CN101254091B - 一种视网膜成像的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明将二次谐波成像、偏振敏感二次谐波成像以及双光子激发荧光成像相结合，对视网膜进行高空间分辨成像，以实现眼底疾病的早期诊断。通过激光扫描共焦检眼镜与超短脉冲激光器相耦合，主要对视网膜三个重要功能的细胞层：色素上皮细胞层、感光细胞层以及神经节细胞层，分别进行双光子激发荧光成像、二次谐波成像以及偏振敏感二次谐波成像，并对同一细胞层进行二次谐波成像、偏振敏感二次谐波成像、双光子激发荧光成像的复合成像，通过计算机处理系统得到各细胞层图像和同一细胞层的合成图像，从而获得各细胞层的功能信息。本发明将为各类视网膜疾病，如糖尿病视网膜病、青光眼和老年黄斑变性等疾病的病理研究和早期诊断以及视觉科学的研究提供一种新型的具有三维高空间分辨率的视网膜单细胞成像手段，对降低视网膜患者的失明风险具有重要意义。
Description
技术领域
本发明将二次谐波成像、偏振敏感二次谐波成像以及双光子激发荧光成像相结合，对视网膜进行高空间分辨成像，以实现眼底疾病的早期诊断。由于视网膜各细胞层在结构及光学性质上各异，利用这种成像方法不仅能够根据视网膜细胞层各自的特点采用相应的成像手段，而且能够对同一细胞层进行多种成像方法的复合测量，从而获得互补的功能信息。因此，本发明将为各类视网膜疾病的早期诊断以及视觉科学的研究提供一种新型的具有三维高空间分辨率的视网膜单细胞成像手段，对降低视网膜患者的失明风险具有重要意义。
背景技术
视觉科学的研究以及眼科临床上对各类视网膜疾病的早期诊断，要求发展新型的具有更高空间分辨率、可三维成像、灵敏度高、能够获取视网膜组织功能信息的成像手段。将自适应光学技术与具有高空间分辨率并能够提供更多新型功能对比信息的成像方法相结合是新一代视网膜成像技术的发展方向，而发展一种能满足视网膜成像特殊要求的具有高空间分辨率的光学成像技术是实现这一目标的关键。
目前已在临床获得应用或正在发展的视网膜成像手段包括激光扫描共焦成像、光学相干层析成像以及眼底自体荧光成像等。双光子激发荧光和二次谐波是近几年来发展起来的并在生物医学领域获得广泛应用的新型成像技术，具有高空间分辨率、灵敏度高、特异性好以及对样品损伤小等优点，有望在新一代视网膜成像设备中获得应用。
双光子激发荧光可以显著提高荧光成像的穿透深度，避免紫外光对视网膜的损伤。由于双光子激发的吸收谱很宽，利用单一光源可以激发视网膜内不同的荧光团，而且可以很好地解决荧光探测中的光谱交叠问题。在色素上皮细胞层主要有两种自体荧光团，即脂褐素和黑色脂褐素。研究表明，这些荧光团在色素上皮细胞层的集聚和分布与年龄以及视网膜疾病有关。因此采用双光子激发视网膜色素上皮细胞层的自体荧光成像可以为眼疾病的病理研究和早期诊断提供方法和依据。
二次谐波成像是近年迅速发展并引起生物医学界关注的一种新型高分辨光学成像方法。与双光子激发荧光相同，二次谐波也是二阶非线性过程，因此具有双光子荧光成像的优点。但与双光子荧光相比，二次谐波成像的独特之处在于信号光的空间分布与微观结构有关，并且对分子排列敏感，具有很高的三维空间分辨能力。因此，二次谐波成像已经被用于细胞膜、细胞和组织等各类生物体系的活体观察，如有丝分裂细胞中的纺锤体和微丝微管。对于成层状分布的视网膜感光细胞阵列，二次谐波是一种很好的观测手段，可以对感光细胞的细胞膜成像，研究细胞的分布密度；借助于染料还可测量细胞膜的膜电位，进行细胞的功能成像。另外，二次谐波具有偏振敏感特性，对于神经节细胞层的成像具有重要的意义。当偏振激发光通过微丝状的神经节细胞的轴突传输并反射回探测器时，其偏振态发生变化，改变的大小取决于光所通过的微丝的数量，因此通过测量反射光的偏振态改变，就可以得到神经节细胞层的厚度，判定视神经细胞的丢失多少。
本发明是一种用二次谐波和双光子激发荧光实现高空间分辨视网膜成像的新方法，有望在视网膜疾病的早期诊断以及视觉科学研究中发挥巨大作用。
发明内容
本发明通过光路系统、机械系统以及电子学系统的特殊设计，将超短脉冲激光器和激光扫描共焦检眼镜相耦合，利用检眼镜对人眼视网膜检查的同时，获取二次谐波信号、偏振敏感二次谐波信号以及双光子激发荧光信号。采用计算机处理与控制系统得到视网膜各细胞层图像，并与激光扫描共焦检眼镜产生的视网膜反射图像形成对比信息。
本发明主要针对视网膜三个重要功能的细胞层：色素上皮细胞层、感光细胞层以及神经节细胞层，分别进行双光子激发荧光成像、二次谐波成像以及偏振敏感二次谐波成像，通过计算机处理与控制系统得到视网膜三个重要功能细胞层的图像。
本发明可对视网膜三个重要功能细胞层的各细胞层，进行二次谐波成像、偏振敏感二次谐波成像、双光子激发荧光成像的复合测量。通过计算机处理与控制系统得到视网膜三个重要功能细胞层的各细胞层的二次谐波与双光子激发荧光的合成图像或偏振敏感二次谐波与双光子激发荧光的合成图像或二次谐波与偏振敏感二次谐波的合成图像或二次谐波、偏振敏感二次谐波与双光子激发荧光的合成图像，从而获得同一细胞层的互补功能信息。
本发明将超短脉冲光源与激光扫描共焦检眼镜相耦合，利用单通道法实现二次谐波和双光子激发荧光视网膜高空间分辨成像原理及系统的举例说明如图1所示。系统主要由高重复频率超短脉冲激光器101、半波片102、功率衰减器103、激光扫描共焦检眼镜105、双色镜107、窄带滤光片112、带通或高通滤光片110、检偏器113、光电倍增管114以及计算机处理与控制系统117等组成。
本发明将超短脉冲光源与激光扫描共焦检眼镜相耦合利用双通道法实现二次谐波和双光子激发荧光视网膜高空间分辨成像原理及系统的举例说明如图2所示。系统主要由高重复频率超短脉冲激光器201、半波片202、功率衰减器203、激光扫描共焦检眼镜205、双色镜207、窄带滤光片212、带通或高通滤光片210、偏振分光棱镜213、光电倍增管214以及计算机处理与控制系统216等组成。
本发明采用高重复频率超短脉激光器，如钛宝石锁模飞秒激光器或其它高重复频率飞秒或皮秒激光器或超快锁模激光器作为双光子激发测量系统的激发光源。其波长可调且允许变化范围700-1000nm。根据视网膜不同细胞层特点选择合适波长进行检测。
本发明在高重复频率超短脉冲激光器如飞秒激光器光路中采用了功率衰减器，衰减从高重复频率超短脉冲激光器如钛宝石激光器输出的功率，使输入到眼睛的光功率满足关于激光安全应用的美国国家标准ANSI。
本发明利用半波片改变激光的偏振方向，使之能够在相互垂直的两个方向进行切换。
本发明利用双色镜使视网膜二次谐波信号和双光子激发荧光信号从视网膜反射光信号中分离，实现二次谐波和双光子激发荧光与视网膜反射光的对比成像。
本发明利用带通或高通滤光片，有效避开二次谐波的峰值波长，挑选出双光子激发荧光信号。
本发明利用窄带滤光片，挑选出二次谐波信号，过滤荧光信号和一次谐波信号。
本发明利用检偏器，透过平行与垂直于激发光偏振方向的二次谐波信号。
本发明利用偏振分光棱镜，将二次谐波信号分成平行与垂直于激发光偏振方向的两个偏振正交信号。
本发明采用高灵敏度的光电倍增管作为二次谐波、偏振敏感二次谐波、双光子激发荧光以及视网膜反射光的探测装置，将探测结果输入到计算机处理与控制系统，实现成像。
本发明采用一个通道依次记录平行与垂直于激发光偏振方向的两种偏振态信号，不必对系统进行校准，提高精度。
本发明利用二次谐波、偏振敏感二次谐波、双光子激发荧光与反射光同时成像的方法，将反射图像中视网膜血管网状分布与二次谐波、偏振敏感二次谐波、双光子激发荧光所成图像对应，用以校正眼底检查过程中由于眼球微动而造成的误差。
附图说明
图1超短脉冲光源耦合激光扫描共焦检眼镜单通道测量方法及其装置示意图。
图2超短脉冲光源耦合激光扫描共焦检眼镜双通道测量方法及其装置示意图。
具体实施方式
下面结合附图对技术方案的实施作进一步的详细描述。
如图1所示，由高重复频率超短脉冲激光器如钛宝石锁模飞秒激光器101，输出的近红外超短脉冲经半波片102、功率衰减器103后，以光纤104输入激光扫描共焦检眼镜105的扫描头，逐点扫描人眼106的视网膜三个重要功能细胞层，并将计算机处理与控制系统117和激光扫描共焦检眼镜105的扫描控制单元120相连，实现同步扫描。此时，光脉冲到达角膜的最大辐射能量小于允许的最大曝光量。从激光扫描共焦检眼镜105输出的光信号，通过双色镜107分光后，将二次谐波信号和荧光信号与反射光信号分离。反射光信号被第一光电倍增管108收集并用于随后的反射光成像119；二次谐波信号和荧光信号经分束镜109，分成两束光。一束光经带通或高通滤光片110，挑选出双光子激发荧光信号，通过高灵敏度的第二光电倍增管111探测，实现双光子激发荧光成像118；另一束光经窄带滤光片112，挑选出二次谐波信号，通过高灵敏度的第三光电倍增管114探测，实现二次谐波成像115。根据视网膜各细胞层的特点，在窄带滤光片112和第三光电倍增管114之间插入检偏器113，将检偏器113的透光轴依次旋转到平行、垂直于激发光的偏振方向，通过第三光电倍增管114接收探测，得到两个相互垂直的偏振光分量的二次谐波图像；切换半波片102，使激发光的偏振方向与原激发光的偏振方向垂直，再次得到两个相互垂直的偏振光分量的二次谐波图像，通过计算机处理与控制系统对这四幅二次谐波图像进行处理，提取出二次谐波的各向异性度信息，实现偏振敏感二次谐波成像116。
为补偿眼球在光照时微动造成的成像偏差，采用二次谐波、偏振敏感二次谐波、双光子激发荧光与视网膜反射光同时成像，并以反射图像中视网膜血管网状分布为标准与二次谐波、偏振敏感二次谐波、双光子激发荧光所成图像结果对应，即在记录反射光成像时，眼球移动的位移矢量被计算机117计算并用于成像过程的校准。用这种方法，计算机处理与控制系统117每次记录将校正为眼球发生移动前的原始状态。
如图2所示，由高重复频率超短脉冲激光器如钛宝石锁模飞秒激光器201，输出的近红外超短脉冲经半波片202、功率衰减器203后，以光纤204输入激光扫描共焦检眼镜205的扫描头，逐点扫描人眼206的视网膜三个重要功能细胞层，并将计算机处理与控制系统216和激光扫描共焦检眼镜205的扫描控制单元223相连，实现同步扫描。从激光扫描共焦检眼镜205输出的光信号，通过双色镜207分光后，将二次谐波信号和荧光信号与反射光信号分离，反射光信号被第四光电倍增管208收集并用于随后的反射光成像222；二次谐波信号和荧光信号经分束镜209，分成两束光。一束光经带通或高通滤光片210，挑选出双光子激发荧光信号，通过高灵敏度的第五光电倍增管211探测，实现双光子激发荧光成像221；另一束光经窄带滤光片212，挑选出二次谐波信号，经偏振分光棱镜213后，偏振方向与偏振分光棱镜213的光轴平行的二次谐波分量透射，与之垂直的二次谐波分量反射。这两个分量分别由对应的第六光电倍增管214和第七光电倍增管215探测，得到两个相互垂直的偏振光分量的二次谐波图像219、220。此时，偏振分光棱镜213光轴与激发光偏振方向平行；切换半波片，使激发光的偏振方向与原激发光的偏振方向垂直，再次得到两个相互垂直的偏振光分量的二次谐波图像，通过计算机处理与控制系统216对这四幅二次谐波图像进行处理，实现偏振敏感二次谐波成像218和二次谐波成像217。
综上所述，本发明将二次谐波成像、偏振敏感二次谐波成像以及双光子激发荧光成像相结合，对视网膜进行高空间分辨成像。为目前多种视网膜疾病，如糖尿病视网膜病、青光眼和老年黄斑变性等疾病的病理研究和早期诊断提供了新方法和依据。因此，本发明对各类视网膜疾病的早期诊断，降低视网膜患者的失明风险具有重要意义，可广泛用于医学研究领域及临床医学诊断方面。
Claims (6)
1.一种视网膜成像的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
由超短脉冲激光器输出的近红外超短脉冲以光纤输入激光扫描共焦检眼镜的扫描头，逐点扫描人眼的视网膜三个重要功能细胞层，通过将计算机处理与控制系统和激光扫描共焦检眼镜的扫描控制单元相连，实现同步扫描；
从激光扫描共焦检眼镜输出的光信号，通过双色镜分光后，将二次谐波信号和荧光信号与反射光信号分离；
反射光信号被第一光电倍增管收集并用于随后的反射光成像；二次谐波信号和荧光信号经分束镜分成两束光；一束光经带通或高通滤光片挑选出双光子激发荧光信号，通过第二光电倍增管探测，实现双光子激发荧光成像；另一束光经窄带滤光片挑选出二次谐波信号，通过第三光电倍增管探测，实现二次谐波成像。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超短脉冲激光器是钛宝石锁模飞秒激光器或各类光纤激光器。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述近红外超短脉冲是经半波片和功率衰减器后以光纤输入激光扫描共焦检眼镜的扫描头的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述另一束光经窄带滤光片挑选出二次谐波信号的步骤之后还包括以下步骤：
将位于窄带滤光片和第三光电倍增管之间的检偏器的透光轴依次旋转到平行、垂直于激发光的偏振方向，通过第三光电倍增管接收探测，得到两个相互垂直的偏振光分量的二次谐波图像；同时，切换半波片，使激发光的偏振方向与原激发光的偏振方向垂直，再次得到两个相互垂直的偏振光分量的二次谐波图像，通过计算机处理与控制系统对四幅二次谐波图像进行处理，提取出二次谐波的各向异性度信息，实现偏振敏感二次谐波成像。
5.一种视网膜成像的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
由超短脉冲激光器输出的近红外超短脉冲经半波片和功率衰减器后以光纤输入激光扫描共焦检眼镜的扫描头，逐点扫描人眼的视网膜三个重要功能细胞层，通过将计算机处理与控制系统和激光扫描共焦检眼镜的扫描控制单元相连，实现同步扫描；
从激光扫描共焦检眼镜输出的光信号，通过双色镜分光后，将二次谐波信号和荧光信号与反射光信号分离；
反射光信号被第四光电倍增管收集并用于随后的反射光成像；二次谐波信号和荧光信号经分束镜分成两束光；一束光经带通或高通滤光片挑选出双光子激发荧光信号，通过第五光电倍增管探测，实现双光子激发荧光成像；
另一束光经窄带滤光片，挑选出二次谐波信号，经偏振分光棱镜后，偏振方向与偏振分光棱镜的光轴平行的二次谐波分量透射，与偏振分光棱镜的光轴垂直的二次谐波分量反射；
与偏振分光棱镜的光轴平行的二次谐波分量和与偏振分光棱镜的光轴垂直的二次谐波分量分别由第六光电倍增管和第七光电倍增管探测，得到两个相互垂直的偏振光分量的二次谐波图像；此时，偏振分光棱镜的光轴与激发光偏振方向平行；
切换半波片，使激发光的偏振方向与原激发光的偏振方向垂直，再次得到两个相互垂直的偏振光分量的二次谐波图像，通过计算机处理与控制系统对四幅二次谐波图像进行处理，实现偏振敏感二次谐波成像和二次谐波成像。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述超短脉冲激光器是钛宝石锁模飞秒激光器或各类光纤激光器。
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