CN101002081B - 多标记的光纤型荧光显微成像方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及产生样品的荧光光纤图像的方法，其中，利用激励信号对样品进行扫描，检测源自所述样品的荧光信号，其中激励信号和荧光信号使用同一个光路；所述光路被用来激励包含在所述样品中的至少两个荧光体，并且产生一个最终图像，该最终图像包含根据所述的至少两个荧光体进行着色的区域。根据本发明的多标记使得可以同时在两个不同的波段中获取两幅图像。根据本发明的系统可以包括用于对荧光信号进行光谱定量分析的光谱仪。

Description

多标记的光纤型荧光显微成像方法和系统

技术领域

本发明涉及一种用于产生一个样品的荧光光纤型显微图像的方法和系统。本发明尤其涉及体内成像和原位成像。

所观测到的荧光可以来源于一个外源性的化合物(通常是一个受管理的标记物)或者是一个由(转基因标记型的)生物组织细胞产生的化合物。

背景技术

已知文献US6148227描述了一组织的自发荧光系统。一个光束激励了该组织的内源性荧光体。所发出的信号分成一个红色信号和一个绿色信号。之后对这些信号进行电处理以获得一个双色图像。文献US6343228描述了一个荧光成像系统，其中的荧光图像是利用一个反射图像而校准的。该系统包含一个用于激励组织的内源性荧光体的第一路径和一个用于恢复由荧光和反射所发出的信号的第二路径。文献WO 0043552描述了一个称之为“生物芯片”的集成电路，其目的是在于检测多个化学化合物。该生物芯片包含多个具有荧光探测器的传感器。一个激光器或发光二极管发出一个光束以便激励目标元素，其导致以固有的方式或者通过注入适合的标记物来产生信号。所产生的信号可以是荧光、磷光或者拉曼散射信号。在入射通量和由目标元素所产生的信号之间的光路是不同的。

上述的现有技术的缺陷是，这三篇文献都无法产生尤其是光纤型的共焦图像和高分辨率的光纤型图像。

发明内容

具体地，本发明涉及一种光纤型显微成像系统，其中使用一个激励信号通过一个光路来扫描样品，并且采用同样的光路来检测由所述样品产生的荧光信号，激励信号和荧光信号。通过与所谓的台式显微镜进行比较，特别是在根据本发明的内窥镜检查领域中，该显微成像系统能够获得一个保留了显微镜分辨率的修正图像。

最后，讨论一下源自相关的现有技术的文献WO 2004/008952，其提出了一种方法用于产生一个在体内处于原位的共焦荧光图像，以便优化每个图像的质量并且获得优异的横向及纵向的分辨率。根据这一方法的第一特征用于产生共焦图像，使用一个由在样品的一个平面上点接点的扫描方式构成的上千个光纤组成的像导，尤其是一个表面以下的平面，每一个点对应着一个由连续的源所发出的激励信号，偏转并注入光纤束中的一个然后进行调焦，特别是在位于平面上的光纤输出端使用了一个光头，每一个点因此发出一个由光纤收集的荧光信号，之后进行检测和数字化以便形成一个图像元素。该共焦特性是通过使用光头将光束聚焦在样品上，并且通过作为空间滤光孔使用的同一光纤来传送传输激励信号和由此发生的荧光信号来实现的。

根据这一方法的第二特征用于产生一个高分辨率荧光图像，与第一个特性相比其是非共焦的，这时以光纤的末端裸露地直接接触被成像样品表面的方式把光纤布置在样品的表面上，每一个光纤能够产生一个发散光束，其能够根据光纤的光芯直径激励微量的位于表面到最大深度间的样品。由于图像不是通过对下层表面进行逐点扫描而获得的，所以获得的图像是非“共焦”的。然而这些图像之所以被称之为“高分辨率”的图像是因为它们是通过轮流扫描直接位于表面下的微量样品并且通过对由每一个微量样品通过同一个用于激励的光纤所发出的荧光信号进行空间过滤而获得的。

对于这两个特性，在各种情况下，激励信号按照对应于在实时使用中每秒钟能够获得足够的图像数量的速度而被偏转的，并且以对应于光纤逐一地进行采样时的最小频率的频率检测荧光信号。考虑到光纤的采样(根据香农标准)，可以获得一个逐点图像，其准确地对应于每一个光纤。在每秒的平均最小图像数量的情况下，也就是每秒钟至少12个最大模式为896×640像素的图像时，通过逐一采样所有的光纤可以不丢失信息。根据该最小采样数目来选择检测频率(检测的带宽)可以使每一个光纤检测到最多的荧光图像。因此，根据一个可行的实施例，使用一个具有大约30000个柔性光纤的像导，采样频率和检测系统(一个雪崩光电二极管或等价物)的带宽被设置为大约1.5MHz，相对应的每个光纤大约12个像素，并且每秒钟可以获得至少12个最大模式896×640像素的图像。实际上，光束的偏转是通过确定一个“行”共振镜的快速共振频率和一个“帧”检流镜的慢共振频率来调整的。这可以使光纤进行适当的快速扫描以获得实时的图像。

本发明的目的是丰富由共焦荧光成像系统获得的图像的信息。本发明的另一个目的是监视明确标识出的元素的动作发展。

上述目标中的至少一个是通过一种用于产生样品的光纤型荧光显微图像的方法实现的，在该方法中：

-样品被一个激励信号扫描，该信号经过一个包含有至少一个光纤的光路，并且

-来源于所述样品的荧光信号被检测，激励信号和荧光信号使用该同一光路。

根据本发明：

-至少有两个包含在样品中的荧光体通过光路被激励，

-所述的至少两个荧光体中的每一个的荧光信号通过光路被检测，并且

-产生一个最终的图像，该最终的图像所包含按照上述至少两个荧光体而被着色的区域。

该激励信号可以源自很多其他具有不同波长的信号。

因此，本发明可以实现多种标记，也就是在样品的检测中可以有至少两个荧光体，该样品可以是人体或动物的组织，换句话说可以有两种染料或标记物。当被适合的光束激励时，每个荧光体发出一个给定波长的信号。优选的，由所述至少两个荧光体发出的荧光信号具有彼此之间间隔足够远的波长，以便这些信号通过空间滤波而分离。然而，当由所述至少两个荧光体发出的荧光信号具有完全或部分重叠的波带时，如下所述，通过依次地发射、在出现交迭时通过过滤进行精确地检测或者在完全重叠时进行依次地检测，其也可以被分离。

使用根据本发明的方法，所注入的每一个荧光体可以标记一个特殊的元素。该荧光体可以被有效地管理(外源性荧光体)或者一开始就存在于样品中。后一种情形包括例如任意的表现出一个或多个荧光体的转基因动物。因此获得的图像可以使不同的元素表现为不同的颜色。这些颜色可以是随意的，也就是“人工的”颜色，或者是有效地对应于由荧光体发出的荧光信号的波长的颜色。当查看图像时，特别是实时地查看时，可以监视到元素的演变。例如，可以提供激励以便查看每一个成分的反应。通过将不同元素标记为不同的色彩，多标记使得可以获得一个有显著区别的图像。最终的图像可以包含着和所注入的荧光体一样多的色彩。因此，第一个荧光体可以具有一个形态或空间上的作用，也就是标记细胞结构，例如示出骨骼、容器。第二个荧光体可以具有功能性作用，例如注入标记蛋白质或离子以便监视它们的活动，进而跟踪它们的含量。作为示例，可以查看到由第一个荧光体标记的钙在由第二荧光体标记的神经元中的活动。例如，通过使用两种根据本发明的荧光体分别进行标记，可以轻松地确定核质指数(核表面与细胞表面的比)。本领域中的技术人员应该明白每一个荧光体可以具有功能或形态上的作用，等等。

本发明可以具有多种应用，特别是无论何时非侵入的和略微侵入的方法都是必须的。例如在插入膀胱的光学探测器具有小于1mm的直径时，这些应用是尿道内窥镜检查；小动物的结肠镜检查；查看角膜和视网膜；查看肌肉纤维和神经；白血球的微循环和血流；脉管和肾的结构；肝细胞的膜；以及在用于查看小的活体动物的深度脑结构的神经生物学中。

根据本发明的一个改进实施例，所述的至少两个荧光体是同时被激励的。此外，当所述的至少两个荧光体的荧光信号被同时检测到时，因此可以实时地工作，例如每秒获得十二个图像。因此本发明适合于体内或原位探测。

作为替代方案，可以依次地激励前述的至少两个荧光体。该荧光体逐一地被激励。在两个荧光体被注入并且具有每秒12个图像的实时图像探测系统被使用的情况下，按照每秒钟六个图像的速率获得最终图像。

也可以依次地检测所述的至少两个荧光体的荧光信号。

应该理解优选的实施例是基于同时发射以实现同时检测的，以便实时地获得最终的图像。作为示例，可以使用两个具有不同波长的激光发射器以便激励两个荧光体，使之也发出不同的波长的光。

有利地，在每一种情况下，按照对应于能够产生满足实时使用要求的每秒钟所获得的图像数量的速度扫描该样品。此外，按照一个对应于光纤逐一进行采样的最小频率的检测频率来检测荧光信号。扫描保持着实时的速度，最终所产生的图像的数量依赖于检测的模式：同时或依次。

优选地，为了产生所述的最终图像，首先产生与所检测到的荧光信号一样多的原像，每一个原像由对应于分配给对应荧光体的色彩来着色，之后所述的原像被重叠以组成最终的图像。重叠的级别可以是50/50的合并或者是透明的。

此外，也可能从通过光路源自样品的部分信号中获得每一个图像的光谱(作为波长函数的亮度)。

根据一个变形并且对于一个给定的图像，也可以使用通过光路源自样品的部分信号来仅仅获得感兴趣的一个区域的光谱。在一段时间内对给定区域的光谱进行分析为最终图像提供了额外的信息。因此可以以详尽的方式监视并确定所标记元素的发展以及它们对激励的反应.

实际上，为了产生光谱，大约百分之二十的来自样品的信号被采样，所以并不影响获取图像。

根据本发明，所述的感兴趣的区域是在获取所述的光谱之前被确定的，这是通过完成第一图像获取阶段，之后在所获得的图像上定义所述的感兴趣的区域来实现的。

此外，为了仅获取图像中感兴趣区域的光谱，可能使用一个通常称之为“快门”的开关，在预定的对应于当激励信号扫描所述激励感兴趣区域的时间的时间内将部分源自样品的信号导向一个光谱仪。其他的高速开关也可以被使用，诸如可控制的反光镜或一个声光偏转器。

还可以使用一个高频的脉冲激光器以便发出激励信号，该脉冲激光器只在扫描前述的感兴趣的区域时被激活。

本发明的目的还在于一种产生样品的光纤型荧光显微图像的系统，该系统包括：

-一个处理单元，

-一个光路，其至少包括用于扫描样品中的激励信号的装置，以及一个包含至少一个光纤以便将激励信号传送至样品同时收集来自所述样品的荧光信号的像导，该激励信号和荧光信号使用该同一光路。

根据本发明，该系统还包括：

-激励装置，用于通过光路激励样品中的至少两个荧光体，

-检测装置，用于通过光路检测所述的至少两个荧光体的荧光信号，以及

-处理单元中的处理装置，用于产生最终的图像，该图像包含着作为所述的至少两个荧光体的函数而被着色的区域。

根据本发明的系统最好作为一个基础使用由Mauna Kea技术公司在文献WO 2004/008952中所描述的设备。

对激励信号的扫描可以发生在样品的表面下或表面或者在样品的内部。

激励装置可以包括一个发射器，例如一个激光器，其能够同时地激励所述的至少两个荧光体。实际上，现有的激光设备通常以405nm的波长发射，其能够同时激励两个荧光体。在这种情况下，在接收时，可以设置一个光探测器以便依次检测荧光信号，或者是当两个荧光信号能够分离时，采用两个光探测器(和荧光体一样多的光探测器)同时检测荧光信号。

优选的，激励装置包括至少两个发射器(特别是两个)，其同时或依次激励所述的荧光体。这时，每个发射器最好能够激励一个单独的荧光体。

最理想地，设置和探测器一样多的发生器以便同时激励和检测，并且实时地产生一个图像(每秒钟十二个图像)。

两个激励信号的发射器有利地分别以488nm和635nm发射激光，在样品中的两个荧光体分别和这两个波长起反应。

在另一个实施例中，检测装置可以包括一个结合了滤波装置的接收器，特别是诸如一个光探测器，例如一个可调整的带通滤波器，能够使前述的至少两个荧光体所发出的荧光信号依次通过。

但是优选的，该检测装置包括至少两个和诸如分色镜的分离器相结合的接收器，该分离器能够根据波长将每一个荧光信号发送至一个给定的接收器。

在一个多路径检测模式中，可以使用多个可调整的带通滤波器和/或多个可调整的分色镜。类似地，在发射过程中，可以使用一个单独的激光器来同时发送多个波长。

有利地，该扫描装置按照对应于能够产生满足实时使用要求的每秒钟所获得的图像数量的速度扫描该样品。此外，检测装置是按照一个对应于光纤逐一进行采样的最小频率的检测频率来检测荧光信号的。

根据一个优选实施例，像导可以由几千个光纤构成，该像导位于扫描装置之前并且在光头之后，以便将激励信号聚焦在样品上。

根据一个变化的实施例，像导可以由一个光纤构成，扫描装置被集成进光头内并且位于像导和样品之间。

根据另一个变化的实施例，像导可以由几千个光纤构成并且考虑将其的末稍几乎直接接触地放置在样品的表面上。在这种情况下，每一个光纤能够产生一个发散的光束，其能够激励微量的位于表面到最大深度间的样品，前述的深度尤其依赖于光纤的光芯直径。

该系统还可以包括一个光谱仪，其能够利用部分来自样品的信号产生一个光谱。因此产生了一个在光纤型荧光成像系统，尤其是共焦成像系统，和光谱分析路径之间的耦合。该光谱仪可以和一个快门相结合，该快门能够在预定的对应于激励感兴趣区域的时间内将部分源自样品的信号导向一个光谱仪。作为替代，为了只获取图像中感兴趣的区域的光谱，激励装置可以包含至少一个高频脉冲激光器，该脉冲激光器只在扫描前述的感兴趣的区域时被激活。应该注意到，当共焦图像成像系统被使用时，该光谱仪也是共焦的。当高分辨率的非共焦图像成像系统被使用时，其也是高分辨率和非共焦的。

根据本发明，处理单元包含用于同步激励装置和接收装置的装置。

根据本发明，随后在检测器通量上继续执行的图像处理被优化以便根据探测到光子的有限通量获得一个非常高质量的图像。这一优化是按照如下的方式进行的。

在获取图像之前，实时地执行以下一系列步骤：

-一个用于检测所选择的将被使用的一组光纤(像导的全部光纤或选择的一部分)中的每一个光纤的位置的阶段；这一阶段至少在每一次像导被改变时被执行；

-一个用于校准注入每一个光纤的速率的阶段，也就是每一个光纤相关的注入率；并且

-一个用于检测背景图像的阶段(没有样品)。

在操作过程中，在对被检测到的信号进行数字化之后，对图像处理的优化还特别包含如下的步骤：

-在根据每一个光纤特定的注入率来进行修正并减去背景图像之后，确定由每个光纤收集的真实通量，也就是只来源于样品的通量，，从而获得一个修正后的信号；

-之后根据这一修正后的信号执行图像的重建，特别是将一个具有光纤组合印记的图像转换为一个不带有明显光纤印记的图像。

根据本发明，因为该处理适合于所获得的信号的结构和优化的算法，实时地进行最后这两个阶段。至于对信号的修正，可以实时地进行。通过选择对每个像素进行一些操作，其可以实时地进行，使得图像的重建可以获得所预期的图像质量。一个高斯低通滤波器很好地克服了处理的复杂度、结果质量和计算时间之间的制约。

附图说明

本发明的其他优点和特性将通过对一个实施例的详细说明和如下的附图而变得显而易见，但并不仅限于此：

附图1是一个示意图，其示出了根据本发明的获取系统；

附图2是一个示意图，其示出了根据本发明从两个原像产生一个最终图像，每一个原像示出了由一个给定荧光体着色的元素；

附图3也是一个示意图，其示出了根据本发明从另两个原像产生另一个最终图像，每一个原像示出了由一个给定荧光体着色的元素；并且

附图4是一个示意图，其示出了一个声光开关。

具体实施方式

根据本发明用于产生高清晰度的共焦图像的系统将以不加限制的方式进行说明，这时样品中存在两个荧光体。后者可以是一个生物组织或一个细胞培养。

该系统包含两个激励路径和两个检测路径，以便有效地实时产生图像。对于每一个路径，光源1、2是一个以激励波长发射的激光器，其有效地激励给定的荧光体，例如分别使用488nm和635nm的波长。每一个光源能够激励一个荧光体。为了优化对像导6中的光纤的注入，激励束是圆形的以便能够注入同样具有圆截面的光纤，并且为了优化注入率，该激光最好是一个单模的纵向激光以便具有最好的注入到光纤中的波阵面，该光纤是弱多模的。激光器的输出功率至少是20mW。为了获取图像，激光器可以以连续和稳定的方式发射(最小的噪声，＜1％)。作为示例，可以使用量子势阱激光器(垂直腔面发射激光器)、二极管注入泵浦固体激光器、激光二极管或一个诸如氩气体激光器的气体激光器。现在而且之后也可以看到，为了仅仅产生感兴趣的区域的光谱，每一个激光器都可以以大于100MHz的频率工作在脉冲状态下。

在光源1、2的输出端，放置了用于修正激励激光束的“扩展”装置3、4。它们由一个不同于1的远焦光学放大系统构成，包含着能够改变激光束直径的透镜。这一放大是经过计算的，以便光束的直径满足注入光纤的注入装置10的要求。

再整形的激励激光束被直接导向装置5、6以提供单独的激励和荧光波长。例如这些装置是一个在激励波长处具有98％至99％的传输效率并主要反射其他波长的分色镜。该荧光信号利用了与激励信号相同的光路返回，因此发送至检测路径15、18。拒波装置11、12被放置在检测路径上，用于分别在激励波长488nm和635nm处完全地消除1％到2％的偏离反射，其穿过了检测路径(例如，分别在488nm和635nm处的两个拒波滤波器)。

扫描装置7吸收激励束。根据在附图1中选择和显示的示例，这些装置包括一个在4KHz处的共振镜M1，其用于抑制水平波束进而产生图像的行，一个位于15Hz(通常位于10Hz至40Hz之间)的检流镜M2，，用于垂直偏转波束进而产生图像的帧；以及两个远焦单元放大系统，AF1位于两个镜之间且AF2位于镜M2之后，这些远焦系统被用于共轭两个镜M1和M2的旋转面和光纤的注入面。根据本发明，确定一个扫描速度以便实现体内的原位观测。为此对于最慢的模式该图像的显示模式为896×640像素的扫描必须足够快速以便每秒钟显示至少12个图像。对于具有更少像素的显示模式，每秒钟所获取的图像的数量仍然大于每秒12个图像。在一个变体中，扫描装置可以特别包括一个旋转式反射镜、MEM类型的集成部件(X和Y扫描镜)，或者一个声光系统。

在扫描装置的输出端被偏转的激励束被导向至光学装置10，以便注入像导8的光纤中的一个。这些装置10由两个光学单元E1和E2构成。第一光学单元E1可以在扫描装置7的场边缘处部分地修正光学像差，因此在全部光场(在中心和边缘处)上的注入被优化。第二光学单元E2被用于实现注入。它的焦距和数值孔径被选择以便优化注入到像导8中的光纤中的注入率。根据一个能够获得标准的消色差的实施例，第一单元E1由一对透镜构成，第二单元E2由两对在靠近像导的透镜之后的透镜构成。在一个变体中，这些注入光学元件可以由其他任意类型的标准光学元件构成，例如两个三重透镜，或者由具有渐变折射率的透镜构成(通过衍射光学部件具有对色差的修正)或者是通过一个显微透镜(然而是非常昂贵的)。

像导8由大量柔软的光纤构成，例如30000个直径为2μm且间隔为3.3μm的光纤。特别的，可以使用像导的全部光纤，或者至选择部分的光纤，例如只选择部分处于中心的光纤。

在光纤的输出端，激励激光束通过光头9聚焦在样品26的一个点上，这个点位于一个相对于光头9希望接触放置的样品表面而言处于几十μm到几百μm之间的给定的深度上。例如这个深度可以是40μm。因此光头使得可以将离开像导的通量聚焦在样品内，但是也可以收集由样品返回的荧光通量。该光头具有2.4的放大率和例如为0.5的数值孔径。选择这两个参数以使返回的信号只出现在传送了激励信号的光纤中而不出现在相邻的光纤中，从而使用光纤来保证共焦过滤。具有这些放大率和数值孔径的数值，轴向的分辨率大约是15μm并且横向的分辨率大约为2μm。以同样的方式来选择数值孔径，以便优化那些必须尽可能大的获得的光子数量。光头可以由标准光学装置(双透镜、三透镜、非球面透镜)构成和/或由带有光学特性的具有渐变折射率(GRIN)的透镜构成以及一个适合非聚焦的显微镜构成，也就是最小的光学像差，否则将导致场的深度降低并且导致设备的轴向分辨率下降。在操作过程中，光头趋向于被放置在接触至样品26。所出现的荧光是通过一个被注入(系统荧光)的荧光体或者由一个通过修改遗传基因(转基因荧光)而由细胞自身产生的荧光体产生的。这样，两个荧光体被注入并且通过一个带宽为50和200nm之间，特别是100nm的光谱带再次发送光子。

在检测路径上，在拒波滤波器11、12的输出端，两个荧光信号被分离，这是通过使用一个分光镜14的波长选择实现的。之后每一个荧光信号分别在空间滤光装置16、19的滤光孔中通过装置17、20聚焦，该装置例如由一个检测透镜构成。检测透镜的焦距是经过计算的以便源自光纤的荧光信号的大小等于或略小于滤光孔的大小。后者可以保证荧光信号只源自被入射波束所照射的光纤。这样可以抑制应该被耦合到与被照射的光纤相邻的光纤中的光线。孔的尺寸被计算以便完美地呈现光纤的图像。在这种情况下，该尺寸是20μm。

所使用的滤波器具有一个足够被选择用来分离荧光信号以及足够大的获得实时获取图像所必须的最大数量的光子的带宽。

检测装置15、18在荧光波长处具有最大的灵敏度。例如可以使用一个雪崩光电二极管(APD)或一个光倍增器。此外，根据本发明，带宽被选择以便优化荧光信号的积分时间。对应于像导在具有优化的每个像素的积分时间时的最小采样频率是1.5MHz。

电子和计算装置25(诸如一个微机)用于控制、分析和数字处理检测到的信号并且用于查看，其包含如下的电路板：

-一个同步电路板24，其功能是：

-以同步方式控制扫描，也就是行反光镜M1和帧反光镜M2的运动；

-以同步方式控制荧光图像，空间分析由光谱22得到的数据；

-了解在所有时间上激光光斑扫描的位置；并且

-通过其自身能够被控制的微控制器来控制其他的电路板；

-一个检测电路板23，对于每个检测路径包括一个尤其产生阻抗匹配的模拟电路、一个放大器、一个模拟-数字转换器和一个修正信号的可编程的逻辑器件(例如一个FPGA电路)。

微计算机25还包括一个数字获取电路板(未示出)，其能够以可变的频率处理数字数据流并且使用一个图形电路板(未示出)将其显示在一个屏幕上。

根据本发明的系统可以实现特别是在文献WO 2004/008952和/或文献WO2004/010377中所描述的图像处理。如附图2所示，这一图像处理可以实时地在每一个检测路径中同时获得示出了标记物的原像27、28。图像27、28和29对应于有活体组织检查采样的腺体组织。更特别的，该组织由人的甲状腺构成。这些图像示出了腺体腺管。使用如附图1所示系统的本发明，可以在两个不同的波带上同时获得两个图像。

原像27示出了蓝色的圆点。蓝色是以随机的方式选择的。这些点对应于由被称之为to-pro-3的第一荧光体发出的荧光信号，并且能够被635nm波长的激光所激励。其是一个DNA插入剂，由于DNA存在与细胞核中，所以该荧光体能够标识出细胞核。

原像28示出了任意的红色结构，定义了非常特殊的空间区域。这些区域对应于由被称之为DiA的第二荧光体发出的荧光信号，并且其能够被488nm波长的激光所激励。这些荧光体和细胞的细胞膜内的脂质(脂肪酸)具有非常强的亲和性。因此图像的可见区域对应于图像场中的可见的膜。根据本发明，之后叠加这两个原像以便形成在图2中所示的最终图像29，包括蓝色和红色的元素。这可以更好地在红色的膜内划定蓝色的细胞核。

以同样的方式，在附图3中，图像33、34和35表示一个源自子宫颈的马尔丕基氏组织。在图像33中，可见的蓝色点对应于细胞核中的DNA。所使用的标记物是POPO-1，其能够被405nm的激光所激励。在附图34中，红色的“蜂巢”结构对应于细胞核和细胞膜。所使用的标记物是DiA并且能够被488nm的激光所激励。在图35中，可以看到叠加的两个图像33和34。可以清楚地看到细胞膜中的细胞核。

有利地，荧光图像获取路径被耦合至一个光谱路径。在附图1中的光谱22可以实现对全部的图像或一部分图像的光谱分析。

对荧光信号的时间和空间监视可以为生物组织的生物活性提供非常重要的信息。事实上，用于产生荧光图像的荧光体对周围环境是非常敏感的(特别是能够选择“智能”荧光体，其在环境发生变化时立即出现反应，或者是和非常特殊的分子类型有反应)。这些荧光的级别(强度)和形状(光谱)随着周围环境的改变而变化。花费时间对荧光的灵敏度和光谱所作的研究可以为生物环境的动力学提供信息。这样，由于对荧光的空间和时间分析，监视药物的活性或新成代谢活动或者对外部压力(例如pH、温度、酶活性等等)的反应可以被纪记录。

这样一种结合的优点是能够对荧光提供更为详细地分析，可以设想以下一些分析情况：

-对图像的荧光进行时间和光谱的分析：在这种情况下，光谱分析应用于所有的图像。这时对所获得的整个图像进行第一次相当粗糙的分析；

-对图像中感兴趣的区域的荧光进行时间和光谱的分析：在这种情况下，这一部分区域是非常感兴趣的，表现为对图像的特定区域的分析。因此需要预先对共焦荧光图像进行一个分析，以便确定所谓的“感兴趣”的区域并随后对这些区域进行特殊的分析。因此需要通过图像同步分析和光谱分析；以及

-对图像的自发荧光进行时间和空间监视；在后一种情况下，是对组织的自发荧光的分析。在这种特殊的情况下，在光谱的蓝色部分使用激光。然而，由外源性荧光体导致的荧光不能放置对自发荧光的检测(其是非常微弱的)。自发荧光对应于来自注入黄素、NADH、卟啉等等的存在于活体组织中的天然荧光化合物的通量。

特别是在第二种情况下，需要分析图像(获取、处理、标识感兴趣的区域)，以同步光谱路径和穿过感兴趣的区域的通道并且最终分析相对应的光谱。在第二种情况下，这种结合可以根据如下两种变体来设想：脉冲激光模式和高速切换模式。

附图1中，示出了使用了脉冲激光的情况，从而激励样品并因此获得一个图像以及整个图像或一个(或多个)感兴趣的区域的光谱。使用脉冲激光的原因是可以避免额外的由光谱路径中的其他成分所引起的损耗，这可以在高速切换模式中看到。一个分束器13采样了百分之二十来自拒波滤波器11、12的光通量。所采样的通量被引入提供光谱22仪的光纤21中。

在这种情况下，足以仅仅将激光切换至所谓的感兴趣的区域并检测和这些区域相关的光谱。这只是简单的同步和组织有关的照明并且可以通过简单的计算装置实现。这一处理是非常简单的。

高速切换模式调用一个非常高速的滤波系统，该系统放置在光谱仪的输入端(参照图4)。当激光的扫描位置对应于感兴趣的区域上的通道时，可以在很短的时间内将荧光通量导向至光谱仪。在理想情况下，设备必须切换至每个光纤，也就是1μm的时间(以1μm/光纤的速度扫描一行光纤)。实际上，例如细胞核的通量(在组织水平上是5μm)是积分的，其对应于几个μm的最大积分时间。如图4所示，这一光谱路径的分量如下：

-具有对于成像路径的透射系数为80％且对于光谱路径的反射系数为20％的分束器13，以免过多地减少形成一个图像所需的通量；

-设备31，其具有足够高的速度以便切换至每一个扫描的光纤或者切换至一个(或多个)之前定义的感兴趣的区域。其可以是一个机械的、声光(31)、一个反光镜等等；

-消色差双合透镜30，其具有100mm的焦距以便将光束聚焦在光纤中；

-光纤21，取决于所希望的分辨率，该光纤的芯直径为50或100μm，，且其数值孔径为0.22，以及

-光谱仪22，其特性如下：首先，例如一个线性CCD(2048像素)或矩阵CCD组成的检测器，其波长范围在200至1100nm之间，具有86光子/计数(2.9×10^-17W/计数)的灵敏度，具有250∶1的信噪比。其次，具有600线/毫米的衍射光栅，效率大于30％，分辨率位于0.3nm和10.0nm之间并且最终具有一个200μm的缝隙宽度。

可以设想一些用于高速切换的设备：

1)机械“快门”：这时其是一个在横向上被一个平移板驱动的平板，以便当扫描感兴趣的区域是允许光束穿过。该平移板必须具有一个数十微米的分辨率，其被一个步进马达或直流马达驱动，位移为几个毫米。它的反应速度取决于感兴趣区域的大小，这最好非常非常显著。

2)反光镜：当扫描到感兴趣的区域外时的另一个切换设备，以便抑制“感兴趣的区域外”的信号。为此，使用了一个反光镜，其放置在分光镜之后，并且具有一个最小为大约一秒钟转动几毫弧度的角度的响应时间，并且具有高的反射率。因此在传送时，该光谱路径不再工作但是在反射时是工作的。

3)图4所示的声光偏转器。这一配置所需要的部件是：一个包含着两个消色差双合透镜且放大率为1/3的共焦系统30，其目的是减少光束的大小从而进入打开了2mm的偏转器31。该偏转器工作的光谱范围为400至800nm，其的响应速度小于一微秒(如果可能的话以便切换每一个光纤)。偏转效率是90％并且静态损耗是最小的(＜10％)以免在进行传输时具有太大的损耗并且具有几毫弧度的偏转角。最后，由于偏转系数是90％(这里仍然有10％的通量位于0级的方向上)，聚焦后的光线32位于偏转方向上(1级)。

在每一个假设的情形中(“快门”方案或脉冲激光方案)，可以设想计算机(自动的)插件程序能够跟踪对以时间为函数的荧光峰值或者是两个荧光峰值在时间和空间上的比率的降低。有一些已经生产的技术模块能够满足用户的需要。

对感兴趣的区域的选择是由用户指定或是自动完成的。

当然，本发明不仅仅局限于上述的实施例，并且在不超出本发明范围的情况下作出大量修改。可以预想：利用由数千根光纤构成的像导产生高清晰度非共焦图像，其中，像导的末稍裸露地被直接接触放置在样品的表面上。在这种情况中，利用根据本发明进行了修改的文献WO2004/008952的教导是非常有可能的。

Claims (26)

1.产生样品的光纤型荧光显微图像的方法，其中：

-利用一个激励信号扫描所述样品，该激励信号经过一个包含由若干光纤构成的像导的光路，

-检测源自所述样品的荧光信号，所述激励信号和荧光信号使用同一个光路；

-通过所述光路激励所述样品中包含的至少两个荧光体，

-所述至少两个荧光体中每一个荧光体的荧光信号通过所述光路被发向检测路径并随后被检测以产生最终图像，

并且

-产生该最终图像，该最终图像包含根据所述至少两个荧光体而被着色的区域，

其特征在于：

-对所述像导的所述光纤逐一进行采样，并

-将通过所述光路的源自样品的一部分信号导向作为光谱路径的部件的光谱仪，并且对于每个图像或只对于图像的一个感兴趣区域，从导向该光谱仪的所述一部分信号获得作为波长函数的亮度的光谱。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少两个荧光体是同时被激励的。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少两个荧光体是依次被激励的。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述至少两个荧光体的荧光信号是同时被检测的。

5.如权利要求1至3中的任一项所述的方法，其特征在于，所述至少两个荧光体的荧光信号是依次被检测的。

6.如权利要求1至4中的任一项所述的方法，其特征在于，以对应于能够产生满足实时使用要求的每秒钟所获得的图像数量的速度来扫描该样品，并且所述荧光信号是以一个对应于光纤逐一进行采样的最小频率的检测频率来检测的。

7.如权利要求1至4中的任一项所述的方法，其特征在于，为了产生所述最终图像，产生同检测到的荧光信号一样多的原像，每一个原像按照被分配给对应荧光体的色彩来着色，然后使所述原像重叠以组成最终的图像。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在获取所述光谱之前，通过以下方式确定所述感兴趣区域：利用权利要求1所述的方法产生一个第一图像，随后在所获得的图像上限定所述感兴趣的区域。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在获取所述光谱之前，通过以下方式确定所述感兴趣区域：利用权利要求2所述的方法产生一个第一图像，随后在所获得的图像上限定所述感兴趣的区域。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在获取所述光谱之前，通过以下方式确定所述感兴趣区域：利用权利要求3所述的方法产生一个第一图像，随后在所获得的图像上限定所述感兴趣的区域。

11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在获取所述光谱之前，通过以下方式确定所述感兴趣区域：利用权利要求4所述的方法产生一个第一图像，随后在所获得的图像上限定所述感兴趣的区域。

12.如权利要求1至4中的任一项所述的方法，其特征在于，为了仅仅获得一个图像中一个感兴趣区域的光谱，利用一快门在预定的时间将源自样品的所述一部分信号导向所述光谱仪，其中所述预定的时间对应于激励信号扫描所述感兴趣区域的时间。

13.如权利要求1至4中的任一项所述的方法，其特征在于，为了仅仅获得一个图像中一个感兴趣区域上的光谱，利用至少一个高频脉冲激光器以便发射激励信号，该激光器仅当所述感兴趣的区域被扫描时才被激活。

14.用于产生样品(26)的光纤型荧光显微图像的系统，该系统包括：

-处理单元(23、24、25)，

-光路(7、8)，其包括至少一个用于扫描样品中的激励信号的装置(7)和一个用于将激励信号传送至样品并且用于收集源自所述样品的荧光信号的像导(8)，该像导(8)包括由若干光纤构成的像导，该激励信号和荧光信号使用同一个光路；

-激励装置(1、2)，用于通过所述光路激励至少两个包括在样品中的荧光体，

-作为检测路径的部件的检测装置(15、18)，用于通过所述光路检测所述至少两个荧光体中每一个荧光体的荧光信号，以便产生最终图像，以及

-处理装置(25)，其位于处理单元内，用于产生该最终图像，该最终图像包括根据所述至少两个荧光体而被着色的区域，

其特征在于：

-该系统被安排为对所述光纤逐一进行采样，并且

-该系统还包括作为光谱路径的部件的光谱仪和开关，

并且其中：

-该开关被安排为将通过所述光路的源自样品的一部分信号导向所述光谱仪，并且

-对于每个图像或只对于图像的一个感兴趣区，所述光谱仪能够利用导向该光谱仪的所述一部分信号产生作为波长函数的亮度的光谱。

15.如权利要求14所述的系统，其特征在于，所述激励装置包含一个能够同时激励所述至少两个荧光体的发射器。

16.如权利要求14所述的系统，其特征在于，所述激励装置包含至少两个发射器，每一个发射器激励所述至少两个荧光体中的一个。

17.如权利要求16所述的系统，其特征在于，由所述至少两个荧光体所发射的荧光信号具有彼此之间间隔足够远的波长，以使这些荧光信号通过滤波而分离。

18.如权利要求16或17所述的系统，其特征在于，所述激励信号的两个发射器是两个分别在488nm和635nm处发射的激光器，在样品中的两个荧光体分别与这两个波长反应。

19.如权利要求14至17中任一项所述的系统，其特征在于，所述检测装置包含一个与作为可调带通滤波器的可调滤波器相结合的接收器，其能够使所述至少两个荧光体所发出的每一个荧光信号依次通过。

20.如权利要求14至17中任一项所述的系统，其特征在于，所述检测装置包括至少两个和分离器(14)相结合的接收器，该分离器(14)能够根据波长将每一个荧光信号发送至一个给定的接收器。

21.如权利要求14至17中任一项所述的系统，其特征在于，所述扫描装置以对应于能够产生满足实时使用要求的每秒钟所获得的图像数量的速度扫描该样品，并且该检测装置是以一个对应于光纤逐一进行采样的最小频率的检测频率来检测荧光信号的。

22.如权利要求14至17中任一项所述的系统，其特征在于，所述像导由上千个光纤构成，该像导位于扫描装置之前并且在光头之后以便将激励信号聚焦在样品上。

23.如权利要求14至17中任一项所述的系统，其特征在于，所述像导由上千个光纤构成，并且其末端放置成裸露地直接与样品的表面接触。

24.如权利要求14所述的系统，其特征在于，该光谱仪可以和一个快门相结合，该快门能够在预定的时间将源自样品的所述一部分信号导向所述光谱仪，其中所述预定的时间对应于激励信号扫描感兴趣区域的时间。

25.如权利要求14所述的系统，其特征在于，为了只获取图像中感兴趣区域的光谱，所述激励装置包含至少一个高频脉冲激光器，该脉冲激光器仅当扫描所述感兴趣的区域期间被激活。

26.如权利要求14至17中任一项所述的系统，其特征在于，所述处理单元包含用于对激励装置和接收装置进行同步的装置。

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