CN101248105B - K-252a及其衍生物的聚合物缀合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及K-252a及其衍生物的新的聚合物缀合物，涉及它们用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防、减轻和治疗与激酶相关的病理学。特别地，本发明涉及预防、减轻和治疗与HMGB1相关的病理学。具体地，本发明涉及K-252a及其衍生物的新的聚合物缀合物在制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防、减轻和治疗中枢和外周神经系统的神经病学病症、神经病和神经变性病症。更优选地，本发明涉及聚合物缀合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防、减轻和治疗皮肤病理学、特别是与过度的角质形成细胞增殖有关的皮肤病理学、特别是银屑病。另一个方面，本发明涉及聚合物缀合物在预防、减轻治疗与NGF相关的疼痛中的用途。更具体地，本发明涉及K-252a及其衍生物的聚合物缀合物，其中的聚合物为聚乙二醇或甲氧基-聚乙二醇，即式(I)。

Description

K-252A及其衍生物的聚合物缀合物

本发明涉及K-252a及其衍生物的新的聚合物缀合物，并且涉及它们用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防、减轻和治疗与激酶相关的病理学。特别地，本发明涉及预防、减轻和治疗与HMGB1相关的病理学。在具体的方面中，本发明涉及K-252a及其衍生物的新的聚合物缀合物在制备药物组合物的用途，所述药物组合物可用于预防、减轻和治疗中枢和外周神经系统的神经病学病症、神经病和神经变性病症。在进一步优选的方面中，本发明涉及聚合物缀合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防、减轻和治疗皮肤病理学，特别是与过度的角质形成细胞增殖有关的皮肤病理学，特别是银屑病。在又一个方面中，本发明涉及该聚合物缀合物在预防、减轻和治疗与NGF相关疼痛中的用途。更具体地，本发明涉及K-252a及其衍生物的聚合物缀合物，其中，聚合物为聚乙二醇或甲氧基-聚乙二醇。

K-252a为第一次从拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)土壤真菌分离的亲脂性生物碱(WO 97/38120)，具有由下式表示的吲哚并咔唑骨架：

K-252a强烈抑制蛋白激酶C(PKC，其在调节细胞功能方面起着重要作用)并且具有多种活性，例如抑制平滑肌收缩的作用(Jpn.3.Pharmacol.43(增刊)：284，1987)、抑制血清素分泌的作用(Yamada等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.144：35-40，1987)、抑制轴突伸长的作用(Koizumi等人，J.Neurosci.Res.8：715，1988)、抑制组胺释放的作用(Morita等人，Allergy 43：100-104，1988)、抑制平滑肌肌球蛋白轻链激酶的作用(Nakanishi等人，J.Biol.Chem.263：6215-6219，1988)、抗炎作用(Papp等人，Acta Physiol.Hung.80：423-425，1992)、细胞存活活性(Glicksman等人，J.Neurochem.64：1502-1512，1995)等等。在“Grove等人，Exp.Cell Res.，193：175-182，1991”中还描述了K-252a具有抑制IL-2产生的活性。K-252a的全合成也已经完成(Wood等人，J.Am.Chem.Soc.117：10413-10414，1995)。

神经生长因子(NGF)是得到最充分表征的神经营养蛋白并且是某些感官和胆碱能神经元正常发育和功能所需要的(Levi-Montalcini，Annu.Rev.Neurosci.5：341-362，1982)。高亲合力神经营养因子的受体trks包括由trk A、trk B、和trk C组成的蛋白质家族(Knusel等人，J.Neurochem.59：715-722，1992)。这个受体家族的成员是表现出酪氨酸激酶活性的膜相关蛋白。神经营养蛋白配体与trks的相互作用诱导受体上特定的酪氨酸残基的磷酸化。trks的磷酸化是对神经营养蛋白结合的直接响应。它对于酶通道活化是绝对必要条件，所述酶通道调节细胞对神经营养蛋白的功能性响应(Klein等人，Cell65：189-197，1991；Lamballe等人，Cell 66：967-979，1991)。K-252a是几种酶(包括trks)的抑制剂。与这种作用相一致，因为K-252a影响trks的磷酸化状态，其在一些体外细胞试验中阻断NGF介导的细胞存活(Koizumi等人，J.Neurosci.8：715-721，1988；Doherty等人，Neurosci.Lett.96：1-6，1989；Matsuda等人，Neurosci.Lett.87：11-17，1988)。

在文献中，K-252a及其衍生物例如双乙基硫代甲基类似物CEP-1347已经在神经变性疾病中表现出治疗潜力(Annu RevPharmacol Toxicol.2004；44：451-74；Neurochem Int.2001年11-12月；39(5-6)：459-68；Neuroport.2000年11月9日；11(16)：3453-6；Neuroscience.1998年9月；86(2)：461-72；Brains Res.19947月4；650(1)：170-4)。

角质形成细胞对于皮肤的动态平衡和病理生理学过程都是关键的细胞组分，其分泌多种细胞素并且是由几种生长因子刺激的。NGF在皮肤中合成并且在培养物中以剂量依赖性方式显著地刺激正常人角质形成细胞的增殖。这种作用可以通过加入K-252a来阻止，K-252a为高亲合力的NGF受体(trk)特异性抑制剂，由此表明，NGF对人角质形成细胞的影响是通过高亲合力的NGF受体介导的。因此，NGF可以起到人皮肤中的细胞因子的作用并且参与角质形成细胞增殖的病症(Pincelli等人，J.Invest.Dermatol.103：13-18，1994)。神经性炎症和NGF的作用已经在银屑病中得到广泛研究。角质形成细胞中的NGF水平增加并且银屑病斑的皮神经中NGF受体向上调节。NGF可以影响在银屑病中看到的所有突出的病理学事件，例如角质形成细胞增殖、血管生成、T细胞活化、粘附分子表达、皮神经增殖和神经肽向上调节。在双盲的、安慰剂对照研究中，在使用银屑病的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠-人皮肤模型的体内体系中研究了NGF和NGF受体在银屑病中的作用。将在SCID小鼠上所移植的银屑病斑用K-252a处理。在2周治疗后，银屑病显著改善。(Raychaudhuri等人，J.Invest.Dermatol.122：812-819，2004)。

另外据报道，NGF在几种急性和慢性疼痛状态中对疼痛产生和痛觉过敏起关键性作用。在受损和发炎的组织中，NGF的表达高，并且感受伤害的神经元上NGF受体酪氨酸激酶TrkA的活化通过多种机制触发和加强疼痛信号。预计NGF拮抗在许多疼痛状态中是非常有效的治疗方法，并且没有常规止痛药的副作用[Hefti FF等人，TrendsPharmacol.Sci(2006)27：85-91]。有证据表明，TrkA受体是NGF的感受伤害作用所需要的。大多数受体酪氨酸激酶抑制剂阻断ATP对催化性酪氨酸激酶结构域的结合[Madhusudan S等人，Clin.Biochem.(2004)37：618-635]。在胰腺疼痛的动物模型中，生物碱K-252a以高效能抑制Trk信号并且减弱超敏性[Winston JH等人，J.Pain(2003)4：329-337]。然而，K-252a没有对TrkA的选择性，因为它是几种激酶的有效抑制剂。这意味着K-252a可能具有许多与抑制TrkA无关的副作用。

专利申请WO 2005/014003描述了属于K-252家族的微生物来源的酪氨酸激酶抑制剂用于制备局部治疗用药物的用途，所述药物能够抑制病症例如银屑病和皮肤肿瘤的过度角质形成细胞增殖特性。

国际专利申请PCT/EP2005/008258公开了K-252a及其衍生物用于预防和治疗HMGB1-相关病理学的用途。HMGB1是由坏死的或垂死的细胞释放的促炎性趋化因子，在几种人病理学中引起炎性细胞因子级联反应。在优选实施方案中，上述的US专利申请描述了K-252a及其衍生物作为用于预防和治疗再狭窄的治疗剂的新用途。K-252a事实上具有阻断/抑制HMGB1诱导的动脉平滑肌细胞迁移和增殖(二者都是作为再狭窄形成的基础的事件)的能力。为此目的，通过结合、嵌入或吸附将K-252a及其衍生物作为表面涂层加载在医疗器械上，特别是加载在支架上，以便原地释放活化剂。

除了K-252a本身之外，已经合成了K-252a的多种衍生物并且试验了生物活性。例如，一种K252a衍生物CEP1347，保留了神经保护性质，但是不抑制TrkA。已经表明CEP1347直接抑制MAPKKKs，包括MLK3(Roux等人，J.Biol.Chem.277：49473-49480，2002)。另一种K-252a衍生物KT5926，已经在BHK-21细胞中研究了对抗水泡性口膜炎病毒(VSV)复制的抑制(Kim等人，Biol.Pharm.Bull.21：498-505，1998)。众所周知，在C3′上保存性取代的K-252a类似物保留了对抗多种激酶的效力(Schneider等人，Org.Lett.7：1695-1698，2005)。

系统给予的药物的效力在体内可以被多种因素阻碍，例如在生理学pH下的弱溶解性，和被肾小球滤过作用、细胞清除和代谢作用的快速消除。在许多情况中，这种不利的影响阻碍了使用这些药物的有效治疗。用于改善药物作用的效力和持续时间、和用于降低可能的毒理学作用的成功策略为使生物活性剂与多种聚合物共价结合。最经常用于改善活化剂的药理学和毒理学性质的聚合物之一是聚环氧烷类的聚乙二醇(简称PEG)。

聚乙二醇(PEG)聚合物为两性的、无毒的和免疫惰性的，可以与药物缀合用于操纵许多药代动力学和毒理学性质。在药物传输领域，PEG衍生物已经广泛用于共价连接于蛋白质(即，“PEG化”)，以减少免疫原性、蛋白水解和肾清除，并且提高溶解度(Zalipsky，Adv.Drug Del.Rev.16：157-182，1995)。类似地，已经将PEG连接于低分子量的、相对疏水的药物，以降低毒性、改变生物分布、和提高溶解度。由于被转移到缀合物上的PEG性质的优点，PEG化的药物可能比它们未经修饰的母体药物更有效(Molineux，Pharmacotherapy 23：3S-8S，2003)。

本发明的目的是利用一些聚合物的特有特征，特别是聚乙二醇(PEG)，以便开发吲哚并咔唑家族成员的治疗有用的给药形式。本发明的发明人的目标是通过PEG修饰得到药代动力学和毒理性得以改善的聚合物缀合的吲哚并咔唑化合物。此外，新的缀合的化合物的活性和/或毒性的改变也是本发明的焦点。

本发明要解决的具体问题之一是利用一些聚合物的特有特征，特别是PEG，以便开发K-252a的给药形式，所述形式允许在多种可能的施用途径中改善药代动力学和毒理学性能、实现K-252a或其衍生物的最佳生物利用度。在本发明的具体方面中，问题是利用聚合物的特征，以便在局部给药的情况中实现K-252a或其衍生物的吸收减少，并且因此而降低甚至消除可能存在的系统毒性和/或副作用。

因此，本发明还涉及吲哚并咔唑化合物成员(特别是K-252a或其衍生物)的新的聚合物缀合物，它们的制备和它们的用途，其中，与未缀合的吲哚并咔唑化合物或与K-252a化合物或其衍生物相比，聚合物缀合物具有更高的水溶性、改善的药学可操作性、改善的药代动力学和生物利用度、和/或降低的毒性和/或免疫原性。

在特别优选的方面中，本发明涉及K-252a或其衍生物的聚合物缀合物，它们的制备和它们的用途，其中，在局部给药之后，系统吸收是受到限制的，因此系统毒性和/或副作用被降低甚至消除。

因此，本发明的第一方面为通式(I)并且优选通式(II)的吲哚并咔唑化合物的聚合物缀合物或其可药用盐，

式(I)

式(II)

其中，R^a和R^b独立地为氢或选自以下组的有机残基，所述组为取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、羟基、低级烷氧基、羧基或烷氧羰基；

或者R^a和R^b一起形成5-7元、优选5元的环状结构，其直接稠合于吲哚并[2，3-a]咔唑核结构，包含0、1或2个杂原子、优选氮原子，并且任选地包含羰基和取代或未取代的环状结构，优选被至少1个选自羰基或W₁或W₂的取代基取代，并且如果环状结构的杂原子成员是氮，则该氮被残基R³取代；并且

其中，

(a)R^c和R^d独立地为氢或选自以下组的有机残基，所述组为取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、羟基、低级烷氧基、羧基或烷氧羰基；或者

R^c和R^d中的1个选自氢、取代或未取代的低级烷基和羟基，而R^c和R^d中的另1个为3-7元、优选5或6元的环状部分，优选环状的碳水化物部分，其中，环状部分为取代或未取代的，优选被至少1个适于缀合聚合物部分的官能团取代，更优选在环的至少1个、优选2～3个乃至所有的位置被羟基、取代或未取代的低级烷基、低级烷氧基、羧基、烷氧羰基、氨基、低级烷基氨基、低级烷基氨基羰基或肟基取代；或

(b)R^c和R^d一起形成3-7元、优选5或6元的环状部分，优选环状的碳水化物部分，其中，环状部分为取代或未取代的，优选被至少1个适于缀合聚合物部分的官能团取代，更优选在环的至少1个、优选2～3个乃至所有的位置被羟基、取代或未取代的低级烷基、低级烷氧基、羧基、烷氧羰基、氨基、低级烷基氨基、低级烷基氨基羰基和/或肟基取代，

并且其中，残基R₁、R₂、R₃、W₁和W₂的定义如下所述。

化合物(I)和(II)具有至少1个与聚合物部分缀合的官能团，优选位于基团R^c和/或R^d上。缀合物可包含1个或多个聚合物部分，例如1个、两个、三个或更多的聚合物部分。优选为本发明的缀合物化合物包含1个聚合物部分。

3-7元的环状部分，优选环状碳水化物部分通过与1个吲哚氮连接或通过与吲哚并咔唑结构的全部吲哚氮连接而结合于吲哚并咔唑化合物。因此，连接可以包括单个吲哚或两个吲哚，并且优选由1个或两个N-糖苷键提供。

优选地，3-7元环状部分，优选环状的碳水化物部分为被取代的呋喃糖基或被取代的吡喃糖基。因此，优选的聚合物缀合化合物是环呋喃糖基化的吲哚并咔唑化合物或环吡喃糖基化的吲哚并咔唑化合物。根据本发明，与聚合物部分缀合的优选的环呋喃糖基化的吲哚并咔唑化合物可选自K-252a、K-252b、ICP-1。优选的环吡喃糖基化的吲哚并咔唑化合物可选自星孢素、K-252d、TAN-1030a、RK-286c、MLR-52、蝴蝶霉素(Rebeccamycin)、UNC-01、UNC-02和RK-1409B。

至少1个聚合物部分通过共价化学键与式(I)和/或式(II)的化合物缀合，以形成稳定的缀合物。具体地，聚合物部分通过连接于选自羟基、氨基、羧基、烷氧羰基或氨基羰基而与通式(I)和/或(II)的化合物结合。在本发明的更优选的实施方案中，聚合物部分在残基R^c和R^d之一上连接于通式(I)和/或(II)的化合物，特别优选在被残基R^c和R^d定义的环状碳水化物部分上进行连接。本发明化合物的聚合物部分以及可用于将聚合物连接于式(I)和/或(II)的吲哚并咔唑化合物的优选的化学键如下所述。

本发明更优选的是由下式(III)表示的聚合物缀合物：

式(III)

其中，R¹和R²为相同或不同的残基，并且各自独立地选自由以下组成的组：

a)氢、卤素、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、羟基、低级烷氧基、羧基、低级烷氧羰基、酰基、硝基、氨基甲酰基、低级烷基氨基羰基、-NR⁵R⁶，其中，R⁵和R⁶各自独立地选自氢、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的低级烷基氨基羰基、取代或未取代的低级芳基氨基羰基、烷氧羰基、氨基甲酰基、酰基，或者R⁵和R⁶与氮原子一起形成杂环基团，

b)-CO(CH₂)_jR⁴，其中，j为1～6，并且R⁴选自以下组成的组：

(i)氢、卤素、-N₃，

(ii)-NR⁵R⁶，其中，R⁵和R⁶如上述定义，

(iii)-SR⁷，其中，R⁷选自以下组成的组：氢、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳烷基、-(CH₂)_aCO₂R¹⁰(其中，a为1或2，并且其中，R¹⁰选自氢和取代或未取代的低级烷基)、和-(CH₂)_aCO₂NR⁵R⁶(其中，a、R⁵和R⁶如上述定义)，

(iv)-OR⁸、-OCOR⁸，其中，R⁸选自氢、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基；

c)-CH(OH)(CH₂)_jR⁴，其中，j和R⁴如上述定义；

d)-(CH₂)_dCHR¹¹CO₂R¹²或-(CH₂)_dCHR¹¹CONR⁵R⁶，其中，d为0～5、R¹¹为氢、-CONR⁵R⁶、或-CO₂R¹³，其中，R¹³为氢或取代或未取代的低级烷基，R¹²为氢或取代或未取代的低级烷基；

e)-(CH₂)_kR¹⁴，其中，k为2～6，R¹⁴为卤素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、-COOR¹⁵、-OR¹⁵(其中，R¹⁵为氢、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或酰基)、-SR⁷(其中，R⁷如上述定义)、-CONR⁵R⁶、-NR⁵R⁶(其中，R⁵和R⁶如上述定义)、或-N₃；

f)-CH＝CH(CH₂)_mR¹⁶，其中，m为0～4，和R¹⁶为氢、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、-COOR¹⁵、-OR¹⁵(其中，R¹⁵如上述定义)、-CONR⁵R⁶或-NR⁵R⁶(其中，R⁵和R⁶如上述定义)；

g)-CH＝C(CO₂R¹²)₂，其中，R¹²如上述定义；

h)-C≡C(CH₂)_nR¹⁶，其中，n为0～4，R¹⁶如上述定义；

i)-CH₂OR²²，其中，R²²为三低级烷基甲硅烷基，其中，三个低级烷基相同或不同，或者R²²具有与R⁸相同的含义；

j)-CH(SR²³)₂和-CH₂-SR⁷，其中，R²³为低级烷基、低级烯基或低级炔基，并且其中，R⁷如上述定义。

R₃为氢，卤素，酰基，氨基甲酰基，取代或未取代的低级烷基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的低级炔基或氨基；

X表示-L¹-X’，Y表示-L²-Y’，其中，X’和Y’中的至少1个为直链或支链的聚合物，其通过L¹和/或L²连接于式(III)化合物的四氢呋喃部分；L¹和/或L²是共价化学键或连接基团，其将四氢呋喃部分连接于聚合物X’和/或Y’；

当Y’是聚合物并且X’不是聚合物时，L¹是共价化学键并且X’选自以下组成的组：

(a)氢、低级羟基烷基、酰基、羧基、低级烷氧羰基、

(b)-CONR^17aR^17b，其中，R^17a和R^17b各自独立地选自

(i)氢、低级烷基、低级烯基、低级炔基，

(ii)-CH₂R¹⁸；其中，R¹⁸为羟基，或

(iii)-NR¹⁹R²⁰，其中，R¹⁹或R²⁰各自独立地选自氢、低级烷基、低级烯基、低级炔基，或者R¹⁹或R²⁰独立地为除羧基的羟基以外的α-氨基酸的残基，或R¹⁹或R²⁰与氮原子组合形成杂环基团；

(c)-CH＝N-R²¹，其中，R²¹为羟基、低级烷氧基、氨基、胍基、或咪唑基氨基；

当X’为聚合物并且Y’不是聚合物时，L²是共价化学键并且Y’选自羟基、低级烷氧基、芳烷氧基、或酰基氧基；

W¹和W²独立地为氢、羟基，或W¹和W²一起表示氧；

或其可药用盐。

术语“低级烷基”，当单独使用或与其它基团组合使用时，是指直链或支链的低级烷基，包含1-6个碳原子，优选1-5个碳原子，更优选1-4个碳原子，特别优选1-3或1-2个碳原子。这些基团特别地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、戊基、异戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基等。“低级烷氧基”、“低级烷氧羰基”、“低级烷基氨基羰基”、“低级羟基烷基”和“三低级烷基甲硅烷基”基团的低级烷基部分具有与上述定义的“低级烷基”相同的含义。

“低级烯基”基团定义为C₂-C₆烯基，其可为直链或支链的并且可为Z或E形状。这种基团包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、异丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、(Z)-2-戊烯基、(E)-2-戊烯基、(Z)-4-甲基-2-戊烯基、(E)-4-甲基-2-戊烯基、戊二烯基，例如1，3或2，4-戊二烯基等。更优选的C₂-C₆-烯基为C₂-C₅-、C₂-C₄-烯基，更优选C₂-C₃-烯基。

术语“低级炔基”基团是指C₂-C₆-炔基，其可为直链或支链的并且包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-戊炔基、3-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基等。更优选的C₂-C₆-炔基为C₂-C₅-、C₂-C₄-炔基，进一步优选C₂-C₃-炔基。

术语“芳基”是指包含6到14个环碳原子的C₆-C₁₄-芳基。这些基团可为单环、双环或三环并且是稠环。优选的芳基包括苯基、联苯基、萘基、蒽基、菲基等。“芳基羰基”和“芳基氨基羰基”的芳基部分具有与上述相同的定义。

术语“杂芳基”可包含1～3个独立地选自氮、硫或氧的杂原子，并且是指C₃-C₁₃-杂芳基。这些基团可为单环、双环或三环。本发明的C₃-C₁₃杂芳基包括杂芳族的和饱和及部分饱和的杂环基团。这些杂环化合物可为单环、双环或三环。优选的5或6-元杂环基团为噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、吗啉基、吡嗪基、甲基吡咯基、和哒嗪基。C₃-C₁₃-杂芳基可为二环的杂环基团。优选的二环杂环基团为苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑基、和嘧啶基。最优选的C₃-C₁₃-杂芳基为呋喃基和吡啶基。

术语“低级烷氧基”包括包含1～6个碳原子、优选1～5个、更优选1～4个、特别优选1～3个或1～2个碳原子并且可为直链或支链的烷氧基。这种基团包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基，异丙氧基，叔丁氧基，戊氧基，己氧基等。

术语“酰基”包括包含1～6个碳原子、优选1～5个、1～4个、1～3个或1～2个碳原子并且可为直链或支链的低级烷酰基。这些基团优选包括甲酰基、乙酰基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基、叔丁酰基，戊酰基，己酰基。“酰氧基”的酰基部分具有与上述相同的定义。

术语“卤素”包括氟、氯、溴、碘等。

术语“芳烷基”是指其中的烷基被芳基取代的C₇-C₁₅-芳烷基。烷基和芳基可选自如上述定义的C₁-C₆烷基和C₆-C₁₄-芳基，其中，碳原子的总数为7～15。优选的C₇-C₁₅-芳烷基为苯甲基、苯乙基，苯丙基，苯基异丙基，苯基丁基，二苯基甲基，1，1-二苯基乙基，1，2-二苯基乙基。“芳烷氧基”的芳烷基具有与上述相同的定义。

被取代的低级烷基，烯基和炔基具有1～3个独立选择的取代基，例如低级烷基，羟基，低级烷氧基，羧基，低级烷氧羰基，硝基，卤素，氨基，单-或二-低级烷基氨基，二氧杂环戊烷、二氧杂环己烷、二硫杂环戊烷、和二硫酮。被取代的低级烷基、烯基和炔基的低级烷基取代基部分，和低级烷氧基、低级烷氧羰基、和被取代的低级烷基、烯基和炔基的单-或二-低级烷基氨基取代基的低级烷基部分具有与上述定义的“低级烷基”相同的含义。

被取代的芳基，被取代的杂芳基和被取代的芳烷基，各自具有1～3个独立选择的取代基，例如低级烷基，羟基，低级烷氧基，羧基，低级烷氧羰基，硝基，氨基，单-或二-低级烷基氨基，和卤素。取代基中的低级烷基、低级烷氧基、低级烷氧羰基、和单-或二-低级烷基氨基的低级烷基部分具有与上述定义的低级烷基相同的含义。

由R⁵和R⁶与氮原子一起形成的杂环基团包括吡咯烷基、哌啶基、哌啶子基、吗啉基、吗啉代、硫代吗啉代、N-甲基哌嗪基、吲哚基和异吲哚基。

α-氨基酸基团包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和赖氨酸，其可为L型、D-型或外消旋物的形式。

优选地，R¹和R²独立地选自以下组成的组：氢、卤素、硝基、-CH₂OH、-(CH₂)_kR¹⁴、-CH＝CH(CH₂)_mR¹⁶、-C≡C(CH₂)_nR¹⁵、-CO(CH₂)_jR⁴，其中，R⁴为-SR⁷、CH₂O-(取代或未取代的)低级烷基(其中，被取代的低级烷基优选为甲氧基甲基、甲氧基乙基或乙氧基甲基)、-NR⁵R⁶。

在上述R¹和R²的优选的含义中，残基R¹⁴优选选自苯基、吡啶基、咪唑基、噻唑基、四唑基、-COOR¹⁵、-OR¹⁵(其中，R¹⁵优选选自氢、甲基、乙基、苯基或酰基)、-SR⁷(其中，R⁷优选选自取代或未取代的低级烷基、2-噻唑啉和吡啶基)和-NR⁵R⁶(其中，R⁵和R⁶优选选自氢、甲基、乙基、苯基、氨基甲酰基和低级烷基氨基羰基)。此外，残基R¹⁶优选选自氢、甲基、乙基、苯基、咪唑、噻唑、四唑、-COOR¹⁵、-OR¹⁵和-NR⁵R⁶(其中，残基R¹⁵、R⁵和R⁶具有如上所述的优选的含义)。在R¹和R²的上述优选的含义中，残基R⁷优选选自取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的苯基、吡啶基、嘧啶基、噻唑和四唑。另外，k优选为2、3或4，j优选为1或2，m和n独立地优选为0或1。

R³优选为氢或乙酰基，更优选为氢。

优选每个W¹和W²为氢。

当Y’为聚合物并且X’不是聚合物时，X’优选选自羧基、羟甲基、或低级烷氧羰基，特别优选甲氧羰基和羧基。

当X’为聚合物并且Y’不是聚合物时，Y’优选选自羟基或乙酰氧基，更优选为羟基。

本发明的更优选的实施方案是指在位置X和/或Y处与聚合物缀合的化合物K252-a。因此，在本发明更优选的实施方案中，式(III)的聚合物缀合物由其中的R₁、R₂、R₃、W₁和W₂是氢并且X’和Y’中的至少1个是聚合物的化合物表示，从而当Y’是聚合物并且X’不是聚合物时，X’为甲氧羰基，当X’是聚合物并且Y’不是聚合物时，Y’是羟基。

本发明的更优选的实施方案是指在位置X和/或Y处与聚合物缀合的化合物K252-b。因此，在本发明更优选的实施方案中，式(III)的聚合物缀合物由其中的R₁、R₂、R₃、W₁和W₂是氢并且X’和Y’中的至少1个是聚合物的化合物表示，从而当Y’是聚合物并且X’不是聚合物时，X’为羧基，而当X’是聚合物和Y’不是聚合物时，Y’是羟基。

本发明的化合物可被制备为可药用盐，包括无机酸例如盐酸、氢碘酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸的盐，以及有机酸例如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、芳基磺酸(例如，对甲苯磺酸、苯磺酸)、膦酸、丙二酸的盐等。用于形成可药用盐的适合的酸是本领域技术人员已知的。此外还包括可与可药用的阳离子形成本发明的化合物的可药用盐。可药用的阳离子为本领域技术人员已知的并且包括碱性阳离子(Li⁺、Na⁺、K⁺)、碱土阳离子(Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺)、铵和有机阳离子例如季铵阳离子。

在通式(III)中由例如X’和/或Y’表示的本发明的聚合物部分必须是生物适合的，可为天然的或半合成的或合成的来源并且可为直链或支链结构。示例性的聚合物包括聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺或其N-烷基衍生物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚乙基丙烯酸、聚乙基丙烯酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(乙烯醇)、聚乙醇酸、聚乳酸、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、聚氨基酸，但不限定于此。

在本发明更优选的实施方案中，聚合物为聚乙二醇(PEG)，其中，末端OH基可以任选地被修饰，例如，用C₁-C₅烷基或C₁-C₅酰基、优选C₁-、C₂-或C₃-烷基或C₁-、C₂-或C₃基团修饰。被修饰的聚乙二醇优选为甲氧基-聚乙二醇(mPEG)。

本发明所用的聚合物的分子量为100～100,000Da，优选200～50,000Da，更优选500～10,000Da。在本发明的1个优选的方面，聚合物为优选具有末端OH和/或甲氧基的短链PEG，其分子量为200～1500Da，优选400～1200Da，更优选550～1100。在最优选的实施方案中，短链PEG的平均分子量为550Da或1100Da。在本发明的第二优选方面，聚合物为优选具有末端OH和/或甲氧基的长链PEG，分子量为从4,000～6,000Da，优选为4,500～5,500Da。在本发明这个方面的最优选实施方案中，使用平均分子量为2,000Da或5,000Da的长链PEG或mPEG。

为了提供稳定的缀合物，式(I)、(II)和/或(III)的聚合物缀合物的聚合体链通过共价化学键与活化剂缀合。图1a和图1b表示例如优选的式(III)的聚合物缀合物。聚合物可以直接结合于式(I)或(II)的化合物或结合于式(III)的K-252a衍生物。在式(III)的这种情况中，L¹和L²是共价键。

在本发明的优选实施方案中，通过使用连接基将聚合物部分结合于吲哚并咔唑衍生物。在式(III)化合物的优选实施方案中，聚合物部分X’和/或Y’通过连接基团连接，从而在这个实施方案中，L¹和L²表示连接基团。在本发明的式(III)的优选实施方案中，术语连接基团L¹和/或L²是指通过式(III)的四氢呋喃部分的C3位置上的残基与聚合物部分上的活性基团之间的化学反应得到的基团。因此，将聚合物部分X’和Y’连接于四氢呋喃环的L¹和L²可代表上述定义的连接基团。

连接基团可为聚合物缀合领域技术人员已知的任何残基，其通过使适于缀合在式(I)或(II)的吲哚并咔唑化合物上、优选缀合在环状部分R^c和/或R^d上、或缀合在式(III)的四氢呋喃环上的取代基和聚合物或被反应基活化的聚合物上的官能团反应而得到。示例性的连接基团，例如示例性的L1和/或L2基团包括酯、醚、缩醛、缩酮、乙烯基醚、氨基甲酸酯、脲、胺、酰胺、烯胺、亚胺、肟、脒、亚胺酯、碳酸酯、原酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯、硫化物、硫酸酯、二硫化物、亚磺酰胺、磺酰胺、硫酯、芳基、硅烷、硅氧烷、杂环、硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯、和磷酰胺键，但不限定于此。连接基团或L¹和L²特别优选选自氨基甲酸酯、醚、酯、碳、酰胺和/或胺键。

此外，连接基团可任选地包含1个或多个间隔基。在本发明的上下文中，间隔基定义为双官能基团，其在两个末端都具有反应性的官能端基。间隔基以1个反应性端基与聚合物部分例如X’和Y’反应，或者与聚合物部分上的反应基反应。间隔基以其另一末端的另1个官能团结合于适于缀合在式(I)或(II)的吲哚并咔唑化合物上、优选缀合在环状部分R^c和/或R^d上、或缀合在式(III)的四氢呋喃环上、优选缀合在式(III)的四氢呋喃环的C3位置上的残基的官能团。适合的间隔基为本领域技术人员已知的。间隔基的例子包括但不限于杂、双官能的小分子或聚合物。例如，间隔基可由包含1-3个选自N、S和O的杂原子或中间的短双官能PEG链的双官能C₆-C₁₂烷基或杂双官能烷基基团表示。

在最优选的实施方案中，通式(III)中由X’或Y’表示的聚合物优选直接或通过间隔基共价键合于衍生自K-252a衍生物的四氢呋喃部分的C3位置的羟基的氧原子。在这个优选实施方案中，在通式(III)中，Y’表示聚合物部分，L²优选为氨基甲酸酯或醚键(图1a)。在选择性的最优选的实施方案中，聚合物优选直接或通过间隔基共价缀合于衍生自K-252a衍生物的四氢呋喃部分的C3位置的甲酯基团的羰基。在这个选择性的实施方案中，在通式(III)中，X’表示聚合物部分，L¹优选为酰胺或胺键(图1b)。

聚合物部分对式(I)、(II)、或(III)的吲哚并咔唑化合物的共价连接通过已知的化学合成得到。具体地，用于得到式(III)化合物的聚合物对K-252a或其衍生物的共价连接可通过已知的化学合成技术实现。例如在本发明的1个示例性实施方案中，K-252a或其衍生物的聚合物缀合可以通过在适当的反应条件下使异氰酸酯活化的聚合物与K-252a或其衍生物反应完成，通常按以下反应流程描述：

聚合物-NCO+HO-药物→聚合物-NH-CO-O-药物

根据这个合成流程，图2表示了本发明的1个实例，其中，式(III)的化合物是通过使聚合物部分Y’(为异氰酸酯活化的PEG)与K-252a的四氢呋喃部分的C3位置上的羟基反应而得到的。由此，通过连接基团L²(为氨基甲酸酯连接基团)得到聚合物和K-252a之间的缀合。

在本发明中，意外地发现，与吲哚并咔唑化合物的成员相比，特别是与K-252a或其衍生物相比，由于溶解度提高，式(I)、(II)和/或(III)的化合物表现出改善的药代动力学和毒理学性能，导致生物利用度改善。在本发明的另一个方面中，意外地发现，在将式(I)、(II)和/或(III)的化合物局部给药时，由于增加的分子大小和亲水性，它们表现出有限的系统吸收，从而减少了系统毒性和/或副作用(参见实施例2)。

另外，本申请的发明人还意外地发现，与吲哚并咔唑化合物本身、特别是K-252a及其衍生物的无选择性的激酶抑制活性相比，式(I)、(II)和/或(III)的K-252a聚合物缀合物表现出在针对TrkA酪氨酸激酶的抑制活性的选择性方面的显著增加(参见实施例3)。因此，本发明的吲哚并咔唑化合物特别是K-252a与聚合物分子的缀合导致得到了对其治疗靶有选择性以及不期望的副作用减少的活性剂。

由此，本发明的另一个方面是式(I)、(II)和/或(III)的化合物作为药物中的活性剂的用途。在本发明优选的方面中，式(I)、(II)和/或(III)的化合物用作用于系统给药和治疗的药物中的活性剂。在另1个优选的方面中，本发明涉及式(I)、(II)和/或(III)的化合物作为局部治疗用药物中的活性剂的用途。

特别地，本发明的缀合的聚合物化合物在用于预防、减轻和治疗HMGB1相关病理学的药物中用作活性剂。

HMGB1相关病理学是患者的一种状况，其中，存在于生物学流体和组织中的乙酰化或非乙酰化形式的核内蛋白HMGB1和/或HMGB1同源蛋白的浓度与正常主体中的浓度相比有所提高，在正常主体中，HMGB1核内蛋白实际上是不可检测的。细胞外的HMGB1s起到有效的趋化性的促炎性的趋化因子的作用。因此，HMGB1相关病理学是具有强烈的炎性基础的病理学，由细胞因子例如TNF-α、IL-1、IL-6等的刺激产生的病理学，或由有害事件例如中毒、感染、烧伤等产生的病理学。特别地，已经在脓毒病患者的血浆中、在类风湿性关节炎患者的血浆和滑液中、在阿尔茨海默氏病患者的脑中、在黑素瘤患者的血浆和组织中、在系统性红斑狼疮患者的血浆中、在动脉粥样硬化患者的动脉粥样硬化斑块中等发现和测定了高浓度的HMGB1蛋白质和同源蛋白。生物学流体和组织中的HMGB1蛋白质和/或同源蛋白的测定和证明可通过本领域技术人员已知的普通诊断工具来检测，包括例如通过ELISA检测法等检测。

因此，有多种疾病特征在于细胞外HMGB1的相应存在，其特别地包括但不限于炎性疾病、狭窄、再狭窄、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病、脓毒病、急性炎性肺损伤、红斑狼疮、神经变性疾病、中枢和外周神经系统的疾病和多发性硬化。在更优选的实施方案中，式(I)、(II)和/或(III)的缀合的聚合物化合物用于预防、减轻、和治疗心血管疾病，特别是动脉硬化症和/或在血管成形术过程中和之后发生的再狭窄。该药物进一步优选用于阻断、延迟和/或削弱血管成形术过程中或之后的再狭窄中的结缔组织再生。

在本发明特别优选的方面中，式(I)、(II)和/或(III)的缀合的聚合物化合物有效地用作药物中的活性剂，所述药物用于预防、减轻和治疗中枢和外周神经系统的神经学障碍、神经病和神经变性病症。

发明人进一步表明，新的聚合物缀合化合物能够减少和/或抑制通过系统处理引起的血浆细胞因子分泌。因此，聚合物缀合化合物用作用于系统给药的药物中的活性剂，用于预防、减轻和/或治疗涉及血浆细胞因子分泌增加的病理学。这些病理学优选为主要涉及分泌TNF-α、IFN-γ、MCP-1、MIP-1和/或RANTES(趋化因子)的病理学。

特别地，在本发明的上下文中，与血浆细胞因子分泌增加有关的病理学包括但不限于炎性疾病、自身免疫性疾病、全身炎症反应综合症、器官移植后的再灌注损伤、心血管疾病、产科和妇科疾病、感染病、过敏性和特异反应性疾病、实体瘤和液态肿瘤病理学、移植排斥疾病、先天性疾病、皮肤疾病、神经疾病、恶病质、肾疾病、医原性中毒状况、代谢和自发性疾病、和眼科疾病。

在最优选的实施方案中，本发明的化合物用作用于系统治疗的药物中的活性剂，用于预防、减轻和/或治疗贝切特氏病、斯耶格伦氏综合征、血管炎、葡萄膜炎、视网膜病。

在本发明的又1个特别的方面中，优选本发明的缀合的聚合物化合物用作局部治疗用药物中的活性剂，用于预防、减轻和/或治疗皮肤病理学。

在本发明的上下文中优选的皮肤病理学是以角质形成细胞过度增殖为特征的病理学，例如银屑病、特异反应性皮炎、慢性湿疹、粉刺、毛发红糠疹、瘢痕瘤、肥厚性疤痕、和皮肤瘤例如角化棘皮瘤、扁平细胞癌、基底细胞癌。在更优选的实施方案中，本发明的化合物在用于预防、减轻和治疗银屑病的局部治疗用药物中用作活性剂。

由于本发明的化合物在抑制TrkA方面的提高的选择性，本发明的另一个方面是所述缀合化合物在预防、减轻和治疗其中的TrkA在病理生理学机制中起关键作用的病理学中的用途，这导致该病理学的进展。在这种情况下，在本发明更优选的实施方案中，式(I)、(II)和/或(III)的缀合的K-252a聚合物化合物用作用于预防、减轻和治疗与NGF相关疼痛和痛觉过敏的药物中的活性剂。

因此，本发明的另一个方面是任选地上述定义的式(I)、(II)、和/或(III)的化合物用于生产药物的用途，所述药物用于预防、减轻或/和治疗如上所述的病理学。

式(I)、(II)、和/或(III)的化合物可单独使用或与一种或多种其他活性剂组合使用。特别地，本发明的聚合物缀合物化合物可用于与至少一种能够抑制炎性细胞因子级联的早期介质的其它试剂组合，所述其它试剂例如选自由TNF，IL-1α，IL-1β，IL-R_a，IL-8，MIP-1α，MIF-1β，MIP-2，MIF和IL-6组成的组的细胞因子的拮抗剂或抑制剂。

可用于与本发明的聚合物化合物组合的其它试剂例如为RAGE的拮抗剂和/或抑制剂、HMGB1的拮抗剂和/或抑制剂、Toll样受体(TCR)与HMGB1相互作用的拮抗剂和/或抑制剂、血栓调节素的官能性N-末端外源凝集素样结构域(D1)、和/或具有如国际专利申请WO2006/002971中所述的弯曲形结构的合成的双链核酸或核酸类似物分子。

式(I)、(II)、和/或(III)的化合物或其可药用盐可以直接给药，或者根据药理学活性和给药目的而以多种药物组合物的形式给药。本发明的又一个方面是药物组合物，其包括有效量的至少一种式(I)、(II)和/或(III)的化合物、任选地可与可药用的载体、助剂、稀释剂或/和添加剂一起使用。药用载体、助剂、稀释剂或/和添加剂为本领域技术人员已知的，并且因此可以用在包含本发明化合物的药物组合物的制剂中。

本发明的药物组合物可以本领域技术人员已知的适宜方式给药，例如由医师给药。特别地，本发明的药物组合物可通过注射或输注给药，特别是通过静脉内、肌肉内、经粘膜、皮下或腹膜内注射或输注、和/或通过口服、局部、皮肤、鼻、吸入、气雾剂和/或直肠用药等给药。给药可为局部的或系统的。优选地，本发明的化合物和药物组合物的给药可通过肠胃外给药进行，特别是以液体溶液或混悬液的形式；或通过口服给药，特别是以片剂或胶囊的形式；或者鼻内给药，特别是以粉末、滴鼻剂、或气雾剂的形式；或经皮给药，通过例如软膏、霜剂、油剂、脂质体或透皮贴剂进行。

根据本发明的一个方面，药物组合物为系统给药。特别地，聚合物缀合化合物可以通过注射或输注给药，特别是通过静脉内、肌肉内、经粘膜、皮下或腹膜内注射或输注、和/或口服给药。

在最优选的实施方案中，本发明的药物组合物通过局部施用给药，特别地，通过皮肤施用给药。在皮肤施用的情况中，本发明化合物的给药可以脂质体形式进行。

在本发明进一步最优选的实施方案中，药物组合物可逆地固定在医疗器械表面而被给药，特别地，将本发明的化合物和/或组合物结合、涂覆和/或嵌入于医疗器械，例如支架、导管、手术器械、套管、心脏瓣膜、或血管假体，但不限于此，在该医疗器械接触体液或身体组织之后，可逆固定的化合物被释放。随后，被涂覆的医疗器械起到洗脱药物的药物输送装置的作用，从而药物给药动力学得以控制，提供例如立即释放、或控制、延迟、或持续的药物输送。医疗器械的涂覆技术是本领域技术人员公知的。

本发明的药物组合物可用于诊断或治疗应用。对于诊断应用，式(I)、(II)、和/或(III)的化合物可以被标记的形式存在，例如以包含同位素(例如放射性同位素或可通过核磁共振检测的同位素)的形式存在。在局部施用的情况下，优选的治疗应用是预防、减轻和治疗银屑病，而在系统应用的情况下，优选的治疗应用是预防、减轻和治疗再狭窄所致的结缔组织再生。

本发明的化合物可以用作药物组合物中的唯一活性成分。或者，它们可用于与其它活性成分联合，例如与用于治疗上述定义的病理学的其它活性药物成分联合。

本发明的化合物在药物组合物中的浓度可以变化。该浓度取决于多种因素，例如所被给药的药物总剂量、所用化合物的化学特征(例如疏水性)、给药途径、患者的年龄、体重和症状。本发明的化合物一般地在包含约0.1～10％w/v化合物的含水生理学缓冲溶液中提供，用于肠胃外给药。典型的剂量范围为每天约1μg～约1g/kg体重；优选的剂量范围为每天约0.01～100mg/kg体重，优选为约0.1～20mg/kg体重，每天一至四次给药。要被给药的优选的药物剂量可能取决于多个变量，例如疾病或病症的类型和进展程度、具体患者的总的健康状况、所选择的化合物的相对生物学效力、化合物赋形剂的制剂、及其给药途径。

本发明的又一个方面是未缀合的K-252a化合物或其衍生物用于生产药物的用途，所述药物用于预防、减轻和/或治疗贝切特氏病。

优选的K-252a衍生物包括合成和/或化学修饰的化合物，例如在环系统上具有取代基(例如C₁-C₄烷基)的化合物、其中的甲基酯被另外的酯基、酰胺基或被H或阳离子代替的化合物、和/或其中的环酰胺基团的N原子被C₁-C₄烷基取代的化合物。

附图说明

通过以下附图和实施例进一步描述本发明。

图1a和1b描述了K-252a及其衍生物的聚合物缀合物的结构。

图2描述了其中的PEG通过氨基甲酸酯键连接于药物的K-252a-PEG缀合物的结构。

图3为纯化的PEG缀合物的色谱图，其中的PEG通过氨基甲酸酯键连接于K-252a并且PEG链具有2000Da的平均分子量。在插图中，表示了主峰的MALDI-TOF光谱。

图4a表示在K-252a局部给药之后在小鼠血浆成分中检测的K-252a的平均血浆浓度结果。

图4b是表示在以约10μmol/kg剂量(相当于5.07mg/kg)的K-252a单次皮肤给药之后的平均血浆浓度相对于时间的分布的图。

图5表示缀合的化合物K252a-PEG(2K)在MTT-试验中在48和96小时的接触时间之后对角质形成细胞的抗增殖活性。

图6表示在MTT试验中K252a-PEG(2K)对角质形成细胞的抗增殖活性。图6a表示分别在1、2和4小时的接触时间下，在48小时后进行的细胞计数。图6b表示分别1、2和4小时的接触时间下，在96小时后进行的细胞计数。

图7表示在MTT试验中K252a对角质形成细胞的抗增殖活性。图7a表示分别在1、2和4小时的接触时间下，在48小时之后进行的细胞计数。图7b表示分别在1、2和4小时的接触时间下，在96小时之后进行的细胞计数。

图8是比较K252a和K252a-PEG(2K)在MTT试验中在4小时的接触时间之后对角质形成细胞的抗增殖活性的图，在96小时之后进行的细胞计数。

图9a和图9b报告了K-252a和K-252a-PEG(2K)分别对普通的酪氨酸激酶的抑制活性。

图10是表示K-252a和K-252a-PEG(2K)分别的激酶抑制性的图，并且报告了将K-252a-PEG(2K)与K-252a在激酶抑制的选择性方面的对比。图10申报告的数据将TrkA抑制活性规格化。

图11表示K-252a和K-252a-PEG(2K)对TrkA的IC₅₀及各自的抑制曲线。

图12表示与用LPS处理之前只接受赋形剂溶液的对照小鼠相比，在用LPS-剂量注射诱导内毒素血症之前用K-252a-PEG(2K)处理的小鼠血浆中的TNF-α分泌抑制。在图中，误差线表示通过二因素方差分析的SEM数据，然后进行Bonferroni事后检验。

图13a)到13e)表示分别在用LPS剂量注射诱导血毒症之前用未缀合的K-252a处理的小鼠与在LPS处理之前只接受赋形剂溶液的对照小鼠相比，分别对血浆中的TNF-α，IFN-γ，MCP-1，MIP-1和RANTES分泌的抑制。在图中，符号“§”代表范围外结果。

实施例

在以下实施例中，术语“K-252a-PEG”、“K-252a-PEG(2K)”或“CT327”代表的制品对应于其中的K-252a通过氨基甲酸酯键与直链的2kDa PEG链的四氢呋喃部分的-OH基团缀合的本发明的化合物。

实施例1

K-252a-PEG(2K)缀合物(化合物CT327)的合成

通过温和的搅拌将1.5mg的K-252a(相当于3.208μmol)溶解在1.5ml的CH₂Cl₂中制备K-252a的1mg/mL二氯甲烷溶液。将该溶液加入到包含65.05mg(32.525μmol)的甲氧基-PEG-异氰酸酯2K(平均分子量为2000Da的m-PEG-异氰酸酯)和作为碱性催化剂的100μl的32.684mg/mL三乙胺的CH₂Cl₂溶液的玻璃烧瓶中。聚合物和催化剂二者都以相对于K-252a为10倍的摩尔比使用。将混合物保持在磁力搅拌(转速约500rpm)和温和的氮气吹扫下在室温回流过夜(反应时间＝16小时40分钟)。然后将溶液蒸发并将固体残余物用300μL的DMSO处理。将混合物通过RP-HPLC在C18柱上纯化，从而得到期望的产物(峰对应于约59/41ACN/水梯度)。将四个随后的纯化步骤的相应级分合并并且通过ACN蒸发干燥然后冷冻干燥。MALDI-TOF分析确认产物为K-252a-PEG缀合物(最大m/z值为2468.81的多分散质量峰)[图2，3]。

实施例2体内药代动力学研究

实施例2.1

K-252a与K-252a-PEG在小鼠中的皮肤吸收研究

进行本研究的目的是测量和评价比较在小鼠中皮肤给药K-252a-PEG之后的吸收动力学与未缀合的(即，未PEG化的)K-252a分子的吸收动力学。两种制剂都使用3mg/kg的活性剂量进行实验。对于本研究，使用每次6只购自Charles River公司(意大利)的Balb/C雄性小鼠进行随后的三个实验。小鼠再分为以下实验组(每组二只动物)：

第1组：小鼠通过皮肤给药用3mg/kg的K-252a处理并且在30分钟之后处死。

第2组：小鼠通过皮肤给药用3mg/kg的K-252a处理并且在60分钟之后处死。

第3组：小鼠通过皮肤给药用3mg/kg的实施例1的K-252-a-PEG(2K)处理并且在60分钟之后处死。

通过用橄榄油稀释储备溶液(K252a储备溶液得自Calbiochem公司批号B50496，为100μg/214μL的DMSO溶液；K-252a-PEG(2K)储备溶液为0.226mg K252a/mL的DMSO溶液)直到K-252a的最终浓度达到0.3mg/mL橄榄油/DMSO 6％，分别制备K-252a和K-252a-PEG(2K)制剂。溶液分别如下制备：60μL K-252a 5mg/mL DMSO+940μL橄榄油和30μL K252a-PEG(2K)，5mg/mL DMSO+470μL橄榄油。基于油的制剂为乳剂形式，其通过重复的超声处理而变为均质的。在每只动物的后背(在实验之前72小时用电剃刀剃毛)上施予240μL的K-252a溶液和235μL的K-252a-PEG溶液(基于23-24g的小鼠平均体重，相当于3mg/kg的剂量)。将施予的乳剂在小鼠后背上温和地按摩，以利于吸收。然后分别在30或60分钟之后在乙醚麻醉下将小鼠处死，并且用胰岛素注射器从腹部主动脉收集血液(约1mL/动物)。然后将血液转移到包含50μL的5％EDTA水溶液的Eppendorf管中。然后将血液样品在冷冻(4℃)离心机中在2000g离心5分钟，通过固相提取(SPE)纯化，然后通过HPLC定量分析进行分析(RT-HPLC分析使用XTerra C18柱，洗脱剂：水/ACN)。

用K-252a处理的小鼠的血浆样品在两个接触时间都表现出确定的血浆浓度。结果如图4中所示，从中可以看出，在30分钟之后处死的第1组小鼠中的K-252a的平均血浆浓度是23.33ηg/mL，而在60分钟之后处死的第2组小鼠中的K-252a的平均血浆浓度为42.11ηg/ml。这表明K-252a的皮肤给药发生了系统吸收。另一方面，将用皮肤给药PEG化的缀合物K-252a-PEG(2K)处理的小鼠的血浆样品即使在60分钟接触时间后也没有表现出活性物质的任何血浆浓度。实际上，在第3组小鼠的血浆样品中不可能显示任何色谱峰，即使是用MALDI-TOF分析之后。因此，在皮肤给药之后没有观察到K-252a-PEG(2K)缀合物通过皮肤的吸收。

这些数据已经被对更大的试验动物组及皮肤给药不同剂量的活性剂的进一步实验研究证实。

实施例2.2

在小鼠中的药代动力学(PK)研究：CT327与K-252a的皮肤单次剂量给药和重复给药

这个实验的目的是在小鼠中单次皮肤给药CT327和K-252a之后评价比较CT327和K-252a的吸收动力学，以及在重复皮肤给药之后比较两种试验化合物的动力学。

·动物：小鼠(Balb/c雄性，7-9周龄，意大利Charles River公司，平均体重22.2-22.4g)；5个实验组(对照、单次和重复给药K-252a、单次和重复给药CT327)，4动物/组，随机分组)。

·材料：K-252a(Cephalon，批号04274Fla)、CT327(Alchemy，批号ALC577.02)、二甲亚砜(DMSO)Hybri-max

(Sigma，批号114K2370)、白凡士林F.U.(AFOM Medical，批号A908006570)、吐温20(Sigma，批号092K0055)、H₂O MilliQ、鼠血浆(品种CD1，OF1，批号50-18/12/05，由Charles River Laboratories Italia SpA，Calco提供)、乙腈(默克制，批号I260430545)、甲醇(VWR BDH，批号05Z4034)、EDTA(Fluka，批号393230/1)。

·给药剂量：对于单次给药，K-252a 5.075mg/kg，CT32725.27mg/kg(以78.5％纯度计，即为32.19mg/kg，相当于K-252a的等摩尔剂量)；对于重复的皮肤给药(一天一次，持续5天)，K-252a 1.03mg/kg，CT327 5.06mg/kg(以78.5％纯度计，即为6.45mg/kg，相当于K-252a的等摩尔剂量)。

·试验项目的给药：对于皮肤给药，将约0.25g的凡士林膏涂在每只小鼠的颈部(在开始实验前一天剃毛，避免皮肤磨损)。对照动物只接受相同剂量体积的赋形剂。

·试验制品制剂：对于单次皮肤给药为DMSO 1.1％/白凡士林膏，对于重复皮肤给药为DMSO 0.23％/白凡士林膏。

·动物处死和血液收集：在处理之后的以下时间点收集血液样品：

单次皮肤给药：在给药K-252a或CT327之后的1，3，6，9，18，24，36，48和72小时

重复皮肤给药：分别在K-252a和CT 327的最后一次给药之后的3小时和24小时。

在每个取样时间，在深度乙醚麻醉下，使用胰岛素注射器从每只动物的腹部主动脉收集大约0.4mL血液样品，并且转移到包含50μL的5％EDTA水溶液的聚乙烯Eppendorf管中，以防止血液凝固。将血液样品在冷冻离心机(2-4℃)中在1400g离心5分钟(之前将其保存在冰中)。然后从每个管回收血浆样品，置于新的Eppendorf管中并且在-20℃冷冻，直到进行HPLC分析。

图4b表示单次给药研究的结果。表示了单次皮肤给药K-252a之后的K-252a血浆浓度曲线，报告为平均值±误差(95％置信区间，即95％CI)(每个时间点4只小鼠，一式两份分析)。相反，CT327单次皮肤给药后没有检测到血浆浓度分布。实际上，与用K-252处理的小鼠相比，对接受单次皮肤给药相当于等摩尔量K-252a的CT327的小鼠的血浆样品的分析在任何时间点都没有显示超过检测限(70.6nM)的试验化合物水平。

然后通过NCOMP 3.1版程序(P.B.Laub等人，Journal ofPharmaceutical Sciences，1996，85(4)：393-395)对得自每个实验组的数据进行计算机拟合。通过以前描述的常规公式计算血浆浓度-时间曲线的曲线下面积值、T_1/2、T_max、C_max等(Gibaldi等人，Pharmacokinetics，1982，Marcel Dekker公司，纽约)。通过拟合K-252a和CT 327的血浆浓度数据估算的它们的PK参数列举在以下表1中。

表1：在小鼠中单次皮肤给药(10μmol/kg)之后估算的K-252a和CT327的血浆药代动力学参数

PK参数	K-252a，皮肤给药	CT327，皮肤给药
			AUC0-∞(nM.分钟)	2.85×105	ND
最终的T1/2(分钟)	63.13	ND
			Tmax(分钟)	180.00	ND

Cmax(nM)

907.98

ND

缩写：AUC_0-∞＝从时间零点到无限的曲线下面积，T_1/2＝半衰期，C_max＝最大血浆水平，T_max＝达到最大血浆水平的时间，ND＝未检出

这个研究的结果证实，在单次皮肤给药之后，K-252a在给药之后的至少直到9小时在血浆中是可检测的(半衰期63分钟)，而在与K-252a等剂量的CT327给药之后，接触时间达到72小时时仍然无法在血浆中检测出CT327。

表2表示重复皮肤给药研究的结果。特别是表2表示重复给药K-252a和CT327后的平均血浆水平的HPLC分析结果。如表2所示，K-252a表现出可检测的和可以计量的血浆浓度，而对于CT327，在重复给药之后收集的血液中则没有显示出可检测水平的试验化合物。

表2：分别以1.03mg/kg和5.06mg/kg的剂量(约2μmol/kg)重复皮肤给药(每日一次，持续5天)之后的K-252a和CT327的平均血浆浓度

试验项目和时间点	平均血浆浓度(nM)	95％CI
			K-252a，t＝3小时	110.19	29.15
CT327，t＝24小时	未检出	-

由此，在这个第二项研究中，评价了以更低剂量(2μmol/kg)重复皮肤给药(每天一次，持续5天)之后的吸收。即使在这种情况下，在鼠血浆样品中仍没有可检测的对应于PEG化分子CT327的色谱峰。选择充分长的血液收集时间点(24小时)以便提供最终的非常慢的吸收的证据。然而，提供的数据得到在皮肤给药K-252a-PEG(2K)之后没有发生通过皮肤的吸收的结论。在代之以K-252a化合物时，在最后一次皮肤给药之后的3小时得到的K-252a血浆水平为110.2nM，其与单次皮肤给药的相同的剂量和时间点得到的浓度(72.9nM±32.5，为数值±95％置信区间)相比甚至略高。

总之，本研究的结果证实了K-252a的聚合物缀合物在以较高剂量单次皮肤给药或在以较低剂量局部处理5天之后的在避免K-252a系统吸收方面的效果。

实施例3.体外药理学

实施例3.1

用于表征K252a-PEG(2K)作为Trka抑制剂对人角质形成细胞抗增殖活性的体外研究

进行代谢MTT-试验作为细胞生命力的检验。使用公知的和已验证的试验方案进行MTT试验，由此，结果通过分光光度法进行定量，活细胞数目与作为MTT([3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物])还原产物形成的甲鐕产物的量成正比(Mosmann T.，Rapidcolorimetric assay for cellular growth and survival：Application to proliferation and cytotoxicity assays.J.Immunol.Met hods.1983，Dec.16，65(1-2)：55-63)。在本研究中，对用于细胞培养的96孔板中接种的角质形成细胞的汇合培养进行MTT试验(8000细胞/孔)。在细胞已经暴露于要被分析的物质之后，将细胞在不含血清的角质形成细胞生长培养基(KGM Clonetics公司，圣地亚哥，加拿大，美国)中与MTT(0.05％)在37℃孵育4小时。在细胞用洗涤剂溶解后，使用用于多孔板的分光光度计在540nm检测染料甲鐕的形成。结果以光密度单位(OD)给出。

使用MTT试验检测缀合产物K-252a-PEG(2K)的抗增殖活性，使在孔中分离的角质形成细胞与待测化合物的溶液分别接触48小时和96小时的时间，使用5、10、50和100nM浓度的K-252a-PEG(2K)。所有的实验进行至少三次。使用ANOVA模型对MTT试验的结果进行统计分析(误差线表示95％置信区间，p＝0.05)。图5表示K-252a-PEG(2K)在MTT试验中的结果。明显地证明K-252a-PEG在48小时的接触时间之后在≥10nM的浓度下表现出对角质形成细胞的抑制作用，而在96小时的接触时间之后任何浓度都表现出抑制效果。

这些结果表明，K-252a与聚合物PEG的缀合物不影响活性分子K-252a的抗增殖活性(图5)。实际上，在48小时和96小时的接触时间之后，都表现出对角质形成细胞增殖的抑制作用。

因此，进行进一步的MTT试验分析以证明在局部给药之后PEG缀合的K252a系统吸收不出现或延迟(如实施例2)以及对角质形成细胞增殖的抑制活性的延迟可能是由于缀合(即PEG化)引起的缀合的K-252a-PEG(2K)化合物进入角质形成细胞延迟的结果。

因此，已经如上所述进行了进一步的体外MTT试验，使用K-252a和K-252a-PEG(2K)二者作为待测化合物，用以检验对角质形成细胞的抗增殖活性，其中，尽管活性物质与孔中角质形成细胞的接触时间缩短。K252a和K-252a-PEG(2K)浓度分别是25、50和100nM。对于每个浓度，接触时间分别是1、2和4小时。在48小时和96小时之后进行细胞计数。

使用K-252a-PEG(2K)进行MTT试验的结果如图6所示。在48小时和96小时之后，缀合的化合物K-252a-PEG(2K)对角质形成细胞增殖的效果没有表现出不同于对照样品所得效果的统计学差异(图6a和图6b)。

使用未缀合的K-252a进行相同的MTT试验，结果如图7a(在48小时之后进行细胞计数)和图7b(在96小时之后进行细胞计数)所示。这些结果表明，对于任何接触时间，在≥200nM的浓度和在48小时之后进行细胞计数的K-252a有统计学显著性的抗增殖作用。在96小时之后进行细胞计数时，甚至对于任何检验浓度和任何接触时间都得到抗增殖活性。

图8表示，在上述MTT试验中在4小时的接触时间和在96小时之后进行细胞计数时，分别为100nM的K-252a和K-252a-PEG(2K)的抑制活性数据的比较。

这些结果显示，与未缀合的K-252a化合物相反，对于≤100nM的浓度，4小时的接触时间对于K-252a-PEG(2K)来说不足以逐步形成其抗增殖作用(即使当96小时之后进行细胞计数时)。与未缀合的(即，未PEG化的)K-252a相比，对于较低浓度的K-252a-PEG(2K)来说，需要较长的接触时间来获得期望的对角质形成细胞增殖活性的抑制效果。对于K-252a-PEG(2K)，其进入细胞的能力有明显的延迟，因此，表现出由于K-252a分子的PEG化产生的通过细胞膜的延迟。

这似乎进一步证实了K-252a化合物及其衍生物在细胞内聚集并且随后缓慢释放活性分子(即使在除去培养基之后)之后发挥它们活性的假设。

实施例3.2

体外评价K-252a和CT327的激酶抑制性

在文献中公知K-252a是几种激酶的有效抑制剂。在本研究中，评价了K-252a对选择的普通酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制活性。已经进行了类似的实验以评价CT327的抑制活性。

将K-252a(Acros制，批号A020265401)溶解于DMSO，得到1mM的储备溶液，然后将其用DMSO稀释，以得到20μM的溶液，进一步用试验缓冲液稀释，得到0.8μM的浓度。K-252a以200nM的浓度进行试验。CT327和参考化合物的制备根据相同的方法进行。CT327也以200nM的浓度进行试验。作为本发明的参考化合物，使用本领域中公知的蛋白激酶抑制剂，例如星孢素、5-碘代杀结核菌素(5-iodotubericidin)、JNK抑制剂II和SB202190(如表3中所示)。

表3：参考化合物

参考化合物	浓度(nM)	激酶
			星孢素	0.3-10000	酪氨酸激酶其它丝氨酸/苏氨酸激酶
5-碘代杀结核菌素	10000	ERK1、ERK2
			JNK抑制剂II	300	JNK1、JNK2
SB202190	300	p38α、p38β

使用各自激酶的标准试验进行K-252a和C327的激酶抑制研究。

K-252a的酪氨酸激酶抑制性和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制性的结果分别表示在图9a所报告的表a和b中。CT327对待试验的酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制活性分别表示在图9b所报告的表a和b中。反应对照(含ATP)的读数设置为0％抑制，背景(不含ATP)的读数设置为100％抑制。

K-252a在200nM的浓度表现出对16种试验激酶(TNK1、JAK2、JAK3、TYK2、FLT3、PDGFRα、PDGFRβ、RET、TrkA、TrkB、TrkC、CHK1、CHK2、JNK1、JNK2、AurA和MAP2K3)为大于90％的非常强烈的抑制活性和对其它7种试验激酶(MER、JAK1、MET、KIT、BLK、FGR和CaMK2a)为80％～90％的强烈抑制性。

相反地，在与K-252a相比相等的浓度(200nM)，CT327只在试验酪氨酸激酶中表现出对TrkA的强烈的抑制活性(＞50％)。CT327表现出对JAK2、JAK3和FLT3的低的活性(为20％～30％)，而对TNK1、EphB4、PDGFRβ、BLK、LCK、TrkB和TrkC表现出非常低的活性(为10％～20％)。对于大多数试验的酪氨酸激酶则根本没有观察到抑制。

在丝氨酸/苏氨酸激酶中，CT327只表现出对MAP2K3有强烈的抑制活性(＞40％)、对JNK3(突出为绿色)为非常低的抑制性(14％)、对试验的其它丝氨酸/苏氨酸激酶根本没有表现出抑制活性。

图10报告了CT327与K-252a之间关于选择性的对比。结果清楚地表明，与K-252a相比，CT327的激酶抑制选择性有显著的改善。特别地，结果证明，CT327对酪氨酸激酶组中的TrkA和对丝氨酸/苏氨酸激酶组中的MAP2K3激酶抑制活性的选择性增加。

这些数据表明，CT327的抑制选择性特别地针对主要的靶目标TrkA和MAP2K3，随之发生来自对其它激酶的抑制活性的不期望的生物学影响降低。因此，其它激酶越少被抑制，则该分子有可能毒性越少。

综上，实施例2和3中所述研究的结果使式(I)的K-252a的聚合物缀合物、特别是K-252a-PEG(2K)成为药物中活性剂的有希望的候选者，这是由于完整无损的生物活性和相伴的副作用风险降低。

实施例3.3

体外评价K-252a和CT327的对TrkA的IC₅₀

本研究的目的是测量CT327和K-252a对TrkA激酶的IC₅₀。将试验化合物溶液用DMSO稀释，以得到100倍稀释的低浓度，然后再用试验缓冲液(15mM Tris-HCl、pH7.5、0.01％吐温20、2mM DTT)稀释25倍，以得到最终的试验溶液。CT327和K-252a在以下浓度进行试验：1000nM、300nM、100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM、0.1nM、0.03nM。参考化合物(星孢素)的制备以与用于制备试验化合物相同的方法进行。星孢素在以下浓度进行试验：100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM、0.1nM、0.03nM、0.01nM和0.003nM。试验方法如下：

ELISA

反应对照(含ATP)的读数设置为0％抑制，背景(空白)(不含ATP)的读数设置为100％抑制，然后计算各个试验溶液的抑制百分比。通过拟合四个参数的逻辑对数曲线从浓度相对抑制％的曲线计算IC₅₀值。

K-252a和CT327对TrkA的IC₅₀值分别为0.50nM和186nM。参考化合物(星孢素)对TrkA的相应IC₅₀值为0.12nM。这些结果总结在图11中。

实施例4

在小鼠中CT327与K-252a的单剂量的急性毒性研究

本研究的目的是进行非临床毒性研究，以便评价CT327与其前体K-252a相比在通过腹腔和口服途径单剂量给予时在小鼠中的毒性。被分为14个组(7组中的每组由5只雄性组成，7组中的每组由5只雌性组成)的总共70只小鼠(Balb/c小鼠，35只雄性和35只雌性)接受以下剂量水平的试验项目：

K-252a：30，45，60，75，和90mg/Kg

CT327：316.68和475.02mg/Kg(分别相当于60和90mg的K-252a)。

在给药之后的前6个小时中的每30分钟和在随后的7天中每天两次进行包括临床现象和行为变化的观察。

在用K-252a处理的雄性组中，只有给予最低剂量(30mg/Kg)的那些存活，而其余所有小鼠都在剂量给药之后的前22小时内死亡。得到的LD₅₀为37.74mg/kg。

与给予相同剂量的雄性小鼠一样，给予最低K-252a剂量的雌性小鼠也存活，表现出非常温和/温和的镇静，并在8-10小时内消失。在给予45mg/kg的五只中有一只雌性小鼠存活，在接受60mg/kg的那些雌性小鼠中有一只存活。更高剂量的K-252a对于所有的雌性小鼠都致死。雌性的LD₅₀为41.44mg/kg。因此，雄性和雌性小鼠的平均LD₅₀为39.02mg/kg。

在用等于316.68和475.02mg/kg(分别相当于60和90mg/kg的K-252a)的CT327处理的所有组中，无论是刚给药之后的几小时内或在7天的观察期内都没有发现诱导任何毒性的行为和/或临床征兆。

在口服给药之后得到类似的结果。特别地，认为K-252a的LD₅₀为78mg/kg，而CT327直到790mg/kg的最大剂量仍未观察到致死。

实施例5

进行该研究的目的在于，在LPS诱导的内毒素血症之后的不同时间点定量测定小鼠血浆中的24种细胞因子并与从用CT327预处理的内毒素血症小鼠中得到的数据进行比较。

实验方案：

动物被分成根据以下时间表处理的两个实验组(55只小鼠/组)：

	对照(n＝55)	处理组(n＝55)
			时间：15分钟	赋形剂	CT-327(105.56mg/kg；腹腔注射)
时间：0	LPS(4mg/kg；腹腔注射)	LPS(4mg/kg；腹腔注射)

内毒素血症诱导：在时间0，两组都接受相当于4mg/kg的LPS剂量，腹腔注射。

CT327处理：“处理”实验组接受单剂量的CT327，相当于105.56mg/kg，腹腔注射。这个剂量在LPS内毒素血症诱导之前15分钟给予(时间0)。同时，“对照”组接受等体积的赋形剂溶液。

每个实验组被分成11个亚组，每亚组5只小鼠。各个亚组在不同的时间点处死小鼠并且收集血液样品。

收集血液样品的时间点为：

·时间：时间为0(基点)；在LPS处理之前

·时间：+30分钟；在LPS处理之后

·时间：+1小时；在LPS处理之后

·时间：+2小时；在LPS处理之后

·时间：+3小时；在LPS处理之后

·时间：+6小时；在LPS处理之后

·时间：+12小时；在LPS处理之后

·时间：+18小时；在LPS处理之后

·时间：+24小时；在LPS处理之后

·时间：+48小时；在LPS处理之后

·时间：+72小时；在LPS处理之后

将血液样品收集在柠檬酸钠管(100μl柠檬酸钠0.1M/900μl血液)中并且在4℃下以1000g离心10分钟。收集血浆样品并将50μl样品在-80℃冷冻，直到进行各种细胞因子特征的检验。在Torino大学的遗传学、生物和生化学部，在Silengo教授的带领下使用23-plex板通过Bio-Plex系统(Bio-Rad公司)两次分析样品。测定以下细胞因子的血浆水平：IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、KC、MIP-1-α、RANTES(趋化因子)、TNF-α、IL-9、IL-13、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、MCP-1、MIP-1-α。

最有统计学意义的结果表示在图12和13中。特别地，图12表示在用本发明的CT327化合物预处理的小鼠血浆水平中的TNF-α分泌明显减少。

图13a-e表示代之以K-252a进行的平行实验的结果。不仅TNF-α明显减少，而且I FN-γ、MCP-1、MIP-α和RANTES也明显减少。

实施例6

K-252a-PEG(1100)(化合物CT336)的合成

1)m-PEG₁₁₀₀-O-CH₂-COOE t的合成

在惰性气氛下、在室温下、在搅拌下、在适当的反应烧瓶中，将t-BuOK(11.2g，100.0mmol)加入到无水THF(70.0ml)中。

当溶解完成时，加入MeO-PEG₁₁₀₀-OH(22.0g，20.0mmol)，然后在30分钟内滴加BrCH₂CO₂Et(16.7g，100.0mmol)，并将反应烧瓶用水浴冷却。

在2小时之后，在40℃真空下除去溶剂。

将得到的残余物(约65g)溶解于H₂O(100mL)并迅速地用CH₂Cl₂(3×100mL)萃取溶液。将有机层脱水(Na₂SO₄)，并在40℃真空除去溶剂。

2)m-PEG₁₁₀₀-O-CH₂-COOH的合成

将上述得到的粗产物的m-PEG-O-CH₂-COOEt(约20g)溶解于NaOH水溶液(1N，200mL)中并且在搅拌下在60℃加热3小时。

然后使用HC l水溶液(1N，约165mL)将反应混合物酸化至pH3，然后用CH₂Cl₂(5×100mL)进行萃取分离。将收集的有机萃取物脱水(Na₂SO₄)，并且在真空下在40℃除去溶剂。

将得到的粘性油状物(约18g)滴加到冷的无水Et₂O(75mL)中，过滤、收集白色沉淀，并将剩余溶剂在室温下真空蒸发(15g)。

3)m-PEG₁₁₀₀-O-CH₂-NCO合成

在适合的反应烧瓶中，在搅拌下将m-PEG₁₁₀₀-O-CH₂-COOH(10.0g，9.1mmol)溶解于甲苯(80mL)中。然后蒸馏掉约15mL的溶剂，以便通过共沸蒸馏干燥混合物。

将残余物冷却到室温并且依次加入无水的Et₃N(1.1g，10.9mmol)和二苯基磷酰叠氮化物[(C₆H₅O)2P(O)N₃](2.7g，10.0mmol)。

在室温下30分钟之后，将混合物加热回流2小时，然后在60℃真空蒸发溶剂。

将得到的粘性油状物(约9g)滴加到冷的无水Et₂O(200mL)中，过滤、收集白色沉淀，并将剩余溶剂在室温下真空除去(6.0g)。

4)K-252a-PEG₁₁₀₀缀合物的合成

通过温和的搅拌将1.5mg的K-252a(相当于3.2μmol)溶解于1.5mL CH₂Cl₂中制备K-252a的1mg/mL DCM溶液。将该溶液加入到包含38.06mg(32.5μmol)的m-PEG₁₁₀₀-O-CH₂-NCO和作为碱性催化剂的100μL的32.8mg/mL的三乙胺的CH₂Cl₂溶液的玻璃烧瓶中。聚合物和催化剂二者都以相对于K-252a为10倍的摩尔比例使用。将混合物保持在磁力搅拌(转速约500rpm)和温和的氮气吹扫下在室温回流过夜(反应时间＝16小时40分钟)。然后将溶液蒸发并将固体残余物用300μL的DMSO处理。将混合物通过RP-HPLC在C18柱上纯化，从而得到期望的产物(峰对应于约61/39 ACN/H₂O梯度)。将四个随后的纯化步骤的相应级分合并并且通过ACN蒸发干燥，然后冷冻干燥。MALDI-TOF分析证实产物为K-252a-PEG₁₀₀缀合物。

参考文献

Tapley P等人，“K252a is a selective inhibitor of thetyrosine protein kinase activity of the trk family of oncogenesand neurotrophin receptors”，Oncogene 7：371-381，1992

DiMarco E等人，“Nerve growth factor binds to normal humankeratinocytes through high and low affinity receptors andstimulates their growth by a novel autocrine loop”，J.Biol.Chem.268：22838-22846，1993

Delsite R等人，“Anti-proliferative effect of the kinaseinhibitor  K252a on human prostatic carcinoma cell lines”，J.Androl.17：481-490，1996

Reddy KR，“Controlled-release，pegylation，liposomalformulations：new mechanisms in the delivery of injectabledrugs”，Ann.Pharmacother.34：915-923，2000

Harris JM等人，“Effect of pegylation on pharmaceuticals”，Nat.Rev.Drug Discov.2：214-221，2003

Pepinsky RB等人，“Design，synthesis，and analysis of apolyethylene glycol-modified(PEGylated)small moleculeinhibitor of integrin α4β1 with improved pharmaceuticalproperties”，J.Pharmacol.Exp.Ther.312：742-750，2005

Yang H等人，“HMGB1 as a cytokine and therapeutic target”，J.Endotoxin Res.8：469-472，2002

Wang H等人，“Extracellular role of HMGB1 in inflammationand sepsis”，J.Intern.Med.255：320-331，2004

Lotze MT等人，“High-mobility group box 1 protein(HMGB1)：nuclear weapon in the immune arsenal”，Nat.Rev.immunol.5：331-342，2005

Claims (27)

1.K-252a的聚合物缀合物或其可药用盐，

其特征在于，

K-252a与聚合物相缀合，聚合物通过氨基甲酸酯、醚、酯、碳、酰胺和/或胺键与K-252a连接，

聚合物的分子量为200～50000Da，其选自聚乙二醇PEG或甲氧基-聚乙二醇m-PEG。

2.权利要求1的聚合物缀合物，其中，聚合物是平均分子量为2000Da或5000Da的PEG或mPEG。

3.权利要求1的聚合物缀合物，聚合物是平均分子量为550Da或1100Da的PEG或mPEG。

4.药物组合物，包括至少一种权利要求1-3中任一项的聚合物缀合物，任选地与可药用的载体或/和添加剂一起使用。

5.权利要求4的药物组合物，用于诊断应用。

6.权利要求4的药物组合物，用于治疗应用。

7.权利要求1～3中任一项的聚合物缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、减轻或/和治疗与HMGB1相关的病理学，

其中，所述与HMGB1相关的病理学是狭窄、再狭窄、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病、脓毒病、急性炎性肺损伤、或中枢和外周神经系统的疾病。

8.权利要求7的用途，其中所述自身免疫疾病是类风湿性关节炎或红斑狼疮。

9.权利要求7的用途，其中所述中枢和外周神经系统的疾病是神经变性疾病或多发性硬化症。

10.权利要求7的用途，其中，所述与HMGB1相关的病理学为狭窄或再狭窄。

11.权利要求7的用途，其中，聚合物缀合物被可逆地固定在医疗器械的表面。

12.权利要求1～3中任一项的聚合物缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、减轻和/或治疗中枢和外周神经系统的神经学障碍或神经病。

13.权利要求12的用途，其中，所述神经病是神经变性病症。

14.权利要求1～3中任一项的聚合物缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、减轻或/和治疗皮肤病理学。

15.权利要求14的用途，其中，皮肤病理学的特征在于角质形成细胞的过度增殖。

16.权利要求14的用途，其中，皮肤病理学是银屑病、特异反应性皮炎、慢性湿疹、粉刺、毛发红糠疹、瘢痕疙瘩、肥厚性疤痕和皮肤瘤。

17.权利要求16的用途，其中，皮肤病理学是银屑病。

18.权利要求1～3中任一项的聚合物缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、减轻或/和治疗与NGF相关的疼痛和痛觉过敏。

19.权利要求14的用途，其中，药物制备为用于局部给药。

20.权利要求18的用途，其中，药物制备为用于局部给药。

21.权利要求19或20的用途，其中，给药是以脂质体的形式进行。

22.权利要求1～3中任一项的聚合物缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、减轻和/或治疗炎性疾病、自身免疫性疾病、器官移植之后的再灌注损伤、心血管疾病、产科和妇科疾病、感染病、过敏性和特异反应性疾病、实体瘤和液态瘤病理学、移植排斥反应疾病、先天性疾病、皮肤疾病、神经疾病、恶病质、肾疾病、医原性中毒状况、代谢和自发性疾病、和眼科疾病。

23.权利要求22的用途，其中所述炎性疾病是全身炎症反应综合症。

24.权利要求1～3中任一项的聚合物缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、减轻和/或治疗贝切特氏病、斯耶格伦氏综合征、血管炎、葡萄膜炎、视网膜病。

25.权利要求18的用途，其中，药物用于系统给药。

26.权利要求22的用途，其中，药物用于系统给药。

27.权利要求24的用途，其中，药物用于系统给药。

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