CN101347492A - 一种剑叶三宝木提取物在制备抗艾滋病病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药，具体涉及一种剑叶三宝木提取物在制备抗艾滋病病毒药物中的应用，该提取物用于制备抗艾滋病病毒的药物，所述剑叶三宝木提取物即将剑叶三宝木经过有机溶剂提取所得的植物提取物，其提取过程为将剑叶三宝木烘干并粉碎成粉末，并真空干燥至恒重，用有机溶剂回流提取三次，合并提取液，过滤，减压回收尽溶剂，冷冻干燥成粉末即为剑叶三宝木提取物。本发明的优点：植物体生物利用率高，效果显著；原料来源具有特有性，安全性高；对该提取物药物活性的深入研究和开发利用意义深远；发展前景广阔。

Description

一种剑叶三宝木提取物在制备抗艾滋病病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药，具体涉及一种剑叶三宝木提取物在制备抗艾滋病病毒药物中的应用。

背景技术

由HIV感染而引起的疾病称为艾滋病，全称为获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，该病患者的免疫功能部份或完全丧失，CD4⁺细胞数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。该病传播速度快、病死率高，且目前无法治愈，引起了各国政府和社会关注。

目前已发现两种HIV，分别为HIV-1和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到。其毒力和传播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。目前治疗艾滋病最有效的方法是高效抗逆转录病毒疗法(Highly activeanti-retroviral therapy，HAART，俗称鸡尾酒疗法)，它是通过同时使用3-4种药物，每一种药物针对艾滋病病毒繁殖周期中的不同环节，从而达到抑制或杀灭艾滋病病毒，治愈艾滋病的目的。“鸡尾酒疗法”目前已成为标准的抗艾滋病药方。但“鸡尾酒疗法”也并非完美，它存在着很大的局限性。例如“鸡尾酒疗法”疗效不是100％，病人必须长期服药，而不能得到根治，还会造成包括脂质营养不良、背腹部脂肪异常堆积、血脂浓度异常升高等毒副作用，其中最严重的是肝功能衰竭和糖尿病。而且HAATR昂贵的费用也限制了它的使用，世界上超过90％的病人不能运用它进行治疗。现实是迫切需要开发出治疗艾滋病价廉的替代药物。在这样的形势下，传统医学异乎寻常地引起人们的关注。我国有五千多年的文化传统，特别是独具一格的中医药是世界科学文化中的一朵奇葩，由于具有独特的理论体系和用药方式，理应在防治艾滋病中发挥较大的作用，为世界攻克艾滋病作出贡献。虽然艾滋病是一种新的人类疾病，中医药文献及经验从未有所记载，但是以中医症侯学及病因病理学为基础，诊治艾滋病及相关综合症是完全可行的。尤其是几千味传统的天然药物历经数千年临床应用，从中一定能开发出有相当疗效的防治艾滋病的药物。基于此，目前全世界寻找天然抑制艾滋病病毒(HIV)药物的研究正在蓬勃开展。

海南岛是一个药用植物资源十分丰富的地区，据海南植物志记载，海南现有植物种类4600多种，其中药用植物就多达3100余种，占我国现存药用植物的1/3。剑叶三宝木为大戟科(Euphorbiaceae)三宝木属(Trigonostemon genus)植物，为海南特有种，主要分布于三亚和陵水。剑叶三宝木在海南民间用作平喘药，经全面查阅国内外文献资料发现，除国外有学者对三宝木Trigonostemon reidioides进行过化学成分和药理活性研究外，未见到关于剑叶三宝木化学成分和药理活性研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种剑叶三宝木提取物的应用，其具有显著的抗艾滋病病毒活性。

本发明采用的技术方案是：一种剑叶三宝木提取物的应用，该提取物在制备抗艾滋病病毒药物中的应用。

剑叶三宝木提取物，即将剑叶三宝木经过有机溶剂提取所得的植物提取物。

所述剑叶三宝木提取物的提取过程为：将剑叶三宝木烘干并粉碎成粉末，并真空干燥至恒重，用有机溶剂回流提取三次，合并提取液，过滤，减压回收尽乙醇，冷冻干燥成粉末即为剑叶三宝木提取物。所述有机溶剂是乙醇或甲醇。

通过应用现代药理实验方法对剑叶三宝术提取物的活性进行检测，发现该提取物具有显著的抗艾滋病病毒作用，可以作为制备抗艾滋病病毒的药物。

本发明具有如下优点：

1、植物体生物利用率高，效果显著。本发明采用有机溶剂进行提取，剑叶三宝木的活性成分溶出率高，提取物具有显著的抗艾滋病病毒作用。

2、原料来源独特，安全性高。剑叶三宝木主要分布于我国海南省的三亚和陵水等地，是海南的特有药用植物，因而资源具有独特性；本发明所提供的提取物来自于天然植物，其在民间也长期用作平喘药，因此作为药物对人体无毒害等副作用。

3、发展前景广阔。利用天然植物的提取物开辟一条治疗艾滋病或病毒性疾病的新途径，并且可以进一步分离纯化提取物中的活性成分，设计开发出更高效的治疗艾滋病或病毒性疾病的药物，应用范围广。

附图说明

图1是剑叶三宝木提取物对HIV复制的影响。

图中：Ctrl(-HIV) Jurkat细胞没有感染HIV；

      Ctrl(+HIV) Jurkat细胞感染了HIV后没有用提取物处理；

      DMSO 溶解提取物的溶剂，作为阴性对照；

      AZT  抗HIV药物，阳性对照；

      TXE  剑叶三宝木乙醇提取物。

图2是剑叶三宝木提取物对细胞存活的影响。

图中：Ctrl(-HIV) Jurkat细胞没有感染HIV；

      Ctrl(+HIV) Jurkat细胞感染了HIV后没有用提取物处理；

      DMSO 溶解提取物的溶剂，作为阴性对照；

      AZT  抗HIV药物，阳性对照；

      TXE  剑叶三宝木乙醇提取物。

图3是剑叶三宝木提取物对Jurkat细胞增殖和存活的影响。

图中：Ctrl：细胞没有进行任何处理；

      DMSO  溶解提取物的溶剂，作为阴性对照；

      AZT   抗HIV药物，阳性对照；

      TXE   剑叶三宝木乙醇提取物。

图4是剑叶三宝木提取物对HIV-1感染的Jurkat细胞合包体形成的影响。

图中：Moc  没有感染的Jurkat细胞；

      Non  感染HIV-1后没有进行任何处理的Jurkat细胞；

      DMSO 溶解提取物的溶剂，作为阴性对照；

      AZT  抗HIV药物，阳性对照；

      TXE  剑叶三宝木乙醇提取物。

图5是剑叶三宝木提取物对逆转录酶活性的直接影响。

图中：Moc  没有感染的Jurkat细胞；

      PBS  磷酸缓冲盐溶液，作为溶剂对照；

      DMSO 溶解提取物的溶剂，作为阴性对照；

      AZT  抗HIV药物，阳性对照；

      TXE  剑叶三宝木乙醇提取物。

图6是剑叶三宝木提取物对HIV-1进入U87.CD4.CXCR4细胞的影响。

图中：DMSO 溶解提取物的溶剂，作为阴性对照；

      TXE  剑叶三宝木乙醇提取物；

      ENV  病毒外壳蛋白；

      HXB2 含HXB2外壳蛋白的HIV-Luc病毒；

      VSV-G含VSV-G外壳蛋白的HIV-Luc病毒。

图7是剑叶三宝木提取物对HIV-1基因表达的影响。

图中：DMSO 溶解提取物的溶剂，作为阴性对照；

      TXE  剑叶三宝木乙醇提取物；

ENV 病毒外壳蛋白；

HXB2含HXB2外壳蛋白的HIV-Luc病毒。

具体实施方式

下面用非限定性实施例对本发明作进一步说明。

实施例一、

将剑叶三宝木茎粉碎成粉末并真空干燥至恒重，用80％甲醇回流提取，合并提取液，过滤，减压回收尽甲醇，合并提取液，过滤，减压回收尽乙醇，冷冻干燥成粉末即为剑叶三宝木提取物。

实施例二、

将剑叶三宝木粉碎成粉末并真空干燥至恒重，用75％乙醇回流提取，合并提取液，过滤，减压回收尽乙醇，合并提取液，过滤，减压回收尽乙醇，冷冻干燥成粉末即为剑叶三宝木提取物。

利用剑叶三宝木提取物抗HIV病毒活性实例：

①待试药物

将剑叶三宝木提取物的粉末按100mg/ml溶解在二甲亚砜(DMSO)中，在室温下轻轻振摇过夜。以3000转/分离心10分钟后用0.4μm的过滤头过滤以除去任何不溶的小颗粒。清澈的部分作为待试药物。

②细胞、病毒和药物

Jurkat细胞和U87.CD4.CXCR4细胞分别培养在RPM1640和DMEM中，补充10％新生小牛血清，100units/ml青霉素和100ug/ml硫酸链霉素。T嗜性HIV-1细胞株HXBc2的前病毒DNA通过DEAE-Dextran法转染进Jurkat细胞以产生病毒接种。HIV-1 HXBc2病毒株表达了HIV-1的Eli病毒株的一部分成分和所有其它的HXB2基因。

③HIV-1复制实验

为了监测病毒复制，1×10⁶/ml Jurkat细胞首先用HIV-1感染，相当于10,000cpm逆转录酶(RT)活性。在感染24小时后，RPMI-1640完全培养基把没有进入细胞的病毒全洗掉，加入待试药物或等量的DMSO溶剂处理。48小时后测量每个细胞培养液的RT活性，同时加入新的药物。用化合物叠氮胸苷(AZT，3′-Azido-3′-deoxythymidine)作为阳性对照。

④细胞毒性实验

待试药物的细胞毒性用台盼蓝拒染法(the trypan blueexclusion method)测定。也就是被HIV-1感染或没被感染的Jurkat细胞存在于待试药物中不同的时间后用0.2％台盼蓝溶液染色，在光镜下计数活细胞。

⑤HIV-1假病毒的制备和感染

通过磷酸钙沉淀法用20μg HIV-Luc质粒和4μg的pHXB2-env，pVSV-G，或pcDNA3转染293T cells。48小时后在培养液改变后细胞培养液的上清液被收集，过滤和保存为病毒储液。相当于2000cpmRT活性的假病毒被用来感染U87.CD4.CXCR4细胞。在2小时的感染后，用新鲜培养基多次洗涤除去了原有病毒。细胞继续培养了48小时后收集做Luc活性检测。

⑥数据分析

所有的数值都用平均值±S.E.M表示，或者代表至少三个独立实验。组之间的比较是用双尾学生实验进行的。p＜0.05用(*)标注，p＜0.01用(**)标注。

⑦检测结果：

剑叶三宝木茎(TXE)的乙醇提取物抑制HIV-1的复制而对细胞增殖和存活没有明显影响(图1、图2和图3)。这个结论通过发现它具有阻止HIV感染的细胞形成合包体而得到进一步证实(图4)。然而，我们没有检测到它对于HIV-1RT酶活性的影响(图5)。我们发现TXE能潜在地阻止HIV-1进入目标细胞(图6)，而且它对进入后HIV-1细胞的基因表达影响很小(图7)。这些结果揭示了剑叶三宝木茎乙醇提取物通过阻止HIV-1细胞的进入具有抗HIV活性。

Claims (2)

1、一种剑叶三宝木提取物在制备抗艾滋病病毒药物中的应用，其特征在于：该提取物在制备抗艾滋病病毒药品中的应用；所述提取物的制备过程是将剑叶三宝木经过有机溶剂提取所得的植物提取物。

2、根据权利要求1所述的剑叶三宝木提取物在制备抗艾滋病病毒药品中的应用，其特征在于：所述有机溶剂是乙醇或甲醇。

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