CN101270358A - 一种miRNA序列及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肝和肝癌细胞相关的miRNA序列、其前体序列和反义寡核苷酸序列，以及其在制备治疗肝癌疾病药物中的用途。

Description

一种miRNA序列及其用途

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，涉及人源miRNA、miRNA前体、miRNA反义寡核苷酸序列及其表达载体，以及在制备治疗肝癌疾病药物中的用途。

背景技术

miRNA(microRNA，微RNA)是一类具有19～25nt的RNA分子，是由其前体分子在酶的作用下加工生成，其前体序列一般为70～120nt，广泛存在于生物体中。由于miRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等，越来越多的证据表明miRNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现miRNA与细胞的癌变有着极为密切的关系，起肿瘤抑制基因作用的miRNA下降或者缺失会导致肿瘤的发生，已经发现miRNA与肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、结直肠肿瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关。分析结果显示约一半已发现的miRNA定位于染色体肿瘤基因相关区域及染色体的脆性位点。这些研究结果都表明miRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用。肿瘤相关miRNA的发现可能会对肿瘤的基因治疗产生重大的影响。通过对肿瘤和正常组织的大范围的miRNA差异表达分析，可以鉴定肿瘤相关的miRNA。通过引入与具有癌基因特性的miRNA互补的反义寡核苷酸可以有效地抑制miRNA作用的发挥，抑制肿瘤的生长。通过对反义寡核苷酸的修饰，可以获得更加持续稳定的抑制效果，比其它的治疗手段的毒副作用会更低。相反，通过病毒载体或质粒载体过表达具有肿瘤抑制基因作用的miRNA或miRNA前体，进而抑制其调控的特定靶基因的表达，也可以达到抑制肿瘤生长的作用。因此，发现肿瘤特异的表达的miRNA对基于miRNA的肿瘤诊断和治疗具有十分重要的意义。

发明内容

肝癌是是严重危害人类健康的重大疾病，针对肝癌的诊断和治疗的生物分子的发现具有重要的应用价值。本发明的目的是提供一种miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸序列，及其表达载体，该发明所涉及的miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸，及其表达载体在制备治疗肝癌疾病药物中的用途。

本发明以人肝癌和癌旁组织为材料进行miRNA分子的克隆分析。采用分子生物学常规技术，从人肝癌和癌旁组织分离获得小分子RNA，将小分子RNA混合，经过3′末端加Poly(A)尾，5′端加RNA接头，反转录，PCR扩增，克隆测序，获得基因片段的核酸序列。经过测序及生物信息学分析，我们得到了其中一条约22t的RNA分子。经Blast比对，RNA二级结构分析，Northern blot杂交得到证实其为miRNA分子，命名为miR-m30。miRNA是由miRNA前体RNA分子在细胞内通过酶加工后形成的成熟体，经过基因序列的同源分析，获得miR-m30相应的前体RNA序列。此外，针对该miRNA序列设计合成了其2′-O-甲基化修饰的反义寡核苷酸序列，以及该miRNA前体的质粒表达载体，并对其对肝癌细胞生长的影响进行了分析。

本发明所提供的miRNA克隆自人肝癌细胞，成熟miRNA序列长度为22nt，其前体序列可以形成miRNA前体的典型二级结构，符合miRNA的结构特征。Northern blot和定量RT-PCR检测结果表明该miRNA分别肝癌组织中高表达，在癌旁组织中低表达。构建miR-m30的真核的细胞表达载体，并转染肝癌细胞HepG2，结果表明在肝癌细胞中表达miR-m30能明显刺激肝癌细胞的增殖。合成miR-m30的反义2′-O-甲基RNA，并转染肝癌细胞HepG2，结果表明在肝癌细胞中转染miR-m30的反义寡核苷酸能明显抑制肝癌细胞的增殖。基于上述工作本发明得以完成。

具体的说，本发明所提供的人源miRNA-miR-m30包含如下序列：5′ACUCGGCGUGGCGUCG GUCGUG。

本发明所提供的人源miRNA-miR-m30的前体RNA包含如下序列：5′CUACCAAUCUCGACCGGACCUCGACCGGCUCGUCUGUGUUGCCAAUCGACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUGGUAG。

本发明所提供的人源miRNA-miR-m30的反义寡核苷酸包含如下序列：5′CACGACCGACGCCACGCCGAGU。

本发明所提供的人源miRNA前体基因在人染色体上定位于人染色体10q24。

本发明提供的miRNA及其前体序列、反义序列也可采用化学合成的方法得到，为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可对其进行硫代修饰或甲氧基修饰，也可采取两种方式结合修饰。例如采用DNA合成仪在合成时自动进行硫代修饰。

本发明提供的miRNA及其前体序列、反义序列及其表达载体可用于制备治疗肝癌疾病的药物。例如以其单独或混合形式为有效组分配制成非肠道给药制剂，依据给药模式、受者年龄、体重、肝肾功能、疾病程度以适量剂量给药；也可采用基因治疗的方法，以质粒或腺病毒为表达载体，使其在癌变部位高效表达。

附图说明

图1.Northern blot检测miR-m30在HepG2细胞中表达

图2.定量PCR检测miR-m30在肝癌及癌旁组织中的表达

图3.过表达miR-m30促进肝癌细胞增殖

图4.miR-m30反义寡核苷酸抑制制肝癌细胞的增殖

以下结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例一

miRNA的克隆和分析

1.人肝癌细胞小RNA的提取纯化

使用mirVana^TM miRNA Isolation(Ambion，Austin，TX)试剂盒从肝癌和癌旁组织提取小RNA(≤200nt)，溶于无RNase水，混合后于260nm测定RNA浓度。

2.构建小RNA分子cDNA文库

首先用Takara公司Poly(A)聚合酶在小分子RNA 3′末端加上Poly(A)尾。在50μl反应体系中加入1.5μg small RNA、5U poly(A)聚合酶(Takara)、5μl 10×缓冲液和1mmol/L的ATP，于37℃反应30min。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收RNA。用T4 RNA ligase(Invitrogen)再在RNA的5′端加上44nt的RNA接头(CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA)，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收RNA。然后用含多个T的60nt RT锚定引物(ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀VN进行反转录，反转录使用SuperScript III(invitrogen)反转录酶，获得cDNA。根据RT引物及RNA接头设计PCR引物(引物1；5′-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′，引物2：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3′)，并以反转录的产物为模板进行PCR。PCR产物行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收大小约为109bp的PCR产物，并连接到T载体上，挑取阳性克隆测序。

3.获得的克隆序列分析

克隆测序获得序列对人基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行BLAST分析，采用Mfold程序(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi)对可能的miRNA前体RNA序列进行结构分析，参照miRNA分子标准筛选获得候选miRNA分子及其前体分子。同时采用生物信息学方法对miRNA前体分子进行了染色体定位。其中获得一条新的miRNA，及其前体RNA序列。miRNA命名为miR-m30。miR-m30的长度为22nt(miR-m30：5′ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG)，其前体长度为74nt(miR-m30前体5′CUACCAAUCUCGACCGGACCUCGACCGGCUCGUCUGUGUUGCCAAUCGACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUGGUAG)，miR-m30前体可以形成miRNA前体的典型的发夹环状结构。染色体定位分析表明，miR-m30前体基因定位于人染色体10q24。

4.miR-m30的Northern blot鉴定

使用mirVanaTM miRNA Isolation(Ambion，Austin，TX)试剂盒从胎肝、肝癌及癌旁组织提取small RNA(≤200nt)，以[γ-32P]ATP标记的miR-m30反向互补寡核苷酸为杂交检测探针，按照常规northern blot方法检测miR-m30在人胎肝、肝癌及癌旁组织中的表达，检测结果如图1。

实施例二

定量PCR检测miR-m30在肝癌及癌旁组织中的表达

以肝癌组织及对应癌旁组织为材料，用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA(操作方法见其说明书)。各取10μg总RNA用Poly(A)聚合酶(Ambion)在3′端加上Poly(A)，反应条件如下：RNA10μg，5×缓冲液10μl，25mM MnCl₂5μl，10mM ATP 5μl，Poly(A)聚合酶2U，加DEPC处理的H₂O至总体积50μl。于37℃反应30分钟后加入50μl DEPC处理水，再加入100μl(等量)的苯酚/氯仿(1∶1)，充分混匀。12000rpm离心5分钟，取上清移至另一微量离心管中，再加入100μl(等量)氯仿，充分混匀后以12000rpm离心5分钟。取上清移至另一微量离心管中，加入10μl(1/10体积)的3MNaAc(pH5.2)混匀。再加入250μl的冷无水乙醇，-20℃放置1小时。于4℃，以12000rpm离心20分钟，用75％的乙醇漂洗沉淀，室温晾干后溶于适量DEPC处理的水中。

以上述处理的RNA为模板，以GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATAGG(T)₁₈VN为引物进行逆转录反应(反应条件参考逆转录酶的说明书)，合成的cDNA即为定量PCR反应的模板。

以逆转录引物序列GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA C为3′PCR引物，以miR-m30部分序列ACT CGG CGT GGC GTC GGT C为5′PCR引物，以前述cDNA为模板用QuantiTectSYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR反应。肝癌及癌旁组织miR-m30的表达情况见图2。图2中LTP1，LTP2，LTP3为肝癌旁组织；LT1，LT2，LT3为对应的肝癌组织。结果表明与相应的癌旁组织相比，miR-m30在肝癌组织中的表达水平显著增强。这表明miR-m30在肝组织和肝癌组织中的表达水平存在明显差异。

实施例三

过表达miR-m30促进肝癌细胞增殖

PCR扩增miR-m30的前体序列，连接到pcDNA3.0真核表达载体上构建miR-m30的表达载体pcDNA-miR-m30。HepG2细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基于5％CO₂的37℃培养箱中培养。转染前一天于96孔板中种入3000个细胞/孔，用lipofectamine 2000按其说明书进行转染，每孔转染0.1μg质粒。转染72h后采用MTT法检测细胞增殖情况，于96孔细胞培养板加入MTT至终浓度50μg/ml，37℃温箱内继续培养4h，吸出培养液，每孔加入DMSO 150μl，室温下于旋涡振荡器上振荡10min，于492nm处测其吸光值。结果见图3。由图3可知，与转染对照载体pcDNA3.0的HepG2细胞相比，转染pcDNA-miR-m30过量表达miR-m30可以显著促进HepG2肝癌细胞的增殖。这表明miR-m30在肝癌细胞中具有重要的生物学功能。

实施例四

miR-m30反义寡核苷酸抑制制肝癌细胞的增殖

合成miR-m30及miR-21的2′-O-甲基修饰的反义寡核苷酸RNA及无关对照RNA。miR-m30反义寡核苷酸序列5′CACGACCGACGCCACGCCGAGU；miR-21反义寡核苷酸序列为5′UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA；无关对照RNA序列为5′UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA。HepG2细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基于5％CO₂的37℃培养箱中培养。转染前一天于96孔板中种入3000个细胞/孔，用Oligofectamine按其说明书进行转染，反义RNA浓度为100nM。转染72h后采用MTT法检测细胞增殖情况，于96孔细胞培养板加入MTT至终浓度50μg/ml，37℃温箱内继续培养4h，吸出培养液，每孔加入DMSO 150μl，室温下于旋涡振荡器上振荡10min，于492nm处测其吸光值。结果见图4，在图中1为无关RNA对照，2为2′-O-甲基修饰的miR-21的反义寡核苷酸RNA，3为2′-O-甲基修饰的miR-m30的反义寡核苷酸RNA。由图4可知，反义RNA抑制miR-m30后，HepG2细胞的增殖受到了一定程度的抑制，而对照RNA及miR-21的反义RNA均对HepG2细胞的增殖没有影响。这表明miR-m30的反义寡核苷酸对肝癌细胞的生长具有抑制作用，具有治疗肝癌相关疾病的用途。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

<120>一种miRNA序列及其用途

<160>3

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>人

<400>

ACUCGGCGUG GCGUCGGUCG UG 22

<210>2

<211>74

<212>RNA

<213>人

<400>

CUACCAAUCU CGACCGGACC UCGACCGGCU CGUCUGUGUU GCCAAUCGAC UCGGCGUGGC GUCGGUCGUG GUAG 74

<210>3

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源miR-m30反义寡核苷酸

<400>

CACGACCGAC GCCACGCCGA GU 22

Claims (9)

1. 一种人源miRNA-miR-m30，其特征在于包含如下miRNA序列：5′ACUCGGCGUGGC GUCGGUCGUG。

2. 权利要求1所述miR-m30的前体RNA，其特征在于包含如下序列：5′CUACCAAUCUCGACCGGACCUCGACCGGCUCGUCUGUGUUGCCAAUCGACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUGGUAG。

3. 权利要求1所述miR-m30的反义寡核苷酸，其特征在于包含如下序列：5′CACGACCGACGCCACGCCGAGU。

4. 权利要求3所述的的反义寡核苷酸，该核苷酸选自DNA或RNA。

5. 权利要求1～3所述任一核苷酸序列，其特征为该序列进行了硫代修饰、甲氧基修饰、或两者的结合修饰。

6. 权利要求1～3所述任一核苷酸序列，其特征为该序列通过化学合成获得。

7. 权利要求1～3所述任一核苷酸序列，其特征为该序列通过构建真核细胞表达载体进行表达获得。

8. 权利要求7所述任一核苷酸序列，其特征为所述载体为质粒载体或病毒载体。

9. 任一miR-m30、miR-m30前体、miR-m30反义寡核苷酸和其表达载体在制备治疗肝癌疾病药物中的用途。

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