CN101134769A - 熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的化合物熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺及其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，还涉及该化合物在预防、治疗乙肝病毒方面的应用。

Description

熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺及其制法和用途

发明领域

本发明涉及一种新的化合物熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺及其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，还涉及该化合物在治疗乙肝病毒感染方面的应用。

发明背景

据世界卫生组织估计：目前全球大约有3.5亿人为HBV感染者，这些感染者部分可发展为肝硬化及肝癌。在这3.5亿人中，75％居住在亚洲，仅中国就有1.2亿HBV感染者。据WHO的数据显示，全球每年有超过50万人死于肝硬化和原发性肝癌，而80％的肝癌起因于乙型肝炎。根据1992-1995年调查数据，我国慢性乙肝病人约3000万例。卫生部最新数据显示，HBV感染位居我国癌症主要危险因素的第二位。目前批准的抗HBV药物优缺点并存，但总体治疗效果仍不理想。

目前已被批准用于治疗慢性乙肝的药物有：干扰素(包括普通干扰素和聚乙二醇干扰素)和核苷类抗病毒药(拉米夫定和阿德福韦等)。其中，干扰素治疗1年，HBeAg转换率可达33％，但副作用较大，对亚洲人疗效稍低，聚乙二醇干扰素的疗效和安全性优于普通干扰素；拉米夫定最大的问题是耐药性，用药4～5年后耐药率约70％；阿德福韦的耐药率显著低于拉米夫定，1年耐药率为0，在HBeAg阴性患者中，4年耐药率为18％。

恩替卡韦是美国施贵宝公司20世纪90年代研制开发的一种新的核苷类似物，能有效地选择性抑制HBV复制，阻断HBV复制的3个时期：启动、逆转录和DNA依赖的DNA合成，抗病毒活性强(半数有效浓度EC₅₀＝4nM)，是现有核苷类似物(拉米夫定、阿德福韦、特必夫定、替诺福韦)中最强的化合物。恩替卡韦口服吸收良好，生物利用率高，其T_max为0.61～lh，C_max为4.3～6.7ng/mol，A u c为15～17.8ng.h^-1.ml^-1，其组织分布广泛，以肾脏内浓度最高，血浆酶结合率低，恩替卡韦三磷酸脂的半衰期为14～15h，体内代谢率低，主要以原形从肾脏排泄。恩替卡韦不仅有很强的抗HBV能力，而且对肝细胞内的CccDNA也有抑制作用。同时，其耐药性好，长期应用，耐药的发生率也较低。因而，可有效地治疗慢性乙型肝炎。虽其长期应用的安全性和有效性有待进一步评估，但相信在不久的将来，恩替卡韦会成为一种新的很有希望的抗乙肝病毒药物。

美国专利US 5,206,244公开了恩替卡韦和其在治疗乙型肝炎的用途。Bisacchi等人在W098/09964中公开了一种改进了的恩替卡韦的合成方法。美国专利申请US-2001-0033864A1和PCT专利申请W001/64421 A1公开了含有低剂量恩替卡韦的制剂组合物。

以恩替卡韦为先导化合物，寻找更利于临床使用的新的抗病毒化合物将具有广阔的前景。恩替卡韦对肝的靶向性较差，如能通过肝靶向给药系统将恩替卡韦制成具有肝靶向性的前体可以增加药物在肝脏的分布，将恩替卡韦浓集定位于肝脏的病变部位而发挥疗效，将具有特异性好、选择性强、可减少药物用量和给药次数、能降低毒副作用、提高药效等优点，使HBV感染的病人得到良好的治疗。

胆酸转运体包括位于人体小肠细胞的人小肠细胞钠依赖性胆酸转运体与肝脏细胞膜表面的钠离子-牛磺胆酸转运多肽，它能特异性地与胆酸及其一系列衍生物结合，从而将其吸收进入细胞内部。根据肝细胞对胆酸有很高的摄取这一特征，利用胆酸将药物导向肝脏是一有效途径，将药物和胆酸结合成肝靶向前体药物可取得较好效果。从20世纪80年代起，国际上针对胆酸受体的特异性结合展开了一系列的研究，认为利用胆酸转运体可以提高有生物活性但难吸收药物的口服吸收，对肝的靶向用药使致病的肝有高的治疗药物浓度，同时使身体其他部位的毒性反应最小化。这些研究还证明了在胆酸的C-24位置上偶联药物并不会导致对肝脏胆酸转运体的亲和性的减弱。Stephen(Stephen ZF，Yurachchek EC，Sharif R，etal.Reduction of cardiovascular and thyroxine-suppressing activity of L-T3 byliver targeting with cholic acid.Biochem Pharmacol，1992，43(9)：1969)等将L-T3和胆酸结合成肝靶向前体药物CGH509A后，其降低胆固醇的作用比刺激心血管作用和抑制甲状腺作用分别高15倍和6倍。苯丁酸氮芥与胆酸结合成的前体药物和HMG-COA还原酶抑制剂与胆酸结合成的前体药物也均有明显的肝靶向作用。

熊去氧胆酸(UDCA)为亲水性胆汁酸，具有利胆、细胞保护、免疫调节等作用，是目前唯一被FDA批准用于胆汁淤积性肝病治疗的药物，临床上广泛用于治疗各种肝病。熊去氧胆酸作为一种无毒性亲水胆酸，能通过肠肝循环系统的胆酸转运体在肝脏被肝细胞重新摄取，由于肝肠循环中小肠和肝重吸收的高效，加上此系统中胆酸转运体的高容量，使这个系统对于药物肝靶向传递的发展有很大前景。

发明内容

本发明的发明人在研制新的抗乙肝病毒药物时，研究了大量的恩替卡韦衍生物，发现以熊去氧胆酸为胆酸转运体配体，抗HBV药物恩替卡韦为模型药物，采用活泼酯法可得到熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺，可将恩替卡韦浓集定位于肝脏的病变部位而发挥疗效，具有特异性好、选择性强、可减少药物用量和给药次数、能降低毒副作用、提高药效等优点。

本发明的另一目的是提供一种制备熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺的合成方法。

本发明的进一步的目的是为临床提供一种可有效治疗抗乙肝病毒感染的一类药物组合物。

为了完成本发明的目的，事实上，本发明提供一种化合物，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺，它具有如下式的结构：

分子式：C₃₆H₅₃N₅O₆

化学名称为2-氨基-1，9-二氢-9-[(1S，3R，4S)-4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酮-3α，7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-羧酸酰胺。

本发明化合物的制备方法如下：

熊去氧胆酸与恩替卡韦在DMF中采用活泼酯法得到熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺，经乙醇提取、浓缩得到产物粗品，再经酸洗，乙醇-乙酸乙酯重结晶纯化制得熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺。

本发明人发现熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺对体外培养细胞的HBV-DNA病毒有极好的抑制作用，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺和恩替卡韦两者抗HBV-DNA的活性相近。

熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺体内试验显示其分布在肝脏中浓度高于其他脏器，具有明显的肝靶向性。

本发明人发现熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺有优异的抗鸭乙肝病毒作用。

熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可以接受的载体。

本发明的化合物和药物组合物可用于制备预防和治疗抗乙肝病毒感染的药物。

上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如：稀释剂、赋形剂等；填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯醇吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇；另外还可在组合物中加入其它辅助剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、静脉注射等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成相应的片剂、粒剂、胶囊剂等；用于注射给药时，可以将其制成注射用的粉针、溶液、水或油性悬浮剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明化合物的使用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～50毫克，可一次或分多次使用。

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺的制备

反应式：

操作步骤  向烧杯中投入100mL DMF，搅拌下加入(10mmol，4.0g)熊去氧胆酸和(10mmol，1.4ml)三乙胺，搅拌下冷却反应液温度至-15℃，再逐滴加入(15mmol，2mL)氯甲酸异丁酯。搅拌2分钟后，加入恩替卡韦(10mmol，2.8g)与三乙胺(15mmol，2.2mL)溶于40mlDMF的溶液，维持反应液温度在-15℃，搅拌反应混合物30min后，室温放置1小时。过滤以除去其中的三乙胺氯化物，再将滤液减压蒸馏浓缩，将浓缩物加入乙醇400ml并适当加热溶解，过滤弃去不溶物，滤液用适量氯仿溶液洗涤2次后，将乙醇层减压蒸馏，再用乙醇-乙酸乙酯重结晶2次得到精制熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺，收率为42％。

红外吸收光谱(KBr)：3405cm^-1(γNH)，1653(γC＝0)，1560(βNH)

核磁共振氢谱：(400M，DMSO)δ(ppm)

1.26～1.27(m，9H)，2.05～4.03(m，24H)，7.48(s，2H)，8.20(s，1H)元素分析：C₃₆H₅₃N₅O₆(FW651.84)

	C(％)	H(％)	N(％)
				理论值	66.33	8.20	10.74
实测值	66.28	8.17	10.94

实施例2：药用组合物的制备片剂：

成分	数量(mg/片)
		熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺	0.5
微晶纤维素	200
		羧甲基淀粉钠	适量
硬脂酸镁(外加)	2.5
		7％LE薄膜包衣剂	适量

制备方法：将原料、辅料分别粉碎，过100目筛，备用。将适量羧甲基淀粉钠溶解在水中，得2％羧甲基淀粉钠溶液，作为粘合剂。将主、辅料充分混匀。用2％羧甲基淀粉钠溶液为粘合剂，制成适宜软材，过30目筛制粒，湿颗粒在60℃左右烘干，过30目筛整粒，加入硬脂酸镁混匀。测定颗粒中药物含量，计算理论片重，压片。取适量LE薄膜包衣剂，加入75％乙醇溶液中，搅拌使之分散均匀，得7％LE薄膜包衣液。测定片芯含量、溶出度，合格后包7％的LE薄膜包衣剂。

实施例3：药用组合物的制备

胶囊剂：

成分	数量(mg／片)
		熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺	0.5
淀粉	200
		羧甲基淀粉钠	适量
微粉硅胶	适量

制备方法：将处方量的主药和辅料分别粉碎过80目筛，备用。取羧甲基淀粉钠加水制成2％羧甲基淀粉钠溶液，作为粘合剂。主药与辅料等量递加法混匀，加入2％羧甲基淀粉钠溶液，过20目筛制粒，55℃干燥，20目整粒，得干颗粒。干颗粒加入过100目的微粉硅胶混匀。装胶囊，即得。

实施例4：熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺体外抗乙肝病毒作用实验

主要试剂：恩替卡韦片剂(中美上海施贵宝制药有限公司，批准文号：国药准字H20052237，0.5mg)，加蒸馏水溶解成0.4mmol/L的溶液；熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺(按实施例1制备)，加蒸馏水溶解成0.1mmol/L，0.2mmol/L，0.4mmol/L，0.8mmol/L的溶液。

细胞模型：HepG₂ 2.2.15细胞系(北京大学肝病研究所提供)。细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中于37℃，5％二氧化碳的条件下连续培养。

试验方法：将HepG₂2.2.15细胞培养在24孔板上，72小时加入适量制备的恩替卡韦、熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺的溶液到培养液中，继续培养9天，应用MTT法检测细胞存活率，收集培养细胞的上清液，测定乙肝病毒HBs Ag和HBe Ag含量。同时作细胞空白培养，比较作用效果。

采用MTT法对HepG₂ 2.2.15细胞的活性分析。MTT为一种四唑盐，其四唑环仅在有活性的线粒体内才被脱氢酶作用，生成蓝色产物formazan，此反应仅在活细胞内发生。因此，测量formazan即可知活细胞数，即细胞存活率。

给药组细胞和空白细胞均经MTT法检测细胞存活率为100％以后，方可用HBs Ag和HBeAg试剂盒和酶标仪检测细胞上清的HBs Ag和HBe Ag的A值。最后按以下公式计算药物对抗原的抑制率：

药物对抗原的抑制率＝(空白细胞A值—给药组细胞A值)/空白细胞A值*100％。

试验结果：熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺对HepG₂ 2.2.15细胞分泌的HBs Ag和HBe Ag有较强的抑制作用。熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺浓度在0.1mmol/L，0.2mmol/L，0.4mmol/L，0.8mmol/L时，对HepG₂ 2.2.15细胞分泌的HBs Ag和HBe Ag的抑制率分别达到了(7.1±1.1)％，(17.6±1.8)％，(50.3±2.4)％，(59.5±1.5)％和(8.2±1.3)％，(41.6±2.7)％，(48.1±2.8)％，(50.5±0.8)％；而恩替卡韦质量浓度在0.4mmol/L时，对HepG₂2.2.15细胞分泌的HBs Ag和HBeAg的抑制率为(49.9±1.5)％和(47.1±1.5)％。

本试验证实熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺对乙肝病毒有明显的抑制作用。熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺在浓度为0.4mmol/L对HBs Ag和HBe Ag的抑制率与恩替卡韦的0.4mmol/L对HBs Ag和HBe Ag的抑制率相当，也就是说，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺的抗病毒能力与恩替卡韦相当。由此可见，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺是一个很有效的抗乙肝病毒药物。

实施例5：熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺的体内分布试验

试验方法：昆明株小鼠90只，体重(20±2)g，雌雄各半，随机分成10组，每组9只，分别按熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺5mg/kg体重尾静脉注射给药。于给药后不同时点断头处死，摘眼球取血，解剖取出各器官，称重后加入0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液制成50％匀浆。全血置15ml肝素化离心管中，离心分离出血浆。血浆0.20ml和各器官匀浆0.20g加12％三氯醋酸0.40ml，50℃水浴30min后旋涡振荡90s，每分钟12000转离心5min，吸取20μl上清液进样，HPLC法测定样品中熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺浓度。色谱条件：agelent 1100系列高效液相色谱仪，ODS柱，流动相为甲醇：水(5：95，V/V)，流速1ml/min，检测波长254nm，柱温为室温。采用外标法定量，以色谱峰面积对恩替卡韦标准品的浓度作标准曲线，试验结果以各器官的蓄积量占注入量的百分比表示如下：

熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺在小鼠体内的分布

时间(min)	血	肺	肝	脾	肾	肠
							1	16.31±3.25	3.11±0.41	58.41±1.32	0.52±0.14	2.42±1.54	1.34±1.24
3	11.02±1.14	2.52±0.38	62.57±3.52	0.49±0.25	1.26±0.79	2.60±0.44
							5	8.37±0.59	1.68±0.59	71.52±1.25	0.36±0.57	2.05±0.93	3.14±0.73
8	6.52±1.25	2.17±1.13	76.37±1.17	0.41±0.25	1.21±0.76	3.69±0.47
							10	7.31±1.19	1.89±1.04	72.43±1.07	0.53±0.27	1.64±0.99	3.93±0.42
15	10.56±1.46	2.42±1.82	67.25±2.36	0.50±0.16	2.00±1.13	6.82±0.42
							30	12.72±1.50	2.1 1±0.47	54.36±1.69	0.64±0.78	1.73±0.71	8.42±0.94
60	11.02±0.49	2.46±0.59	26.82±3.27	0.48±0.39	1.54±0.61	14.27±3.16
							120	7.24±0.58	2.30±1.07	19.18±1.09	0.49±0.17	1.73±0.29	9.67±1.73

从试验结果可以看出：随时间的延长，肝摄取逐渐降低，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺在血中的分布随肝脏的摄取、代谢过程呈下降、升高、再下降的特征，符合肝靶向药物的代谢特点。熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺在肝脏中浓度远高于其他脏器，具有明显的肝靶向性。

实施例6：熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺抗慢性鸭乙型肝炎的试验

1.1动物 ld龄武汉麻鸭70只，雌雄不拘，体重(50±5)g(北京大学医学部动物室提供)。

1.2药物恩替卡韦片剂(中美上海施贵宝制药有限公司，批准文号：国药准字H20052237，0.5mg)，加50ml蒸馏水溶解；熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺片剂(按实施例2制备，主药含量分别为1mg、0.5mg、0.2mg)，加50ml蒸馏水溶解。

1.3主要试剂鸭乙型肝炎病毒强阳性血清(北京大学肝病研究所提供)，肝功能(ALT、AST、TBil)试剂盒(由上海丰汇医学科技有限公司生产)。

1.4试验方法

造模：将1d龄雏鸭腹腔注射鸭乙型肝炎病毒强阳性血清，每只0.1mL。检测雏鸭DHBsAg：利用Dot-ELA法(张维，闻玉梅，李自力，等.一种快速、简便检测鸭乙型肝炎病毒抗原、抗体的方法.上海医科大学学报，1998，15(6)：413-415)，将造模雏鸭第7天颈外静脉采血，每只0.8mL，分离血清，测DHBsAg，去除未感染阴性鸭。分组：将感染阳性鸭随机分为5组：模型对照组，恩替卡韦组，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只。

治疗：造模第8天开始给药，恩替卡韦组，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺高剂量组、中剂量组、低剂量组每天分别按30mL/kg/d灌胃制备的恩替卡韦0.5mg、熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺1mg、0.5mg、0.2mg的溶于50ml蒸馏水的药物；模型组每天按30mL/kg/d灌胃0.9％的生理盐水，连续给药1个月。

1.5观测指标

1.5.1鸭肝组织病理变化实验结束后，全部鸭颈动脉放血处死，立即摘取肝脏，各组取肝右叶同一部位1cm-0.5cm大小的肝组织用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色光镜观察。

1.5.2肝功能测定各组分别在给药1月、停药第7天颈外静脉取血，每只1mL，2000转/min离心30min，分离血清，用半自动分析生化仪测各组鸭血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和血清总胆红素(TBil)的变化。

1.5.3统计学处理全部数据采用SPSS软件，配对t检验。

1.6试验结果

实验结束时模型组和恩替卡韦组的雏鸭死亡2只，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺1mg组的雏鸭死亡2只，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺0.5mg组的鸭死亡3只，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺0.2mg组的鸭死亡2只。

1.6.1鸭肝组织病理学检查各组实验鸭光镜下可见汇管区的炎性细胞浸润，胆小管增生；肝细胞轻、中度变性(气球样变、脂肪变)，点灶状及碎屑样坏死，但无纤维增生。光镜观察结果见下表：

熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺高、中剂量组，恩替卡韦组的肝细胞点状坏死和碎屑样坏死与模型对照组相比，有显著性差异(P<0.05)。

1.6.2肝功能测定各实验组用药1个月及停药第1周时血清ALT、AST、TBil变化见下表

注：熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺0.5mg组、熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺1mg组和恩替卡韦组与模型对照组比，*P<0.05。

结果：熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺0.5mg组、熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺1mg组和恩替卡韦组与模型组之间比较血谷丙转氨酶(ALT)均有显著性差异(P<0.05)，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺0.5mg组、熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺1mg和恩替卡韦组间的ALT相比无显著性差异(P>0.05)；组间的血清谷草转氨酶(AST)有轻度异常，之间无显著差异(P>0.05)。熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺0.5mg组效果相当于恩替卡韦0.5mg组，熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺1mg组效果优于恩替卡韦0.5mg组。

病理学检查结果表明：熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺lmg组肝细胞点状坏死和碎屑样坏死与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05)，而肝细胞坏死特别是点状坏死和碎屑样坏死是判断肝组织炎症活动度的重要指标。这说明熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺有明显抗炎作用，使肝脏炎症反应减轻，肝细胞受损减少。熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺0.5mg组、熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺1mg组与模型对照组之间比较，血清谷丙转氨酶(ALT)降低，之间有显著性差异，表明熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺连续应用后有优异的护肝作用。

Claims (5)

1.一种如下式的化合物：

2.权利要求1中的化合物的制备方法，其特征是熊去氧胆酸与恩替卡韦在DMF中采用活泼酯法得到熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺，经乙醇提取、浓缩得到熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺粗品，再经酸洗，乙醇-乙酸乙酯重结晶纯化制得熊去氧胆酸恩替卡韦酰胺纯品。

3.一种用于抗乙肝病毒的药物组合物，其特征在于含有治疗有效量的权利要求1的化合物和药学上可以接受的载体。

4.根据权利要求书1的化合物在制备预防和治疗抗乙肝病毒药物中的应用。

5.根据权利要求书4所述的应用，其特征在于该化合物可制成片剂、胶囊剂、冻干剂或针剂。