CN101215547A - 一种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物细胞提取及应用领域，提供一种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：首先无菌条件下脂肪源抽取，然后通过缓冲液浸泡、冲洗，再采用营养液水浴振荡消化，所得消化物过筛后取过滤液进行离心处理，获其基质微管层，沉淀部分除去红细胞，然后再离心处理后用营养液离心洗涤，将消化分离出的细胞用生理盐水稀释；接着将电泳槽用尼龙筛布均匀横向分为三格，按一定体积比置入氯化钾及葡萄糖酸钙溶液，交流电持续输入2～5分钟，然后将上述所得细胞溶液置入中间格电泳槽搅匀，直流电电泳15～30分钟，抽取正电极侧电泳槽内细胞液，即得脂肪间充质干细胞。该方法周期短，不会造成DNA双旋链上的基因排序紊乱或突变。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞提取及应用领域，特别是涉及一种干细胞提取方法。
背景技术
干细胞工程作为未来医学的趋势之一，正为越来越多的学者所重视。2007年10月8日，诺贝尔生理或医学奖表彰了两位美国科学家和一位英国科学家在干细胞方面的突出贡献。主要内容是利用未分化的干细胞，通过同源DNA重组，改造活体内特定基因，并为“基因靶向”技术的发展奠定了基础。这将产生一种全新的医疗技术，也就是筛选人体基因，通过干细胞修复受损组织或器官。
美国科学家发现，从病人臀部和大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。这一发现有可能使脂肪成为干细胞的主要来源，科学家今后可能将不必从胚胎组织或骨髓中提取干细胞，从而既降低成本，又避免伦理上的争论。
2007年2月出版的《自然科学进展》第17卷报道：“脂肪间充质干细胞是一类存在于脂肪组织中具有多向分化潜能的干细胞。近年来的研究证明：脂肪组织具有取材方便和干细胞含量高的优势！在研究与应用领域较骨髓干细胞具有更广阔的应用前景”。
另外，干细胞在抗衰老领域也具有突出的优势，但是，所有这些理论成果要从实验室走向实际临床应用，还有相当的距离。其主要原因是干细胞提取方法不易快速产量化，目前的干细胞提取方法主要采用传统的“贴壁、培养、传代”法。这类方法的弊端是周期太长，干细胞在体外增殖复制过程中，容易造成DNA 旋链上的基因排序紊乱或突变。
发明内容
鉴于以上问题，本发明的主要目的在于提供一种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法。
本发明提供的该种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法，主要包括以下步骤：
a、脂肪源抽取、分离、纯化
无菌条件下脂肪源抽取，然后通过缓冲液浸泡、冲洗，再采用营养液水浴振荡消化，所得消化物过筛后取过滤液进行离心处理，获其基质微管层，沉淀部分除去红细胞，然后再离心处理后用营养液离心洗涤，将消化分离出的细胞用生理盐水稀释；
b、间充质干细胞电泳、提取
将电泳槽用尼龙筛布均匀横向分为三格，按一定体积比置入氯化钾及葡萄糖酸钙溶液，交流电持续输入2～5分钟，然后将上述所得细胞溶液置入中间格电泳槽搅匀，直流电电泳15～30分钟，抽取正电极侧电泳槽内细胞液，即得脂肪间充质干细胞。
其中，上述步骤一中的湿性抽脂法采用的肿胀液配制标准优选为：
生理盐水 1000ML；
2％利多卡因 20ML；
0.5％肾上腺素 1ML。
所述尼龙筛及尼龙筛布的孔径皆优选为50uM。
更具体的说，本发明提供的该种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
a、脂肪源抽取、分离、纯化
无菌条件下湿性抽脂法抽取脂肪，并采用磷酸盐缓冲液浸泡、冲洗，然后用含0.1％I型胶原酶的无血清DMEM营养液水浴振荡消化，所得消化物通过尼龙筛过筛后取过滤液，再进行离心处理，弃上清及漂浮的成熟脂肪细胞，获得基质微管层，沉淀部分再用140～180mmol/L的NH4CL在室温下处理3～8分钟，除去红细胞，然后再进行离心处理，再用完全营养液离心洗涤，然后将消化分离出的细胞用生理盐水稀释；
b、间充质干细胞电泳、提取
将电泳槽用尼龙筛布均匀横向分为三格，将重量百分含量为10％的氯化钾与重量百分含量为10％的葡萄糖酸钙以2～3∶5的体积比混合置入电泳槽，交流电输入，电压90～120v，电流400～600mA持续2～5分钟，然后将上述所得细胞溶液置入中间格电泳槽，搅匀，在5～10摄氏度恒温下，直流电输入，电压30～50v，电流90～120mA，电泳15～30分钟，抽取正电极侧电泳槽内细胞液，得脂肪间充质干细胞。
本发明提供的该种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法，可快速便捷地克服上述所提到的问题，周期短，且不会造成DNA双旋链上的基因排序紊乱或突变。
具体实施方式
以下结合具体实施例及检验测定对本发明的技术方案进一步说明，但不作为对本发明所要求保护范围的限定：
本发明提供的一种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法，包括步骤如下：
一、脂肪源抽取、分离、纯化
无菌条件下湿性抽脂法抽取200ML以上脂肪，其中，肿胀液配制标准为：生理盐水1000ML、2％利多卡因20ML、0.5％肾上腺素1ML，然后采用磷酸盐(PBS)缓冲液浸泡、冲洗3次，再用含0.1％I型胶原酶的无血清DMEM营养液在37度水浴振荡中消化30分钟，消化物再依次通过孔径为50uM的尼龙筛，收取过滤液，离心2分钟(离心速度3000转/分)弃上清及漂浮的成熟脂肪细胞，获基质微管层，沉淀部分用160mmol/L NH4CL在室温下处理5分钟，除去红细胞，再离心处理，然后用完全营养液离心洗涤3次，再将消化分离出的细胞用生理盐水稀释，总量加到1000ML。
二、间充质干细胞电泳、提取
将40cm×22cm×9cm的电泳槽用孔径为50uM尼龙筛布均匀横向分为三格，将10％氯化钾20ML、10％葡萄糖酸钙50ML混和置入电泳槽，交流电输入，电压100v，电流500mA持续三分钟后，将上述所得的1000ML细胞溶液置入中间格电泳槽，搅匀2分钟，在5-10摄氏度恒温下，直流电输出，电压40v，电流100mA，电泳20分钟，抽取正电极侧电泳槽内细胞液，得脂肪间充质干细胞。
以下对本实施例所得的间充质干细胞测定：
在体外分离脂肪组织提取的细胞主要分为两种，一是成熟的脂肪细胞，人和动物的脂肪组织大约三分之一是脂肪细胞，体积较大，离心后漂浮于上层；另一种就是离心后沉淀部分，占到三分之二，也称为微管基质成分，其所包含的细胞类型较多，主要为微血管、神经纤维、成纤维细胞和处于各种不同分化阶段的前体脂肪细胞及具有多向分化能力的干细胞等。这种干细胞在特定的诱导条件下也可分化为成骨细胞、软骨细胞和肌细胞等，显示了这种细胞的多潜能的分化能力，其行为与骨髓间充质干细胞相似。
对于任何一种类型干细胞而言，干细胞的分离、纯化是深入研究并应用该类干细胞的前提，干细胞表面的特异性分子标记是分离、纯化及鉴定该类干细胞的重要依据。本实施例采用阴性标志和阳性标志相结合，并辅以形态学和分化特性来进行间充质干细胞的鉴定。
检验结果表明，本实施例中最后抽取的细胞液基本为梭形细胞，体外培养证实分离的细胞有较强的增殖能力，分离的细胞表面标志CD44和CD105阳性，表明为间充质干细胞。CD14和CD34是造血谱系和内皮细胞标记HLA-DR为阴性，可排除为造血细胞和内皮细胞的可能，S-100是前体脂肪细胞的特异标志物亦呈阴性，提示该细胞虽为脂肪组织来源，但经离心、纯化、电场改造后其中的前体脂肪细胞已被去除，从而证明本实施例所提取的细胞为间充质干细胞。
Claims (4)
1.一种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
a、脂肪源抽取、分离、纯化
无菌条件下脂肪源抽取，然后通过缓冲液浸泡、冲洗，再采用营养液水浴振荡消化，所得消化物过筛后取过滤液进行离心处理，获其基质微管层，沉淀部分除去红细胞，然后再离心处理后用营养液离心洗涤，将消化分离出的细胞用生理盐水稀释；
b、间充质干细胞电泳、提取
将电泳槽用尼龙筛布均匀横向分为三格，按一定体积比置入氯化钾及葡萄糖酸钙溶液，交流电持续输入2～5分钟，然后将上述所得细胞溶液置入中间格电泳槽搅匀，直流电电泳15～30分钟，抽取正电极侧电泳槽内细胞液，即得脂肪间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，该方法的具体步骤包括以下步骤：
a、脂肪源抽取、分离、纯化
无菌条件下湿性抽脂法抽取脂肪，并采用磷酸盐缓冲液浸泡、冲洗，然后用含0.1％I型胶原酶的无血清DMEM营养液水浴振荡消化，所得消化物通过尼龙筛过筛后取过滤液，再进行离心处理，弃上清及漂浮的成熟脂肪细胞，获得基质微管层，沉淀部分再用140～180mmol/L的NH4CL在室温下处理3～8分钟，除去红细胞，再进行离心处理，然后用完全营养液离心洗涤，再将消化分离出的细胞用生理盐水稀释；
b、间充质干细胞电泳、提取
将电泳槽用尼龙筛布均匀横向分为三格，将重量百分含量为10％的氯化钾与重量百分含量为10％的葡萄糖酸钙以2～3∶5的体积比混合置入电泳槽，交流电输入，电压90～120v，电流400～600mA持续2～5分钟，然后将上述所得细胞溶液置入中间格电泳槽，搅匀，在5～10摄氏度恒温下，直流电输入，电压30～50v，电流90～120mA，电泳15～30分钟，抽取正电极侧电泳槽内细胞液，得间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的一种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤a中的湿性抽脂法采用的肿胀液配制标准优选为：
生理盐水 1000ML；
2％利多卡因 20ML；
0.5％肾上腺素 1ML。
4.根据权利要求2所述的一种分离、纯化及提取脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述尼龙筛及尼龙筛布的孔径皆优选为50uM。
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