  SuperScript III RT   1232439
  AmpliTaq Gold   E11258
  DMSO   R19030
  SureFill 6％测序凝胶   0294B94
  MicroCel 500   2624
  含有以下的Cy5.5/5循环测序试剂盒：   01609
  测序缓冲液
  ThermoSequenase酶
  ThermoSequenase稀释缓冲液
使用以下的样品：
样品
  HCV基因型(LiPATMALiPA) HCV基因型(TRUGENE5′NC) HCV基因型(NS5B) 样本ID 病毒载荷(c/mL) 供应厂商
  1   Acrometrix1   Acrometrix
  2b   Acrometrix2   Acrometrix
  3a   Acrometrix3   Acrometrix
  4a   Acrometrix4   Acrometrix
  5a   Acrometrix5   Acrometrix
  6a   Acrometrix6   Acrometrix
  1a 1a   1   MP1   Millenium
  1a 1a   1a   MP2   Millenium
  1a 1a   1a   MP3   Millenium
  1a 1a   1a   MP4   Millenium
  1a 1a   1a   MP5   Millenium
  1b 1b   1b   MP6   Millenium
  1b 1b   1b   MP7   Millenium
  1b 1b   1b   MP8   Millenium
  1b 1b   1   MP9   Millenium
  1b 1b   1b   MP10   Millenium
  2 2b 2   2b   MP11   Millenium
  2 2b 2   2b   MP12   Millenium
  2 2b 2   2b   MP13   Millenium
  2 2b 2   2b   MP14   Millenium
  2 2b 2   2b   MP15   Millenium
  3a 3a   3a   MP16   Millenium
  3a 3a   3a   MP17   Millenium
  3a 3a   3d   MP18   Millenium
  HCV基因型(LiPATMALiPA) HCV基因型(TRUGENE5′NC) HCV基因型(NS5B) 样本ID 病毒载荷(c/mL) 供应厂商
  1a 1a   1a   MP19   Millenium
  4 4   4a   MP20   Millenium
  4c/4d4c/4d 4a MP21 Millenium
  3a 3a   3a   MP22   Millenium
  4h 4   4a   MP23   Millenium
  5a 5a   5a   MP24   Millenium
  5a 5a   5a   MP25   Millenium
1A GP1A-C2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
1B GP1B-A2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
2A 9810067 2,292,000   Bayer ClinicalAffairs
2A GP2A-A2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
2A GP2A-B2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
2A GP2A-C2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
2B GP2B-A2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
3A 3A 3-3A 30,043,850   Bayer ClinicalAffairs
4A GP4A-A2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
  HCV基因型(LiPATMALiPA) HCV基因型(TRUGENE5′NC) HCV基因型(NS5B) 样本ID 病毒载荷(c/mL) 供应厂商
4A GP4A-B2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
4A GP4A-C2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
 5A(Sequetech) 1-5A 9,745,338   Bayer ClinicalAffairs
6A GP6A-A2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
6A GP6A-A3 5,000   Bayer ClinicalAffairs
6A 2-6A(24485) 11,168,451   Bayer ClinicalAffairs
 6A(Sequetech) GP6A-C2 10,000   Bayer ClinicalAffairs
 6A(Sequetech) GP6A-C3 5,000   Bayer ClinicalAffairs
 4A   14682   1,326,000   Teragenix
  5A   15038   2,522,000   Teragenix
  6A   20759   8,112,000   Teragenix
  7C   HCVGTP-004c#1   17,628,000   Teragenix
  9B   HCVGTP-004c#2   10,660,000   Teragenix
  8C   HCVGTP-004c#3   45,240,000   Teragenix
  6B   HCVGTP-004c#4   1,237,000   Teragenix
  7C   HCVGTP-004c#5   31,824,000   Teragenix
  10A   HCVGTP-004a#1   7,852,000   Teragenix
  8C   HCVGTP-004a#2   25,584,000   Teragenix
  HCV基因型(LiPATMALiPA) HCV基因型(TRUGENE5′NC) HCV基因型(NS5B) 样本ID 病毒载荷(c/mL) 供应厂商
  10A   HCVGTP-004a#3   19,032   Teragenix
  9B   HCVGTP-004a#4   14,248,000   Teragenix
neg neg M60825阴性稀释物   Bayer ClinicalAffairs
neg neg   HCV阴性对照(1/29/04)   Bayer ClinicalAffairs
neg M60789阴性稀释物   Bayer ClinicalAffairs
  1b   阳性对照   对照
分析精度分析
为了确定本发明的方法和试剂的分析精确性，使用包含基因型1-5的25成员系列、包含基因型1-6的6成员系列、包含基因型4-10的12成员系列进行分析，并分析了包含基因型1-6的15种其他的临床样品，结果与早先的基因型比较。
使用以上实施例1中描述的方法对样品进行基因分型，与早先通过LiPA或TruGene 5′NC基因分型或在样品小节中详述的另一种NS5b方法表征的相同样品的基因型比较，来确定分析精确性。这项分析的结果在以下的表格中概述：
分析精确度数据
  样品ID   预期的基因型(新命名)   BRTL NS5B基因型
  MP1   1a   1a
  MP2   1a   1a
  MP3   1a   1a
  MP4   1a   1a
  MP5   1a   1a
  MP6   1b   1b
  MP7   1b   1b
  MP8   1b   1b
  MP9   1b   1a
  MP10   1b   1b
  MP11   2b   2b
  MP12   2b   2b
  MP13   2b   2b
  MP14   2b   2b
  MP15   2b   2b
  MP16   3a   3a
  MP17   3a   UG rpt 3a
  MP18   3a   3a
  MP19   1a   1a
  MP20   4a   4a
  MP21   4a   4a
  MP22   3a   UG(hets)rpt 3a
  MP23   4a   4a
  MP24   5a   5a
  MP25   5a   5a
  Acrometrix1   1b   1a
  Acrometrix2   2b   2b
  Acrometrix3   3a   3a
  样品ID   预期的基因型(新命名)   BRTL NS5B基因型
  Acrometrix4   4   4a
  Acrometrix5   5a   5a
  Acrometrix6   6a   UG
  HCVGTP-004c#1   7c(6f)   UG
  HCVGTP-004c#2   9b(6i)   6i
  HCVGTP-004c#3   8c(6n)   6n
  HCVGTP-004c#4   6b   6b
  HCVGTP-004c#5   7c(6f)   UG
  HCVGTP-004a#1   10a(3k)   3k
  HCVGTP-004a#2   8c(6n)   6n
  HCVGTP-004a#3   10a(3k)   3k
  HCVGTP-004a#4   9b(6i)   6i
  14682   4a   4a
  15038   5a   5a
  20759   6a   UG
  GP1A-C2(10,000c/mL)   1a   1a
  GP1B-A2(10,000c/mL)   1b   1a rpt 1a
  9810067(2,292,000c/mL)   2a   2a
  GP2A-A2(10,000c/mL)   2a   2a rpt 2a
  GP2A-B2(10,000c/mL)   2a   2a rpt 2a
  GP2A-C2(10,000c/mL)   2a   2a
  GP2B-A2(10,000c/mL)   2b   2b rpt 2b
  3-3A(30,043,850c/mL)   3a   3a
  GP4A-A2(10,000c/mL)   4a   4a
  GP4A-B2(10,000c/mL)   4a   4a
  2-6A(24485)(11,168,451c/mL)   6a   UG
  GP4A-C2(10,000c/mL)   4a   4a
  1-5A(9,745,338c/mL)   5a   5a
  GP6A-A2(10,000c/mL)   6a   UG
  样品ID   预期的基因型(新命名)  BRTL NS5B基因型
  GP6A-C2(10,000c/mL)   6a  UG
所分析的总共58份精确性样品产生了51个NS5b基因型结果。可用NS5b基因分型的51个中的51个或100％的样品产生了在型水平上与早先确定的基因型一致的基因型。51个样品中的48个在型和亚型水平上是一致的，51个样品中的3个仅在型水平上是一致的(所有的3个根据LiPA是1b，根据NS5b是1a)。7个样品(5个基因型6a和2个基因型7c)未能扩增，并且不能通过NS5b来进行基因分型。
以上数据表明，本发明的基因分型分析的精确性优于其他商业上可获得的分析。该分析表现出与之前在型水平上可用NS5b进行基因分型的51个样品的基因型结果100％一致。不能用NS5b进行基因分型的七个样品从这个评估阶段中排除。所有7个不能进行基因分型的样品在这项评估的阶段2中重复。
备选RT-PCR引物对正在开发中以扩增基因型6a和7c，如以下连同阶段2分析描述的，随后被设计和分析。
重现性分析
为了确定本发明的HCV NS5b基因分型分析和试剂的重现性，由两个操作员在两个独立试验上对包含基因型1-10的总共22个样品进行分析，并对结果在型和亚型水平上的一致性进行比较。还比较了对八个试验的每一个上的阳性对照的结果。
操作员之间的重现性数据
  样品ID   操作员1NS5b基因型   操作员2NS5b基因型
  HCVGTP-004c#1   UG   UG
  HCVGTP-004c#2   6i   6i
  HCVGTP-004c#3   6n   6n
  HCVGTP-004c#4   6b   6b
  HCVGTP-004c#5   UG   UG
  HCVGTP-004a#1   3k   3k
  HCVGTP-004a#2   6n   6n
  HCVGTP-004a#3   3k   3k
  HCVGTP-004a#4   6i   6i
  14682   4a   4a
  15038   5a   5a
  20759   UG   UG
  Acrometrix1   1a   1a
  Acrometrix2   2b   2b
  Acrometrix3   3a   3a
  Acrometrix4   4a   4a
  Acrometrix5   5a   5a
  Acrometrix6   UG   UG
  GP4A-C2   4a   4a
  1-5A   5a   5a
  GP6A-A2   UG   UG
  GP6A-C2   UG   UG
试验之间的重现性数据
 样品ID   预期的基因型  BRTL NS5b基因型
 阳性对照试验1   1b  1b
 阳性对照试验2   1b  1b
 阳性对照试验3   1b  1b
 阳性对照试验4   1b  1b
 阳性对照试验5   1b  1b
 阳性对照试验6   1b  1b
 阳性对照试验7   1b  1b
 阳性对照试验8   1b  1b
分别由两个操作员分析了22个样品，产生了16种NS5b基因型。以上数据表明，NS5b基因分型分析在两个操作员之间以及在两个试验之间NS5b基因型在型和亚型水平上产生了16/16或100％的一致性。
6个样品(4个基因型6a和2个基因型7c)不能被两个操作员扩增或进行基因分型。试验之间的重现性：8个试验的8份阳性对照之间一致性为100％。
敏感性分析
为了确定基因分型分析的敏感性水平，还如以下详述的制备了基因型1-10的系列稀释物。
HCV NS5b敏感性系列稀释物
  基因型   标称的c/mL   测试的份数   可基因分型的份数
  1a   5,000   3   3/3
  1a   1,000   6   3/6
  1a   500   6   0/6
  2b   5,000   3   3/3**
  2b   1,000   6   6/6**
  2b   500   6   4/6
  3   1,000   3   3/3
  4   1,000   3   1/3
  5   1,000   3   3/3
6 1,000 3 0/3
  6b(004c#4)   2,423*   3   0/3
  7c(004c#1)   258*   3   0/3
  7c(004c#5)   101*   3   0/3
  8c(004c#3)   182*   3   0/3
  8c(004a#2)   665*   3   0/3
  9b(004c#2)   283*   3   0/3
  9b(004a#4)   1,372*   3   0/3
  10a(004a#1)   1,743*   3   3/3
  10a(004a#3)   1,000   3   0/3
  4a(14682)   571*   1   0/1
  5a(15038)   368*   1   0/1
  6a(20759)   343*   1   0/1
*根据供应厂商提供的分析值证书制造敏感性系列稀释物。随后通过bDNA测定的病毒载荷被用于重新计算这些敏感性系列成员的标称值。
**这个样品通过LiPA和HCV 5′NC TruGene基因分型确认为2b，用NS5b基因分型确认为1b基因型。它将被送到参比实验室进行附加的测试来解决基因型矛盾。
上述数据表明，对基因型1-5的HCV NS5b基因分型分析满足可接受的敏感性的规定，因为1,000c/mL(192IU/mL)的HCV基因型1-5被精确地和可重现地基因分型。
然而，HCV NS5b基因分型分析并不能始终对HCV基因型6的样品进行基因分型。1,000c/mL(192IU/mL)的HCV基因型6样品始终不能被基因分型。因而，由于在制备基因型6-10的敏感性稀释物中的问题，1,000c/mL的敏感性不能由这些数据确定。因而NS5b基因分型分析对于1,000c/mL的基因型1-5是精确的，同时一致性有所变化。
实施例3-通过测序的HCV NS5b基因分型的性能特征评估
分析精度分析
将对一小部分阶段1验证精确性样品进行分析，并将结果与之前的基因型进行比较，所述样品由包含基因型1-6的6成员系列、包含基因型4-10的12成员系列、以及包含基因型4、5和6的4个其他临床样品组成。样品早先通过LiPA或TruGene 5′NC基因分型或在采样小节详述的另一种NS5b方法来表征。
分析精确度数据
样品ID              预期的基因型    BRTL NS5b基因型
  HCVGTP-004c#1   7C(6f)   6f
  HCVGTP-004c#2   9B(6i)   6i
  HCVGTP-004c#3   8C(6n)   6n
  HCVGTP-004c#4   6B   6b
  HCVGTP-004c#5   7C(6f)   6f
  HCVGTP-004a#1   10A(3k)   3k
  HCVGTP-004a#2   8C(6n)   6n
  HCVGTP-004a#3   10A(3k)   3k
  HCVGTP-004a#4   9B(6i)   6i
  14682   4A   4a
  15038   5A   5a
  20759   6A   6a
  Acrometrix1   1B   1a
  Acrometrix2   2B   2b
  Acrometrix3   3A   3a
  Acrometrix4   4   4a
  Acrometrix5   5A   5a
  Acrometrix6   6A   6a
  GP4A-C2   4A   UG(no amp)rpt 4a
  1-5A   5A   5a
  GP6A-A2   6A   6a
  GP6A-C2   6A   6a
上述数据表明，HCV NS5b基因分型分析的精确性对于所有样品在型水平上是100％一致的，包括早先失败的两个7c样品和四个6a样品。
重现性分析
对四个试验的每一个上的阳性对照的结果进行比较，如下：
重现性数据
  样品ID   预期的基因型  BRTL NS5b基因型
  阳性对照试验1   1b  1b
  阳性对照试验2   1b  1b
  阳性对照试验3   1b  1b
  阳性对照试验4   1b  1b
上述数据显示了在来自4个试验的4份阳性对照中的100％一致性。
敏感性分析
如以下详述的制备基因型1-6的系列稀释物：
敏感性数据
  基因型ID   标称c/mL   测试的份数   可基因分型的份数
  1a 5,000   5,000   3   3/3
  1a 1,000   1,000   3   1/3
  2b 5,000   5,000   3   3/3*
  2b 1,000   1,000   3   2/3*
  3 1,000   1,000   3   3/3
  4 1,000   1,000   3   3/3
  5 1,000   1,000   3   3/3
  6 1,000   1,000   3   0/3
  7c 004c#1   5,000   3   3/3
  9b 004c#2   5,000   3   3/3
  8c 004c#3   5,000   3   1/3
  6b 004c#4   5,000   3   3/3
  7c 004c#5   5,000   3   3/3
  10a 004a#1   5,000   3   3/3
  8c 004a#2   5,000   3   3/3
  10a 004a#3   1,000   3   1/3
  9b 004a#4   5,000   3   1/3
  6a GP6a A3   5,000   3   1/3
  6a GP6A C3   5,000   3   1/3
  6a 20759   5,000   3   3/3
*这个样品通过LiPA和HCV 5′NC TruGene基因分型确认为2b，用NS5b确认为1b基因型。它将被送到参比实验室用于附加的测试来解决基因型矛盾。
这项分析对1,000c/mL(192IU/mL)的基因型1-5产生了精确的和可重现的基因分型，并对5,000c/mL(962IU/mL)的基因型6产生了精确的和可重现的基因分型。
                        序列表
<110>BAYER HEALTHCARE LLC
     HNATYSZYN，James
     BELD，Marcellinus Gualbertus Hubertus Maria
     GUETTOUCHE，Toumy
     GOUW，Remko
     van der MEER，Carola Beatrijs Maria
<120>对HCV进行基因分型的方法和试剂
<130>49493-326
<140>Not yet assigned
<141>2006-12-22
<150>US 60/753,761
<151>2005-12-23
<160>12
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<400>1
tatgayaccc gctgyttyga ytc    23
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<220>
<221>modified_base
<222>(10)..(10)
<220>
<221>modified_base
<222>(10)..(10)
<223>i
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>n is a，c，g，或t
<400>2
vgtcatrgcn tcygtraagg ctc      23
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<400>3
tggggttckc gtatgayacc cgctg    25
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<220>
<221>modified_base
<222>(11)..(11)
<223>i
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>n is a，c，g，或t
<220>
<221>modified_base
<222>(23)..(23)
<223>i
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>n is a，c，g，或t
<400>4
tggggttckc ntatgayacy mgntg     25
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<220>
<221>modified_base
<222>(18)..(18)
<223>i
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>n is a，c，g，或t
<400>5
gartayctvg tcatrgcntc ygtraa    26
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>n is a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>n is a，c，g，或t
<400>6
tggsbttykc ntaygayacy mgntg    25
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<400>7
tggggttckc gtatgayacc cgctg    25
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<220>
<221>modified_base
<222>(11)..(11)
<223>i
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>n is a，c，g，或t
<220>
<221>modified_base
<222>(23)..(23)
<223>i
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>n is a，c，g，或t
<400>8
tggggttckc ntatgayacy mgntg    25
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<220>
<221>modified_base
<222>(18)..(18)
<223>i
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>n is a，c，g，或t
<400>9
gartayctvg tcatrgcntc ygtraa    26
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<400>10
tatgayaccc gctgyttyga ytc       23
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<220>
<221>modified_base
<222>(10)..(10)
<223>i
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>n is a，c，g，或t
<400>11
vgtcatrgcn tcygtraagg ctc                                          23
<210>12
<211>1944
<212>DNA
<213>人类细胞巨化病毒
<400>12
cccgactccg acgttgagtc ctattcttcc atgccccccc tggaggggga gcctggggat    60
ccggatctca gcgacgggtc atggtcgacg gtcagtagtg gggccgacac ggaagatgtc   120
gtgtgctgct caatgtctta ttcctggaca ggcgcactcg tcaccccgtg cgctgcggag   180
gaacaaaaac tgcccatcaa cgcactgagc aactcgttgc tacgccatca caatctggtg   240
tattccacca cttcacgcag tgcttgccaa aggaagaaga aagtcacatt tgacagactg   300
caagttctgg acagccatta ccaggacgtg ctcaaggagg tcaaagcagc ggcgtcaaaa   360
gtgaaggcta acttgctatc cgtagaggaa gcttgcagcc tggcgccccc acattcagcc   420
aaatccaagt ttggctatgg ggcaaaagac gtccgttgcc atgccagaaa ggccgtagcc   480
cacatcaact ccgtgtggaa agaccttctg gaagacagtg taacaccaat agacactacc   540
atcatggcca agaacgaggt tttctgcgtt cagcctgaga aggggggtcg taagccagct   600
cgtctcatcg tgttccccga cctgggcgtg cgcgtgtgcg agaagatggc cctgtacgac   660
gtggttagca agctcccctt ggccgtgatg ggaagctcct acggattcca atactcacca   720
ggacagcggg ttgaattcct cgtgcaagcg tggaagtcca agaagacccc gatggggctc   780
tcgtatgata cccgctgttt tgactccaca gtcactgaga gcgacatccg tacggaggag   840
gcaatttacc aatgttgtga cctggacccc caagcccgcg tggccatcaa gtccctcact   900
gagaggcttt atgttggggg ccctcttact aattcaaggg gggaaaactg cggctaccgc   960
aggtgccgcg cgagcagagt actgacaact agctgtggta acaccctcac tcgctacatc  1020
aaggcccggg cagcctgtcg agccgcaggg ctccaggact gcaccatgct cgtgtgtggc  1080
gacgacttag tcgttatctg tgaaagtgcg ggggtccagg aggacgcggc gagcctgaga    1140
gccttcacgg aggctatgac caggtactcc gccccccccg gggacccccc acaaccagaa    1200
tacgacttgg agcttataac atcatgctcc tccaacgtgt cagtcgccca cgacggcgct    1260
ggaaagaggg tctactacct tacccgtgac cctacaaccc ccctcgcgag agccgcgtgg    1320
gagacagcaa gacacactcc agtcaattcc tggctaggca acataatcat gtttgccccc    1380
acactgtggg cgaggatgat actgatgacc cacttcttta gcgtcctcat agccagggat    1440
cagcttgaac aggctctcaa ctgcgagatc tacggagcct gctactccat agaaccactg    1500
gatctacctc caatcattca aagactccat ggcctcagcg cattttcact ccacagttac    1560
tctccaggtg aaattaatag ggtggccgca tgcctcagaa aacttggggt cccgcccttg    1620
cgagcttgga gacaccgggc ctggagcgtc cgcgctaggc ttctggccag aggaggcaag    1680
gctgccatat gtggcaagta cctcttcaac tgggcagtaa gaacaaagct caaactcact    1740
ccgataacgg ccgctggccg gctggacttg tccggctggt tcacggctgg ctacagcggg    1800
ggagacattt atcacagcgt gtctcatgcc cggccccgct ggttctggtt ttgcctactc    1860
ctgcttgctg caggggtagg catctacctc ctccccaacc gatgaagatt gggctaacca    1920
ctccaggcca ataggccatt  ccct                                          1944

Claims (32)

1.一种测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的基因型的方法，包括：
(a)测定指示测试样品中存在的所述HCV种的基因型的HCV的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列，其中多种HCV种的相应核苷酸序列指示所述HCV种的特有基因型；
(b)将(a)中测定的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与所述多种HCV种之一的基因型相关联。
2.权利要求1的方法，其中HCV的NS5b区域的所述部分基本上由从SEQ ID NO：1的大约核苷酸位置8344到大约8547的区域组成。
3.权利要求1的方法，其中所述HCV的NS5b区域的部分基本上由从SEQ ID NO：1的核苷酸位置8344到8547的区域组成。
4.一种测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的基因型的方法，包括：
(a)测定指示存在于所述测试样品中的所述HCV种的基因型的HCV的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6的多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示所述HCV种的特有基因型；
(b)将(a)中测定的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与所述HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相关联。
5.权利要求4的方法，其中所述HCV的NS5b区域的部分基本上由从SEQ ID NO：1的大约核苷酸位置8344到大约8547的区域组成。
6.权利要求4的方法，其中所述HCV的NS5b区域的部分基本上由从SEQ ID NO：1的核苷酸位置8344到8547的区域组成。
7.一种测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的基因型和亚型的方法，包括：
(a)测定指示存在于测试样品的所述HCV种的基因型和亚型的HCV的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列，其中具有HCV基因型1、2、3、4、5和6以及表1所列的每一种HCV亚型的相应核苷酸序列指示所述HCV种的特有基因型和亚型；
(b)将(a)中测定的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与所述HCV基因型1、2、3、4、5和6之一以及表1中所列所述亚型之一相关联。
8.权利要求7的方法，其中所述HCV的NS5b区域的部分基本上由从SEQ ID NO：1的大约核苷酸位置8344到大约8547的区域组成。
9.权利要求7的方法，其中所述HCV的NS5b区域的部分基本上由从SEQ ID NO：1的核苷酸位置8344到8547的区域组成。
10.一种测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的基因型的方法，包括：
(a)提供能够产生多种HCV种的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示所述HCV种的特有基因型；
(b)测定指示存在于测试样品中的所述HCV种的基因型的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列；并
(c)将(b)中测定的所述HCV种的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与所述多种HCV种之一的基因型相关联。
11.权利要求10的方法，其中所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从大约核苷酸8256到大约8278互补的简并核苷酸序列或其互补物，以及与多种HCV种的NS5b区域从SEQ IDNO：1的大约核苷酸8611到大约8633互补的简并核苷酸序列或其互补物。
12.权利要求10的方法，其中所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从核苷酸8256到8278互补的简并核苷酸序列或其互补物，以及与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的核苷酸8611到8633互补的简并核苷酸序列或其互补物。
13.权利要求10的方法，其中所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含由下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：1：5′-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3′；和
SEQ ID NO：2：5′-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3′。
14.一种测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的基因型的方法，包括：
(a)提供能够产生多种HCV种的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一；
(b)测定指示存在于所述测试样品中的所述HCV种的基因型的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列；以及
(c)将(b)中测定的所述HCV种的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与HCV基因型1、2、3、4、5和6之一相关联。
15.权利要求14的方法，其中所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从大约核苷酸8256到大约8278互补的简并核苷酸序列或其互补物，以及与多种HCV种的NSSb区域从SEQ IDNO：1的大约核苷酸8611到大约8633互补的简并核苷酸序列或其互补物。
16.权利要求14的方法，其中所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从核苷酸8256到8278互补的简并核苷酸序列或其互补物，以及与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的核苷酸8611到8633互补的简并核苷酸序列或其互补物。
17.权利要求14的方法，其中简并寡核苷酸测序引物的混合物包含由下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：1：5′-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3′；和
SEQ ID NO：2：5′-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3′。
18.一种测定测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的基因型的方法，包括：
(a)提供能够产生多种HCV种的NS5b区域的至少一部分的核苷酸序列的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述多种HCV种的每一种的相应核苷酸序列指示HCV基因型1、2、3、4、5和6之一和所述亚型之一；
(b)测定指示存在于测试样品中的所述HCV种的基因型和亚型的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列；以及
(c)将(b)中测定的所述HCV种的NS5b区域的所述部分的核苷酸序列与HCV基因型和亚型相关联。
19.权利要求18的方法，其中所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从大约核苷酸8256到大约8278互补的简并核苷酸序列或其互补物，以及与多种HCV种的NS5b区域从SEQ IDNO：1的大约核苷酸8611到大约8633互补的简并核苷酸序列或其互补物。
20.权利要求18的方法，其中所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含与多种HCV种的NS5b区域从核苷酸8256到8278互补的简并核苷酸序列或其互补物，以及与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的核苷酸8611到8633互补的简并核苷酸序列或其互补物。
21.权利要求18的方法，其中所述简并寡核苷酸测序引物的混合物包含由下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：1：5′-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3′；和
SEQ ID NO：2：5′-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3′。
22.一种扩增测试样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)种的NS5b区域的一部分的方法，包括：
(a)提供简并寡核苷酸PCR引物的混合物，它包含：
与多种HCV种的NS5b区域从大约核苷酸8245到大约8269互补的简并核苷酸序列或其互补物；和
与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的大约核苷酸8616到大约8641互补的简并核苷酸序列或其互补物；并
(b)扩增NS5b区域的所述部分的核苷酸序列。
23.权利要求22的方法，其中所述简并寡核苷酸PCR引物的混合物包含：
与多种HCV种的NS5b区域从核苷酸8256到8278互补的简并核苷酸序列或其互补物；和
与多种HCV种的NS5b区域从SEQ ID NO：1的核苷酸8611到8633互补的简并核苷酸序列或其互补物。
24.权利要求22的方法，其中所述简并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：6：5′-TGG SBT TYK CNT AYG AYA CYM GNT G-3′
SEQ ID NO：5：5′-GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA-3′
25.权利要求22的方法，其中所述简并寡核苷酸PCR引物的混合物包含由下式定义的简并寡核苷酸序列，或其互补物：
SEQ ID NO：3：5′-TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GCT G-3′
SEQ ID NO：4：5′-TGG GGT TCK CIT ATG AYA CYM GIT G-3′
SEQ ID NO：5：5′-GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA-3′
26.一种简并寡核苷酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由一个或多个下式定义的多种寡核苷酸PCR引物：
SEQ ID NO：3：5′-TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GCT G-3′
SEQ ID NO：4：5′-TGG GGT TCK CIT ATG AYA CYM GIT G-3′
SEQ ID NO：5：5′-GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA-3′
27.权利要求26的简并寡核苷酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定义的多种寡核苷酸PCR引物：
SEQ ID NO：3：5′-TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GCT G-3′
28.权利要求26的简并寡核苷酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定义的多种寡核苷酸PCR引物：
SEQ ID NO：4：5′-TGG GGT TCK CIT ATG AYA CYM GIT G-3′
29.权利要求26的简并寡核苷酸PCR引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定义的多种寡核苷酸PCR引物：
SEQ ID NO：5：5′-TGG GGT TCK CIT ATG AYA CYM GIT G-3″
30.一种简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述混合物包含由一个或多个下式定义的多种寡核苷酸测序引物：
SEQ ID NO：1：5′-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3′；和
SEQ ID NO：2：5′-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3′。
31.权利要求30的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定义的多种寡核苷酸测序引物：
SEQ ID NO：1：5′-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3′；和
32.权利要求30的简并寡核苷酸测序引物的混合物，其中所述混合物包含由下式定义的多种寡核苷酸测序引物：
SEQ ID NO：2：5′-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3′。
CNA200680048422XA 2005-12-23 2006-12-22 对hcv进行基因分型的方法和试剂 Pending CN101341247A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75376105P 2005-12-23 2005-12-23
US60/753,761 2005-12-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101341247A true CN101341247A (zh) 2009-01-07

Family

ID=38218857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA200680048422XA Pending CN101341247A (zh) 2005-12-23 2006-12-22 对hcv进行基因分型的方法和试剂

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20070259339A1 (zh)
EP (1) EP1963493B1 (zh)
JP (1) JP2009521235A (zh)
KR (1) KR20080082662A (zh)
CN (1) CN101341247A (zh)
AU (1) AU2006330464A1 (zh)
BR (1) BRPI0620445A2 (zh)
CA (1) CA2638903A1 (zh)
MX (1) MX2008008237A (zh)
NO (1) NO20083233L (zh)
WO (1) WO2007076493A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102719558A (zh) * 2012-05-30 2012-10-10 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090325145A1 (en) * 2006-10-20 2009-12-31 Erwin Sablon Methodology for analysis of sequence variations within the hcv ns5b genomic region
EP2236624B1 (en) 2007-08-09 2012-11-07 Federalnoe Gosudarstvennoe Byudzhetnoe Uchrezhdenie Nauki Institut Molekulyarnoi Biologi Im. V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk Method for identifying the genotype and subtype of hepatitis c virus on a biological microchip
EP2625286B1 (en) * 2010-10-04 2020-04-15 Roche Diagniostics GmbH Method for cell lysis in a pcr reaction buffer
JP5911495B2 (ja) 2010-10-04 2016-04-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 同じ反応容器内での細胞溶解およびｐｃｒのための方法
WO2012045668A1 (en) * 2010-10-04 2012-04-12 Roche Diagnostics Gmbh Method for cell lysis in a rt-pcr reaction buffer
CN102286644B (zh) * 2011-08-26 2013-04-10 李艳 一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒
FR2989089B1 (fr) 2012-04-04 2020-02-07 Etablissement Francais Du Sang Oligonucleotides modifies comprenant des fonctions thiol et leur utilisation pour la detection d'acides nucleiques
GB2520021A (en) * 2013-11-06 2015-05-13 Vela Operations Pte Ltd HCV genotyping algorithm
US20150176060A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Roche Molecular Systems, Inc. Method For Coding Of Multiple PCR Reactions For Assay Recognition
EP3451894B1 (en) 2016-05-02 2023-11-15 Entellus Medical, Inc. Nasal valve implants
KR102412183B1 (ko) * 2017-04-17 2022-06-23 주식회사 씨젠 올리고뉴클레오타이드 최적 조합의 제공방법
US11837326B2 (en) 2017-08-11 2023-12-05 Seegene, Inc. Methods for preparing oligonucleotides for detecting target nucleic acid sequences with a maximum coverage

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5352600A (en) 1986-08-22 1994-10-04 Hoffmann-La Roche Inc. Purified thermostable enzyme
US5079352A (en) 1986-08-22 1992-01-07 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5427911A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Yale University Coupled amplification and sequencing of DNA
EP0655506B1 (en) 1994-10-17 1996-09-18 President And Fellows Of Harvard College DNA polymerases having modified nucleotide binding site for DNA sequencing
US6007983A (en) 1995-12-22 1999-12-28 Visible Genetics Inc. Method and kit for evaluation of HIV mutations
US7196183B2 (en) * 2001-08-31 2007-03-27 Innogenetics N.V. Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102719558A (zh) * 2012-05-30 2012-10-10 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009521235A (ja) 2009-06-04
EP1963493A4 (en) 2009-11-25
EP1963493A2 (en) 2008-09-03
WO2007076493A8 (en) 2017-02-02
EP1963493B1 (en) 2017-02-22
NO20083233L (no) 2008-07-21
US8735063B2 (en) 2014-05-27
MX2008008237A (es) 2008-11-06
US20070259339A1 (en) 2007-11-08
KR20080082662A (ko) 2008-09-11
WO2007076493A2 (en) 2007-07-05
WO2007076493A3 (en) 2008-04-24
US20100196876A1 (en) 2010-08-05
AU2006330464A1 (en) 2007-07-05
CA2638903A1 (en) 2007-07-05
BRPI0620445A2 (pt) 2011-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101341247A (zh) 对hcv进行基因分型的方法和试剂
JP5524838B2 (ja) オリゴヌクレオチド、及び５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を著しく欠如するポリメラーゼを使用する、増幅の抑制
US20200017902A1 (en) Quantification of Mutant Alleles and Copy Number Variation Using Digital PCR with Nonspecific DNA-Binding Dyes
US7989168B2 (en) Proofreading primer extension
US11725242B2 (en) Nucleic acid amplification controls and kits and methods of use thereof
JP2021509821A (ja) 標的核酸増幅方法及び標的核酸増幅用組成物
US20070298415A1 (en) Method of Amplifying Nucleic Acid
US20050059000A1 (en) Method of stabilizing reagent for amplifying or detecting nucleic acid and storage method
EP3818172A1 (en) Formulations and signal encoding and decoding methods for massively multiplexed biochemical assays
AU2003241943A1 (en) Method of typing gene polymorphisms
EP1013775A1 (en) Quantitative polymerase chain reaction using a fluorogenic real-time detection system
CN112501166A (zh) 一种化学修饰的高稳定性rna及试剂盒和方法
CN108291252B (zh) 稳定特定rna的通用方法
KR102599751B1 (ko) 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트
WO2024141476A1 (en) Digital pcr assay designs for multiple hepatitis b virus gene targets and non-extendable blocker oligonucleotides therefor
CN109735607A (zh) 一种双脱氧核苷封闭的寡核苷酸的制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20090107