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CN101296708B - 选择性vpac2受体肽激动剂 - Google Patents

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CN101296708B CN2006800398953A CN200680039895A CN101296708B CN 101296708 B CN101296708 B CN 101296708B CN 2006800398953 A CN2006800398953 A CN 2006800398953A CN 200680039895 A CN200680039895 A CN 200680039895A CN 101296708 B CN101296708 B CN 101296708B
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Abstract

本发明涵盖了选择性激活VPAC2受体并用于糖尿病治疗的肽。

Description

选择性VPAC2受体肽激动剂
本发明涉及选择性VPAC2受体肽激动剂。 
特别的，本发明涉及与一个或多个聚乙二醇分子或其衍生物共价连接的选择性VPAC2受体肽激动剂。 
2型糖尿病，或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，是糖尿病最常见的形式，影响90％的糖尿病患者。患有NIDDM的患者具有受损的β-细胞功能，导致胰岛素生产不足和/或降低的胰岛素敏感度。如果不控制NIDDM，血液中会积累过多的葡萄糖，导致高血糖症。随着时间推移，可以产生越来越多严重的并发症，包括肾官能障碍、心血管问题、视力丧失、下肢溃烂、神经病和局部缺血。NIDDM的治疗包括改善饮食、运动、控制体重以及使用多种口服药物。通过服用此类口服药物，患有NIDDM的个体可以初步控制他们的血糖水平。然而，这类药物不能减慢NIDDM患者中β-细胞功能的进行性丧失，因此，不足以在疾病晚期控制血糖水平。而且，用目前可获得的药物进行治疗将NIDDM患者暴露在潜在的副作用下，例如低血糖症、胃肠道问题、液体潴留、水肿和/或体重增加。 
垂体的腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)和血管活性肠肽(VIP)与例如促胰液素和胰高血糖素属于同一个肽家族。PACAP和VIP通过三个G蛋白偶联受体作用，并通过cAMP介导的和其它Ca2+介导的信号转导途径发挥作用。这类受体已知如PACAP-优选的1型(PAC1)受体(Isobe等人、Regul.Pept.，110：213-217(2003)；Ogi等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，196：1511-1521(1993))和两种VIP-共享的2型受体(VPAC1和VPAC2)(Sherwood等人，Endocr.Rev.，21：619-670(2000)；Hammar等人，Pharmacol Rev，50：265-270(1998)；Couvineau等人，J.Biol.Chem.，278：24759-24766(2003)；Sreedharan，等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，193：546-553(1993)；Lutz等人，FEBS Lett.，458：197-203(1999)； Adamou等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，209：385-392(1995))。在US 6,242,563和WO 2000/05260中公开了一系列PACAP同源物。 
PACAP具有与所有三种受体可比较的活性，而VIP选择性的激活两种VPAC受体(Tsutsumi等人，Diabetes，51：1453-1460(2002))。VIP(Eriksson等人，Peptides，10：481-484(1989))和PACAP(Filipsson等人，JCEM，82：3093-3098(1997))在静脉给药时，都已表现出不仅刺激人体胰岛素分泌，而且增加胰高血糖素分泌和肝葡萄糖排出。因此，PACAP或VIP刺激一般不会导致糖血的净改善。PACAP或VIP对多种受体的激活作用还对神经、内分泌腺、心血管、生殖、肌肉和免疫系统具有广泛的生理学效应(Gozes等人，Curr.Med.Chem.，6：1019-1034(1999))。在大鼠中VIP诱导的水样腹泻显示出仅由VPAC受体之一，VPAC1介导(Ito等人，Peptides，22：1139-1151(2001)；Tsutsumi等人，Diabetes，51：1453-1460(2002))。VPAC1和PAC1受体在α-细胞和肝细胞上表达，因此最有可能涉及肝葡萄糖排出。 
在毒蜥(Heloderma Suspectum)的唾液分泌物中发现了毒蜥外泌肽-4(Eng等人，J.Biol.Chem.，267(11)：7402-7405(1992))。这是39个氨基酸的肽，具有葡萄糖依赖性促胰岛素分泌的活性。WO2000/66629中描述了特殊的加入聚乙二醇的毒蜥外泌肽和毒蜥外泌肽激动肽。 
最新的研究表明选择性作用于VPAC2受体的肽能够刺激胰腺分泌胰岛素，而不产生胃肠副作用也不增加胰高血糖素的释放和肝葡萄糖排出(Tsutsumi等人，Diabetes，51：1453-1460(2002))。最初通过修饰的VIP和/或PACAP鉴定选择性作用于VPAC2受体的肽。(见例如，Xia等人，J Pharmacol Exp Ther.，281：629-633(1997)；Tsutsumi等人，Diabetes，51：1453-1460(2002)；WO 01/23420和WO 2004/06839.) 
然而，目前报道过的许多VPAC2受体肽激动剂具有不令人满意的效价、选择性和稳定性谱，会阻碍它们的临床可行性。此外，由于多肽在制剂中的稳定性问题，以及这类多肽在体内短暂的半衰期，许多此类肽都不适合作为商业的候选物。另外，已经鉴定了一些VPAC2受体肽激动剂被 二肽基肽酶(DPP-IV)灭活。短的血清半衰期可以妨碍这类激动剂作为治疗剂的应用。因此需要新的治疗，其克服与目前NIDDM药物相关的困难。 
本发明寻求提供改善的化合物，其对VPAC2受体具有选择性，并且只有存在高血糖水平时才诱导胰脏分泌胰岛素。本发明的化合物是相信也改善β细胞功能的肽。这类肽可在不引起胃肠(GI)副作用或相应的增加肝葡萄糖排出的条件下具有诱导胰岛素分泌的生理效应，而且与已知的VPAC2受体肽激动剂相比，一般具有增强的选择性、效价和/或体内肽稳定性。 
本发明还寻求提供选择性的VPAC2受体肽激动剂，其具有降低的清除率和改善的体内稳定性。在延长的时期内以最少次数施用本发明的激动剂是理想的。 
根据发明的第一个方面，提供了加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其包含选自以下的序列： 
SEQ ID NO：17    HSDAVFTEQY(OMe)TRAibRAibQLAAAibOrnY(OMe)LQSIKAibOrn； 
SEQ ID NO：18    HSDAVFTEK(CO(CH2)2SH)Y(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：19    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnK(W)Orn； 
SEQ ID NO：20    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(CO(CH2)2SH)YLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：21    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAK(CO(CH2)2SH)OrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：22    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVCAAibOrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：23    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRCQVAAAibOrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：24    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：25    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYAibQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：26    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：27    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：28    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：29    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYAibQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：30    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYAibQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：31    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：32    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYAibQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：33    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYAibQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：34    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(W)QVAAAibOrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：35    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLK(W)SIOrnOrn； 
SEQ ID NO：36    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(W)AAAibOrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：37    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(CO(CH2)2SH)QVAAAibOrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：38    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(W)YLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：39    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibCYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：40    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：41    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSK(W)OrnOrn； 
SEQ ID NO：42    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnCOrn； 
SEQ ID NO：43    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibCOrnOrn； 
SEQ ID NO：44    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：45    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRCQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：94    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVK(CO(CH2)2SH)AAibOrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：95    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnCOrn； 
SEQ ID NO：96    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSCOrnOrn； 
SEQ ID NO：97    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnK(CO(CH2)2SH)Orn； 
SEQ ID NO：98    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnK(CO(CH2)2SH)Orn； 
SEQ ID NO：99    HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(W)QLAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：100   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQSIOrnOrnC； 
SEQ ID NO：101   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnOrnC； 
SEQ ID NO：102   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnOrnC； 
SEQ ID NO：103   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：104   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnCOrn； 
SEQ ID NO：105   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnOrn； 
SEQ ID NO：106   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrnC； 
SEQ ID NO：107   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：108   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrnY(OMe)LQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：109   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQSIOrnCOrn； 
SEQ ID NO：110   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAbuAAibOrnYLQSIOrnOrn； 
SEQ ID NO：111   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(CO(CH2)2SH)AAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn； 
和 
SEQ ID NO：112   HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(W)AAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn； 
以及C末端延伸，其中C末端延伸的N端与肽序列的C末端相连，其中C末端延伸包含下式的氨基酸序列： 
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12
式3(SEQ ID NO：3) 
其中： 
Xaa1是：Gly、Cys或不存在； 
Xaa2是：Gly、Arg或不存在； 
Xaa3是：Pro、Thr或不存在； 
Xaa4是：Ser或不存在； 
Xaa5是：Ser或不存在； 
Xaa6是：Gly或不存在； 
Xaa7是：Ala或不存在； 
Xaa8是：Pro或不存在； 
Xaa9是：Pro或不存在； 
Xaa10是：Pro或不存在； 
Xaa11是：Ser、Cys或不存在；和 
Xaa12是：Cys或不存在； 
其中，C末端延伸的Xaa1至Xaa12中至少有5个是存在的，以及其中如果Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10 或Xaa11空缺，出现在下游的下一个氨基酸就是C末端延伸的下一个氨基酸，且其中C末端氨基酸可被酰胺化， 
并且其中； 
肽激动剂包含至少一个Cys残基，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂包含至少一个Lys残基，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂包含至少一个K(W)，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂包含至少一个K(CO(CH2)2SH)残基，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂的羧基端氨基酸共价的连接PEG分子，或者 
它们的组合。 
优选的，式3的C末端延伸的Xaa1至Xaa12中至少有6个存在。更优选的，C末端延伸的Xaa1至Xaa12中至少有七、八、九、十、十一或全部都存在。 
更优选的，加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的C末端延伸选自： 
  SEQ ID NO：5   GGPSSGAPPPS
  SEQ ID NO：6   GGPSSGAPPPS-NH2
  SEQ ID NO：7   GGPSSGAPPPC
  SEQ ID NO：8   GGPSSGAPPPC-NH2
  SEQ ID NO：9   GRPSSGAPPPS
  SEQ ID NO：10   GRPSSGAPPPS-NH2
  SEQ ID NO：11   GGPSSGAPPPCC
  SEQ ID NO：12   GGPSSGAPPPCC-NH2
甚至更优选的，加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的C末端延伸是SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。 
根据本发明的第一个方面，PEG分子可以共价的连接到位于VPAC2受体肽激动剂任何位置的任何Lys、Cys、K(W)或K(CO(CH2)2SH)残基上。 
当加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有选自SEQ ID NO：22、23、39、42、43、44、45、95、96、100、101、102、104、105、106、108和 109中的序列时，优选的半胱氨酸残基是加入聚乙二醇的。 
当加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有选自SEQ ID NO：19、34、35、36、38、41、99和112中的序列时，优选的K(W)残基是加入聚乙二醇的。 
当加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有选自SEQ ID NO：18、20、21、37、94、97、98和111中的序列时，优选的K(CO(CH2)2SH)残基是加入聚乙二醇的。 
当加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有C末端延伸时，PEG分子可以共价的连接到所述C末端延伸的一个或多个Cys残基上。当序列选自含有一个或多个Lys、Cys、K(V)或K(CO(CH2)2SH)残基的SEQ IDNO：17至45和94至112，并且C末端延伸含有一个或多个Cys残基时，一方或双方序列中都可以有一个或多个加入聚乙二醇的残基。 
优选的，至少有一个PEG分子共价的连接到VPAC2受体肽激动剂的C末端延伸的残基上。 
当有一个以上的PEG分子时，可以是Lys、Cys、K(CO(CH2)2SH)、K(W)和羧基端氨基酸加入聚乙二醇的组合。例如，如果有两个PEG分子，其中一个可以连接Lys残基，一个可以连接Cys残基。 
优选的，PEG分子是分枝的。或者，PEG分子可以是线性的。 
优选的，PEG分子的分子量在1000道尔顿和100,000道尔顿之间。更优选的，PEG分子是选自10,000、20,000、30,000、40,000、50,000和60,000道尔顿。甚至更优选的，是选自20,000、30,000、40,000或60,000道尔顿。当有两个PEG分子共价连接到本发明的肽激动剂时，每个是1,000至40,000道尔顿且优选的，具有分子量为20,000和20,000道尔顿，10,000和30,000道尔顿，30,000和30,000道尔顿，或20,000和40,000道尔顿。 
加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂序列在肽N端的Xaa1之前还可以含有组氨酸残基。 
优选的，根据本发明第一方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，在肽激动剂的N端，还另外包含N末端修饰，其中N末端修饰是选 自： 
(a)添加D-组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或正亮氨酸； 
(b)添加肽，其含有序列Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg(SEQ ID NO：93)，其中Arg与肽激动剂的N端相连； 
(c)添加C1-C16烷基，其用一个或多个独立的选自芳基、C1-C6 烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的取代基任选的取代； 
(d)添加-C(O)R1，其中R1是用独立的选自芳基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素、-SH和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的C1-C16 烷基；用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基；用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基C1-C4烷基；-NR2R3，其中R2和R3独立的是氢、C1-C6烷基、芳基或芳基C1-C4烷基；-OR4，其中R4是用独立的选自芳基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的C1-C16烷基，用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6 烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基，或者用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基C1-C4烷基；或者5-吡咯烷-2-酮； 
(e)添加-SO2R5，其中R5是芳基、芳基C1-C4烷基或C1-C16烷基； 
(f)形成用C1-C6烷基或-SR6任选的取代的琥珀酰亚胺基团，其中R6是氢或C1-C6烷基； 
(g)添加甲硫氨酸亚砜； 
(h)添加生物素基-6-氨基己酸(6-氨基己酸(aminocarproicacid))；和 
(i)添加-C(＝NH)-NH2。 
优选的，N末端修饰是添加选自以下的基团：乙酰基、丙酰基、丁酰 基、戊酰基、己酰基、甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、3-苯基丙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、正亮氨酸、D-组氨酸、异亮氨酸、3-巯丙酰、生物素基-6-氨基己酸和-C(＝NH)-NH2。特别优选的N末端修饰是添加乙酰基或己酰基。 
本领域技术人员可知，加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有选自SEQ ID NO：17至45和94至112的肽序列的多种组合，基于上述公开可以产生本文中描述的C末端延伸和N末端修饰。 
优选的根据本发明第一个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有选自以下的氨基酸序列： 
  激动剂  #  SEQ ID NO   序列
  P410  46   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(  W-PEG40K)YLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P417  47   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TRAibRAibQLAAAibOr  nY(OMe)LQSIKAibOrnGGPSSGAPPPC(PEG40K)  -NH2
  P451  48   C6-HSDAVFTEK(CO(CH2)2SPEG40K)Y(OMe)TOr  nLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPP  PS-NH2
  P454  49   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLQSIOrnK(WPEG40K)OrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P460  50   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibC(  PEG40K)YLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P472  51   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(  CO(CH2)2S  PEG40K)YLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P473   52   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(  CO(CH2)2S  PEG20K)YLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P475   53   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAK(CO(  CH2)2SPEG  40K)OrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P478   54   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVC(PEG40  K)AAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P483   55   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRC(PEG40K)QVA  AAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P485   56   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(CO(CH2)2SPE  G40K)QVAAAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPP  S-NH2
  P507   57   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYAibQSI  OrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG40K)-NH2
  P509   58   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLQAibI  OrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG40K)-NH2
  P511   59   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAbuAib  OrnYLQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG40K)-N  H2
  P513   60   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOr  nYAibQSI  OrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20K)C(PEG20K)-NH2
  P515   61   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOr  nYLQAibI  OrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20K)C(PEG20K)-NH2
  P517   62   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20K)C(  PEG20K)-NH2
  P519   63   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOr  nYAibQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20K)C(P  EG20K)-NH2
  P521   64   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYAibQSIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20K)C(  PEG20K)-NH2
  P523   65   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQSI  OrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20K)C(PEG20K)-NH2
  P525   66   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYAibQ  AibIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20K)C(PEG20K)  -NH2
  P529   67   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(WPEG40K)Q  VAAAibOrnYLQSIOrnOrn GGPSSGAPPPS-NH2
  P531   68   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLK(W  PEG40K)SIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P533   69   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(WPEG40  K)AAAib  OrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P535   70   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLQSK  (WPEG40K)OrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P537   71   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQAibIOrnC(PEG40K)OrnGGPSSGAPPPS-  NH2
  P541   72   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQAibC(PEG40K)OrnOrnGGPSSGAPPPS-N  H2
  P545   73   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQC(PEG40K  )AAbuAib  OrnYLQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P547   74   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRC(PEG40K)QLA  AbuAibOrnYLQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P480   113   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVK(CO(CH2)2   SPEG40K)AAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPP  PS-NH2
  P481   114   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVK(CO(CH2)2   SPEG20K)AAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPP  PS-NH2
  P539   115   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQSI  OrnC(PEG40K)OrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P543   116   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQS  C(PEG40K)OrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P549   117   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYL  QAibIOrnK(CO(CH2)2SPEG20K)OrnGGPSSGAPP  PC(PEG20K)-NH2
  P551   118   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYL  QSIOrnK(CO(CH2)2SPEG20K)OrnGGPSSGAPPP  C(PEG20K)-NH2
  P555   119   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQSI  OrnC(PEG20K)OrnGGPSSGAPPPC(PEG20K)-NH2   
  P557   120   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(WPEG40K)Q  LAAbuAib  OrnYLQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P560   121   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOr  nYLQSIOrn  OrnC(PEG40K)GGPSSGAPPPS-NH2
  P562   122   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLQSIOrnOrnC(PEG20K)GGPSSGAPPPC(PEG2  0K)-NH2
  P564   123   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQAibIOrnOrnC(PEG40K)GGPSSGAPPPS-  NH2
  P566   124   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQSI  OrnOrnC(PEG40K)GGPSSGAPPPS-NH2
  P572   125   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQSI  OrnOrnC(PEG20K)GGPSSGAPPPC(PEG20K)-NH2
  P574   126   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnY(OMe)LQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG2  0K)C(PEG20K)-NH2
  P576   127   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnY(OMe)LQAibIOrnC(PEG40K)OrnGGPSSGA  PPPS-NH2
  P578   128   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQC(PEG40K  )AAbuAib  OrnY(OMe)LQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P580   129   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQAibIOrnOrnC(PEG20K)GGPSSGAPPPC(  PEG20K)-NH2
  P582   130   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnY(OMe)LQSIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20  K)C(PEG20K)-NH2
  P584   131   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnY(OMe)LQSIOrnC(PEG40K)OrnGGPSSGAPP  PS-NH2
  P586   132   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQC(PEG40K  )AAbuAib  OrnY(OMe)LQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P588   133   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnY(OMe)LQSIOrnC(PEG20K)OrnGGPSSGAPP  PC(PEG20K)-NH2
  P590   134   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAbuAAib  OrnYLQSI  OrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20K)C(PEG20K)-NH2
  P597   135   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(CO(CH2)2   SPEG20K)AAbuAibOrnYLQAibIOrnOrnGGPSSG  APPPC(PEG20K)-NH2
  P599   136   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(CO(CH2)2   SPEG40K)AAbuAibOrnYLQAibIOrnOrnGGPSSG  APPPS-NH2
  P601   137   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(WPEG40  K)AAbuAibOrnYLQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPS-  NH2
  P469   139   C6-HSDAVFTEK(CO(CH2)2SPEG20K)Y(OMe)TOr  nLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPP  PS-NH2
  P486   140   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(CO(CH2)2SPE  G20K)QVAAAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPP  S-NH2
  P553   141   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQAibIOrnC(PEG20K)OrnGGPSSGAPPPC(  PEG20K)-NH2
  P570   144   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYLQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG30K)C(  PEG30K)-NH2
  P595   146   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQC(PEG20K  )AAbuAib  OrnYLQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20K)-N  H2
  P476   147   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAK(CO(  CH2)2SPEG  20K)OrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P602   148   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYAibQSIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG30K)C(  PEG30K)-NH2
更优选的，根据本发明第一方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有选自SEQ ID NO：47、64、66、115、119、122、126、130和144的氨基酸序列。 
根据本发明的第二个方面，提供了加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其含有选自以下的氨基酸序列： 
  激动剂  #  SEQ ID NO   序列
  P470  75   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnK(CO(CH2)2SPEG2  0K)RAibQVAAAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAP  PPS-NH2
  P490  76   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLK(CO(CH2)2SPEG20K)SIOrnOrnGGPSSGAPP  PC(PEG20K)-NH2
  P492   77   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAK(CO(C  H2)2SPEG20K)AibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPP  PC(PEG20K)-NH2
  P495   78   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLQK(CO(CH2)2SPEG20K)IOrnOrnGGPSSGAP  PPC(PEG20K)-NH2
  P497   79   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLQSK(CO(CH2)2SPEG20K)OrnOrnGGPSSGAP  PPC(PEG20K)-NH2
  P499   80   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLQSIOrnK(CO(CH2)2SPEG20K)OrnGGPSSGA  PPPC(PEG20K)-NH2
  P501   81   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLC(PEG20K)SIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20  K)-NH2
  P503   82   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLQSC(PEG20K)OrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG2  0K)-NH2
  P505   83   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLQSIOrnC(PEG20K)OrnGGPSSGAPPPC(PEG2  0K)-NH2
  P402   138   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOr  nYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPK(W-PEG40K)-NH2
  P558   142   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQC(PEG20K  )AAAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
  P568   143   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQC(PEG20K  )AAAibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPC(PEG20  K)-NH2
  P593   145   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAib  OrnYAibQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPK(WPEG40  K)-NH2
更优选的，根据本发明第二个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：83的氨基酸序列。 
根据本发明的第三个方面，是提供了含有下式的氨基酸序列的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂： 
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Thr-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Abu-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40
式4(SEQ ID NO：4) 
其中： 
Xaa1是：His、dH或不存在 
Xaa2是：dA、Ser、Val、Gly、Thr、Leu、dS、Pro或Aib； 
Xaa3是：Asp或Glu； 
Xaa4是：Ala、Ile、Tyr、Phe、Val、Thr、Leu、Trp、Gly、dA、Aib或NMeA； 
Xaa5是：Val、Leu、Phe、Ile、Thr、Trp、Tyr、dV、Aib或NMeV； 
Xaa6是：Phe、Ile、Leu、Thr、Val、Trp或Tyr； 
Xaa8是：Asp、Glu、Ala、Lys、Leu、Arg或Tyr； 
Xaa9是：Asn、Gln、Asp、Glu、Ser、Cys、Lys或K(CO(CH2)2SH)； 
Xaa10是：Tyr、Trp、Tyr(OMe)、Ser、Cys或Lys； 
Xaa12是：Arg、Lys、Glu、hR、Orn、Lys(异丙基)、Aib、Cit、Ala、Leu、Gln、Phe、Ser或Cys； 
Xaa13是：Leu、Phe、Glu、Ala、Aib、Ser、Cys、Lys或K(CO(CH2)2SH)； 
Xaa14是：Arg、Leu、Lys、Ala、hR、Orn、Lys(异丙基)、Phe、Gln、 Aib、Cit、Ser或Cys； 
Xaa15是：Lys、Ala、Arg、Glu、Leu、hR、Orn、Lys(异丙基)、Phe、Gln、Aib、K(Ac)、Cit、Ser、Cys、K(W)或K(CO(CH2)2SH)； 
Xaa16是：Gln、Lys、Glu、Ala、hR、Orn、Lys(异丙基)、Cit、Ser、Cys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)； 
Xaa17是：Val、Ala、Leu、Ile、Met、Nle、Lys、Aib、Ser、Cys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)； 
Xaa18是：Ala、Ser、Cys、Lys、K(CO(CH2)2SH)、K(W)、Abu或Nle； 
Xaa20是：Lys、Gln、hR、Arg、Ser、His、Orn、Lys(异丙基)、Ala、Aib、Trp、Thr、Leu、Ile、Phe、Tyr、Val、K(Ac)、Cit、Cys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)； 
Xaa21是：Lys、His、Arg、Ala、Phe、Aib、Leu、Gln、Orn、hR、K(Ac)、Cit、Ser、Cys、Val、Tyr、Ile、Thr、Trp、K(W)或K(CO(CH2)2SH)； 
Xaa22是：Tyr、Trp、Phe、Thr、Leu、Ile、Val、Tyr(OMe)、Ala、Aib、Ser、Cys、Lys、K(W)或K(CO(CH2)2SH)； 
Xaa23是：Leu、Phe、Ile、Ala、Trp、Thr、Val、Aib、Ser、Cys、Lys、K(W)或K(CO(CH2)2SH)； 
Xaa24是：Gln、Glu、Asn、Ser、Cys、Lys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)； 
Xaa25是：Ser、Asp、Phe、lle、Leu、Thr、Val、Trp、Gln、Asn、Tyr、Aib、Glu、Cys、Lys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)； 
Xaa26是：Ile、Leu、Thr、Val、Trp、Tyr、Phe、Aib、Ser、Cys、Lys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)； 
Xaa27是：Lys、hR、Arg、Gln、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Lys(异丙基)、Cys、Leu、Orn、dK、K(W)或K(CO(CH2)2SH)； 
Xaa28是：Asn、Asp、Gln、Lys、Arg、Aib、Orn、hR、Cit、Pro、dK、Ser、Cys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)； 
Xaa29是：Lys、Ser、Arg、Asn、hR、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Thr、Val、Trp、Tyr、Cys、Orn、Cit、Aib、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa30是：Arg、Lys、Ile、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Cys、hR、Cit、Aib、Orn、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa31是：Tyr、His、Phe、Thr、Cys、Ser、Lys、Gln、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa32是：Ser、Cys、Lys或不存在； 
Xaa33是：Trp或不存在； 
Xaa34是：Cys或不存在； 
Xaa35是：Glu或不存在； 
Xaa36是：Pro或不存在； 
Xaa37是：Gly或不存在； 
Xaa38是：Trp或不存在； 
Xaa39是：Cys或不存在；和 
Xaa40是：Arg或不存在 
其中，如果Xaa29、Xaa30、Xaa31、Xaa32、Xaa33、Xaa34、Xaa35、Xaa36、Xaa37、Xaa38或Xaa39不存在，下游出现的下一个氨基酸就是肽激动剂序列中的下一个氨基酸， 
以及C末端延伸，其中C末端延伸的N端与式4的肽的C端相连， 
其中C末端延伸含有下式的氨基酸序列： 
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12
式3(SEQ ID NO：3) 
其中： 
Xaa1是：Gly、Cys或不存在； 
Xaa2是：Gly、Arg或不存在； 
Xaa3是：Pro、Thr或不存在； 
Xaa4是：Ser或不存在； 
Xaa5是：Ser或不存在； 
Xaa6是：Gly或不存在； 
Xaa7是：Ala或不存在； 
Xaa8是：Pro或不存在； 
Xaa9是：Pro或不存在； 
Xaa10是：Pro或不存在； 
Xaa11是：Ser、Cys或不存在；和 
Xaa12是：Cys或不存在； 
其中C末端延伸的Xaa1至Xaa12中至少五个是存在的，并且其中如果Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10或Xaa11 不存在，下游出现的下一个氨基酸就是C末端延伸的下一个氨基酸，其中C末端氨基酸可以被酰胺化， 
并且其中； 
肽激动剂包含至少一个Cys残基，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂包含至少一个Lys残基，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂包含至少一个K(W)，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂包含至少一个K(CO(CH2)2SH)，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂的羧基端氨基酸共价的连接PEG分子，或者 
它们的组合。 
优选的，本发明第三个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有式4(SEQ ID NO：4)的序列，其中Xaa3是Asp或Glu，Xaa8是Asp或Glu，Xaa9是Asn或Gln，Xaa10是Tyr或Tyr(OMe)，Xaa12是Arg、hR、Lys或Orn，Xaa14是Arg、Gln、Aib、hR、Orn、Cit、Lys、Ala，或Leu、Xaa15是Lys、Aib、Orn或Arg，Xaa16是Gln或Lys，Xaa17是Val、Leu、Ala、Ile、Lys或Nle，Xaa20是Lys、Val、Leu、Aib、Ala、Gln或Arg，Xaa21是Lys、Aib、Orn、Ala、Gln或Arg，Xaa23是Leu或 Aib，Xaa25是Ser或Aib，Xaa27是Lys、Orn、hR或Arg，Xaa28是Asn、Gln、Lys、hR、Aib、Orn，或Pro且Xaa29是Lys、Orn、hR或是不存在。 
优选的，本发明第三个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有式4(SEQ ID NO：4)的序列，其中Xaa23或Xaa25是Aib。甚至更优选的，Xaa23和Xaa25都是Aib。 
优选的，本发明第三个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有式4的序列，其中Xaa14或Xaa15是Aib。 
可选的，本发明第三个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有式4的序列，其中Xaa20或Xaa21是Aib。 
更优选的，Xaa14或Xaa15是Aib以及Xaa20或Xaa21是Aib。特别优选的Xaa15是Aib以及Xaa20是Aib。 
优选的，本发明第三个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有式4的序列，其中Xaa15是Aib，Xaa20是Aib，且Xaa12、Xaa21、Xaa27 和Xaa28都是Orn。更优选的，Xaa15是Aib，Xaa20是Aib，Xaa12、Xaa21、Xaa27和Xaa28都是Orn，Xaa8是Glu，Xaa9是Gln以及Xaa10是Tyr(OMe)。甚至更优选的，Xaa15是Aib，Xaa20是Aib，Xaa12、Xaa21、Xaa27和Xaa28 都是Orn，Xaa8是Glu，Xaa9是Gln，Xaa10是Tyr(OMe)，以及Xaa23和/或Xaa25是Aib。Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa12、Xaa15、Xaa20、Xaa21、Xaa23、Xaa25、Xaa27和Xaa28中的任一个或多个可以是加入聚乙二醇的Lys、Cys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)，同时所有其它位置具有上述优选的氨基酸取代。 
优选的，式3的C末端延伸的Xaa1至Xaa12中至少有6个存在。更优选的，C末端延伸的Xaa1至Xaa12中有七、八、九、十、十一或全部都存在。 
优选的，根据本发明第三个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的C末端延伸选自：SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11和12。 
更优选的，根据本发明第三个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的C末端延伸是SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。 
根据本发明的第三个方面，PEG分子可以共价的连接位于VPAC2受体肽激动剂任何位置的任何Lys、Cys、K(W)或K(CO(CH2)2SH)残基上。C末端延伸可以含有一个或多个可以被加入聚乙二醇的Cys残基。当根据式4的序列含有一个或多个Lys、Cys、K(W)或K(CO(CH2)2SH)残基并且C末端延伸含有一个或多个Cys残基时，在一方或双方序列中可以有一个或多个加入聚乙二醇的残基。 
优选的，至少有一个PEG分子共价的连接式4中的残基。更优选的，有PEG分子共价的连接式4下列位置上的一个或多个残基：9、13、15、16、17、18、20、21、24、25、26和28。 
优选的，有至少一个PEG分子共价的连接VPAC2受体肽激动剂的C末端延伸的残基。 
当有一个以上的PEG分子时，可以是Lys、Cys、K(CO(CH2)2SH)、K(W)和羧基端氨基酸加入聚乙二醇作用的组合。例如，如果有两个PEG分子，其中一个可以连接Lys残基，一个可以连接Cys残基。 
优选的，PEG分子是分枝的。可选的，PEG分子可以是线性的。 
优选的，PEG分子的分子量在1000道尔顿和100,000道尔顿之间。更优选的，PEG分子是选自10,000、20,000、30,000、40,000、50,000和60,000道尔顿。甚至更优选的，是选自20,000、30,000、40,000或60,000道尔顿。当有两个PEG分子共价连接到本发明的肽激动剂时，每个是1,000至40,000道尔顿且优选的，它们具有分子量为20,000和20,000道尔顿，10,000和30,000道尔顿，30,000和30,000道尔顿，或20,000和40,000道尔顿。 
优选的，本发明第三个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，还在肽激动剂的N端含有N末端修饰，其中N末端修饰是选自： 
(a)添加D-组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或正亮氨酸； 
(b)添加肽，其含有序列Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg(SEQ ID NO：93)，其中Arg与肽激动剂的N端相连； 
(c)添加C1-C16烷基，其用一个或多个独立的选自芳基、C1-C6 烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的取代基任选的取代； 
(d)添加-C(O)R1，其中R1是用独立的选自芳基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素、-SH和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的C1-C16烷基；用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基；用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基C1-C4 烷基；-NR2R3，其中R2和R3独立的是氢、C1-C6烷基、芳基或芳基C1-C4烷基；-OR4，其中R4是用独立的选自芳基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的C1-C16烷基，用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基，或者用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基C1-C4烷基；或者5-吡咯烷-2-酮； 
(e)添加-SO2R5，其中R5是芳基、芳基C1-C4烷基或C1-C16烷基； 
(f)形成用C1-C6烷基或-SR6任选的取代的琥珀酰亚胺基团，其中R6是氢或C1-C6烷基； 
(g)添加甲硫氨酸亚砜； 
(h)添加生物素基-6-氨基己酸(6-氨基己酸(aminocarproicacid))；和 
(i)添加-C(＝NH)-NH2。 
优选的，N末端修饰是添加选自以下的基团：乙酰、丙酰、丁酰、戊酰、己酰、甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、3-苯基丙酰基、苯乙酰、苯甲酰、正亮氨酸、D-组氨酸、异亮氨酸、3-巯丙酰、生物素基-6-氨基己酸和 -C(＝NH)-NH2。特别优选的N末端修饰是添加乙酰基或己酰基。 
本领域技术人员可知，加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有根据式4的肽序列的多种组合，基于上述公开可以产生本文中描述的C末端延伸和N末端修饰。 
优选的，根据本发明第三个方面的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂含有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：59、62、64、65、66、71、72、73、74、115、116、117、118、119、120、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、135、136、137、141、144、146和148。 
根据本发明的第四个方面，是提供含有本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，以及一个或多个可药用稀释剂、载体和/或赋形剂的药物组合物。 
根据本发明的第五个方面，是提供本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其用作药物。 
根据本发明的第六个方面，是提供本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂制备治疗非胰岛素依赖型糖尿病的药物的用途。 
根据本发明的其它方面，是提供本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂制备治疗胰岛素依赖型糖尿病的药物的用途。 
本发明提供治疗在有需要的患者中的糖尿病的方法其包括施用本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其中糖尿病可以是非胰岛素依赖型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病。 
本发明还提供含有本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的药物组合物，用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病。 
根据本发明的替代实施方案，是提供加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其含有选自SEQ ID NO：17至45和94至112的序列； 
以及C末端延伸，其中C末端延伸的N端与肽序列的C-端相连，其中C末端延伸含有下式的氨基酸序列： 
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13
式1(SEQ ID NO：1) 
其中， 
Xaa1是：Gly、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa2是：Gly、Arg、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa3是：Pro、Thr、Ser、Ala、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa4是：Ser、Pro、His、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa5是：Ser、Arg、Thr、Trp、Lys、Cys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa6是：Gly、Ser、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa7是：Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly、Cys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa8是：Pro、Ser、Ala、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa9是：Pro、Ser、Ala、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa10是：Pro、Ser、Ala、Arg、Lys、His、Cys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa11是：Ser、Cys、His、Pro、Lys、Arg、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa12是：His、Ser、Arg、Lys、Cys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在；和 
Xaa13是：His、Ser、Arg、Lys、Cys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
条件是如果Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11或Xaa12不存在，下游出现的下一个氨基酸是C末端延伸的下一个氨基酸，其中C末端氨基酸可以被酰胺化， 
并且其中； 
肽激动剂包含至少一个Cys残基，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂包含至少一个Lys残基，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂包含至少一个K(W)残基，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂包含至少一个K(CO(CH2)2SH)，其共价的连接PEG分子，或者 
肽激动剂的羧基端氨基酸共价的连接PEG分子，或者 
它们的组合。 
优选的，式1的C末端延伸具有不会超过三个的下列任一项：Cys、Lys、K(W)或K(CO(CH2)2SH)。更优选的C末端延伸具有不超过两个的任一上述残基。如果C末端延伸有两个Cys残基，优选的Cys残基位于C-端。甚至更优选的C末端延伸有不超过一个的任一上述残基。如果C末端延伸只有一个Cys残基，优选的Cys残基位于C-端。 
优选的，根据上面替代实施方案的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的C末端延伸含有下式的氨基酸序列： 
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13
式2(SEQ ID NO：2) 
其中： 
Xaa1是：Gly、Cys、Lys或不存在； 
Xaa2是：Gly、Arg、Cys、Lys或不存在； 
Xaa3是：Pro、Thr、Ser、Ala、Cys、Lys或不存在； 
Xaa4是：Ser、Pro、His、Cys、Lys或不存在； 
Xaa5是：Ser、Arg、Thr、Trp、Lys、Cys或不存在； 
Xaa6是：Gly、Ser、Cys、Lys或不存在； 
Xaa7是：Ala、Asp、Arg、Glu、Lys、Gly、Cys或不存在； 
Xaa8是：Pro、Ser、Ala、Cys、Lys或不存在； 
Xaa9是：Pro、Ser、Ala、Cys、Lys或不存在； 
Xaa10是：Pro、Ser、Ala、Arg、Lys、His、Cys或不存在； 
Xaa11是：Ser、Cys、His、Pro、Lys、Arg或不存在； 
Xaa12是：His、Ser、Arg、Lys、Cys或不存在；和 
Xaa13是：His、Ser、Arg、Lys、Cys或不存在； 
条件是如果Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11或Xaa12不存在，下游出现的下一个氨基酸是C末端延伸的下一个氨基酸，其中C末端氨基酸可以被酰胺化。 
优选的，式1或2的C末端延伸的Xaa1至Xaa13中至少有1个存在。更优选的，C末端延伸的Xaa1至Xaa13中至少有二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二个或全部是存在的。 
更优选的，根据上面的替代实施方案，加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的C末端延伸含有下式的氨基酸序列： 
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12
式3(SEQ ID NO：3) 
其中： 
Xaa1是：Gly、Cys或不存在； 
Xaa2是：Gly、Arg或不存在； 
Xaa3是：Pro、Thr或不存在； 
Xaa4是：Ser或不存在； 
Xaa5是：Ser或不存在； 
Xaa6是：Gly或不存在； 
Xaa7是：Ala或不存在； 
Xaa8是：Pro或不存在； 
Xaa9是：Pro或不存在； 
Xaa10是：Pro或不存在； 
Xaa11是：Ser、Cys或不存在；和 
Xaa12是：Cys或不存在； 
条件是如果Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10或Xaa11不存在，下游出现的下一个氨基酸是C末端延伸的下一个氨基酸，其中C末端氨基酸可以被酰胺化。 
优选的，式3的C末端延伸的Xaa1至Xaa12中的至少一个存在。更优选的，C末端延伸的Xaa1至Xaa12中至少有二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或全部都存在。 
可以用于本发明的任一方面和实施方案的可选的C末端延伸包含下式的氨基酸序列： 
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10
式13(SEQ ID NO：13) 
其中： 
Xaa1是：Ser、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa2是：Arg、Ser、hR、Orn、His、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在， 
Xaa3是：Thr、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa4是：Ser、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa5是：Pro、Ser、Ala、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa6是：Pro、Ser、Ala、Arg、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa7是：Pro、Ser、Ala、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa8是：Lys、K(W)、Pro、Cys、K(CO(CH2)2SH)或不存在； 
Xaa9是：K(E-C16)、Ser、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在；和 
Xaa10是：Ser、Cys、Lys、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在。 
优选的如果式13的Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8或Xaa9不存在，下游的下一个氨基酸是C末端延伸的下一个氨基酸。C末端氨基酸可以被酰胺化。 
优选的，式13的C末端延伸的Xaa1至Xaa10中的至少1个存在。更优选的，C末端延伸的Xaa1至Xaa10中至少有二、三、四、五、六、七、 八、九或全部都存在。 
更优选的，在本发明的任一方面和实施方案中可以使用的可选的C末端延伸是选自： 
  SEQ ID NO：85   SRTSPPP
  SEQ ID NO：86   SRTSPPP-NH2
  SEQ ID NO：87   SSTSPRPPSS
  SEQ ID NO：88   SSTSPRPPSS-NH2
  SEQ ID NO：89   SRTSPPPK(W)
  SEQ ID NO：90   SRTSPPPK(W)-NH2
  SEQ ID NO：91   SRTSPPPC
  SEQ ID NO：92   SRTSPPPC-NH2
本发明的VPAC2受体肽激动剂的优点是具有超过已知VPAC2受体肽激动剂的增强的选择性、效价和/或稳定性。特别是，添加毒蜥外泌肽-4的C末端序列，或该C末端序列的变体作为c-加帽序列，出乎意料的增加了VPAC2受体的选择性并增加蛋白水解的稳定性。 
一个或多个PEG分子与VPAC2受体肽激动剂的特定残基的共价连接可获得具有生物活性的、加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其与未加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂相比，具有延长的半衰期和降低的清除率。 
术语“VPAC2”用于指代并联系本发明的激动剂激活的特定受体(Lutz等人，FEBS Lett.，458：197-203(1999)；Adamou等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，209：385-392(1995))。该术语也用指代并联系本发明的激动剂。 
本发明的“选择性VPAC2受体肽激动剂”或“VPAC2受体肽激动剂”是选择性激活VPAC2受体，诱导胰岛素分泌的肽。优选的，本发明的选择性VPAC2受体肽激动剂的序列具有28至40个天然存在的和/或非天然存 在的氨基酸，可以或可以不额外的含有C末端延伸。 
“选择性的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂”或“加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂”是选择性VPAC2受体肽激动剂(其共价的连接一个或多个聚乙二醇(PEG)分子)或其衍生物，其中，每个PEG连接半胱氨酸或赖氨酸、K(W)或K(CO(CH2)2SH)，或肽的羧基端。 
选择性的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可以含有C末端延伸。本发明的“C末端延伸”包括具有1至13个天然存在的或非天然存在的氨基酸的序列，所述氨基酸在C末端延伸的N端通过肽键与序列C端连接。C末端延伸中的任一个Cys、Lys、K(W)或K(CO(CH2)2SH)残基可以共价的连接PEG分子，和/或C末端延伸的羧基端氨基酸可以共价的连接PEG分子。 
本文中使用的关于术语C末端延伸的术语“连接”，包括直接在肽序列的C端添加或附着氨基酸或化学基团。 
任选的，选择性的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂还可以具有N末端修饰。本文使用的术语“N末端修饰”包括直接在肽的N端添加或附着氨基酸或化学基团，以及形成化学基团，其与肽的N端的氮结合。 
N末端修饰可以包括在VPAC2受体肽激动剂肽序列上添加一个或多个天然存在的或非天然存在的氨基酸，优选的是不超过10个氨基酸，其中一个氨基酸是更优选的。可以添加到N末端的天然存在的氨基酸包括甲硫氨酸和异亮氨酸。添加到N末端的修饰的氨基酸可以是D-组氨酸。或者，下列氨基酸可以添加到N末端：SEQ ID NO：93Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg，其中，Arg与肽激动剂的N端相连。优选的，添加到N端的任何氨基酸通过肽键与N端相连。 
本文中使用的关于N末端修饰的术语“连接”，包括直接在VPAC2受体激动剂的N末端添加或附着氨基酸或化学基团。可以在形成肽键的常规偶联条件下实现上述N末端修饰的添加。 
还可以通过添加烷基基团(R)，优选的C1-C16烷基基团来修饰肽激动剂的N端，形成(R)NH-。 
可选的，可以通过添加一组式-C(O)R1形成式R1C(O)NH-的酰胺来修饰肽激动剂的N端。添加一组式-C(O)R1可以通过与式R1COOH的有机酸反应来实现。现有技术已经表明了用酰化修饰氨基酸序列的N端(例如，Gozes等人，J.Pharmacol Exp Ther，273：161-167(1995))。添加一组式-C(O)R1可以导致在N端形成尿素基团(见WO01/23240，WO2004/06839)或氨基甲酸基团。此外，通过添加焦谷氨酸，或6-氨基己酸可以修饰N端。 
肽激动剂的N端可以通过添加一组式-SO2R5来修饰，以在N端形成磺胺基团。 
肽激动剂的N端页可以通过与琥珀酸酐反应来修饰，以在N端形成琥珀酰亚胺基团。琥珀酰亚胺与肽N端的氮结合。 
可以通过添加甲硫氨酸亚砜、生物素基-6-氨基己酸或-C(＝NH)-NH2可选的修饰N端。添加-C(＝NH)-NH2是胍基化(guanidation)修饰，使N端氨基酸的末端NH2变成-NH-C(＝NH)-NH2。 
本发明的大多数序列，包括N末端修饰和C末端延伸，都含有20个天然存在的氨基酸的标准单字母或三字母代码。使用的其他代码定义如下： 
C6＝己酰基 
d＝各种氨基酸的D同种型(非天然存在的) 
例如，dA＝D-丙氨酸，dS＝D-丝氨酸，dK＝D-赖氨酸 
hR＝高精氨酸 
Aib＝氨基异丁酸 
OMe＝甲氧基 
Nle＝正亮氨酸 
Nme＝与氨基酸的α氨基连接的N-甲基， 
例如，NmeA＝N-甲基丙氨酸，NmeV＝N-甲基缬氨酸 
Orn＝鸟氨酸 
K(CO(CH2)2SH)＝ε-(3’-巯丙酰)-赖氨酸 
K(W)＝ε-(L-色氨酰)-赖氨酸 
Abu＝α-氨基-n-丁酸或2-氨基丁酸 
Cit＝瓜氨酸 
K(Ac)＝ε-乙酰赖氨酸 
PEG＝聚乙二醇 
PEG40K＝40,000道尔顿PEG分子 
PEG30K＝30,000道尔顿PEG分子 
PEG20K＝20,000道尔顿PEG分子 
天然存在的VIP是作为有28个氨基酸的单一序列。然而，PACAP以具有酰胺化羧基的38个氨基酸的肽(PACAP-38)或者27个氨基酸的肽(PACAP-27)存在(Miyata等人，Biochem Biophys Res Commun，170：643-648(1990))。VIP、PACAP-27和PACAP-38的序列如下： 
  肽   Seq.ID   #   序列
  VIP   SEQ  ID  NO：  14   HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN
  PACAP-27   SEQ  ID  NO：  15   HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2
  PACAP-38   SEQ  ID  NO：  16   HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYQ  RVKNK-NH2
本文中使用的术语“天然存在的氨基酸”意指人类遗传密码子编码的 20个氨基酸(即，20个标准氨基酸)。上述20个氨基酸是：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。 
“非天然存在的氢基酸”的实例包括合成的氨基酸和由身体修饰的氨基酸。其包括D-氨基酸，精氨酸样氨基酸(例如，高精氨酸)，及其它在侧链具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)，以及修饰的氨基酸(如正亮氨酸、赖氨酸(异丙基)-其中赖氨酸的侧链酰胺被异丙基修饰)。还包括氨基酸如鸟氨酸，氨基异丁酸和2-氨基丁酸。 
本文中使用的“选择性”指与其它已知受体相比，VPAC2受体肽激动剂对VPAC2受体具有增加的选择性。通过VPAC2受体结合亲和力与VPAC1受体结合亲和力的比值，或者通过VPAC2受体结合亲和力与PAC1受体结合亲和力的比值测定选择性的程度。结合亲和力的测定描述在下文的实施例4中。 
“促胰岛素活性”指对升高的葡萄糖水平作出反应，刺激胰岛素分泌的能力，从而导致细胞摄取葡萄糖和降低血浆葡萄糖水平。可以通过本领域已知的方法评价促胰岛素活性，包括用测量VPAC2受体结合活性或受体活化作用(例如，胰岛素瘤细胞系或胰岛分泌胰岛素、静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)、腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)和口服葡萄糖耐量试验(OGTT))的实验。人体内促胰岛素活性的常规测量是通过测量胰岛素水平或C肽水平。本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂具有促胰岛素活性。 
本文中使用的“体外效价”是在基于细胞的测定中对肽活化VPAC2受体的能力的测量。体外效价表示为“EC50”，是在单一剂量反应实验中导致活性50％最大增长的化合物有效浓度。出于本发明的目的，用两种不同的测定确定体外效价：DiscoveRx和Alpha Screen。上述测定的其它细节参见实施例3和5。同时，上述测定以不同的方式实施，结果证明了两种测定之间的普遍相关性。 
术语“血浆半衰期”指之前在血浆中循环的相关分子一半被清除的时间。替代使用的术语是“消除半衰期”。在血浆半衰期或清除半衰期中使用的术语“延长的”或“更长的”指如在可比较的条件下确定的，与参照分子(例如，未加入聚乙二醇的形式的肽或天然肽)相比，加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的半衰期有统计学上的显著增加。本文中报道的半衰期是消除半衰期；其对应于消除的终端对数线性率。本领域的技术人员已知半衰期是衍生的参数，作为清除率和分布容积的函数而变化。 
清除率是对身体排除药物的能力的测量。当清除率由于例如药物修饰作用而降低时，预期半衰期将增长。然而，只有当分布容积没有改变时，该互反关系才是精确的。等式t1/2≈0.693(V/C)给出了终端对数线性半衰期(t1/2)、清除率(C)和容积分布(V)之间有效的近似关系。清除率不表示移除了多少药物，而是表示为了实现消除，必须完全脱离药物的生物流体如血液或血浆的体积。清除率表示为每单位时间的体积。 
本文中使用的“百分比(％)序列同一性”用于指序列，其在比对时具有位于替换的氨基酸是那些与初始蛋白质相比不改变蛋白质活性或功能的氨基酸。例如，相互具有至少85％同一性的两个氨基酸序列，在相似的位置上具有至少85％相似(相同或保守替换的残基)，其中当比对时最优允许高达3个间隔，条件是间隔影响的氨基酸残基总共不超过15个。 
本文中用于计算百分比序列同一性的参照肽是： 
  P487  SEQ ID NO：84   C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAA  AibOrnYLQSIOrnOrnGGPSSGAPPPS-NH2
百分比序列同一性可以通过以下来计算：确定在本发明涵盖的肽和参照肽如P487(SEQ ID NO：84)之间不同的残基数目，获得该数目并以其除以参照肽的氨基酸数目(例如，P487是39个氨基酸)，再乘以一百，并从得数中减去100。例如，有39个氨基酸的序列有4个氨基酸与P487不同，其百分比(％)序列同一性为90％(例如，100-((4/39)×100))。对于 超过39个氨基酸的序列，出于上述计算的目的，与P487序列不同的残基数目将包括超过39个的额外的氨基酸。例如，有40个氨基酸的序列，其中有4个氨基酸与P487序列中的39个氨基酸不同，并且在羧基端有一个P487序列中不存在的额外的氨基酸，它共有5个氨基酸与P487不同。因此，该序列有87％的百分比(％)序列同一性(例如，100-((5/39)×100))。可以使用本领域普遍已知的方法确定序列同一性的程度(见例如，Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730(1983)以及Myers E.和Miller W.，Comput.Appl.Biosci.4：11-17(1988))。一个可用来确定相似度的程序是MegAlign Lipman-Pearson的单对(one pair)方法(使用缺省参数)，其可以从DNAstar公司，1128，Selfpark Street，Madison，Wisconsin，53715，USA作为Lasergene系统的部分获得。另一个可以使用的程序是Clustal W。这是由Thompson等人(Nucleic AcidsResearch，22(22)：4673-4680(1994))开发的用于DNA或蛋白质序列的多序列比对软件包。该工具对于实施相关序列的跨物种比较并观察序列保守性是有效的。Clustal W是用于DNA或蛋白质的常规目的多序列比对程序。它产生不同序列的生物学有意义的多序列比对。它计算选定序列的最佳匹配，将其排列从而可以看出同一性、相似性和差别。通过观看Cladograms或Phylograms可以看出进化关系。 
本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的序列是选择性用于VPAC2受体，并与P487(SEQ ID NO：84)优选的具有在60％至70％、60％至65％、65％至70％、70％到80％、70％至75％、75％至80％、80％至90％、80％至85％、85％至90％、90％至97％、90％至95％或95％至97％范围内的序列同一性。优选的，序列与P487(SEQ ID NO：84)有大于82％的序列同一性。更优选的，序列与P487(SEQ ID NO：84)有大于90％的序列同一性。甚至更优选的，序列与P487(SEQ ID NO：84)有大于92％的序列同一性。还更优选的，序列与P487(SEQ ID NO：84)有大于95％的序列同一性或97％的序列同一性。 
本文中使用的术语“C1-C16烷基”意指单价饱和直链、支链或环链的烃 基，其具有1至16个碳原子，或者当成环状时，具有3至16个碳原子。因此，术语“C1-C16烷基”包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正庚基、正辛基、环丙基、环丁基、环戊基和环己基。C1-C16烷基基团可以用一个或多个取代基任选的取代，所述取代基包括例如芳基、C1-C6烷氧基、-OH、卤素、-CF3和-SH。 
本文使用的术语“C1-C6烷基”意指单价饱和直链、支链或环链的烃基，其具有1至6个碳原子或者当成环状时，具有3至6个碳原子。因此，术语“C1-C6烷基”包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基和环己基。C1-C6烷基基团可以用一个或多个取代基任选的取代。 
本文使用的术语“C2-C6烯基”意指单价直链、支链或环链的烃基，其具有至少一个双键和2至6个碳原子，或者当成环状时，具有3至6个碳原子。因此，术语“C2-C6烯基”包括乙烯基、丙-2-烯基、丁-3-烯基、戊-4-烯基和异丙烯基。C2-C6烯基可以用一个或多个取代基任选的取代。 
本文使用的术语“C2-C6炔基”意指单价直链或支链的烃基，其具有至少一个三键和2至6个碳原子。因此，术语“C2-C6炔基”包括丙-2-炔基、丁-3-炔基和戊-4-炔基。C2-C6炔基基团可以用一个或多个取代基任选的取代。 
本文使用的术语“C1-C6烷氧基”意指单价不取代的饱和直链或支链的烃基，其具有与二价O基的取代点相连的1至6个碳原子。因此，术语“C1-C6 烷氧基”包括，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。C1-C6烷氧基基团可以用一个或多个取代基任选的取代。 
术语“卤”或“卤素”意指氟、氯、溴或碘。 
当单独使用或作为基团的一部分使用时，术语“芳基”是5至10元的芳香基团或芳香杂环基团，其包括苯基、5或6-元的单环芳香杂环基(其中每元都可以被1、2、3、4或5个取代基任选的取代(取决于可用的取代位置数量))、萘基或8-、9-或10-元二环芳香杂环基(其中每元都可以被1、 2、3、4、5或6个取代基任选的取代(取决于可用的取代位置数量))。在芳基该定义中，合适的取代基包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-NH2、-OH、卤素、-SH和CF3。 
本文使用的术语“芳基C1-C4烷基”意指用芳基取代的C1-C4烷基。因此，术语“芳基C1-C4烷基”包括苯甲基、1-苯乙基(α-甲苄基)、2-苯乙基、1-萘甲基或2-萘甲基。 
术语“萘基”包括1-萘基和2-萘基。1-萘基是优选的。 
本文使用的术语“苯甲基”意指通过-CH2-基与取代点连接的单价未取代的苯基。 
本文使用的术语“5-或6-元单环芳香杂环基”意指环内共有5或6个原子的单环芳香基，其中1至4个上述原子是各自独立的选自N、O和S。优选的基团在环内有1或2个原子，其各自独立的选自N、O和S。五元单环芳香杂环基团的实例包括吡咯基(又称azolyl)、呋喃基(furanyl)、噻吩基、吡唑基(也称1H-吡唑基和1，2-diazolyl)、咪唑基、噁唑基(又称1，3-噁唑基)、异噁唑基(又称1，2-噁唑基)、噻唑基(又称1，3-噻唑基)、异噻唑基(又称1，2-噻唑基)、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、噁三唑基和噻三唑基。6元单环芳香杂环基团的实例包括吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基和三嗪基。 
本文使用的术语“8-、9-或10-元二环芳香杂环基团”意指环系统中共有8、9或10个原子的融合耳环芳香基，其中1至4个上述原子各自独立的选自N、O和S。优选的基团在环系统内有1至3个原子，它们各自独立的选自N、O和S。合适的8-元二环芳香杂环基包括咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑基、噻吩并[3，2-b]噻吩基、噻吩并[2，3-d][1，3]噻唑基和噻吩并[2，3-d]咪唑基。合适的9-元二环芳香杂环基包括吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基(又称苯并[b]呋喃基)、异苯并呋喃基(又称苯并[c]呋喃基)、苯并噻吩基(又称苯并[b]噻吩基)、异苯并噻吩基(又称苯并[c]噻吩基)、吲唑基、苯并咪唑基、1，3苯并噁唑基、1，2-苯并异噁唑基、2，1-苯并异噁唑基、1，3苯并噻唑基、1，2-苯并异噻唑基、2，1-苯并异噻唑基、苯并三唑基、1，2，3-苯并噁 二唑基、2，1，3-苯并噁二唑基、1，2，3-苯并噻二唑基、2，1，3-苯并噻二唑基、噻吩并吡啶基、嘌呤基(purinyl)和咪唑并[1，2-a]吡啶。合适的10-元二环芳香杂环基包括喹啉基、异喹啉基、噌啉、喹唑啉基、喹喔啉基、1，5-萘啶基(naphthyridyl)、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基和1，8-萘啶基。 
本文使用的术语“PEG”意指聚乙二醇分子。PEG典型的形态是具有末端羟基的线性聚合物，并具有式HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，其中n是从约8至约4000。末端的氢可以用保护基团取代例如烷基或链烷醇基。优选的，PEG具有至少一个羟基基团，更优选的，其是末端的羟基基团。正是该羟基基团优选被活化与肽反应。有多种形式的PEG可用于本发明。本领域存在多种PEG衍生物适合用于本发明。(见例如，美国专利号：5445090；5900461；5932462；6436386；6448369；6437025；6448369；6495659；6515100和6514491，以及Zalipsky，S.Bioconjugate Chem.6：150-165，1995)。在本发明中共价连接VPAC2受体肽激动剂的PEG分子并不意图被限定为特定类型。PEG分子的分子量优选的是500-100,000道尔顿。PEG可以是线性或分支的。本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可以有一、二或三个PEG分子与肽连接。更优选的是每个加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂有一个或两个PEG分子，但是，当每个肽分子有一个以上的PEG分子时，优选的是不超过3个。进一步考虑PEG分子的两端可以是同-或异-官能化的，用于将两个或多个VPAC2受体肽激动剂交联在一起。当存在两个PEG分子时，PEG分子优选的是每个20,000道尔顿PEG分子或每个30,000道尔顿PEG分子。但是，也可以使用具有不同分子量的PEG分子，例如，一个10,000道尔顿PEG分子和1个30,000PEG分子，或一个20,000道尔顿PEG分子和一个40,000道尔顿PEG分子。 
在本发明中，PEG分子可以共价的连接Cys或Lys残基，或连接C末端残基。PEG分子还可以共价的连接与Lys残基(K(W))的侧链偶联的Trp残基。可选的，K(CO(CH2)2SH)基团可以被加入聚乙二醇以形成K(CO(CH2)2S-PEG)。肽激动剂中的任一个Lys残基都可以用K(W)或 K(CO(CH2)2SH)取代，后者可以随后被加入聚乙二醇的。此外，肽激动剂中的任何Cys残基可以用修饰的半胱氨酸残基例如，hC取代。修饰的Cys残基可以共价的连接PEG分子。 
本文使用的术语“加入聚乙二醇作用”意指如上所述在本发明的VPAC2受体肽激动剂上共价的连接一个或多个PEG分子。 
根据本发明优选的实施方案，提供了加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其含有选自：SEQ ID NO：17至45和94至112的肽序列，以及选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11和12的C末端延伸。特别优选的，C末端延伸是SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。 
根据本发明更优选的实施方案，提供了加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其含有选自：SEQ ID NO：17至45和94至112的肽序列，以及选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11和12的C末端延伸，其中VPAC2受体肽激动剂还包括N末端修饰，该修饰是添加乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、3-苯基丙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、正亮氨酸、D-组氨酸、异亮氨酸、3-巯丙酰、生物素基-6-氨基己酸和-C(＝NH)-NH2。在该实施方案中，更优选的N末端修饰是添加乙酰基或己酰基。 
根据本发明另一优选的实施方案，提供了加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其含有式4(SEQ ID NO：4)的肽序列，以及选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11和12的C末端延伸，其中加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂还包括N末端修饰，该修饰是添加乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、3-苯基丙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、正亮氨酸、D-组氨酸、异亮氨酸、3-巯丙酰、生物素基-6-氨基己酸(6-氨基己酸)和-C(＝NH)-NH2。在该实施方案中，更优选的N末端修饰是添加乙酰基或己酰基。 
根据本发明更优选的实施方案，提供了加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其含有式4(SEQ ID NO：4)的肽序列(其中Xaa15是Aib，Xaa20 是Aib，Xaa12、Xaa21、Xaa27和Xaa28都是Orn)，以及选自SEQ ID NO：5、 6、7、8、9、10、11和12的C末端延伸，并且其中加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂还包括N末端修饰，该修饰是添加乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、3-苯基丙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、正亮氨酸、D-组氨酸、异亮氨酸、3-巯丙酰、生物素基-6-氨基己酸(6-氨基己酸)和-C(＝NH)-NH2。在该实施方案中，更优选的Xaa15 是Aib，Xaa20是Aib，Xaa12、Xaa21、Xaa27和Xaa28都是Orn，Xaa8是Glu、Xaa9是Gln以及Xaa10是Tyr(OMe)。特别优选的Xaa15是Aib，Xaa20 是Aib，Xaa12、Xaa21、Xaa27和Xaa28都是Orn，Xaa8是Glu、Xaa9是Gln，Xaa10是Tyr(OMe)，以及Xaa23和/或Xaa25是Aib。 
蛋白质的加入聚乙二醇作用可以克服使用肽或蛋白质作为治疗剂相关的许多药理学和毒理学/免疫学的问题。但是，对于任何单个的肽都不确定，与肽的未加入聚乙二醇的形式相比，肽的加入聚乙二醇的形式是否会显著的丧失生物活性。 
加入聚乙二醇的蛋白质的生物活性可以被以下因素影响，例如：i)PEG分子的大小；ii)特定的连接位点；iii)修饰的程度；iv)不利的偶联条件；v)连接是否使用接头或者是否聚合物直接连接；vi)有害副产物的产生；vii)活化的聚合物造成的破坏；或viii)电荷的滞留。对细胞因子加入聚乙二醇作用实施的工作展现了例如加入聚乙二醇作用具有的效果。根据使用的偶联反应，细胞因子的聚合物修饰导致了生物活性的显著下降[Francis，G.E.等人，(1998)PEGylation of cytokines and other therapeutic proteinsand peptides：the importance of biological optimization of couplingtechniques，Intl.J.Hem.68：1-18]。维持加入聚乙二醇的肽的生物活性甚至比维持蛋白质的更困难。由于肽比蛋白质小，通过加入聚乙二醇作用的修饰对生物活性可能具有更大的影响。 
本发明的VPAC2受体肽激动剂通过共价的连接一个或多个PEG分子来修饰，并且由于减慢的蛋白水解降解和肾清除率，其一般具有改善的药物动力学谱。加入聚乙二醇作用将增加VPAC2受体肽激动剂的表观尺寸，从而降低肾清除率和改变生物分布。加入聚乙二醇的作用可以保护VPAC2 受体肽激动剂的抗原表位，从而降低网状内皮的清除率和被免疫系统识别，还降低蛋白水解酶如DPP-IV的降解。 
一个或多个PEG分子与小的、生物学活化的VPAC2受体肽激动剂的共价连接造成了负面影响激动剂的风险，例如，通过使内在的二级结构和生物活性构象不稳定并降低生物活性，从而使激动剂不适合作为治疗剂。但是，本发明基于这样的发现，即一个或多个PEG分子与VPAC2受体肽激动剂的特定残基的共价结合，令人惊奇的获得了生物活化的、加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其与未加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂相比，具有延长的半衰期和降低的清除率。本发明的化合物包括选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂。 
为了确定VPAC2受体肽激动剂中潜在的加入聚乙二醇作用位点，可以进行丝氨酸扫描。肽中特定位置的Ser残基被取代，检测Ser-修饰的肽的效价和选择性。如果Ser取代对效价只有最低限度的影响，而且Ser-修饰的肽选择作用于VPAC2受体，则然后用Cys或Lys残基取代该Ser残基，并作为直接或间接的加入聚乙二醇作用位点。残基的间接加入聚乙二醇作用是与加入聚乙二醇作用位点的残基结合的化学基团或残基的加入聚乙二醇作用。Lys的间接加入聚乙二醇作用包括K(W)和K(CO(CH2)2SH)的加入聚乙二醇作用。 
本文描述的发明提供了加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂。加入聚乙二醇作用可以增加选择性VPAC2受体肽激动剂的半衰期，获得具有至少一个小时，优选的至少3、5、7、10、15、20或24小时以及最优选的至少48小时的消除半衰期的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂。本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂优选的具有200ml/h/kg或更少的清除率值，更优选的180、150、120、100、80、60ml/h/kg或更少，以及最优选的少于50、40或20ml/h/kg。 
本发明涵盖了这样的发现，即在VPAC2受体肽激动剂的肽序列的C末端添加的特定氨基酸可以保护肽并且增加活性、选择性和/或效价。例如，上述C末端延伸可以稳定肽的螺旋结构，稳定位于C末端附近的、倾向于 于被酶切的位点。此外，本文公开的许多C末端延伸肽可以对于VPAC2受体是更具选择性的，并且可以比VIP、PACAP和其它已知的VPAC2受体肽激动剂具有更高的效价。优选的C末端延伸的实例是毒蜥外泌肽-4延伸肽作为C-加帽序列。毒蜥外泌肽-4是在毒蜥(Heloderma Suspectum)(Eng等人，J.Biol.Chem.，267(11)：7402-7405(1992)))的唾液分泌物中发现的。其它C末端延伸的实例是毒蜥皮肽和毒蜥肽。毒蜥皮肽和毒蜥肽也是在毒蜥的唾液分泌物中发现的。 
此外还发现VPAC2受体肽激动剂的N末端修饰作用可以提高效价和/或提供对抗DPP-IV切割的稳定性。 
VIP和一些已知的VPAC2受体肽激动剂对多种酶的切割作用易感，因此具有短的体内半衰期。下文讨论了在VPAC2受体肽激动剂上的多种酶切位点。对切割位点的讨论是相对于VIP(SEQ ID NO：14)中的氨基酸位置，并可适用于本文中提到的序列。 
由二肽基肽酶IV(DPP-IV)对肽激动剂的切割作用发生在位置2(VIP中的丝氨酸)和位置3(VIP中的天冬氨酸)之间。通过添加N末端修饰，致使本发明的激动剂对在该区域的DPP-IV切割更稳定。可以改善对抗DPP-IV切割的稳定性的N末端修饰作用的实例包括添加乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、3-苯基丙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、正亮氨酸、D-组氨酸、异亮氨酸、3-巯丙酰、生物素基-6-氨基己酸和-C(＝NH2)-NH2。优选的，N末端修饰是添加乙酰基或己酰基。 
在野生型的VIP的氨基酸10和11(酪氨酸和苏氨酸)以及22和23(酪氨酸和亮氨酸)之间有胰凝乳蛋白酶切割位点。使在位置10和/或11以及位置22和/或23的取代可以增加肽在这些位点的稳定性。例如，在位置10和/或22用Tyr(OMe)取代酪氨酸可以增加稳定性。 
在野生型VIP 12和13位的氨基酸之间有胰蛋白酶切割位点。一些氨基酸使得肽对该位点的切割较不易感，例如，鸟氨酸位于第12位和氨基异丁酸位于第13位时。 
在野生型VIP和本领域已知的许多VPAC2受体肽激动剂中，在位置14和15的碱性氨基酸之间与位置20和21的碱性氨基酸之间有切割位点。因为上述位点的取代，本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂具有改善的体内蛋白水解稳定性。上述位点优选的取代是使肽对胰蛋白酶样酶，包括胰蛋白酶的切割较不易感的取代。例如，位于第15位的氨基异丁酸、位于第20位的氨基异丁酸和位于第21位的鸟氨酸都是优选的取代，其可以产生改善的稳定性。实施例7中示例了代表性编号的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的改善的稳定性，其具有对肽酶切割的抗性，并被本发明所涵盖。 
在野生型VIP的位置25和26的氨基酸之间也有切割位点。 
VPAC2受体肽激动剂在涵盖了位置27、28、29、30和31的氨基酸区域对酶切也是易感的。添加C末端延伸可以使肽激动剂对神经内肽酶(NEP)更稳定，还可以增加VPAC2受体的选择性。胰蛋白酶样酶也可以攻击该区域。如果发生上述攻击，肽激动剂可以失去其具有额外的羧肽酶活性的C末端延伸，导致肽的失活形式。增加对该区域切割的抗性的优选取代包括位置27的鸟氨酸，位置28的鸟氨酸或氨基异丁酸和位置29的鸟氨酸。 
除了选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂(其具有对多种肽酶切割的抗性)，本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2肽受体激动剂还可以涵盖这样的肽，即与本领域已知的一些肽相比，具有对VPAC2受体增加的选择性、增加的效价和/或增加的稳定性的肽。实施例3、4和5中表明了本发明的多种加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的增加的效价和选择性。 
实施例3的表1提供了选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂及其相应的体外效价结果的表。优选的，本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂具有低于200nM的EC50值。更优选的，EC50值低于100nM。甚至更优选的，EC50值低于50nM。仍然更优选的，EC50值低于30nM。 
实施例4的表2提供了加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂及其相应的与人VPAC2、VPAC1和PAC1的受体结合结果的列表。上述测定的其它细节参见实施例4。选择性的程度是通过VPAC2受体结合亲和力与VPAC1受体结合亲和力的比例，以及VPAC2受体结合亲和力与PAC1受体结合亲和力的比例来确定的。优选的，本发明的激动剂具有选择性比例，其中对VPAC2受体的亲和力比对VPAC1和/或PAC1受体至少大50倍。更优选的，对VPAC2的亲和力比对VPAC1和/或PAC1至少大100倍。甚至更优选的，对VPAC2的亲和力比对VPAC1和/或PAC1至少大200倍。仍然更优选的，对VPAC2的亲和力比对VPAC1和/或PAC1至少大500倍。更优选的，对VPAC2的亲和力比对VPAC1和/或PAC1的比值至少大1000倍。 
在本文中使用的“选择性VPAC2受体肽激动剂”还包括本文中描述的激动剂的可药用盐。本发明的选择性VPAC2受体肽激动剂可以具有足够的酸性、足够的碱性、或双官能基团，相应的与任意数目的无机碱，和无机和有机酸反应，从而形成盐。一般用于形成酸加成盐的酸是无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等等，和有机酸例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯-磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸、三氟乙酸等等。该类盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐，等等。 
 碱加成盐包括从无机碱衍生的，例如铵或碱金属或碱土金属氢氧化物、 碳酸盐、碳酸氢盐，等等。可用于制备本发明的盐的这类碱因此包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化胺、碳酸钾，等等。 
本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂优选的按药物组合物配制。可以使用的标准药物配制技术例如描述在Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中。本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可以配制为通过口腔、局部、口服、经皮、鼻或肺途径施用，或者通过肠胃外施用。 
肠胃外施用可包括，例如全身施用如通过肌内、静脉内、皮下、真皮内或腹膜内注射。选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可以与作为药物组合物的一部分的可接受的药物载体、稀释剂或赋形剂一起联合向受试者施用，用于治疗NIDDM或以下讨论的疾病。药物组合物可以是溶液，或者如果肠胃外施用，是加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的悬液或者加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂与二价金属阳离子例如锌复合的悬液。合适的药物载体可以包含惰性成分，其不与肽或肽衍生物相互作用。用于肠胃外施用的合适的药物载体包括，例如无菌水、生理盐水、制菌盐水(含有约0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸缓冲的盐溶液、Hank溶液、Ringer-乳酸盐等等。合适赋形剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇和甘露醇。 
本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可以配制成使血浆水平在延长的时间段中维持在有效范围内的施用。有效的口服肽药物递送的主要障碍是低下的生物利用率，这是由于酸和酶造成肽的降解、通过上皮膜的低吸收、以及在暴露于消化道内的酸性pH环境后肽转变为不可溶的形式。肽的口服递送系统例如本发明涵盖的的那些是本领域已知的。例如，加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可以用小球体包入胶囊然后口服递送。例如，可以将加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂包入到由商业上可获得的、生物相容的、生物可降解的聚合物组成的微球体中，多聚(交酯-共-乙交酯)-COOH和橄榄油作为填充物(参见Joseph等人，Diabetologia 43：1319-1328(2000))。其它类型的微球体技术如来自奥克美 斯公司(Alkermes)的 
Figure S2006800398953D00471
和 
Figure S2006800398953D00472
生物可降解的聚合物也是可以商业获得的。 
Figure S2006800398953D00473
多聚物可以用任意的交酯异构体产生。交酯∶乙交酯的比例可以在0∶100和100∶0之间变动，允许产生宽范围的聚合物性质。这可用于设计具有范围在数周至数月的再吸收时间的递送系统和可植入装置。Emisphere也已发表了多篇讨论肽和蛋白质的口服递送技术的文章。例如，参见Leone-bay等人的WO95/28838，其公开了由修饰的氨基酸组成的特殊载体，用来促进吸收。 
本文中描述的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可用于治疗具有多种疾病和病症的受试者。本发明涵盖的激动剂通过作用于受体，指如VPAC2受体，行使其生物学效应。因此可以用本发明的加入聚乙二醇的VPAC2激动剂治疗具有疾病和/或病症的受试者，所述受试者对VPAC2受体刺激或VPAC2受体肽激动剂施用具有有利的反应。这类受试者是所谓的“需要用VPAC2激动剂治疗”或“需要VPAC2受体刺激”。 
本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可用于治疗糖尿病，包括1型和2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM)。激动剂还可以用于治疗需要用VPAC2受体激动剂预防疗法的受试者，例如有发展NIDDM的风险的受试者。该治疗还可以延迟糖尿病和糖尿病并发症的发作。其它可以用本发明的激动剂治疗的受试者包括那些患有葡萄糖耐量降低(IGT)(糖尿病分类的专家委员会(Expert Committee onClassification of Diabetes Mellitus)，Diabetes Care 22(增补1)：S5，1999)或空腹葡萄糖异常(IFG)(Charles等人，Diabetes 40：796，1991)的受试者，那些体重超过根据受试者身高和体格的正常体重约25％的受试者，有一位或多位亲代患有NIDDM的受试者，已患有妊娠糖尿病的受试者，和患有由于例如降低的内源性胰岛素分泌造成的代谢疾病的受试者。选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可用于防止具有葡萄糖耐量降低的受试者继续发展NIDDM，防止胰腺β-细胞衰退，诱导β-细胞增殖，改善β-细胞功能，活化休眠的β-细胞，使细胞分化成β-细胞，刺激β-细胞复制，以及抑制β-细胞凋亡。在本发明的方法中使用本发明的激动剂可以治疗或 预防的其它疾病和病症包括：青春晚期糖尿病(MODY)(Herman等人，Diabetes 43：40，1994)；成人隐性自身免疫糖尿病(LADA)(Zimmet等人，Diabetes Med.11：299，1994)；妊娠糖尿病(Metzger，Diabetes，40：197，1991)；代谢综合症X、血脂异常、高血糖症、高胰岛素血症、高甘油三酯血症和抗胰岛素性。 
本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂还可用于治疗糖尿病的继发性原因(糖尿病分类专家委员会(Expert Committee onClassification of Diabetes Mellitus)，Diabetes Care 22(增补l)：S5，1999)。该继发性原因包括糖皮质激素过多、生长激素过多、嗜铬细胞瘤和药物引起的糖尿病。可以引起糖尿病的药物包括但不限于，吡甲硝苯脲、烟酸、糖皮质激素类、苯妥英、甲状腺素、β-肾上腺素能药、α-干扰素和用于治疗HIV感染的药物。 
本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂在抑制食物摄取和治疗肥胖症中是有效的。 
本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂也可在预防或治疗例如下述疾病中是有效的，所述疾病例如动脉粥样硬化症、高脂血症、高胆固醇血症、低HDL水平、高血压、原发性肺动脉高压、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、冠心病和冠状动脉病)、脑血管病和外周血管病；以及用于治疗狼疮、多囊性卵巢综合征、癌发生(carcinogenesis)，和增生、雄性和雌性生殖问题、性功能障碍、溃疡、睡眠障碍、脂类和碳水化合物代谢障碍、生理节律功能障碍、生长障碍、能量内稳态障碍、免疫病包括自身免疫病(例如，系统性红斑狼疮)，以及急性和慢性炎症、类风湿性关节炎和败血症性休克。 
本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂还可以用于治疗与以下相关的生理障碍：例如细胞分化产生脂类聚集细胞，调节例如异常胰腺β-细胞功能、胰腺分泌肿瘤和/或自身免疫低血糖症所涉及的胰岛素灵敏度和血糖水平(其中所述低血糖症是由于对胰岛素的自身抗体、对胰岛素受体的自身抗体或对胰腺β-细胞有刺激的自身抗体，导致形成粥样硬 化斑块的巨噬细胞分化、炎症反应、癌发生、增生、脂肪细胞基因表达、脂肪细胞分化、胰腺β-细胞量下降、胰岛素分泌、组织对胰岛素的灵敏度、脂肪肉瘤细胞生长、多囊性卵巢病、持续无排卵、雄激素增多症、孕酮产生、类固醇生成、细胞内的氧化还原电位和氧化应激、氧化氮合酶(NOS)产生、γ-谷氨酰转肽酶增加、过氧化氢酶、血浆三酰甘油、HDL和LDL胆固醇水平，等等。 
此外，本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可以用于治疗哮喘(Bolin等人，Biopolymer 37：57-66(1995)；美国专利号5,677,419；显示多肽R3PO在松弛豚鼠气管平滑肌中起作用)；低血压诱导(VIP在哮喘患者中诱导低血压、心动过速和面潮红(Morice等人，Peptides7：279-280(1986)；Morice等人，Lancet 2：1225-1227(1983)))；用于治疗雄性生殖问题(Siow等人，Arch.Androl.43(1)：67-71(1999))；作为抗凋亡/神经保护剂(Brenneman等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.865：207-12(1998))；在缺血事件中保护心脏(Kalfin等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.1268(2)：952-8(1994)；Das等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.865：297-308(1998))；用于调控昼夜节律钟及其相关疾病(Hamar等人，Cell 109：497-508(2002)；Shen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.97：11575-80，(2000))；以及作为抗溃疡剂(Tuncel等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.865：309-22，(1998))。 
选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的“有效量”是向需要VPAC2受体刺激的受试者施用时，不引起不令人接受的副作用而获得需要的治疗和/或预防效果的量。“需要的治疗效应”包括一个或多个下列：1)与疾病或病症相关的症状的改善；2)延迟与疾病或病症相关的症状的发作；3)与没有治疗相比延长的寿命；和4)与没有治疗相比更好的生活质量。例如，用于治疗NIDDM的加入聚乙二醇的VPAC2激动剂的“有效量”是与没有治疗相比，可获得对血糖浓度的更大控制的量，从而获得糖尿病并发症例如视网膜病、神经病或肾病发作的延迟。用于预防NIDDM的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的“有效量”是与没有治疗相比，可以延迟血糖水平升高的发作的量，所述升高的血糖水平需要用抗低血糖药 物如磺酰脲类、噻唑烷二酮类、胰岛素和/或氯苯呱哌嗪类(bisguanidines)治疗。 
施用给受试者的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的“有效量”也取决于疾病的类型和严重程度，以及受试者的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和药物耐受性。有效的使患者血糖正常化的选择性加入聚乙二醇的VPAC2肽受体激动剂的剂量取决于多种因素，其中包括但不限于，受试者的性别、重量和年龄，不能调节血糖的严重程度，施用途径和生物利用率，肽的药物动力学谱、效价和配方。 
本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的典型剂量范围从每日约1μg至每日约5000μg。优选地，剂量范围从每日约1μg至每日约2500μg，更优选的从每日约1μg至每日约1000μg。甚至更优选的，剂量范围从每日约5μg至每日约100μg。其它优选的剂量范围从每日约10μg至每日约50μg。最优选的，剂量是每日约20μg。 
“受试者”是哺乳动物，优选的人类，但也可以是动物例如陪伴动物(例如，狗、猫，等等)、农场动物(例如，牛、羊、猪、马，等等)和实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠，等等)。 
本发明的选择性加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂可以用固相肽合成技术的标准方法制备。肽合成仪是可以商业获得，例如Rainin-PTISymphony肽合成仪(Tucson，AZ)。固相合成的试剂是可商业获得的，例如从格莱科派普公司(Glycopep)(Chicago，IL)。固相肽合成仪可用于根据生产商说明书阻断干扰性基团，保护待反应的氨基酸、偶联、去偶联和将未反应氨基酸加帽。 
通常，在树脂上生长的肽链的α-N-保护氨基酸和N末端氨基酸是在室温、惰性溶剂偶联的，所述惰性溶剂例如在二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷，并有偶联剂(例如二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑)和碱(如二异丙基乙胺)的存在。α-N-保护基团是用试剂如三氟醋酸或哌啶从获得的肽树脂去掉的，并重复与下一个待添加到肽链上的需要的N-保护氨基酸的偶联反应。合适的胺保护基团是本领域普遍已知的，并描述 在例如Green和Wuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，JohnWiley和Sons，1991中。实例包括叔丁氧羰基(tBoc)和芴甲氧羰基(Fmoc)。 
选择性VPAC2受体肽激动剂还可以使用叔丁氧羰基-或芴甲氧羰基-α-氨基酸，在适当的侧链保护下用标准自动化固相合成规程合成。在完成合成后，可以通过α-氨基基团与下述反应完成N末端修饰，所述例如(i)活化酯(使用与上述相似的引入α-N-保护氨基酸的规程)；(ii)醛，在存在还原剂时(还原性氨基化步骤)；和(iii)胍基化试剂。然后，从固相支持物上切除肽，并同时用标准氟化氢方法或三氟醋酸(TFA)进行侧链去保护。然后，用在VYDAC C18柱上，使用0.1％TEA中的乙腈梯度的反相层析进一步纯化粗肽。为了去除乙腈，从含有0.1％TEA、乙腈和水的溶液中冻干肽。通过分析反相层析验证纯度。通过质谱验证肽的特性(Identity ofpeptides)。肽可以溶于中性pH的含水缓冲液中。 
本发明的肽激动剂还可以用本领域已知的重组方法，使用真核和原核细胞宿主制备。 
一旦制备和纯化了肽，便在Cys或Lys残基，在K(W)或K(CO(CH2)2SH)，或在羧基端氨基酸上共价的连接至少一个PEG分子进行修饰。本领域已经描述了多种方法生产共价缀合PEG的肽，并且本发明使用的特定方法并非意图进行限定(综述文章参见，Roberts，M.等人Advanced Drug Delivery Reviews，54：459-476，2002)。 
可使用的PEG分子的实例是甲氧基-PEG2-MAL-40K，分支的PEG马来酰亚胺(奈克塔公司(Nektar)，Huntsville，Alabama)。其它实例包括但不限于大的mPEG-SBA-20K(奈克塔公司(Nektar))，mPEG2-ALD-40K(奈克塔公司(Nektar))和甲氧基-PEG-MAL-30K(陶氏公司(Dow))。 
PEG的羧基端连接可以通过酶促偶联，使用重组VPAC2受体肽激动剂作为前体来连接，或者用本领域已知的替代方法例如描述在美国专利4,343,898或Intl.J.Pept.& Prot.Res.43：127-38(1994)中。 
制备本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的一个方法涉及 使用PEG-马来酰亚胺将PEG直接连接到肽的硫羟基上。可以通过添加或插入Cys或hC残基到肽的上述位置上或其中来实现硫羟官能团的引入。还可以在肽的侧链上引入硫羟官能团(例如，用含有硫羟基的酸如巯基丙酸酰化赖氨酸的ε-氨基基团)。本发明的加入聚乙二醇作用过程使用迈克尔加成(Michael addition)形成稳定的硫醚接头。反应是高度特异的并且在温和条件下在其它官能团存在时进行。PEG马来酰亚胺作为反应聚合物用于制备定义明确的、生物活性的PEG-蛋白质缀合物。优选的过程使用相对于PEG马来酰亚胺来说摩尔过量(优选1至10摩尔过量)的含有硫羟基的VPAC2受体肽激动剂来驱动反应完成。优选的在pH4.0和9.0之间室温实施反应10分钟至40小时。通过常规分离方法可方便的分离过量的未加入聚乙二醇的含有硫羟基的肽与加入聚乙二醇的产物。优选的用反相HPLC或大小排阻层析分离加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂。实施例8中提出了VPAC2受体肽激动剂的加入聚乙二醇作用需要的特定条件。可以用PEG马来酰亚胺或分支的PEG马来酰亚胺实施半胱氨酸加入聚乙二醇的作用。 
制备本发明的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的替代方法涉及使用PEG-琥珀酰亚胺衍生物来向赖氨酸残基加入聚乙二醇。为了实现位点特异性加入聚乙二醇作用，用Arg残基取代没有用于加入聚乙二醇的作用的Lys残基。 
加入聚乙二醇作用的另一个方法是通过Pictet-Spengler反应。将PEG分子掺入到VPAC2受体选择性肽上需要Trp残基及其游离胺。实现它的一种方法是在固相合成中，通过酰胺键在Lys侧链的胺上，位点特异性的引入Trp残基(参见实施例10)。 
本发明的多种优选的特征和实施方案仅通过参考下列附图以及实施例来描述，其中：附图1显示在葡萄糖注射前24小时用P505或P525处理的动物中对静脉内葡萄糖负荷(glucose challenge)的胰岛素反应的增强。载体处理的动物中的胰岛素反应显示作为参考。 
实施例1-通过固相t-Boc化学过程制备选择性VPAC2受体肽激动剂：
将约0.5-0.6克(0.38-0.45毫摩尔)Boc Ser(Bzl)-PAM树脂置于标准60mL反应容器中。在美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)ABI430A肽合成仪上运行双偶联。 
从米德维斯特生物技术公司(Midwest Biotech)(Fishers，IN)获得下列的侧链保护氨基酸(2毫摩尔柱体(cartridge)的Boc氨基酸)并用于合成： 
Arg-甲苯磺酰基(TOS)、Asp-δ-环己基酯(OcHx)、Glu-δ-环己基酯(OcHx)、His-苄氧基甲基(BOM)、Lys-2-氯苄氧基羰基(2Cl-Z)、Ser-O-二苄醚(OBzl)、Thr-O-二苄醚(OBzl)、Trp-甲酰基(CHO)和Tyr-2-溴苄氧基羰基(2Br-Z)。 
三氟乙酸(TFA)、二异丙基乙胺(DIEA)、DMF中的0.5M羟基苯并三唑(HOBt)和二氯甲烷中的0.5M二环己基碳二亚胺(DCC)是从PE-应用生物系统公司(Applied Biosystems)(Foster City，CA)购买的。二甲基甲酰胺(DMF-Burdick和Jackson)和二氯甲烷(DCM-Mallinkrodt)是从梅斯化学公司(Mays Chemical Co.)(Indianapolis，IN)购买的。 
使用都是用DCC形成的对称酐或HOBt酯实施标准双偶联。在合成完成后，去掉N端Boc基团，如果序列中存在Trp，用DMF中的20％哌啶处理肽基树脂从而对Trp侧链脱甲酰基化。为了酰化N端，在肽树脂上加入4倍过量的相应酸的对称酐。用在DCM中二异丙基碳二亚胺(DIC)活化制备对称酐。将反应进行4小时并通过茚三酮检测监控。用DCM洗涤后，将树脂转移到TEFLON反应容器并在真空中干燥。 
通过反应容器与HF(氢氟酸)装置(潘尼苏拉实验室(PenninsulaLaboratories))的接触进行切割。加入1mL间甲酚每克/树脂，并在预冷的容器中浓缩入10mL HF(购自AGA公司，Indianapolis，IN)。如果存在甲硫氨酸，则加入1mL DMS每克树脂。反应在冰浴中搅拌1小时。真空去掉HF。残渣悬浮在乙醚中。过滤固体并用乙醚洗涤。将每种肽抽提到含水乙酸中，并且冰冻干燥或者直接上样到反相柱上。 
在2.2×25cm VYDAC C18柱上和缓冲液A(水中含0.1％TFA)中进行纯化。在HPLC(沃特氏公司(Waters))上以10mL/分钟运行20％至90％B(乙腈中的0.1％TFA)的梯度120分钟以上，同时在280nm(4.0A)监控UV并且收集一分钟级分。合并适当的级分，冷冻并冻干。用HPLC(0.46×15cm METASIL AQ C18)和MALDI质谱分析干燥产物。 
实施例2-通过固相Fmoc化学过程制备选择性VPAC2受体肽激动剂：
在每个反应容器中加入约114mg(50毫摩尔)FMOC Ser(tBu)WANG树脂(购自格莱科派普公司(Glycopep)，Chicago，IL)。在Rainin Symphony肽合成仪上进行合成。用75mg(50微摩尔)Rink Amide AM树脂(来普普利莫公司(Rapp Polymere.)Tuebingen，德国)制备具有C末端酰胺的类似物。 
下列FMOC氨基酸购自格莱科派普公司(Glycopep)(Chicago，IL)和诺华生物化学公司(NovaBiochem)(La Jolla，CA)：Arg-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、Asn-三苯甲基(Trt)、Asp-β-t-丁酯(tBu)、Glu-δ-t-丁酯(tBu)、Gln-三苯甲基(Trt)、His-三苯甲基(Trt)、Lys-t-叔丁氧羰基(Boc)、Ser-叔丁基醚(OtBu)、Thr-叔丁基醚(OtBu)、Trp-叔丁氧羰基(Boc)、Tyr-叔丁基醚(OtBu)。 
溶剂二甲基甲酰胺(DMF-Burdick和Jackson)、N-甲基吡咯烷酮(NMP-Burdick和Jackson)、二氯甲烷(DCM-Mallinkrodt)购自梅斯化学公司(Mays Chemical Co.)(Indianapolis，IN)。 
羟基苯并三唑(HOBt)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、二异丙基乙胺(DIEA)和哌啶(Pip)购自阿尔德里克化学公司(Aldrich Chemical Co)(Milwaukee，WI)。 
所有的氨基酸都以0.3M溶解在DMF中。用20％Pip/DMF去保护20分钟后，进行三个小时DIC/HOBt活化偶联。在去保护和偶联后用DMF洗涤每个树脂。在最后的偶联和去保护后，用DMC洗涤肽基树脂并在真空的反应容器中干燥。为了N末端酰化作用，向肽树脂上加入4倍过量的相应酸的对称酐。通过在DCM中DIC活化制备对称酐。将反应进行4小 时并用茚三酮检测监控。然后用DCM洗涤肽树脂并在真空中干燥。 
切割反应与切割混合物混合2小时，所述切割混合物由每10mL TFA的0.2mL苯硫基甲烷、0.2mL甲醇和0.4mL三异丙基硅烷组成，以上均购自阿尔德里克化学公司(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)。如果序列中存在Cys，则加入2％乙二硫醇。向TFA滤出物加入40mL乙醚。沉淀剂在2000rpm离心2分钟。倾去上清。将沉淀重悬在40mL乙醚中，再离心，再倾出，在氮气中干燥，然后真空干燥。 
0.3-0.6mg的每种产物溶解在1ml 0.1％TFA/乙腈(ACN)中，其中取20μL用HPLC分析[0.46×15cm METASIL AQ C18，1mL/分钟，45℃，214nM(0.2A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。梯度＝50％B至90％B30分钟以上]。 
在2.2×25cm VYDAC C18柱上和缓冲液A(水中的0.1％TFA)中进行纯化。在HPLC(沃特氏公司(Waters))上以10mL/分钟运行20％至90％B(乙腈中的0.1％TFA)的梯度120分钟以上，同时在280nm(4.0A)监控UV，并且收集一分钟级分。合并适当的级分，冷冻并冻干。用HPLC(0.46×15cm METASIL AQ C18)和MALDI质谱分析干燥产品。 
P521 
(C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYAibQSIOrnOrnGGPSSGAPPPCC-NH2)的前体：用上述FMoc规程进行合成。通过分析HPLC：tR＝10.9分钟(HPLC条件如上述)，以及MALDI-TOF：计算的m/z＝4290.0，测量的m/z＝4290.8[M+H+]表征肽。用反相制备HPLC纯化后，合并并冻干纯级分：获得的最终冻干粉末为14.8mg。 
P525 
(C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYAibQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPCC-NH2)的前体：如对P521前体的描述。分析HPLC：tR＝11.0分钟。MALDI-TOF：计算的m/z＝4288.0，测量的m/z＝4288.8[M+H+]。获得的最终冻干粉末为18.7mg。 
P574 
(C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPCC-NH2)的前体：如对P521前体的描述。分析HPLC：tR＝11.7分钟。MALDI-TOF：计算的m/z＝4330.1，测量的m/z＝4330.7[M+H+]。获得的最终冻干粉末为46.2mg。 
实施例3-对人VPAC2受体的体外效价：
α筛选：细胞在培养瓶中用PBS洗涤一次。然后用无酶的解离缓冲液漂洗细胞。移除解离的细胞。然后将细胞离心下来，并在刺激缓冲液中洗涤。对每一个数据点，使用50,000个悬浮在刺激缓冲液中的细胞。对于该缓冲液，加入α筛选受体微珠连同刺激物。孵育该混合物60分钟。加入裂解缓冲液和α筛选供体微珠，并将其孵育60至120分钟。在合适的仪器(例如，皮尔金艾尔莫公司(Perkin-Elmer)的AlphaQuest)上读取α筛选信号(指示胞内cAMP水平)。包括α筛选供体和受体微珠的步骤在弱光下实施。从原始信号或基于绝对cAMP水平计算cAMP生成的EC50，所述绝对cAMP水平用在每块平板上实施的标准曲线确定。 
每种激动剂的结果都至少来自单次运行中进行的两次分析。对于一些激动剂，结果是一次以上运行的平均值。检测的肽浓度是：10000、1000、100、10、3、1、0.1、0.01、0.003、0.001、0.0001和0.00001nM。 
DiscoveRx：在测定的前一天，将稳定表达人VPAC2受体的CHO-S细胞系按50,000细胞/孔接种在96孔微量滴定板上。允许细胞在200μL培养基中贴壁24小时。在实验当天，去掉培养基。并且洗涤细胞两次。细胞在测定缓冲液加IBMX中室温孵育15分钟。然后，加入刺激物并溶解在测定缓冲液中。刺激物存在30分钟。然后，温和的去掉测定缓冲液。加入DiscoveRx cAMP试剂盒的细胞裂解试剂。然后，使用生产商描述的用于显现cAMP信号的标准规程(迪斯卡Rx有限公司(DiscoveRx Inc.)，美国)。从原始信号或基于绝对cAMP水平计算cAMP生成的EC50值，所述绝对cAMP水平用在每块平板上实施的标准曲线确定。 
每种激动剂的结果都是两次独立运行的平均值。肽的一般检测浓度是：1000、300、100、10、1、0.3、0.1、0.01、0.001、0.0001和0nM。 
表1报道了不同测定模式的人VPAC2受体的活性(EC50(nM))。 
表1.人VPAC2受体的肽效价 
  激动剂#   人VPAC2受体：  α筛选  (EC50；nM)   人VPAC2受体：  DiscoveRx  (EC50；nM)
  VIP   1.0   0.7
  PACAP-27   2.3   0.8
  P410   128.8  
  P417   14.7  
  P451   68.6  
  P454   59.9  
  P460   430.2  
  P470   83.3  
  P472   123.3  
  P473   26.5  
  P475   109.3  
  P478   49.9  
  P483   33.5  
  P485   44.5  
  P490   115.6  
  P492   509.6  
  P495   116.7  
  P497   176.1  
  P499   57.7  
  P501   130.9  
  P503   146.8  
  P505   40.5  
  P507   27.1  
  P509   13.0  
  P511   7.6  
  P513   28.9  
  P517   7.5  
  P519   30.3  
  P521   22.1  
  P523   5.8  
  P525   25.0  
  P529   170.5  
  P531   94.6  
  P533   2382.0  
  P535   98.4  
  P537   32.0  
  P541   45.8  
  P545   45.0  
  P547   62.0  
  P539   10.7   47.3
  P543   84.2   8.9
  P551   15.6  
  P553   15.0  
  P555   22.5   8.1
  P557     108.3
  P560   13.8   11.3
  P562   30.2   24.2
  P566   11.8   7.8
  P568   128.6  
  P570   13.4   4.5
  P572   11.2  
  P574   21.2   36.1
  P576   55.0  
  P578   205.3  
  P580   10.9  
  P582   20.3  
  P584   51.2  
  P586   122.4  
  P588   54.0  
  P590   4.1  
  P602   42.1   7.2
实施例4-选择性：
结合测定：使用从稳定的VPAC2细胞系(参见实施例3)或从瞬时转染人VPAC1或PAC1的细胞制备的膜。用125I-标记的VIP作为VPAC1和VPAC2，以及125I-标记的PACAP-27作为PAC1的示踪物，实施滤膜结合试验。 
用于该测定的溶液和仪器包括： 
预浸液：蒸馏水中的0.5％聚乙烯胺 
用于冲洗滤板的缓冲液：25mM HEPES pH 7.4 
封闭缓冲液：25mM HEPES pH 7.4；0.2％无蛋白酶BSA 
测定缓冲液：25mM HEPES pH 7.4；0.5％无蛋白酶BSA 
稀释和测定平板：PS-Microplate，U型 
滤板：Multiscreen FB Opaque板；1.0μM B型Glasfiber滤膜 
为了制备滤板，用真空过滤吸去预浸液。平板用200μL冲洗缓冲液冲洗两次。加入200μL封闭缓冲液到滤板上。然后将滤板与200μL预浸液在室温孵育1小时。 
在测定平板中装入25μL测定缓冲液，25μL(2.5μg)悬浮在测定缓冲液中的膜，25μL在测定缓冲液中的激动剂，和25μL在测定缓冲液中的示踪物(约40000cpm)。装好的平板振荡孵育1小时。 
进行从测定平板到滤板的转移。真空过滤吸去封闭缓冲液，并用冲洗缓冲液洗涤两次。从测定平板转移90μL到滤板。吸去从测定平板转移的90μL，并用200μL冲洗缓冲液洗涤三次。去掉塑料支持物。在60℃干燥1小时。加入30μL Microscint。计数。 
表2中报道了人VPAC2、VPAC1和PAC1的受体结合(IC50)。 
表2 
  激动剂#   人VPAC2受体结  合(IC50；nM)  人VPAC1受体结合 (IC50；nM)   人PAC1受体结合  (IC50；nM)
  VIP   5.1  3.3   ＞1000
  PACAP-27   2.6  4.5   10.2
  P410   264.4  ＞25000  
  P417   24.1  ＞25000  
  P451   595.7    
  P454   36.6  ＞25000  
  P460   914.5  ＞25000  
  P470   262.9    
  P473   256.4  ＞25000  
  P475   436.0    
  P478   30.0    
  P483   37.3   ＞25000  
  P485   17.3    
  P490   13.2    
  P492   156.0    
  P495   142.1    
  P497   146.0    
  P499   34.0   ＞25000  
  P501   111.0    
  P503   41.5    
  P505   26.1   ＞25000   ＞25000
  P509   11.2   ＞25000  
  P511   7.2   ＞25000   ＞25000
  P513   50.5    
  P517   3.7   ＞25000  
  P519   51.6    
  P521   67.1    
  P523   4.8    
  P525   41.8   ＞25000   ＞25000
  P529   192.4    
  P531   69.7    
  P533   959.0    
  P535   145.4   ＞25000  
  P537   17.2   ＞25000   ＞25000
  P539   13.5    
  P541   59.8   ＞25000  
  P543   56.3    
  P545   79.9   ＞25000   ＞25000
  P547   5.6    
  P551   16.6   ＞25000   ＞25000
  P553   21.7   ＞25000   ＞25000
  P555   15.4   ＞25000   ＞25000
  P557   380.0    
  P560   11.6    
  P562   42.8   ＞25000   ＞25000
  P566   8.2    
  P570   4.1   ＞25000   ＞25000
  P572   14.9   ＞25000   ＞25000
  P574   32.3   ＞25000   ＞25000
  P580   20.7   ＞25000   ＞25000
  P582   48.3   ＞25000   ＞25000
  P590   7.4   ＞25000   ＞25000
  P602   28.0   ＞25000   ＞25000
实施例5-大鼠VPAC1和VPAC2受体的体外效价：
DiscoveRx：CHO-PO细胞用可商业获得的转染试剂(英杰生命技术公司(Invitrogen)的Lipofectamine)瞬时转染大鼠VPAC1或VPAC2受体DNA。细胞按10,000/孔的密度接种在96孔平板中，并允许其在200mL培养基中生长3天。在第3天，实施检测。 
在实验当天，去掉培养基。并且洗涤细胞两次。细胞在测定缓冲液加IBMX中室温孵育15分钟。然后，加入刺激物并将其溶解在测定缓冲液中。刺激物存在30分钟。然后，温和的去掉测定缓冲液。加入DiscoveRx cAMP试剂盒的细胞裂解试剂。然后，使用生产商描述的用于显现cAMP信号的标准规程(迪斯卡Rx公司(DiscoveRx Inc.)，美国)。从原始信号或基于绝对cAMP水平计算cAMP生成的EC50值，所述绝对cAMP水平用在每块平板上实施的标准曲线确定。 
每种激动剂的结果都是两次独立运行的平均值。大鼠VPAC1和VPAC2的结果只用DiscoveRx测定产生。肽的一般检测浓度是：1000、300、100、10、1、0.3、0.1、0.01、0.001、0.0001和0nM。 
表3报道了大鼠VPAC2和VPAC1受体的活性(EC50(nM))。 
表3. 
  激动剂  #  大鼠 VPAC1受 体： DiscoveRx： (EC50；nM)  大鼠 VPAC2受 体： DiscoveRx： (EC50；nM)
  VIP  0.01  0.6
  P410  ＞1000  318.5
  P417   232.3   8.7
  P454   1229.5   79.6
  P460   ＞1000   1163.1
  P470   ＞1000   110.9
  P472   ＞1000   284.6
  P473   ＞1000   25.5
  P475   ＞1000   220.4
  P478   2053.8   120.1
  P483   223.9   128.4
  P485   734.9   42.5
  P490   ＞1000   191.8
  P492   ＞4000   962.7
  P497   ＞1000   344.7
  P499   803.8   68.2
  P501   ＞1000   272.1
  P503   ＞4000   520.3
  P505   639.4   42.6
  P507   ＞1000   94.9
  P509   328.4   28.2
  P511   61.9   13.9
  P517   92.4   10.0
  P521   602.4   33.1
  P523   20.4   5.3
  P525   1137.3   44.0
  P529   1182.9   199.3
  P531   300.7   69.9
  P535   ＞1000   317.6
  P537   205.8   38.8
  P539   32.6   21.0
  P541   665.1   101.9
  P543   355.0   101.1
  P545   380.5   99.5
  P547   76.2   149.8
  P551   171.9   13.2
  P553   261.8   22.0
  P555   68.9   32.5
  P557   581.1   397.2
  P560   155.6   20.4
  P562   393.4   52.5
  P566   52.7   13.1
  P568   ＞1000   250.3
  P570   86.7   21.3
  P572   94.5   10.8
  P574   162.9   33.8
  P576   460.9   67.4
  P578   269.4   305.6
  P580   1.1   11.9
  P582   137.4   31.0
  P584   188.1   67.2
  P586   501.6   186.8
  P588   406.3   311.2
  P590   245.0   6.9
  P602   209.0   36.9
实施例6-体内测定：
静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)：普通Wistar大鼠禁食过夜，并在实验前麻醉。将血液取样导管插入大鼠。一般在葡萄糖负荷前24h皮下给予激动剂。从颈动脉中取血样。在给予激动剂和葡萄糖注射之前立即取血样。在初始血样后，静脉内(i.v.)注射混合的葡萄糖。给予0.5g/kg体重的葡萄糖负荷，每kg体重注射总量1.5mL有葡萄糖和激动剂的载体。变动肽浓度按μg/kg产生需要的剂量。在给予葡萄糖后的2、4、6和10分钟取血样。动物对照组接受只有葡萄糖但没有加入激动剂的相同载体。在一些实例中，取20和30分钟的葡萄糖后血样。在血样中加入抑酶肽(250-500kIU/ml血)。然后用标准方法分析血浆的葡萄糖和胰岛素。 
使用使用储存在PBS中的配制和校准的肽。一般，该储液是预稀释的100μM储液。但是，使用的是具有每mL约1mg激动剂的更浓缩的储液。特定浓度一般是已知的。最大反应中的变异性最主要是由于载体剂量的变异性。规程细节如下： 
  物种/品系/体重   大鼠/Wistar Unilever/约275-300g
  治疗时程   单剂量
  给药体积/途径   1.5mL/kg/静脉内(iv)
  载体   水中的8％PEG300、0.1％BSA
  食物/水方案   大鼠在手术前禁食过夜。
  生活状态参数   在测试结束时处死动物。
  IVGTT：在每组  大鼠上实施(具有  两根导管，颈静脉和  颈动脉)，戊巴比妥  麻醉。   葡萄糖静脉内推注：在时间＝0时作为  10％溶液(5mL/kg)的500mg/kg。  化合物静脉内(iv)：在葡萄糖血液取样  前0-240分钟(从颈动脉取300μL；EDTA作  为抗凝剂；抑酶肽和PMSF作为抗蛋白水解  物；置于冰上)：0、2、4、6和10、20和30  分钟。  确定的参数：胰岛素+葡萄糖
  毒物动力学   在胰岛素测量后剩余的血浆样品保存在  -20℃并确定化合物水平。
表4a 
 激动剂#  葡萄糖&化 合物间的 时间  ％增加 AUC：剂量 ＝0.09 mg/kg   ％增加  AUC：剂量  ＝0.1mg/kg   ％增加AUC：剂  量＝0.3mg/kg
 P505  24h     12   74
 P511  24h     38   59
 P525  24h     72   208
 P570  24h     36  
 P602  24h  73     198
AUC＝曲线下面积(胰岛素，葡萄糖后0-10分钟) 
加入聚乙二醇的肽的药物动力学谱：将健康的Fisher 344大鼠(每组 3只动物)注射100μg激动剂/kg(激动剂量基于肽含量并溶于PBS缓冲液)。在给药后3、12、24、48、72、96和168小时取血样，用直接针对肽的N末端的放射免疫测定(RIA)分析血浆中的肽含量。然后用模型非依赖性方法计算PK参数(WinNonlin Pro，法赛特公司(Pharsight Corp.)，Mountain View，CA，USA)。 
表4b.加入聚乙二醇的肽激动剂的PK参数。N＝3的平均值和(SD)值。 
*NC＝由于数据不充分未计算 
实施例7-大鼠血清的稳定性研究：
为了确定VPAC2受体肽激动剂在大鼠血清中的稳定性，获得了 CHO-VPAC2细胞克隆#6(96孔平板/50,000细胞/孔，培养1天)、PBS1×(Gibco)、在100μM储液中的用于分析的肽，处死的普通Wistar大鼠的大鼠血清、抑酶肽和DiscoveRx测定试剂盒。在使用前将大鼠血清储存在4℃并在两周内使用。 
在第0天，制备两份100μL等分试样的大鼠血清中的10μM肽，通过对于每个等分试样在90μL大鼠血清中加入10μL肽储液。在这些等分试样之一中加入250kIU抑酶肽/mL。有抑酶肽时等分试样储存在4℃。没有抑肽酶时等分试样储存在37℃。将等分试样孵育24或72小时。 
在第1天，将第0天制备的等分试样孵育24或72小时后，制备含有PBS+1.3mM CaCl2、1.2mM MgCl2、2mM葡萄糖和0.25mM IBMX的孵育缓冲液。对于每种研究的肽，制备装有11个连续5×稀释的肽(对于4℃和37℃等分试样)。如果初步筛选(参见实施例3)中肽的EC50大于1nM，使用2000nM作为最大浓度，如果肽的EC50低于1nM，使用1000nM作为最大浓度。带有细胞的平板用孵育缓冲液洗涤两次。允许平板每孔维持50μL孵育培养基15分钟。从平板向细胞转移每孔50μL溶液，使用初步筛选提示的最大浓度，一式两份，所述平板是制备的，其对每种所研究肽的4℃和37℃等分试样，具有11个连续5×稀释的肽。该步骤将肽浓度稀释了一倍。细胞在室温孵育30分钟。去掉上清。加入40μL/孔的DiscoveRx抗体/抽提缓冲液。细胞在振荡器(300rpm)上孵育1小时。然后进行DiscoveRx试剂盒的普通程序。在柱12中包括cAMP标准物。从cAMP测定数据确定EC50值。通过公式EC50，4℃/EC50，37℃估计每种条件的活性肽的剩余量。 
表537℃大鼠血清中24h或72h后估计的肽稳定性 
  激动剂  #   24小时稳  定性(stab)  (％)   72小时稳定  性(％)
  VIP   0.2  
  P417   265  
  P472   66  
  P473   86  
  P475   61  
  P478   34  
  P483   22  
  P485   65  
  P492   131  
  P503   174  
  P505   133   161
  P521     294
  P523     281
  P525   298   353
  P529     119
  P543   119  
  P539   123  
  P555   117  
  P557   131  
  P560   192  
  P562   213  
  P566   152  
  P574   288  
  P602   573  
1值＞100％可代表从PEG缀合物释放完整的肽 
实施例8-使用硫羟基化学过程的选择性VPAC2受体肽激动剂的加入聚乙二醇作用：
一般在允许硫醚键形成的条件下进行加入聚乙二醇的反应。特别的，溶液的pH范围在约4至9之间，含有硫羟基的肽的浓度范围在PEG马来酰亚胺浓度的0.7至10摩尔过量之间。一般在室温下进行加入聚乙二醇的作用。然后用反相HPLC或大小排阻层析(SEC)分离加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂。用分析RP-HPLC、HPLC-SEC、SDS-PAGE和/或MALDI质谱描述加入聚乙二醇的肽激动剂的特征。 
一般通过在一端或两端添加半胱氨酸或高半胱氨酸或含有硫羟基的部分，或者通过在序列中插入半胱氨酸或高半胱氨酸或含有硫羟基的部分来 将硫羟基官能团引入到选择性VPAC2受体肽激动剂中或其上。含有硫羟基的VPAC2受体肽激动剂通过硫醚键与40kDa、30kDa或20kDa的PEG马来酰亚胺反应生产与PEG通过硫醚键共价连接的衍生物。 
P505的合成 
将19mg肽前体(未加入聚乙二醇的P505)和162mg平均分子量为20,000道尔顿的甲氧基-PEG-马来酰亚胺(NOF，日本)溶解在2mL含有10mM EDTA(pH6.8)的100mM NH4Ac缓冲液中，使反应进行4小时。在制备RP-HPLC纯化后，获得97mg冻干粉末产品。用RP-HPLC和大小排阻HPLC描述加入聚乙二醇的肽激动剂的特征，并检测其体外活性。 
P525的合成 
18.7mg肽前体(未加入聚乙二醇的P525)和157mg平均分子量为20,000道尔顿的甲氧基-PEG-马来酰亚胺溶解在2mL含有10mM EDTA(pH6.8)的100mM NH4Ac缓冲液中，使反应进行4小时。在制备RP-HPLC纯化后，获得114mg冻干粉末产品。用RP-HPLC和大小排阻HPLC描述加入聚乙二醇的肽激动剂的特征，并检测其体外活性。 
P572的合成 
22.3mg肽前体(未加入聚乙二醇的P572)和177mg平均分子量为20,000道尔顿的甲氧基-PEG-马来酰亚胺溶解在2mL含有10mM EDTA(pH6.8)的100mM NH4Ac缓冲液中，使反应进行4小时。在制备RP-HPLC纯化后，获得137mg冻干粉末产品。用RP-HPLC和大小排阻HPLC描述加入聚乙二醇的受体肽激动剂的特征，并检测其体外活性。 
P574的合成 
31.9mg肽前体(未加入聚乙二醇的P574)和283mg平均分子量为20,000道尔顿的甲氧基-PEG-马来酰亚胺溶解在3mL含有10mM EDTA(pH6.8)的100mM NH4Ac缓冲液中，使反应进行4小时。在两次运行制备RP-HPLC纯化后，获得171mg冻干粉末产品。用RP-HPLC和大小排阻HPLC描述加入聚乙二醇的肽激动剂的特征，并检测其体外活性。 
P602的合成 
20mg肽前体(未加入聚乙二醇的P602)和223mg平均分子量为30,000道尔顿的甲氧基-聚(乙二醇)马来酰亚胺-丙酰胺(凯罗技术公司(ChirotechTechnology Ltd.)，英国)溶解在2mL含有10mM EDTA(pH6.8)的100mMNH4Ac缓冲液中，使反应进行4小时。在制备RP-HPLC纯化后，获得132mg冻干粉末产品。用RP-HPLC和大小排阻HPLC描述加入聚乙二醇的肽激动剂的特征，并检测其体外活性。 
实施例9-通过酰化赖氨酸侧链的加入聚乙二醇作用
为了实现选择性VPAC2受体肽激动剂的位点特异性加入聚乙二醇作用，将除了计划加入聚乙二醇的赖氨酸残基以外的所有Lys残基都转变成Arg残基。PEG分子可使用mPEG-SBA-20K(奈克塔公司(Nektar)，批号：PT-04E-11)。优选的在室温下进行加入聚乙二醇反应2-3小时。用制备HPLC纯化肽。 
实施例10-通过Pictet-Spengler反应的加入聚乙二醇作用
为了进行通过Pictet-Spengler反应的加入聚乙二醇作用，需要具有其游离胺的Trp残基将PEG分子掺入到选择性VPAC2受体肽激动剂上。将Trp残基偶联到Lys残基的侧链上。深入的SAR表示该修饰没有改变亲本肽在其体外效价和选择性上的性质。 
反应使用具有功能性醛的PEG，例如mPEG2-BUTYRALD-40K(奈克塔公司(Nektar)，USA)。位点特异性的加入聚乙二醇的作用涉及在PEG和肽之间形成四咔啉环。加入聚乙二醇的作用在冰醋酸中室温进行1至48小时。反应使用1至10摩尔过量的PEG乙醛。在去掉醋酸后，通过制备RP-HPLC分离加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂。 
P535的合成 
27.7mg肽前体(未加入聚乙二醇的P535)和590mgmPEG2-BUTYRALD-40K溶解在3mL乙酸中，使反应进行2天。产物用制备RP-HPLC分离，产生94mg的加入聚乙二醇的肽激动剂冻干粉末。用RP-HPLC和大小排阻HPLC描述加入聚乙二醇的肽激动剂的特征，并检测其体外活性。 
P557的合成 
23mg肽前体(未加入聚乙二醇的P557)和460mgmPEG2-BUTYRALD-40K溶解在3mL乙酸中，使反应进行2天。产物用制备RP-HPLC分离，产生50mg的加入聚乙二醇的肽激动剂冻干粉末。用RP-HPLC和大小排阻HPLC描述加入聚乙二醇的肽激动剂的特征，并检测其体外活性。 
本发明的其它改变对本领域技术人员是显而易见的，且不脱离本发明的范围。 

Claims (15)

1.加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其含有选自以下的序列：
SEQ ID NO：17
HSDAVFTEQY(OMe)TRAibRAibQLAAAibOrnY(OMe)LQSIKAibOrn；
SEQ ID NO：18
HSDAVFTEK(CO(CH2)2SH)Y(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：19
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnK(W)Orn；
SEQ ID NO：20
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(CO(CH2)2SH)YLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：21
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAK(CO(CH2)2SH)OrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：22
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVCAAibOrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：23
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRCQVAAAibOrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：24
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：25
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYAibQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：26
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：27
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：28
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：29
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYAibQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：30
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYAibQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：31
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：32
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYAibQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：33
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYAibQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：34
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(W)QVAAAibOrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：35
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLK(W)SIOrnOrn；
SEQ ID NO：36
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(W)AAAibOrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：37
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(CO(CH2)2SH)QVAAAibOrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：38
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(W)YLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：39
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibCYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：40
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：41
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSK(W)OrnOrn；
SEQ ID NO：42
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnCOrn；
SEQ ID NO：43
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibCOrnOrn；
SEQ ID NO：44
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：45
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRCQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：94
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVK(CO(CH2)2SH)AAibOrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：95
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnCOrn；
SEQ ID NO：96
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSCOrnOrn；
SEQ ID NO：97
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnK(CO(CH2)2SH)Orn；
SEQ ID NO：98
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnK(CO(CH2)2SH)Orn；
SEQ ID NO：99
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(W)QLAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：100
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQSIOrnOrnC；
SEQ ID NO：101
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnOrnC；
SEQ ID NO：102
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnOrnC；
SEQ ID NO：103
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：104
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnCOrn；
SEQ ID NO：105
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnOrn；
SEQ ID NO：106
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrnC；
SEQ ID NO：107
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：108
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrnY(OMe)LQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：109
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQSIOrnCOrn；
SEQ ID NO：110
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAbuAAibOrnYLQSIOrnOrn；
SEQ ID NO：111
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(CO(CH2)2SH)AAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn；和
SEQ ID NO：112
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(W)AAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn；
以及C末端延伸，其中C末端延伸的N端连接在肽序列的C端，并且其中C末端延伸选自：
  SEQ ID NO：5   GGPSSGAPPPS   SEQ ID NO：6   GGPSSGAPPPS-NH2   SEQ ID NO：7   GGPSSGAPPPC   SEQ ID NO：8   GGPSSGAPPPC-NH2   SEQ ID NO：9   GRPSSGAPPPS   SEQ ID NO：10   GRPSSGAPPPS-NH2   SEQ ID NO：11   GGPSSGAPPPCC   SEQ ID NO：12   GGPSSGAPPPCC-NH2
并且其中：
肽激动剂包含至少一个Cys残基，其共价的连接PEG分子，或者
肽激动剂包含至少一个Lys残基，其共价的连接PEG分子，或者
肽激动剂包含至少一个K(W)，其共价的连接PEG分子，或者
肽激动剂包含至少一个K(CO(CH2)2SH)，其共价的连接PEG分子，或者
肽激动剂的羧基端氨基酸共价的连接PEG分子，或者
它们的组合。
2.根据权利要求1的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其中C末端延伸是SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。
3.根据权利要求1的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其中至少有一个PEG分子与C末端延伸中的残基共价的连接。
4.根据前述权利要求中任一项的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其中PEG分子是分支的。
5.根据权利要求1至3中任一项的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其中PEG分子是线性的。
6.根据权利要求1-3任一项的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其中每一个PEG分子的分子量是20,000、30,000、40,000或60,000道尔顿。
7.根据权利要求1-3任一项的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其在肽激动剂的N端还含有N末端修饰，其中N末端修饰选自：
(a)添加D-组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或正亮氨酸；
(b)添加肽，其含有序列Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg(SEQ ID NO：93)，其中Arg与肽激动剂的N端相连；
(c)添加C1-C16烷基，其用一个或多个独立的选自芳基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的取代基任选的取代；
(d)添加-C(O)R1，其中R1是用独立的选自芳基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素、-SH和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的C1-C16烷基；用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基；用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基C1-C4烷基；-NR2R3，其中R2和R3独立的是氢、C1-C6烷基、芳基或芳基C1-C4烷基；-OR4，其中R4是用独立的选自芳基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的C1-C16烷基，用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基，或者用独立的选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、-NH2、-OH、卤素和-CF3的一个或多个取代基任选的取代的芳基C1-C4烷基；或者5-吡咯烷-2-酮；
(e)添加-SO2R5，其中R5是芳基、芳基C1-C4烷基或C1-C16烷基；
(f)形成用C1-C6烷基或-SR6任选的取代的琥珀酰亚胺基团，其中R6是氢或C1-C6烷基；
(g)添加甲硫氨酸亚砜；
(h)添加生物素基-6-氨基己酸；和
(i)添加-C(＝NH)-NH2。
8.根据权利要求7的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其中N末端修饰是添加选自以下的基团：乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、3-苯基丙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、正亮氨酸、D-组氨酸、异亮氨酸、3-巯丙酰、生物素基-6-氨基己酸和-C(＝NH)-NH2。
9.根据权利要求8的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其中N末端修饰是添加乙酰基或己酰基。
10.根据权利要求1的加入聚乙二醇的VPAC2肽受体激动剂，其含有选自以下的氨基酸序列：
Figure FSB00000557141900081
Figure FSB00000557141900091
Figure FSB00000557141900101
Figure FSB00000557141900121
Figure FSB00000557141900131
Figure FSB00000557141900141
Figure FSB00000557141900151
Figure FSB00000557141900161
11.加入聚乙二醇的VPAC2肽受体激动剂，其含有选自以下的氨基酸序列：
Figure FSB00000557141900171
Figure FSB00000557141900181
12.加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其含有下式的序列：Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Thr-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Aib-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Abu-Aib-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40
式4(SEQ ID NO：4)
其中：
Xaa1是：His、dH或不存在
Xaa2是：dA、Ser、Val、Gly、Thr、Leu、dS、Pro或Aib；
Xaa3是：Asp或Glu；
Xaa4是：Ala、Ile、Tyr、Phe、Val、Thr、Leu、Trp、Gly、dA、Aib或NMeA；
Xaa5是：Val、Leu、Phe、Ile、Thr、Trp、Tyr、dV、Aib或NMeV；
Xaa6是：Phe、Ile、Leu、Thr、Val、Trp或Tyr；
Xaa8是：Asp、Glu、Ala、Lys、Leu、Arg或Tyr；
Xaa9是：Asn、Gln、Asp、Glu、Ser、Cys、Lys或K(CO(CH2)2SH)；
Xaa10是：Tyr、Trp、Tyr(OMe)、Ser、Cys或Lys；
Xaa12是：Arg、Lys、Glu、hR、Orn、Lys(异丙基)、Aib、Cit、Ala、Leu、Gln、Phe、Ser或Cys；
Xaa13是：Leu、Phe、Glu、Ala、Aib、Ser、Cys、Lys或K(CO(CH2)2SH)；
Xaa14是：Arg、Leu、Lys、Ala、hR、Orn、Lys(异丙基)、Phe、Gln、Aib、Cit、Ser或Cys；
Xaa16是：Gln、Lys、Glu、Ala、hR、Orn、Lys(异丙基)、Cit、Ser、Cys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)；
Xaa17是：Val、Ala、Leu、Ile、Met、Nle、Lys、Aib、Ser、Cys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)；
Xaa18是：Ala、Ser、Cys、Lys、K(CO(CH2)2SH)、K(W)、Abu或Nle；
Xaa21是：Lys、His、Arg、Ala、Phe、Aib、Leu、Gln、Orn、hR、K(Ac)、Cit、Ser、Cys、Val、Tyr、Ile、Thr、Trp、K(W)或K(CO(CH2)2SH)；
Xaa22是：Tyr、Trp、Phe、Thr、Leu、Ile、Val、Tyr(OMe)、Ala、Aib、Ser、Cys、Lys、K(W)或K(CO(CH2)2SH)；
Xaa23是：Leu、Phe、Ile、Ala、Trp、Thr、Val、Aib、Ser、Cys、Lys、K(W)或K(CO(CH2)2SH)；
Xaa24是：Gln、Glu、Asn、Ser、Cys、Lys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)；
Xaa25是：Ser、Asp、Phe、Ile、Leu、Thr、Val、Trp、Gln、Asn、Tyr、Aib、Glu、Cys、Lys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)；
Xaa26是：Ile、Leu、Thr、Val、Trp、Tyr、Phe、Aib、Ser、Cys、Lys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)；
Xaa27是：Lys、hR、Arg、Gln、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Met、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Lys(异丙基)、Cys、Leu、Orn、dK、K(W)或K(CO(CH2)2SH)；
Xaa28是：Asn、Asp、Gln、Lys、Arg、Aib、Orn、hR、Cit、Pro、dK、Ser、Cys、K(CO(CH2)2SH)或K(W)；
Xaa29是：Lys、Ser、Arg、Asn、hR、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Thr、Val、Trp、Tyr、Cys、Orn、Cit、Aib、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在；
Xaa30是：Arg、Lys、Ile、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Cys、hR、Cit、Aib、Orn、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在；
Xaa31是：Tyr、His、Phe、Thr、Cys、Ser、Lys、Gln、K(W)、K(CO(CH2)2SH)或不存在；
Xaa32是：Ser、Cys、Lys或不存在；
Xaa33是：Trp或不存在；
Xaa34是：Cys或不存在；
Xaa35是：Glu或不存在；
Xaa36是：Pro或不存在；
Xaa37是：Gly或不存在；
Xaa38是：Trp或不存在；
Xaa39是：Cys或不存在；和
Xaa40是：Arg或不存在
其中，如果Xaa29、Xaa30、Xaa31、Xaa32、Xaa33、Xaa34、Xaa35、Xaa36、Xaa37、Xaa38或Xaa39不存在，下游出现的下一个氨基酸就是肽激动剂序列中的下一个氨基酸，
以及C末端延伸，其中C末端延伸的N端与式4的肽的C端相连，且其中C末端延伸选自：
  SEQ ID NO：5   GGPSSGAPPPS   SEQ ID NO：6   GGPSSGAPPPS-NH2   SEQ ID NO：7   GGPSSGAPPPC   SEQ ID NO：8   GGPSSGAPPPC-NH2   SEQ ID NO：9   GRPSSGAPPPS   SEQ ID NO：10   GRPSSGAPPPS-NH2   SEQ ID NO：11   GGPSSGAPPPCC   SEQ ID NO：12   GGPSSGAPPPCC-NH2
并且其中：
肽激动剂包含至少一个Cys残基，其共价的连接PEG分子，或者
肽激动剂包含至少一个Lys残基，其共价的连接PEG分子，或者
肽激动剂包含至少一个K(W)，其共价的连接PEG分子，或者
肽激动剂包含至少一个K(CO(CH2)2SH)，其共价的连接PEG分子，或者
肽激动剂的羧基端氨基酸共价的连接PEG分子，或者
它们的组合。
13.含有根据权利要求1至12中任一项的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂以及一种或多种可药用的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。
14.根据权利要求1-3、11、12中任一项的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂，其用作药物。
15.根据权利要求1至12中任一项的加入聚乙二醇的VPAC2受体肽激动剂的用途，其用于制备治疗非胰岛素依赖型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病的药物。
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