CN101314767A - 增强胎肝造血干细胞cd34表达的培养液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物工程技术领域的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液及其制备方法。培养液组分和重量百分比为:MEM:56.5%-64.7%;RPMI-1640:29.4%-30.4%;Hanks:5.88%-13.0%等。培养液的制备方法:①制得基础培养液;②按所述比例再取相关组分依次加入基础培养液中,搅拌、溶解;③将纯化出的间充质细胞,置入培养瓶,进行培养、冲洗,混合,连续培养将上清液全部收集,经过过滤后,离心,将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;④将条件培养液与MEM混合后,利用碳酸氢钠将混合培养液的pH调节至7.40~7.45,经过过滤即得培养液。本发明对干细胞所具有的CD34表达特征实施强化表达,达到可标识、纯化的范围,提高了干细胞可标识数量,安全可靠,满足临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术领域的培养液及其制备方法。具体涉及一种增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液及其制备方法。
背景技术
造血干细胞在上世纪初被提出且应用于临床已经显示出它的治疗潜力,诸多的血液系统疾病在干细胞移植治疗后使病患的临床症状得以改善,患者的生存期显著的延长。造血干细胞的主要来源包括骨髓源造血干细胞、脐血造血干细胞、胎肝造血干细胞。由于造血干细胞来源不同,干细胞所具备的抗原性亦不同,主要表现为:骨髓源造血干细胞的抗原性(例如:HLA)强,植入体内的骨髓源造血干细胞,如果不经配型,首先宿主的免疫系统会对植入体内的造血干细胞产生排斥作用。输入的抗原性强的干细胞也会排斥宿主,强烈的排斥反应会引起一系列的系统性的免疫变态反应,并导致人体器官的功能障碍和衰竭。因此,骨髓源造血干细胞的植入必须将供体和配体的抗原型作完全比较后,在找出供体和宿主抗原“相同”或极“相近”者才能做细胞植入的治疗,这最终导致患者只有10万或百万分之一的机会寻找到符合自身细胞要求的供体,临床应用存在极大困难。
脐带血提供的造血干细胞由于抗原性较骨髓源造血干细胞弱,故理论上脐血造血干细胞是理想的具有临床治疗价值的干细胞,其机体排斥反应较骨髓源造血干细胞轻。由于脐血造血干细胞的数量有限,不能满足成人及大龄儿童患者植入干细胞修复机体的临床要求,由于脐带血造血干细胞体外增殖,尚存在诸多关键技术问题未解决,临床实际应用存在困难。与前两者相比,胎肝造血干细胞具有以下优势。第一,造血干细胞抗原性较脐血造血干细胞弱,所以干细胞抗原配型相对简易而且容易在小规模的人组织供体中寻获;第二,胎肝造血组织蕴含具有相当数量的干细胞(50~120×106),而脐血造血干细胞仅有1~2×106,该数量的脐血造血干细胞仅能满足体重≤20公斤的患者植入要求;第三,干细胞的成活率高,分化性强。单位细胞产生的细胞集落均高于骨髓和脐血源性造血干细胞,纯化出的干细胞仅需ABO、HLA,六位点配型,便可以实际用于患者,其配型成功机率可高达25%。
经检索发现,中国专利申请号:02134314.4,公开号:CN1389566,名称:神经干细胞培养基及其制备方法,该项技术自述为:公开了一种神经干细胞培养基及其制备方法,由DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液、胰岛素、盐酸丁二胺、硒化钠、氢化可的松、L-谷氨酰胺、人转铁蛋白和黄体酮配制而成,具有使骨髓组织等不同来源种子细胞定向发育分化为神经干细胞功能,可随时准确无误地为医学科研教学及临床应用提供相关需要的神经干细胞。由于造血干细胞的CD34表达受微环境的作用影响较大,某些干细胞在部分周期内CD34表达极弱,而某些干细胞在同样的周期内CD34表达又很强(这种现象又称为“漂移表达”)。这种生物特性使用目前的纯化方法只能纯化CD34表达强的干细胞(通过荧光标记抗体或CD34分离试剂盒对CD34细胞进行标记等方法),而在同一周期内CD34表达弱的干细胞,由于不能有效标记则被忽略,干细胞的这种生物特性(CD34表达)使得目前的纯化方法只能对那些经过标识的干细胞进行纯化,使得干细胞可纯化数量不稳定,且不能有效的纯化出足量的造血干细胞应用于临床,为患者提供多次治疗的机会。
该项技术作用是将一种具有使骨髓组织等不同来源种子细胞定向发育分化为神经干细胞功能的细胞培养基。由于神经干细胞在定向发育分化过程中细胞存在不确定性,经分化后的细胞是否继承并具有原干细胞特征尚不能确定,因此临床应用存在较大的风险。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足,提供一种增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液及其制备方法。本发明的培养液,其作用是对干细胞所具有的CD34表达特征实施强化表达,达到可标识、纯化的范围,从而极大地提高了干细胞可标识数量;本发明的制备方法,使原本造血干细胞中某些CD34表达弱的干细胞,重新显现出来,使原有的造血干细胞数量更多的显现出来,大幅提高了造血干细胞纯化数量,安全可靠,满足临床应用。
本发明所涉及的上述增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液,其组分和重量百分比为:
MEM:56.5%-64.7%;
RPMI-1640:29.4%-30.4%;
Hanks:5.88%-13.0%;
人类干细胞生长因子-2:470×10-9%-1740×10-9%;
人类干细胞生长因子:1.9×10-9%-2.8×10-9%;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子:2.0×10-9%-2.9×10-9%;
CD135配体蛋白:9.4×10-9%-10.8×10-9%;
人类促红细胞生成因子:1.4×10-9%-2.4×10-9%;
人类上皮细胞生成因子:9.4×10-9%-10.8×10-9%;
人类促成纤维细胞生成因子-b:9.4×10-9%-10.8×10-9%。
本发明上述组分的术语和符号具体说明如下:
所述的MEM,是指:minimum essential medium培养基,由美国GIBCO公司生产的动物细胞培养基,含L-谷氨酰胺,不含碳酸氢铵、丙酮酸钠,2℃-8℃保存,更适于支持各种哺乳动物细胞的生长。已有公开文献记载:1、张迎春,廖晓梅等,《不同培养基对海马脑片活性及微管相关蛋白tau表达的影响》,中国医学科学院学报,中图分类号:R745.7文献标识码:A文章编号:1000-503X(2005)04-0513-05;2、韩明,董丽萍,袁芳,Earle’s液与MEM培养基对神经元活性的影响[J],中国康复理论与实践,2005,11(2):125-126。
所述的RPMI-1640,是指:RPMI-1640medium培养基,由Roswell ParkMemorial Institute开发用于培养正常的人白细胞的液体培养基,含L-谷氨酰胺(L-Glutamine),不含碳酸氢铵(HEPES),2℃-8℃保存。已有公开文献记载:1、黄蓓,李振刚等,《RPMI1640培养基对水螅体表渗透营养的初步观察》,动物学杂志,中图分类号:Q172,文献标识码:A,文章编号:025023263(2001)06240203,2001年;2、鄂征等,《组织培养技术》,北京:人民卫生出版社,1985.219。
所述的Hanks,是指:平衡盐缓冲溶液(GENMED Hanks),是一种旨在用于细胞和组织的清洗或组化预处理最常用的溶液,其标准化成分配方依据Hanks和Wallace在1949年发表的成果,并符合美国体外组织培养标准化委员会(Tissue Culture Standards Committee,In Vitro)的规定。产地美国。产品即到即用,严格无菌,性能稳定。标准的Hanks平衡盐溶液(HBSS)含有氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、D-葡萄糖等,但不含钙、镁离子。已有公开文献记载:《中华人民共和国国家标准GB 15193-10-94非程序性DNA合成试验》。
人类干细胞生长因子-2,全称为:human Stem Cell Growth Factor-2;人类干细胞生长因子,全称为:human Stem Cell Growth Factor;人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,全称为:human Granulocyte Macrophage-ColonyStimulation Factor;CD135配体蛋白,全称为:human flt3 ligand;人类促红细胞生成因子,全称为:human Erythropoietin;人类上皮细胞生成因子,全称为:human Epithelial Growth Factor;人类促成纤维细胞生成因子-b,全称为:human Fibroblast Growth Factor-b;上述术语在公开文献均有记载。
本发明组分的优选重量百分比为:
MEM:59.36%-61%;
RPMI-1640:29.7%-30.14%;
Hanks:9.3%-10.5%;
人类干细胞生长因子-2:850×10-9%-1260×10-9%;
人类干细胞生长因子:2.1×10-9%-2.5×10-9%;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子:2.2×10-9%-2.6×10-9%;
CD135配体蛋白:9.8×10-9%-10.4×10-9%;
人类促红细胞生成因子:1.7×10-9%-2.1×10-9%;
人类上皮细胞生成因子:9.7×10-9%-10.4×10-9%;
人类促成纤维细胞生成因子-b:9.6×10-9%-10.4×10-9%。
本发明所涉及的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液的制备方法,使原本造血干细胞中某些CD34表达弱的干细胞,重新显现出来,促进干细胞自然的CD34表达能力,将胎肝中CD34表达弱的造血干细胞表达出能被荧光标记抗体所能辨识出的水平。而原来干细胞中CD34表达强的干细胞不受影响,维持其原有的CD34表达水平。通过细胞“信号”调节系统,将非活跃的CD34基因激活,致使细胞增强CD34蛋白表达。因此本发明不是对造血干细胞进行细胞分化和增殖,而是使原有的造血干细胞数量更多的显现出来,可大幅提高造血干细胞的纯化数量,满足临床应用。
本发明所述的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液可使CD34表达弱的干细胞在特定的周期内增强表达,使其CD34蛋白表达达到可被标识范围。以胎肝造血干细胞为例,用常规荧光抗体标记法,可标记的CD34胎肝造血干细胞的数量范围为10~20×106,而应用本发明制备的“胎肝造血干细胞CD34增强表达的培养液”处理和纯化后,可使胎肝造血干细胞的可标记数量提高5倍以上,即可标记造血干细胞数量为80~100×106。
本发明所涉及的上述增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液的制备方法,包括以下步骤:
①按所述比例取MEM、RPMI 1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③取19-20周标准检验后的人类胎肝,将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入T-75型培养瓶,加入DMEM培养液(DMEM培养液,Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和2%人血清进行培养,经10-14天的培养,将上清液抽出,用Hanks对T-75型培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。然后加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在T-75型培养瓶内混合,经48小时连续培养(条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%),将上清液全部收集。上清液经过0.2微米滤器过滤后,再经过2500g的高速离心将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液。
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠(0.1μmol NaHCO3)将混合培养液的pH调节至7.40~7.45,经过两次0.2微米滤器过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
本发明的培养液,其作用是对干细胞所具有的CD34表达特征实施强化表达,使原本即具有CD34表达特征的干细胞所具有的CD34表达特征得以强化,达到可标识、纯化的范围,从而极大地提高了干细胞可标识数量,由于不存在细胞分化过程,因此干细胞标识、纯化安全可靠,克服了现有技术中存在的细胞分化不确定性的缺点。
本发明培养液的制备方法,使原本造血干细胞中某些CD34表达弱的干细胞,重新显现出来,促进干细胞自然的CD34表达能力,将胎肝中CD34表达弱的造血干细胞表达出能被荧光标记抗体所能辨识出的水平。而原来干细胞中CD34表达强的干细胞不受影响,维持其原有的CD34表达水平。通过细胞“信号”调节系统,将非活跃的CD34基因表达细胞激活,因此本发明不是对造血干细胞进行细胞分化和增殖,而是使原有的造血干细胞数量更多的显现出来,可大幅提高造血干细胞纯化数量,满足临床应用。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一:
本实施例增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液在总重量为1升(L)的情况下组分配比为:
RPMI-1640 250ml;
Hanks 110ml;
人类干细胞生长因子24μg;
人类干细胞生长因子16ng;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子17ng;
CD135配体蛋白92ng;
人类促红细胞生成因子12ng;
人类上皮细胞生成因子92ng;
人类促成纤维细胞生成因子-b 92ng;
MEM余量。
①按上述比例取MEM、RPMI-1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③取19周标准检验后的人类胎肝,将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入T-75型培养瓶,加入DMEM培养液(DMEM培养液,Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和2%人血清进行培养,经13天的培养,将上清液抽出,用Hanks对T-75型培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。然后加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在T 75型培养瓶内混合,经48小时连续培养(条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%),将上清液全部收集。上清液经过0.2微米(μM)滤器过滤后,再经过2500g的高速离心将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠(0.1μmol NaHCO3)将混合培养液的pH调节至7.42,经过两次0.2微米(μM)滤膜过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
实施效果:应用上述方法制备的“胎肝造血干细胞CD34增强表达的培养液”,可使胎肝造血干细胞的可标记数量提高至80×106。
实施例二
本实施例增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液在总重量为1L的情况下组分配比为:
RPMI-1640 300ml;;
Hanks 70ml;
人类干细胞生长因子-220μg;
人类干细胞生长因子32ng;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子33ng;
CD135配体蛋白108ng;
人类促红细胞生成因子28ng;
人类上皮细胞生成因子108ng;
人类促成纤维细胞生成因子-b 108ng;
MEM余量。
①按上述比例取MEM、RPMI-1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③取19周标准检验后的人类胎肝,将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入T-75型培养瓶,加入DMEM培养液(DMEM培养液,Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和2%人血清进行培养,经13天的培养,将上清液抽出,用Hanks对T-75型培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。然后加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在T-75型培养瓶内混合,经48小时连续培养(条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%),将上清液全部收集。上清液经过0.2微米(μM)滤器过滤后,再经过2500g的高速离心将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠(0.1μmol NaHCO3)将混合培养液的pH调节至7.42,经过两次0.2微米(μM)滤膜过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
实施效果:应用上述方法制备的“胎肝造血干细胞CD34增强表达的培养液”,可使胎肝造血干细胞的可标记数量提高至85×106。
实施例三
本实施例增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液在总重量为1L的情况下组分配比为:
RPMI-1640 301ml;
Hanks 98ml;
人类干细胞生长因子-2 13μg;
人类干细胞生长因子25ng;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子30ng;
CD135配体蛋白101ng;
人类促红细胞生成因子21ng;
人类上皮细胞生成因子101ng;
人类促成纤维细胞生成因子-b 101ng;
MEM余量。
①按上述比例取MEM、RPMI-1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③取19周标准检验后的人类胎肝,将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入T-75型培养瓶,加入DMEM培养液(DMEM培养液,Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和2%人血清进行培养,经13天的培养,将上清液抽出,用Hanks对T-75型培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。然后加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在T-75型培养瓶内混合,经48小时连续培养(条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%),将上清液全部收集。上清液经过0.2微米(μM)滤器过滤后,再经过2500g的高速离心将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠(0.1μmol NaHCO3)将混合培养液的pH调节至7.42,经过两次0.2微米(μM)滤膜过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
实施效果:应用上述方法制备的“胎肝造血干细胞CD34增强表达的培养液”,可使胎肝造血干细胞的可标记数量提高至90×106。
实施例四
本实施例增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液在总重量为1L的情况下组分配比为:
RPMI-1640 285ml;
Hanks 130ml;
人类干细胞生长因子-26μg;
人类干细胞生长因子19ng;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子21ng;
CD135配体蛋白96ng;
人类促红细胞生成因子16ng;
人类上皮细胞生成因子96ng;
人类促成纤维细胞生成因子-b 96ng;
MEM余量。
①按上述比例取MEM、RPMI-1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③取20周标准检验后的人类胎肝,将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入T-75型培养瓶,加入DMEM培养液(DMEM培养液,Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和2%人血清进行培养,经12天的培养,将上清液抽出,用Hanks对T-75型培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。然后加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在T-75型培养瓶内混合,经48小时连续培养(条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%),将上清液全部收集。上清液经过0.2微米(μM)滤器过滤后,再经过2500g的高速离心将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠(0.1μmol NaHCO3)将混合培养液的pH调节至7.43,经过两次0.2微米(μM)滤膜过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
实施效果:应用上述方法制备的“胎肝造血干细胞CD34增强表达的培养液”,可使胎肝造血干细胞的可标记数量提高至89×106。
实施例五
本实施例增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液在总重量为1L的情况下组分配比为:
RPMI-1640 325ml;
Hanks 50ml;
人类干细胞生长因子-216μg;
人类干细胞生长因子27ng;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子29ng;
CD135配体蛋白104ng;
人类促红细胞生成因子24ng;
人类上皮细胞生成因子104ng;
人类促成纤维细胞生成因子-b 104ng;
MEM余量。
①按上述比例取MEM、RPMI-1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③取20周标准检验后的人类胎肝,将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入T-75型培养瓶,加入DMEM培养液(DMEM培养液,Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和2%人血清进行培养,经12天的培养,将上清液抽出,用Hanks对T-75型培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。然后加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在T-75型培养瓶内混合,经48小时连续培养(条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%),将上清液全部收集。上清液经过0.2微米(μM)滤器过滤后,再经过2500g的高速离心将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠(0.1μmol NaHCO3)将混合培养液的pH调节至7.43,经过两次0.2微米(μM)滤膜过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
实施效果:应用上述方法制备的“胎肝造血干细胞CD34增强表达的培养液”,可使胎肝造血干细胞的可标记数量提高至91×106。
实施例六
本实施例增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液在总重量为1L的情况下组分配比为:
RPMI-1640 299ml;
Hanks 102ml;
人类干细胞生长因子-2 12μg;
人类干细胞生长因子23ng;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子28ng;
CD135配体蛋白99ng;
人类促红细胞生成因子19ng;
人类上皮细胞生成因子99ng;
人类促成纤维细胞生成因子-b 99ng;
MEM余量。
①按上述比例取MEM、RPMI-1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③取20周标准检验后的人类胎肝,将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入T-75型培养瓶,加入DMEM培养液(DMEM培养液,Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和2%人血清进行培养,经12天的培养,将上清液抽出,用Hanks对T-75型培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。然后加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在T-75型培养瓶内混合,经48小时连续培养(条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%),将上清液全部收集。上清液经过0.2微米(μM)滤器过滤后,再经过2500g的高速离心将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠(0.1μmol NaHCO3)将混合培养液的pH调节至7.43,经过两次0.2微米(μM)滤膜过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
实施效果:应用上述方法制备的“胎肝造血干细胞CD34增强表达的培养液”,可使胎肝造血干细胞的可标记数量提高至93×106。
实施例七
本实施例增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液在总重量为1L的情况下组分配比为:
RPMI-1640 293ml;
Hanks 114ml;
人类干细胞生长因子-2 9μg;
人类干细胞生长因子21ng;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子24ng;
CD135配体蛋白98ng;
人类促红细胞生成因子18ng;
人类上皮细胞生成因子98ng;
人类促成纤维细胞生成因子-b 98ng;
MEM余量。
①按上述比例取MEM、RPMI-1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③取19周标准检验后的人类胎肝,将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入T-75型培养瓶,加入DMEM培养液(DMEM培养液,Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和2%人血清进行培养,经13天的培养,将上清液抽出,用Hanks对T-75型培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。然后加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在T-75型培养瓶内混合,经48小时连续培养(条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%),将上清液全部收集。上清液经过0.2微米(μM)滤器过滤后,再经过2500g的高速离心将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠(0.1μmol NaHCO3)将混合培养液的pH调节至7.45,经过两次0.2微米(μM)滤膜过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
实施效果:应用上述方法制备的“胎肝造血干细胞CD34增强表达的培养液”,可使胎肝造血干细胞的可标记数量提高至98×106。
实施例八
本实施例增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液在总重量为1L的情况下组分配比为:
RPMI-1640 313ml;
Hanks 74ml;
人类干细胞生长因子-2 11μg;
人类干细胞生长因子23ng;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子26ng;
CD135配体蛋白102ng;
人类促红细胞生成因子22ng;
人类上皮细胞生成因子102ng;
人类促成纤维细胞生成因子-b 102ng;
MEM余量。
①按上述比例取MEM、RPMI-1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③取19周标准检验后的人类胎肝,将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入T-75型培养瓶,加入DMEM培养液(DMEM培养液,Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和2%人血清进行培养,经13天的培养,将上清液抽出,用Hanks对T-75型培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。然后加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在T-75型培养瓶内混合,经48小时连续培养(条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%),将上清液全部收集。上清液经过0.2微米(μM)滤器过滤后,再经过2500g的高速离心将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠(0.1μmol NaHCO3)将混合培养液的pH调节至7.45,经过两次0.2微米(μM)滤膜过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
实施效果:应用上述方法制备的“胎肝造血干细胞CD34增强表达的培养液”,可使胎肝造血干细胞的可标记数量提高至99×106。
实施例九
本实施例增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液在总重量为1L的情况下组分配比为:
RPMI-1640 300ml;
Hanks 100ml;
人类干细胞生长因子-2 11μg;
人类干细胞生长因子24ng;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子29ng/l
CD135配体蛋白100ng;
人类促红细胞生成因子20ng;
人类上皮细胞生成因子100ng;
人类促成纤维细胞生成因子-b 100ng;
MEM余量。
①按上述比例取MEM、RPMI-1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③取19周标准检验后的人类胎肝,将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入T-75型培养瓶,加入DMEM培养液(DMEM培养液,Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和2%人血清进行培养,经13天的培养,将上清液抽出,用Hanks对T-75型培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。然后加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在T-75型培养瓶内混合,经48小时连续培养(条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%),将上清液全部收集。上清液经过0.2微米(μM)滤器过滤后,再经过2500g的高速离心将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠(0.1μmol NaHCO3)将混合培养液的pH调节至7.45,经过两次0.2微米(μM)滤膜过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
实施效果:应用上述方法制备的培养液,可使胎肝造血干细胞的可标记数量提高至100×106。
Claims (10)
1、一种增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液,其特征在于,组分和重量百分比为:
MEM:56.5%-64.7%;
RPMI-1640:29.4%-30.4%;
Hanks:5.88%-13.0%;
人类干细胞生长因子-2:470×10-9%-1740×10-9%;
人类干细胞生长因子:1.9×10-9%-2.8×10-9%;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子:2.0×10-9%-2.9×10-9%;
CD135配体蛋白:9.4×10-9%-10.8×10-9%;
人类促红细胞生成因子:1.4×10-9%-2.4×10-9%;
人类上皮细胞生成因子:9.4×10-9%-10.8×10-9%;
人类促成纤维细胞生成因子-b:9.4×10-9%-10.8×10-9%。
2、根据权利要求1所述的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液,其特征是,组分和重量百分比为:
MEM:59.36%-61%;
RPMI-1640:29.7%-30.14%;
Hanks:9.3%-10.5%;
人类干细胞生长因子-2:850×10-9%-1260×10-9%;
人类干细胞生长因子:2.1×10-9%-2.5×10-9%;
人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子:2.2×10-9%-2.6×10-9%;
CD135配体蛋白:9.8×10-9%-10.4×10-9%;
人类促红细胞生成因子:1.7×10-9%-2.1×10-9%;
人类上皮细胞生成因子:9.7×10-9%-10.4×10-9%;
人类促成纤维细胞生成因子-b:9.6×10-9%-10.4×10-9%。
3、一种如权利要求1所述的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液的制备方法,其特征是,包括以下步骤:
①按所述比例取MEM、RPMI 1640、Hanks混合后,充分搅拌,制得基础培养液;
②按所述比例再取人类干细胞生长因子-2、人类干细胞生长因子、人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CD135配体蛋白、人类促红细胞生成因子、人类上皮细胞生成因子、人类成纤维细胞生成因子-b依次加入基础培养液中,充分搅拌均匀、溶解;
③将胎肝间充质细胞分离,将纯化出的间充质细胞,根据计数器的读数取107个胎肝间充质细胞置入培养瓶,加入DMEM培养液和2%人血清进行培养,然后将上清液抽出,进行冲洗,
进一步加入DMEM培养液和5%人血清与胎肝间充质细胞在培养瓶内混合,连续培养将上清液全部收集,
上清液经过过滤后,再经过离心,将全部细胞碎片及非溶解性的物质去除,制得条件培养液;
④将条件培养液与MEM混合后,充分搅拌均匀后形成混合培养液,利用碳酸氢钠将混合培养液的pH调节至7.40~7.45,经过过滤即可制得干细胞CD34增强表达培养液。
4、根据权利要求3所述的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液的制备方法,其特征是,步骤③中所述的胎肝,是指:取19-20周标准检验后的人类胎肝。
5、根据权利要求3所述的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液的制备方法,其特征是,步骤③中所述的2%人血清进行培养,是指:经10-14天的培养,
6、根据权利要求3所述的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液的制备方法,其特征是,步骤③中所述的将上清液抽出后,用Hanks对培养瓶中的胎肝间充质细胞进行冲洗二次。
7、根据权利要求3所述的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液的制备方法,其特征是,步骤③中所述的将上清液全部收集前,经48小时连续培养,连续培养条件控制要求:温度37℃,CO2浓度5%。
8、根据权利要求3所述的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液的制备方法,其特征是,所述的过滤,是指:上清液经过0.2微米滤器过滤后。
9、根据权利要求3所述的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液的制备方法,其特征是,步骤③中所述的离心,是指:经过2500g的高速离心。
10、根据权利要求3所述的增强胎肝造血干细胞CD34表达的培养液的制备方法,其特征是,步骤④中所述的碳酸氢钠,是指:0.1μmol NaHCO3。
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