CN100528235C

CN100528235C - 红细胞生成素共轭物

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Publication number: CN100528235C
Application number: CNB018206093A
Authority: CN
Inventors: 约瑟夫·伯格; 阿尔弗雷德·恩格尔; 莱因哈德·弗兰泽; 贝恩德·希尔格; 哈特穆特·恩斯特·舒里希; 威廉·蒂舍尔; 曼夫雷德·沃茨尼
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-12-20
Filing date: 2001-12-08
Publication date: 2009-08-19
Anticipated expiration: 2021-12-08
Also published as: JP2008069155A; ZA200304647B; KR100645843B1; CN1527726A; KR20030074667A; AR035407A1; US20020115833A1; AU3323002A; CA2431964A1; JP4563434B2; MXPA03005406A; AU2002233230B2; CA2431964C; ES2361824T3; BR0116381A; JP4656814B2; JP2004525097A; US7128913B2

Abstract

本发明涉及一种聚(乙二醇)与红细胞生成素的共轭物，所述的共轭物包含红细胞生成素糖蛋白，该红细胞生成素糖蛋白具有N末端α-氨基基团并具有引起骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学活性，并且该糖蛋白选自人红细胞生成素及其类似物，所述的红细胞生成素类似物具有通过添加1-6个糖基化位点或者至少一个糖基化位点重排而修饰的人红细胞生成素序列；所述的糖蛋白与以下化学式的一个聚(乙二醇)基团共价地连接-CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR该聚(乙二醇)基团的-CO与所述的N末端α-氨基形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或者3；和m是大约450-大约1350。

Description

红细胞生成素共轭物

红细胞生成是指用来补偿细胞破坏作用而发生的红细胞产生。红细胞生成是一种受控的生理学机制，其能够使肌体获得充足的红细胞用于适当的组织氧化。自然发生的人红细胞生成素(EPO)在肾脏中产生，并且是刺激红细胞产生的体液血浆因子(Carnot，P and Deflandre，C(1906)C.R.Acad.Sci.143：432；Erslev，AJ(1953Blood 8：349；Reissmann，KR(1950)Blood 5：372；Jacobson，LO，Goldwasser，E，Freid，W and Plzak，LF(1957)Nature 179：6331-4)。自然发生的EPO刺激骨髓中定向红细胞祖细胞的分裂和分化，并且通过结合到红细胞前体的受体上来发挥其生物学活性(Krantz，BS(1991)Blood 77：419)。

红细胞生成素已经通过使用重组DNA技术(Egrie，JC，Strickland，TW，Lane，J et al.(1986)Immunobiol.72：213-224)被生产出来，它是人EPO基因克隆插入并在中国仓鼠卵巢组织细胞(CHO细胞)中表达的产物。在图1中描述了占优势的完全加工形式的人红细胞生成素(hEPO)的一级结构。在Cys⁷-Cys¹⁶¹和Cys²⁹-Cys³³之间存在两个二硫桥键。没有糖部分的EPO多肽链的分子量为18,236Da。在完整的EPO分子中，碳水化合物基团占分子量的大约40％，此碳水化合物基团在蛋白的糖基化位点处将蛋白糖基化(Sasaki，H，Bothner，B，Dell，A and Fukuda，M(1987)J.Biol.Chem.262：12059)。

由于人红细胞生成素在红细胞形成中非常重要，因此此激素可被用于以低或缺乏红细胞生成为特征的血液病症的治疗中。在临床上，EPO被用于治疗慢性肾功能衰竭患者(CRF)中的贫血(Eschbach，JW，Egri，JC，Downing，MR et al.(1987)NEJM 316：73-78；Eschbach，JW，Abdulhadi，MH，Browne，JK et al.(1989)Ann.Intern.Med.111：992；Egrie，JC，Eschbach，JW，McGuire，T，Adamson，J W(1988)Kidney Intl.33：262；Lim，VS，Degowin，RL，Zavala，D et al.(1989)Ann.Intern.Med.110：108-114)和AIDS以及接受化疗的癌症患者(Danna，RP，Rudnick，SA，Abels，RI In：MB，Garnick，ed.Erythropoietin in Clinical Applications-AnInternational Perspective.New York，N.Y.：Marcel Dekker；1990：p.301-324)的治疗。但是，可以商购的蛋自制剂如EPO，其生物利用度被其短的血浆半衰期和对蛋白降解的敏感性所限制。因此，已经建议使用例如聚乙二醇化(pegylated)的EPO衍生物来克服这些不足。

制备聚乙二醇化蛋白的常规方法，可以产生单-和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物。另外，取决于蛋白表面上可以利用的反应基团的数量和反应性，聚乙二醇化合物(PEG)可以结合到蛋白质的多个位置。这种混合物会导致严重的不足：PEG可能会结合到与蛋白特异受体相互作用的位置，并且决定性地降低甚至抑制治疗效果。为了克服这一缺点，需要对这种混合物的组分进行分离和纯化，或者需要选择性的合成方法以避免此混合物的形成。非常明显，避免任何混合物形成，将会更容易地高产率地获得单位置异构体的纯活性药物组分。在规模化生产中，使用常规方法来分离PEG蛋白的位置异构体甚至是不可能的。

在下列国际专利申请中提及了PEG蛋白化合物的实例WO00/32772，WO97/03106和WO00/42175。WO00/32772涉及聚合物衍生的非糖基化红细胞生成素化合物以及用于制备这些涉及无接头醛修饰方法应用的蛋白质的方法。WO97/03106公开了聚(乙二醇)和被丙酸或丁酸单取代的相关聚合物，和用于生物技术应用的功能性衍生物，例如，琥珀酰亚胺基酯在生产蛋白共扼物中的应用。WO00/42175涉及具有游离半胱氨酸的可溶性蛋白的制造方法，其中的宿主细胞被暴露于半胱氨酸封闭剂。随后对通过所述方法制备的所述可溶性蛋白进行修饰以增加它们的效力。这些修饰作用包括附着PEG部分以形成聚乙二醇化的蛋白质。

已有人提出了对重组产生的多肽进行选择性修饰的几种方法。

在欧洲专利申请EP 651,761中公开了在重组产生多肽的末端α-碳反应基团处进行的选择性修饰。该方法的第一步是形成重组产生的多肽，这样可以用生物学添加的保护基团保护所述的末端α-碳反应基团。此生物学添加的保护基团优选是氨基酸、肽和/或包含至少一个可以被酶切或者被化学切割的位点的多肽，所述的多肽优选具有不出现于目的多肽序列中的序列。一旦形成，生物学上保护的多肽就与化学保护制剂反应以保护侧链基团，随后用对生物学添加的保护基团特异的切割试剂对其进行切割。通过这些方法，产生了具有未保护的N末端氨基和保护的侧链反应基团的多肽。用修饰剂修饰未保护的N末端氨基，以形成N末端修饰的和侧链保护的多肽。随后进行去保护作用以形成N末端修饰的多肽。在EP 651,761中教导：可以将任何氨基酸序列作为生物学添加的基团附加。但是，在哺乳动物表达系统中，被表达的EPO带有一个前导信号序列，其被信号肽酶切割以产生被加工的、成熟的EPO。这种信号肽酶只识别在P1’和P3’切点的限制性氨基酸残基(R.E.Dalbey et al.Protein Sci.6，1129(1997))。因此，必须从至少3个氨基酸的N末端氨基酸序列建立用于信号序列切割的生物学添加的保护肽，随后建立用于酶去除或者化学去除保护基团的氨基酸序列。如果信号肽酶和切割蛋白酶的识别序列都是相同的或者密切相关的，那么可以将生物学添加的保护基团序列减少到几个氨基酸。

另外，通过化学选择性连接到醛(或者酮)-官能化的目的大分子，实现了N末端选择性修饰(欧洲专利申请EP 788,375；Gaertner，HF，Offord，RE，Bioconjugate Chem.，7(1)，38-44(1996))。但是，这种方法只对N末端为苏氨酸或者丝氨酸的情况适用。

通过丙氨酸到丙酮酸盐的氨基转换作用，实现了N末端丙氨酸的选择性修饰(欧洲专利申请EP 964,702和EP 605,963)。该方法的不足在于：所形成的EPO衍生物表现出体外活性的下降。转化剂Cu²⁺/乙醛酸/NaOAc也可能会在EPO分子内产生副反应。

谷氨酰胺转移酶介导的聚(乙二醇)衍生物的结合，同样显示了点特异的N末端修饰(Sato，H.，Yamamoto，K，Hayashi，E，Takahara，Y，Bioconjugate Chem.11(4)，502-509(2000))。但是这种方法表现出低产量并且需要在N末端结合肽标记物，并因此修饰了所述的多肽结构。

使用基于乙醛酰标记的试剂所进行的修饰作用，也可以进行选择性的N末端修饰(Zhao，ZG，Im，JS，Clarke，DF，Bioconjugate Chem.10，424-430(1999))，但是其仅限于半胱氨酸。

本发明提供了一种红细胞生成素共轭物，所述共轭物包含红细胞生成素糖蛋白，该红细胞生成素糖蛋白具有N末端α-氨基基团并具有引起骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学活性，并且该糖蛋白选自人红细胞生成素及其类似物，所述的红细胞生成素类似物具有通过添加1-6个糖基化位点或者至少一个糖基化位点重排而修饰的人红细胞生成素序列；所述的糖蛋白与以下化学式的一个聚(乙二醇)基团共价地连接

-CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR

该聚(乙二醇)基团的-CO与所述的N末端α-氨基形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或者3；和m是大约450-大约1350。

与未修饰的EPO(即：无PEG附着的EPO)和传统的PEG-EPO共轭物相比较，本发明的共轭物具有增加的循环半衰期和血浆滞留时间、降低的清除率、和增加的体内临床活性。本发明的共轭物具有与EPO相同的用途。具体地说，本发明的共轭物以与EPO治疗患者的相同的方式，通过刺激骨髓中定向红细胞祖细胞的分裂和分化来治疗患者。

本发明提供了这样的共轭物，所述的共轭物包含红细胞生成素糖蛋白，该红细胞生成素糖蛋白具有N末端α-氨基基团并具有引起骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学活性，并且所述的共轭物选自这样的人红细胞生成素及其类似物，该人红细胞生成素类似物具有通过添加1-6个糖基化位点或者至少一个糖基化位点重排来修饰的人红细胞生成素序列；所述的糖蛋白与以下化学式的一个聚(乙二醇)基团共价地连接

-CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR

该聚(乙二醇)基团的-CO-CO(即羰基)与所述的N末端α-氨基形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或者3；m是大约450-大约1350；即，对m进行选择以使共轭物减去红细胞生成素糖蛋白的分子量为大约20kDa(千道尔顿)-大约60kDa。

据发现，可以与未修饰的EPO相同的方式使用本发明的共轭物。但是，本发明的共轭物具有增加的循环半衰期和血浆滞留时间、降低的清除率、和增加的体内临床活性。由于这些改进的性质，可以每周一次的给予本发明的共轭物，而不需要象未修饰的EPO那样每周给予三次。给药频率的降低，预计会引起患者顺从性的改善，从而引起治疗结果的改善以及患者生命质量的改善。与连接到聚(乙二醇)的传统EPO共轭物相比，已经发现，具有本发明共轭物的分子量和接头结构的共轭物，具有增强的效能、稳定性、曲线下面积(AUC)、和循环半衰期。

术语“N末端α-氨基”指的是肽的N末端氨基残基，即：具有带有游离α-氨基(NH₂-)基团的氨基酸的肽链或者蛋白链的那一末端。

术语“红细胞生成素”或“EPO”指的是一种糖蛋白，该糖蛋白具有图1(SEQ ID NO：1)或者图2(SEQ ID NO：2)所示的、优选图1所示的氨基酸序列，或者基本上与其具有同源性的序列，其生物学性质涉及对红细胞产生的刺激作用以及对骨髓中的定向红细胞祖细胞的分裂与分化的刺激作用。这里使用的术语包括这样一些被特意修饰的蛋白质，例如，通过位点定向突变或者通过随机突变修饰的蛋白质。这些术语还包括具有1-6个附加糖基化作用位点的类似物、在该糖蛋白的羧基末端具有至少一个附加氨基酸的类似物，其中的附加氨基酸包括至少一个糖基化作用位点、和这样的类似物，该类似物具有包含至少一个糖基化作用位点重排的氨基酸序列。这些术语既包括天然的也包括重组产生的红细胞生成素。

术语“中间体EPO”指的是带有N末端延伸的红细胞生成素糖蛋白衍生物。优选地，此氨基酸延伸包含一种分泌信号序列，其后任选地具有一个纯化标记例如组氨酸标记(描述于例如H.M.Sassenfeld的Trends inBiotechnol.8，88-93(1990)中)，其后为一个用于蛋白消化的酶识别序列，其后是如下定义的红细胞生成素糖蛋白氨基酸序列。

术语“修饰的EPO”指的是其中所述的分泌信号已经被切除的一种中间体EPO，例如，指的是通过蛋白水解切割位点在N末端延伸的一种EPO糖蛋白，蛋白水解切割位点是例如APPRIEGR，即为：APPRIEGR-EPO(SEQ ID NO：3)；蛋白水解切割位点或者是APP，即为：APP-EPO(SEQ ID NO：4)；蛋白水解切割位点或者是APPGAAHY，即为：APPGAAHY-EPO(SEQ ID NO：5)；蛋白水解切割位点或者为基本上与其同源的序列(同样见图3，4，5)。

术语“保护修饰的EPO”指的是一种被修饰的EPO，其通过使用化学保护制剂对ε-氨基进行酰化作用例如通过柠康酰基化(citraconylation)而得到。

术语“保护的EPO”指的是这样的EPO衍生物，此衍生物通过蛋白水解切割所述的保护修饰EPO后得到，即：其中的ε-氨基基团被化学保护制剂所修饰并且其中存在游离的N末端α-氨基的EPO。

术语“同源的氨基酸序列”指的是与图1或者图2中相应的红细胞生成素氨基酸序列或者相应的蛋白水解切割序列具有至少80％氨基酸序列相同性，并且显示出所需生物活性(在此处说明书和权利要求书中定义的聚乙二醇化红细胞生成素化合物的情况下，或者可以被相应的蛋白酶切割，或者具有这样的体内生物学活性，该活性能够引起骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞的产生)的相应的氨基酸序列。优选地，同源性为90％，更优选为95％。

本发明的红细胞生成素共轭物可以由以下的化学式I表示

P-NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR (I)

其中x，m和R如上定义。在化学式I中，P是这里描述的红细胞生成素糖蛋白的残基(即：没有与化学式I中所示的羰基形成酰胺键的N末端α-氨基基团)，其具有引起骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学活性。

在本发明优选的实施方案中，R是甲基。优选地，m为大约550-大约1000，更优选为大约650-大约750。

在本发明最优选的实施方案中，R是甲基，m是大约650-大约750，即：如上定义的共轭物具有如下的化学式：

CH₃O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂CH₂CO-NH-P

其中m是650-750，P如上定义。优选地，m的平均值为大约730。

优选地，以上定义的共轭物的糖蛋白是人红细胞生成素。可以通过内源性基因活化作用来表达人红细胞生成素和如上定义的类似蛋白。优选的人红细胞生成素糖蛋白是图1或图2中显示的那些，最优选为图1所示的那些。

另外，P可以选自人红细胞生成素及其具有1-6个附加糖基化作用位点的类似物的残基。如在以下所详细阐述的那样，本领域的技术人员熟知EPO的制备和纯化。EPO指的是天然或者重组体蛋白、优选人的EPO，其可以从任何常规来源例如组织、蛋白合成、天然或者重组体细胞的细胞培养物中获得。包括任何具有EPO活性的蛋白，例如突变型蛋白或者其它修饰的蛋白。重组体EPO可以通过重组DNA技术或者通过内源性基因活化作用，在下列细胞系中表达而制备：CHO，BHK，COS，HeLa或PER.C6细胞系，或者动物或者人源的其它合适的细胞系。通过内源性基因活化来表达包括EPO在内的蛋白的技术，在本领域中为人所熟知，其被公开在例如美国专利5,733,761，5,641,670，5,733,746中，以及国际专利申请WO 93/09222，WO 94/12630，WO 95/31560，WO 90/11354，WO91/06667和WO 91/09955中，将每个文献的内容在此加入作为参考。制备红细胞生成素糖蛋白产物的优选EPO种类是人EPO种类。更优选地，该EPO种类是具有图1或图2中所示的氨基酸序列的人EPO种类，更优选为图1中所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，P可以是具有1-6个附加糖基化作用位点的糖蛋白类似物的残基。一个或者多个寡糖基团的蛋白糖基化作用，发生在沿着多肽骨架的特定位置，并且极大地影响了所述蛋白的物理性质，例如蛋白稳定性、分泌、亚细胞定位、和生物学活性。糖基化作用通常有两种类型。O连接的寡糖附着到丝氨酸或者苏氨酸，N连接的寡糖附着到天门冬酰胺的残基。同时发现在N连接和O连接寡糖上的一种类型的寡糖是N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，其是含有9或者更多碳原子的氨基糖家族。唾液酸通常是N连接和O连接寡糖上的末端残基，而且由于具有负电荷，其将酸性质赋予所述的糖蛋白。具有165个氨基酸的人红细胞生成素，含有3个N连接的和1个O连接的寡糖链，这些寡糖链占所述糖蛋白全部分子量的大约40％。N连接的糖基化作用发生在位于位置24，38，和83的天门冬酰胺残基处，O连接的糖基化作用发生在位于位置126处的丝氨酸残基。寡糖链被末端唾液酸残基所修饰。用酶促消除法将所有的唾液酸残基从糖基化的红细胞生成素中去除，这样导致其丧失了体内活性但是没有丧失体外活性，这是因为红细胞生成素的唾液酰化作用(sialylation)防止了其被肝结合蛋白结合、和随后清除。

本发明的糖蛋白包括具有一个或者多个人红细胞生成素氨基酸序列改变的人红细胞生成素类似物，这些改变会引起唾液酸附着位点数量的增加。这些糖蛋白类似物可以通过位点定向突变产生，位点定向突变包括氨基酸残基的添加、缺失、或者取代，其增加或者改变了糖基化作用可以使用的位点。通过添加不会干扰生物学活性所需的二、三级构象的糖基化位点，产生了具有比在人红细胞生成素中发现的唾液酸水平更高的糖蛋白类似物。本发明的糖蛋白还包括在糖基化位点具有提高的糖类附着水平的类似物，其通常涉及在N连接或者O连接位点附近的一个或者多个氨基酸取代。本发明的糖蛋白还包括这样的类似物，该类似物具有一个或者多个从红细胞生成素的羧基末端延伸出来的氨基酸，并且提供了至少一个附加的糖类位点。本发明的糖蛋白还包括具有至少一个糖基化作用位点重排的氨基酸的类似物。这种糖基化作用位点的重排包括：删除人红细胞生成素中的一个或者多个糖基化作用位点，和增加一个或者多个非天然存在的糖基化作用位点。在红细胞生成素上糖类链的数量的增加，和因此增加的每个红细胞生成素分子的唾液酸数量，可以带来这样一些优点如提高的稳定性、对蛋白水解更高的抗性、降低的免疫原性、增加的血清半衰期、和增加的生物学活性。在1995年3月1日公开的Elliot的欧洲专利申请640619中，更为详细的公开了具有附加糖基化作用位点的红细胞生成素类似物。

在优选的实施方案中，本发明的糖蛋白含有这样一段氨基酸序列，此序列包含至少一个附加的糖基化作用位点，例如但不限于，含有由选自下列的修饰作用修饰的人红细胞生成素序列的红细胞生成素：

Asn³⁰Thr³²；

Asn⁵¹Thr⁵³；

Asn⁵⁷Thr⁵⁹；

Asn⁶⁹；

Asn⁶⁹Thr⁷¹；

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹；

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²；

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹；

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹；

Asn¹³⁶Thr¹³⁸；

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰；

Thr¹²⁵；和

Pro¹²⁴Thr¹²⁵.

这里使用的用于氨基酸序列修饰的符号的意思是：由上角标数字表示的相应未修饰蛋白(例如：图1和图2的hEPO)的位置，被改变为紧接各自上角标数字之前的氨基酸。

糖蛋白也可以是具有包含至少一个糖基化作用位点重排的氨基酸序列的类似物。所述的重排可以包括在人红细胞生成素中的任何一个N连接糖类位点的缺失、和在人红细胞生成素的氨基酸序列的位置88处的N连接糖类位点的增加。优选地，所述的糖蛋白是选自Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO；Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO；和Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO的类似物。

这里使用的“低级烷基”指的是具有1-6个碳原子的线性的或者支化的烷基。低级烷基的实例包括甲基、乙基、和异丙基。依照本发明，R是任何低级烷基。优选其中R是甲基的共轭物。

符号“m”代表在聚(环氧乙烷)基团中的环氧乙烷残基(OCH₂CH₂)的数目。环氧乙烷的单个PEG亚单位具有大约为44道尔顿的分子量。因此，所述共轭物的分子量(EPO的分子量除外)取决于数字“m”。在本发明的共轭物中，“m”是大约450-大约1350(相当于大约20kDa-大约60kDa的分子量)，优选为大约650-大约750(相当于大约30kDa)，最优选为大约730。对数字m进行选择，以使所得到的本发明共轭物具有与未修饰EPO的生理学活性可比较的活性，该活性可以是与相应的未修饰EPO的活性相同、比相应的未修饰EPO的活性高、或者是未修饰EPO活性的一部分。“大约”某一数字的分子量指的是该分子量处于通过常规分析技术所测定的数字的合理范围内。对数字“m”进行选择，以使共价连接红细胞生成素糖蛋白的聚(乙二醇)链的分子量为大约20kDa-大约60kDa，优选为大约32kDa。

上述化合物制备方法的步骤包括：形成一个重组体单拷贝红细胞生成素糖蛋白或者其一部分，使该单拷贝糖蛋白被一个或者多个生物学添加的保护基团在N末端α胺处保护。此重组体红细胞生成素可以随后与保护制剂反应以选择性地保护反应性侧链氨基基团并因此防止侧链基团被聚乙二醇化试剂所修饰。可以用至少一种对生物学保护基团特异的切割试剂来切割所述的红细胞生成素糖蛋白，以形成未保护的末端氨基酸α-碳反应性氨基基团。可以用聚乙二醇化试剂来修饰未保护的末端氨基酸α-碳反应基。侧链保护的末端修饰的红细胞生成素糖蛋白被随后在侧链基团处去保护以形成末端修饰的(＝聚乙二醇化)重组体红细胞生成素糖蛋白。

因此，本发明还涉及一种方法，其包括

a)表达和，优选地，无血清发酵重组体EPO蛋白，该蛋白包含含有蛋白水解切割位点的N末端肽延伸，

b)保护ε-氨基基团，

c)N末端肽延伸的蛋白水解切割，

d)N末端α-氨基基团的聚乙二醇化，

e)红细胞生成素糖蛋白的ε-氨基基团的去保护，

f)其中，任选地在上述每个步骤以后进行一个纯化步骤。

本发明还涉及上述的方法，其中的重组体EPO包含一种选自图1-5中所示氨基酸序列的序列。可以通过柠康酰基化作用来保护所述的ε-氨基基团，而且可以用化学式II的化合物来对N末端α-氨基基团进行聚乙二醇化作用

其中R，m和x如上定义。

更具体而言，上述的步骤可以如下进行：

A)被修饰的EPO的表达、发酵和纯化：

EPO和EPO相关分子的克隆和表达方法为本领域技术人员所熟知。人红细胞生成素(EPO)是一种刺激红细胞形成的人糖蛋白。其制备和治疗学应用在如下的文献中进行了详细描述，例如美国专利5,547,933和5,621,080，EP-B 0 148 605，Huang，S.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)2708-2712，EP-B 0 205 564，EP-B 0 209 539和EP-B 0 411 678以及Lai，P.H.等的J.Biol.Chem.261(1986)3116-3121，Sasaki，H.等的J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076。治疗学应用的红细胞生成素可以通过重组方法得到(EP-B 0148605，EP-B 0209539和Egrie，J.C.，Strickland，T.W.，Lane，J.et al.(1986)Immunobiol.72：213-224)。

红细胞生成素在无血清培养基中的表达和制备方法被描述在例如于1996年11月14日公布的Burg的WO 96/35718中，和于1992年6月12日公布的Koch的欧洲专利公开513738中。除了上述提及的出版物，已知可以进行含有EPO基因的重组体CHO细胞的无血清发酵。这些方法被描述在例如EP-A 0 513 738，EP-A 0 267 678中以及下面的一些文献中：Kawamoto，T.等的Analytical Biochem.130(1983)445-453，EP-A 0 248656，Kowar，J.和Franek，F.，Methods in Enzymology 421(1986)277-292，Bavister，B.，Exp.Zoology 271(1981)45-51，EP-A 0 481 791，EP-A 0 307247，EP-A 0 343 635，WO 88/00967。

红细胞生成素和EPO衍生物的纯化方法同样为本领域所熟知。

在EP-A 0 267 678中描述了用于在透析后纯化无血清培养物中产生的EPO而进行的在S-琼脂糖凝胶上的离子交换色谱、在C8柱上的制备性反相HPLC、和凝胶过滤色谱。在此，可以用高流动性S-琼脂糖凝胶上的离子交换色谱来代替凝胶过滤色谱步骤。同样建议可以在离子交换色谱之前在Blue Trisacryl柱上进行染色色谱(dye chromatography)。

在Nobuo，I.等的J.Biochem.107(1990)352-359中描述了重组体EPO的纯化方法。在此方法中，在纯化步骤之前，用20、苯基甲基磺酰基氯、乙基马来酰亚胺、胃蛋白酶抑制剂A、硫酸铜和草氨酸处理EPO。在包括于1996年11月14日公布的Burg的WO96/35718在内的出版物中，公开了在无血清培养基发酵工艺(EPOsf)中制备红细胞生成素的方法。

B)与保护制剂反应以选择性地保护反应性侧链氨基基团：保护修饰的EPO的制备

合适的化学保护制剂在未保护的侧链胺处形成键，这些键与在N末端的那些键相比较，较不稳定而且不同。大量的化学保护制剂是已知的(见例如欧洲专利申请EP651,761)。优选环二羧酸酐例如马来酐或者柠康酰酐(citraconylic anhydrides)。

如果目的多肽或者融合蛋白(这里称为修饰的EPO)的性质接受用于保护的微碱性条件和用于去保护的微酸性条件，那么柠康酰基化(Citraconylation)是优选方法(Dixon，HBF；Perham，RN：Biochem.J.109(2)，312-14(1968)；Atassi，MZ，Habeeb，AFSA：Methods Enzymol.25(Pt.B)，546-53(1972))。

任选地，可以在执行下一步骤前对保护修饰的EPO进行纯化。C)对保护修饰的EPO的蛋白水解切割：保护的EPO的制备

在Carter，P：Site-specific proteolysis of fusion proteins；ProteinPurification：From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes，ACS，Washington D.C.，pp.181-193(1990)中描述了用于切割融和蛋白的合适的蛋白酶。这些蛋白酶需要很窄的特异性以在其识别序列而不是在目的蛋白的任何地方进行选择性地切割。实例是在IEGR↓处切割的Xa因子和在DDDDK↓处切割的肠激酶。另外，据报道，肠激酶切割DDDDK↓AP，这表明了白细胞介素在P1’和P2’位点的特异性(P.Carter)。但是，如果必须引入保护赖氨酸侧链ε氨基基团的化学保护制剂，则肠激酶并不是优选的。在此情况下，肠激酶将不会在所需切点处发挥作用。

在其它的酶中，IgA蛋白酶是有用的，其优先在PP↓XP(X＝T，S.A)处切割。XP序列使其适合于白细胞介素和肠激酶(EP513073)。另一个合适的蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’变体(Genenase^TM，Genencor Int.Inc.)，其在HY↓处切割。

任选地，在此阶段可以纯化保护的EPO。

D)用聚乙二醇化试剂修饰

人EPO含有9个游离氨基基团：所述的氨基-末端氨基基团加上8个赖氨酸残基的ε氨基基团。当聚乙二醇化试剂是化学式II的SBA化合物的时候，据发现在pH7.5、蛋白∶PEG的比率为1∶3、并且反应温度为大约20-25℃的时候，如果与EPO反应，则产生单-、二-、和痕量的三-聚乙二醇化类别的混合物。聚乙二醇化的EPO可以以混合物给予，或者通过阳离子交换色谱分离的不同聚乙二醇化类别给予。通过控制反应条件(例如：试剂的比率、pH、温度、蛋白浓度、反应时间等等)，不同聚乙二醇化类别的相对量可以是变化的。

使用这里列举的步骤来保护EPO，只有所述被保护EPO的N末端丙氨酸的N末端α氨基基团被聚乙二醇化。因为赖氨酸侧链的所有ε氨基被保护起来，所以既没有形成二-聚乙二醇保护的EPO也没有形成寡-聚乙二醇保护的EPO。

通过将化学式II的化合物与步骤C)的红细胞生成素糖蛋白缩合，可以由已知的聚合材料来制备化学式I化合物：

其中R和m如前定义。其中x是3的化学式II化合物是α-低级烷氧基-聚(乙二醇)丁酸琥珀酰亚胺基酯(低级烷氧基-PEG-SBA)。其中x是2的化学式II化合物是α-低级烷氧基-聚(乙二醇)丙酸琥珀酰亚胺基酯(低级烷氧基-PEG-SPA)。可以使用任何使活化酯与胺反应生成酰胺的常规方法。在上述的反应中，例举的琥珀酰亚胺基酯是引起酰胺形成的离去基团。在于1997年9月30日授予的美国专利5,672,662(Harris，等)中，公开了将琥珀酰亚胺基酯例如化学式II化合物用于产生与蛋白质的共轭物。

聚乙二醇化反应可以在1∶5(EPO∶PEG-SBA试剂)的摩尔比至最终蛋白浓度为5mg/ml的条件下来进行。优选的聚乙二醇化试剂是甲氧基-PEG-SBA，该试剂是其中R是甲基、x是3且m是650-750(平均值为大约730，相当于大约32kDa的平均分子量，甲氧基-PEG-SBA是可以商购的：Shearwater Polymers，Inc)的化学式II化合物。

可以通过如以下实施例中所描述的常规色谱纯化，来从反应混合物中纯化出反应产物。

E)ε-氨基基团(侧链氨基基团)的去保护：

可以通过常规方法来实现保护制剂的切割(见上)。在去柠康酰基化的情况下，可以通过将溶液在低pH如2.5、室温中搅动5小时来实现蛋白的去保护作用。可以通过使用氢氧化钠将pH调节到4.5来终止反应，将溶液冻存在-20℃以备纯化时使用。

可以通过如实施例中所描述的常规色谱纯化，来从反应混合物中纯化出反应产物。

可以通过各种本领域已知的分析方法来测定本发明的EPO或EPO共轭物的比活性。本发明的纯化EPO蛋白的生物学活性是这样表现的：通过将EPO蛋白通过注射方式给予患者，导致与未注射的或者对照组的受试者相比，骨髓细胞的网织红细胞和红细胞产量增高。可以通过Annable，等的Bull.Wld.Hlth.Org.(1972)47：99-112and Pharm.EuropaSpec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)中的方来，来测定依照本发明获得的和纯化的EPO蛋白或者其片段的生物学活性。在实施例4中描述了另一种用于确定EPO蛋白生物学活性的生物学分析方法。

可以以与给予EPO相同的方式给予患者治疗学上有效量的本发明的共轭物。治疗学上有效的量指的是其体内生物学活性能够引起骨髓细胞提高网织红细胞和红细胞产生量的共轭物的必需数量。共轭物的确切量依赖于下列一些因素：所处理疾病的确切类型、所治疗患者的条件、以及组合物中的其它组分。可以例如每周一次地给予0.01-10μg/kg体重，优选0.1-3μg/kg体重。

本发明还涉及含有上述共轭物的相应药物组合物，以及药学上可接受的赋形剂。

可以以这样的强度来配制含有所述共轭物的药物组合物，此强度对于通过以各种方法给予被表征为红细胞产生低或者有缺陷的血液病征患者有效。所述共轭物的平均治疗有效量是变化的，特别是应该基于有资格内科医师的处方和建议。

依照本发明制备的红细胞生成素糖蛋白产物，可以被制备在带有药学上可接受的载体适于注射的药物组合物中，制备方法为本领域技术人员所熟知。例如在WO97/09996，WO97/40850，WO98/58660，和WO99/07401中描述了合适的组合物。例如，本发明的组合物可以被配制在pH为7、包含张性制剂如132mM氯化钠的10mM钠/钾磷酸盐缓冲液中。任选地，所述药物组合物可以含有防腐剂。所述的药物组合物可以含有不同量的红细胞生成素，例如10-10000μg/ml，例如50μg/ml或者400μg/ml。

优选地，所述的药物组合物含有上述定义的共轭物、适于将溶液pH保持在5.5-7.0范围内的药用缓冲液中的多电荷的无机阴离子、和任选地一种或者多种药用赋形剂，例如，所述的组合物含有大约10μg-大约10000μg红细胞生成素共轭物/ml、10-200mmol/l硫酸盐、大约10-大约50mmol/l的pH为6.0-6.5的磷酸盐、任选为1mM的CaCl₂和任选地大约1-5％的多元醇。合适组合物的实例是：

a)50μg/ml或者400μg/ml的红细胞生成素共轭物，10mM的钠/钾磷酸盐，100mM NaCl，pH 7.0；

b)50μg/ml或者400μg/ml的红细胞生成素共轭物，10mM磷酸钠，120mM硫酸钠，pH 6.2；

c)50μg/ml或者400μg/ml的红细胞生成素共轭物，10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露糖醇，pH 6.2；

d)50μg/ml或者400μg/ml的红细胞生成素共轭物，10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露糖醇，7.5μM CaCl₂，pH 6.2；

e)50μg/ml或者400μg/ml的红细胞生成素共轭物，50mM精氨酸，100mM硫酸钠，1mM CaCl₂，pH 6.2；和

f)50μg/ml或者400μg/ml的红细胞生成素共轭物，50mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露糖醇，1mM CaCl₂，pH 6.2.

其它优选的组合物可以含有10-大约10000μg/ml的红细胞生成素，优选为25-2500μg/ml红细胞生成素，和

a)10mM钠/钾磷酸盐，100mM NaCl，pH 7.0；或者

b)10mM磷酸钠，120mM硫酸钠，pH 6.2；或者

c)10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，pH 6.2；或者

d)10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)，pH 6.2；或者

e)40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，pH 6.2；或者

f)40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％聚醚(pluronic)F68(w/v)，pH 6.2。

在最优选的实施方案中，本发明的组合物包含的红细胞生成素蛋白的量为50，100，400，800或者2500μg/ml。最优选的组合物含有10mM磷酸钠、40mM硫酸钠、3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸、0.01％聚醚F68(w/v)、pH 6.2，或者40mM精氨酸、30mM硫酸钠、3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸、0.01％聚醚F68(w/v)，pH 6.2。

本发明的共轭物可用于以下药物的制备，这些药物用于防治慢性肾功能衰竭患者中的贫血相关疾病，AIDS，和用于治疗经受化疗的癌症患者。

本发明还涉及上述的共轭物在药物制备中的用途，特别是这样药物的制备，这些药物用于防治慢性肾功能衰竭患者中的贫血相关疾病，AIDS，和用于治疗经受化疗的癌症患者。

本发明的另一个实施方案涉及一种与慢性肾功能衰竭患者(CRF)中的贫血、AIDS和经受化疗的癌症患者相关的病症的预防和/或治疗方法，其包括将上述共轭物给予患者这样一个步骤。

本发明还涉及上述的化合物在治疗慢性肾功能衰竭患者(CRF)中的贫血相关疾病、AIDS和经受化疗的癌症患者中的应用。

本发明的另一个方面包括通过使用上述方法而制备的上述化合物。

本发明的另一个实施方案涉及红细胞生成素糖蛋白，其包含如图1和图2中所示的、具有代表蛋白水解切割位点的N末端肽延伸的氨基酸序列、任选地含有一个N末端纯化标记。这些肽的实例是APPRIEGR-EPO，APP-EPO和APPGAAHY-EPO(还见图3-5)。本发明的一个实施方案涉及含有如图3-5中所示的氨基酸序列的红细胞生成素糖蛋白。

通过参考下面的实施例，可以更好地理解本发明，下述实施例的目的是为了阐述本发明，而不是为了限制本发明。

实施例

实施例1：修饰的EPO的表达、发酵和纯化

(1)修饰的EPO构建体的表达

a)试剂

除非特别指出，这里使用的所有生化试剂来自Roche DiagnosticsGmbH(Mannheim，Germany)，所有的细胞培养试剂来自Gibco-BRL(Eggenstein，Germany)。

b)野生型EPO表达载体的克隆

为了在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中得到稳定的表达，通过用编码小鼠二氢叶酸还原酶(dehydrofolate reductase)的基因代替编码G418抗性的neo基因，来修饰标准的真核表达载体如pcDNA3(Invitrogen BV，Groningen，Netherlands)和pCI-neo(Promega，Madison，Wis.，USA)(DHFR，Crouse et al.J.Biol.Chem.257，7887-7897(1982))，其表达水平受控于猿病毒40(SV40)早期启动子及其晚期多腺苷化信号。在pcDNA3的情况下，所得到的载体被命名为p.11381(M.Tacke et al.Hepatology26，1626-1633(1997))。

根据本领域已知的方法例如描述在Jacobs K.等的Nature 313，806-10(1985)中的方法，可以得到野生型红细胞生成素编码片段。优选地，使用下列引物来扩增该编码片段：EPO-EcoRI 5′-GAGCCTGAATTCACCACC和EPO-SalI 5′-AGGTGGGTCGACCTGGTCATCTGTCCCCTG。用EcoRI和SalI(在引物序列中，位点附加有下划线)来消化PCR片段，并将其克隆到预先消化的pCI-dhfr载体片段的多克隆位点。EPO基因的表达因此受控于人巨细胞病毒(CMV)即早期增强子/启动子区域，用于受控表达的最优化嵌合内含子和SV40晚期多腺苷化信号。

c)APPRIEGR-EPO表达构建体的克隆

通过两个退火的寡核苷酸APPRIEGRfor，5′-CGCCCCCCCCCGAATCGAGGGCCG，和APPRIEGRrev ，5′-CGCGGCCCTCGATTCGGGGGGGGG(NarI位点的剩余部分用下划线表示)，以NarI DNA片段组装APPRIEGR肽，并将其克隆到N末端信号序列和成熟EPO编码区之间。

d)APP-EPO表达构建体的克隆

通过两个退火的寡核苷酸APPfor，5′-CGCCCCCCC，和APPrev，5′-CGGGGGGGG(NarI位点的剩余部分用下划线表示)，以NarI DNA片段组装APPRIEGR肽，并将其克隆到N末端信号序列和成熟EPO编码区之间。

e)APPGAAHY-EPO表达构建体的克隆

通过两个退火的寡核苷酸APPGAAHYfor，5′-CGCCCCCCCCGGCGCCGCCCACTA，和APPGAAHYrev，5′-CGTAGTGGGCGGCGCCGGGGGGGG(NarI位点的剩余部分用下划线表示)，以NarI DNA片段组装APPRIEGR肽，并将其克隆到N末端信号序列和成熟EPO编码区之间。

f)细胞培养步骤

从美国典型组织保藏中心(American Type Tissue Collection)(Manassas，Va.，USA)得到dhfr酶基因缺陷的诱变细胞系CHO/dhfr-(ATCC CRL-9096)。将未转染的细胞培养在α-MEM、5％渗析的胎牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺中。使用FuGENE6转染试剂，用EPO质粒转染细胞。在补充了10％渗析的FCS，2mM谷氨酰胺的缺乏核苷的α-MEM(α-MEM^-)中选择被转染的细胞。用FACS分离单克隆、扩增，通过酶联免疫吸附反应(ELISA)来分析培养上清液中EPO的产生和分泌。通过在含有增高浓度氨钾喋呤(MTX，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.，USA)的培养基中扩增dhfr和EPO基因，使EPO的表达水平提高数倍。

(2)发酵

以下描述了修饰的EPO的发酵和纯化。

接种物的制备和发酵

从液氮储存罐的气相中取出一个细胞库小瓶，其源自产生修饰的EPO的CHO细胞系(宿主细胞系：A T CC CRL-9096，缺乏dhfr酶基因)。将细胞转移到玻璃旋转烧瓶中并在碳酸氢盐缓冲的培养基中、在二氧化碳孵箱中培养。用于接种物制备和发酵的典型无血清培养基公开在下列文献中：于1992年6月12日公布的Koch的欧洲专利申请513738，或者于1996年11月14日公布的Burg的WO 96/35718，例如，其含有作为培养基的DMEM/F 12(例如：JRH Biosciences/Hazleton Biologics，Denver，US，order No.57-736)和另外的碳酸氢钠，L+谷氨酰胺，D+葡萄糖，重组体胰岛素，亚硒酸钠，二氨基丁烷，氢化可的松，硫酸铁(II)，天门冬酰胺，天门冬氨酸、丝氨酸和哺乳动物细胞的稳定剂例如聚乙烯醇、甲基纤维素、聚葡聚糖、聚乙二醇、聚醚F68、血浆扩容剂聚明胶肽(

)或者聚乙烯吡咯烷酮(WO 96/35718)。

显微检查所述的培养物，确认其不含污染微生物，确定细胞密度。这些测试在每个分开的步骤中进行。

在最初的生长期过后，用新鲜的培养基将细胞培养物稀释到初始细胞密度并使其进入另一个生长周期。重复此步骤直到培养物的体积达到大约2升/旋转烧瓶。在大约12次重复后，可以得到1-5升此培养物，随后将其用作10升接种发酵罐的接种物。

3-5天后，可以将10升发酵罐中的培养物用作100升接种发酵罐的接种物。

在另培养3-5天后，可以将100升发酵罐中的培养物用作1000升发酵罐的接种物。

收集和细胞分离

使用分批再进料方法，即：当达到所需细胞密度的时候，收集大约80％的培养物。用新鲜的培养基重新补足剩余的培养物，进行培养直到下次收集。一个产程最多由10次随后的收集组成：9个部分收集和一个在发酵最后的总收集。每3-4天收集一次。

将确定的收集体积转移到冷却的容器中。通过离心或过滤和弃除来去除细胞。顺序过滤含有修饰的EPO的离心步骤的上清液并收集在第二个冷却的容器中。在纯化过程中，分别地进行每次收集。修饰的EPO蛋白的典型纯化工艺阐述如下。

(3)修饰的EPOs的纯化

在于1996年11月14日公布的Burg的WO 96/35718中，公开了EPO蛋白的典型纯化工艺。此纯化工艺被应用于修饰的EPOs并阐述如下：

(1)蓝琼脂糖凝胶色谱

蓝琼脂糖凝胶(Pharmacia)由其表面共价结合有Cibacron蓝色染料的琼脂糖凝胶珠子组成。由于修饰的EPO对蓝琼脂糖凝胶的结合力比大多数非蛋白质污染物和蛋白质杂质的结合力要高，因此修饰的EPO可以在此步骤中被富集。通过增加盐浓度以及pH来洗脱蓝琼脂糖凝胶柱。

将柱子充满蓝琼脂糖凝胶、用NaOH再生、并用平衡缓冲液(钠/钾氯化物和乙酸钠)平衡。装载酸化的和过滤的发酵罐上清液。装载完成后，首先用类似于平衡缓冲液的、含有较高氯化钠浓度的缓冲液清洗，并连续地用Tris-碱缓冲液清洗。用含有1M NaCl的Tris-碱缓冲液洗脱产物，并将其收集在单一馏分中。

(2)丁基Toyopearl色谱

丁基Toyopearl 650C(Toso Haas)是一种共价偶联有脂肪族丁基残基的聚苯乙烯基基质。由于修饰的EPO对这种凝胶的结合力比大多数杂质的结合力要高，其可以被含有异丙醇的缓冲液洗脱。

用丁基Toyopearl 650C将柱子填满、用NaOH再生、用Tris-碱缓冲液清洗、并用含有异丙醇的Tris-碱缓冲液平衡。

将蓝琼脂糖洗脱液调节到柱平衡缓冲液中的异丙醇浓度并装载到柱子上。用增加异丙醇浓度的平衡缓冲液清洗柱子。产物被洗脱缓冲液(具有高异丙醇含量的Tris-碱缓冲液)洗脱，并被收集在单一馏分中。

(3)羟基碱石灰Ultro凝胶色谱

羟基碱石灰Ultrogel^TM(Biosepra)由羟基碱石灰组成，其被结合到琼脂糖基质中以提高机械性质。被修饰的EPO对羟基碱石灰的亲和性低，因此可以被比蛋白杂质更低的磷酸盐浓度洗脱。

用羟基碱石灰Ultrogel将柱子填满、用磷酸钾/氯化钙缓冲液和NaOH随后用Tris-碱缓冲液再生。而后用含有少量异丙醇和氯化钠的Tris-碱缓冲液平衡。

用Tris-碱缓冲液稀释含有修饰的EPO的丁基Toyopearl色谱洗脱液，并将其装载上柱。随后用平衡缓冲液和不含异丙醇和氯化钠的Tris-碱缓冲液清洗此柱子。用含有低浓度磷酸钾的Tris-碱缓冲液洗脱产物，并将其收集在单一馏分中。

浓缩羟基碱石灰Ultrogel柱的洗脱液并用柠康酰基化缓冲液渗滤(diafilter)。用配备有10kDa截留的Millipore Pellicon XL膜的MilliporeLabscale^TM TFF系统进行浓缩/渗滤。

实施例2：修饰的EPO的柠康酰基化、蛋白水解切割和保护的EPO的纯化

将修饰的EPO溶液调节到pH8.5-9.0，并在室温下搅动。以等分部分将柠康酐(Merck 8.41321.0100)缓慢地添加到搅动的溶液中；通过加入0.5N的NaOH、用恒pH器将pH保持在9.0。柠康酐的总量相应于修饰EPO中赖氨酸ε氨基基团的5倍摩尔过量。当柠康酐的添加完成时，在室温下搅动反应混合物1小时。通过加入2M的乙醇胺溶液，去除剩余的柠康酐，调节到pH9.0。

通过加入切割蛋白酶来实现修饰保护EPO的切割。在实施例1(1c)中所描述的构建体的情况下，Xa因子(Roche Molecular Biochemicals，Order No.602388)被加入到修饰的EPO 1∶100(w/w)中并在室温下搅动几个小时。通过取样和分析切割产物来控制切割的进展。在较低的分解速率下，可以增加蛋白酶的量。

在应用其它蛋白酶如IgA蛋白酶(如EP 513,073所述制备)Genenase^TM(Genencor Int.Inc.)的情况下，实施相应的步骤。

通过在Superdex^TM 75pg(Pharmacia)上的大小排阻色谱(SEC)或者RP-HPLC，从反应混合物中去除所述的蛋白酶。

Superdex 75pg材料由交联琼脂糖和右旋糖苷珠组成。在填充以后，用NaOH来使柱再生，并用带有100mM氯化钠的磷酸缓冲液系统来使柱平衡。

将先前步骤中的反应混合物，在配备有10kDa截留的MilliporePellicon XL膜的Millipore Labscale^TM TFF系统上浓缩到10mg/ml。在一个步骤中将大约1-5％此溶液的柱体积施用到柱上。在平衡缓冲系统进行色谱。将产物收集在馏分中，通过分析rpHPLC，根据这些馏分的纯度，将其合并。

将合并的馏分在配备有10kDa截留的Millipore Pellicon XL膜的Millipore Labscale^TM TFF系统中浓缩到7-8mg/ml。

实施例3：N末端聚乙二醇化EPO的制备

在终蛋白浓度为5mg/ml、摩尔比1∶5(保护的EPO∶PEG-SBA试剂)下进行聚乙二醇化反应。所使用的聚乙二醇化试剂是甲氧基-PEG-SBA，该试剂是其中R是甲基；x是3；m为650-750(平均为大约730，相当于大约32kDa的平均分子量)的化学式II化合物。

将30kDa的PEG-SBA(Shearwater Polymers，Inc.)溶于1mM的HCl。添加pH为7.5的足够的100mM磷酸钾缓冲液，以在反应混合物终得到20mM的终磷酸盐浓度。将保护的EPO(在反应混合物中为大约3mg/ml)加入反应混合物，并将反应混合物在室温(20-25℃)下搅动。在2个小时以后，通过用酸将pH调节到2.5来终止反应。

通过在pH2.5、室温下搅动溶液5小时，来实现蛋白的去柠康酰基化。通过用氢氧化钠将pH调节到4.5来终止反应，并将溶液存储在-20℃直到纯化时使用。

通过在SP-琼脂糖凝胶FF(Pharmacia)上的色谱，来实现从过剩的试剂、反应副产物、和未聚乙二醇化的EPO中分离N末端聚乙二醇化的EPO(PEG-A1-EPO)。SP-琼脂糖凝胶材料由硫代丙基(SP)基团组成，其与琼脂糖凝胶珠的表面共价地结合。用SP-琼脂糖凝胶填充柱，并用磷酸和NaOH使柱再生，并用乙酸钠缓冲液平衡柱子。

用乙酸钠缓冲液将来自先前步骤中的反应混合物稀释到1∶5，将pH调节到3，并施用于SP-琼脂糖凝胶柱。用平衡缓冲液清洗柱子以去除过量的试剂和反应副产品。随后用100mM的NaCl清洗。而后用200mM的NaCl洗脱PEG-A1-EPO。将产物收集在馏分中，根据通过高效大小排阻色谱确定的这些馏分的纯度将其合并。用750mM的NaCl洗脱剩在柱上的未聚乙二醇化的EPO。

随后将PEG-A1EPO库浓缩到大约4.5-7.5mg/ml，并透滤到存储缓冲液中：10mM磷酸钾，100mM NaCl，pH 7.5。在配备有10kDa截留的Millipore Pellicon XL膜的Millipore Labscale^TM TFF系统上、在室温下进行浓缩/透滤。无菌过滤浓缩的PEG-A1EPO并将其冻存在-20℃。实施例4：通过Normocythaemic小鼠分析方法测定的PEG-A1-EPO体内活性

normocythaemic小鼠生物测定法在本领域中为人熟知(Pharm.EuropaSpec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))，Ph.Eur.BRP的红细胞生成素专论中的方法也同样在本领域为人熟知。用BSA-PBS稀释样品。皮下给予7-15周龄的正常健康小鼠0.2ml实施例1-3中的PEG-A1-EPO溶液。将EPO溶液和缓冲液作为对照。6天以后，通过穿刺尾静脉来抽取血样，并将血样稀释，使1ml的0.15μmol吖啶橙染色溶液中存在1μl血液。染色时间为3-10分钟。通过分析红色荧光柱形图，在流式细胞仪中，显微荧光测量地进行网织红细胞计数。以绝对数字(每30,000分析的血细胞)给出网织红细胞计数。对于给出的数据，每一个组由5只小鼠/天组成，而且小鼠只被放一次血。

结果见表1。

表1中的结果证实了本发明PEG-A1-EPO类别的优良活性和延长的半衰期，其通过下面的结果表现出来：显著增加的网织红细胞数量；与源自CHO细胞的EPO相比，使用相同的剂量/小鼠(100ng)，网织红细胞计数最大值的变化。

表1

	EPO	PEG-A1-EPO	对照缓冲液
	EPO	PEG-A1-EPO	对照缓冲液	72小时	2404	2911	857
96小时	1814	3713	697	72小时	2404	2911	857
96小时	1814	3713	697	120小时	901	未测量	701
144小时	536	3424	708	120小时	901	未测量	701

附图说明

图1：人EPO(165个氨基酸)的一级结构。

图2：人EPO(166个氨基酸)的一级结构。

图3：APPRIEGR-EPO的一级结构和相应的核酸序列。下面划线的氨基酸序列相应于分泌信号序列，波形线相应于特异于蛋白水解切割位点的氨基酸序列。

图4：APP-EPO的一级结构和相应的核酸序列。下面划线的氨基酸序列相应于分泌信号序列，波形线相应于特异于蛋白水解切割位点的氨基酸序列。

图5：APPGAAHY-EPO的一级结构和相应的核酸序列。下面划线的氨基酸序列相应于分泌信号序列，波形线相应于特异于蛋白水解切割位点的氨基酸序列。

序列表

<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司

<120>红细胞生成素共轭物

<130>Case 20805

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>165

<212>PRT

<213>智人

<400>1

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

20 25 30

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp

165

<210>2

<211>166

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

20 25 30

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165

<210>3

<211>174

<212>PRT

<213>CHO/dhfr-

<400>3

Ala Pro Pro Arg Ile Glu Gly Arg Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp

1 5 10 15

Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn

20 25 30

Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr

35 40 45

Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val

50 55 60

Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu

65 70 75 80

Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp

85 90 95

Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser

100 105 110

Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser

115 120 125

Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp

130 135 140

Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys

145 150 155 160

Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165 170

<210>4

<211>169

<212>PRT

<213>CHO/dhfr-

<400>4

Ala Pro Pro Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu

1 5 10 15

Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys

20 25 30

Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Agn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys

35 40 45

Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val

50 55 60

Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu

85 90 95

His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu

100 105 110

Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala

115 120 125

Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu

130 135 140

Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr

145 150 155 160

Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165

<210>5

<211>174

<212>PRT

<213>CHO/dhfr-

<400>5

Ala Pro Pro Gly Ala Ala His Tyr Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp

1 5 10 15

Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn

20 25 30

Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr

35 40 45

Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val

50 55 60

Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu

65 70 75 80

Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp

85 90 95

Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser

100 105 110

Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser

115 120 125

Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp

130 135 140

Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys

145 150 155 160

Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165 170

Claims

1、一种共轭物，该共轭物包含红细胞生成素糖蛋白，该红细胞生成素糖蛋白具有N末端α-氨基基团并具有引起骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学活性，并且该糖蛋白选自

(i)人红细胞生成素，

(ii)其类似物，所述的红细胞生成素类似物具有通过选自下列的修饰作用而修饰的人红细胞生成素序列：

Asn³⁰Thr³²；

Asn⁵¹Thr⁵³，

Asn⁵⁷Thr⁵⁹；

Asn⁶⁹；

Asn⁶⁹Thr⁷¹；

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹；

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²；

Asn⁵⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹；

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹；

Asn¹³⁶Thr¹³⁸；

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰；

Thr¹²⁵；和

Pro¹²⁴Thr¹²⁵，和

(iii)其类似物，所述的红细胞生成素类似物具有通过选自下列的修饰作用而修饰的人红细胞生成素序列：

Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；和

Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

所述的糖蛋白与以下化学式的一个聚(乙二醇)基团共价地连接

-CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR

该聚(乙二醇)基团的-CO与所述的N末端α-氨基形成酰胺键；其中：

R是低级烷基；

x是2或者3；和

m是大约450-大约1350。

2、权利要求1的共轭物，其具有下面的化学式

P-NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR (I)

其中x，m和R如权利要求1所定义，P是没有N末端α氨基基团的所述糖蛋白的残基，所述的氨基基团与聚(乙二醇)基团形成酰胺键。

3、上述权利要求任何一项中的共轭物，其中R是甲基。

4、上述权利要求任何一项中的共轭物，其中m为550-1000。

5、上述权利要求任何一项中的共轭物，其中m是从大约650到大约750。

6、上述权利要求任何一项中的共轭物，其中R是甲基，并且m是从大约650到大约750。

7、上述权利要求任何一项中的共轭物，其具有化学式

CH₃O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂CH₂CO-NH-P

其中m是650-750，并且P如权利要求2所定义。

8、上述权利要求任何一项中的共轭物，其中的糖蛋白是人红细胞生成素。

9、权利要求1-7的任何一项中的共轭物，其中的人红细胞生成素糖蛋白是通过内源基因活化来表达的。

10、权利要求1-9的任何一项中的共轭物，其中的糖蛋白具有如图1或者图2中所示的序列。

11、包含权利要求1-10任何一项中的共轭物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

12、权利要求1-10任何一项中的共轭物在治疗或者预防慢性肾功能衰竭患者(CRF)中的贫血相关疾病，AIDS，和在治疗经受化疗的癌症的药物制备中的用途。

13、一种制备权利要求1一10任何一项中的共轭物的方法，其包括：

a)表达和，优选地，无血清发酵重组EPO蛋白，该EPO蛋白包含含有蛋白水解切割位点的N末端肽延伸，

b)保护ε-氨基基团，

c)N末端肽延伸的蛋白水解切割，

d)N末端α-氨基基团的聚乙二醇化，

e)红细胞生成素糖蛋白的ε-氨基基团的去保护，

f)其中，任选地在上述每个步骤以后进行一个纯化步骤。

14、权利要求13的方法，其中重组EPO包含选自图1-图5中所示氨基酸序列的序列。

15、权利要求13或者14的方法，其中在步骤b)中，ε-氨基基团通过柠康酰基化作用被保护。

16、权利要求13-15任何一项中的方法，其中的N末端α氨基基团被下面化学式的化合物聚乙二醇化

其中R，m和x如权利要求1-10任何一项中所定义。

17、通过权利要求13-16任何一项的方法制备的权利要求1-10任何一项的化合物。

18、含有图1和图2所示氨基酸序列的红细胞生成素糖蛋白，其具有一个代表蛋白水解切割位点的N末端肽延伸，任选地包含N末端纯化标记。