CN100490961C - 一种生物乳化剂和它的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及枯草芽孢杆菌产生的一种新的生物乳化剂和它的生产方法，所述生物乳化剂组成成分质量百分含量分别为：蛋白质45.6±0.3%，醣类8.9±0.3%，临界胶束浓度为2.67～2.96g/L，此时它将蒸馏水的表面张力值从78mN/m下降到45.7～47.3mN/m，所述生物乳化剂乳化系数E₂₄保持在60%～70%之间；本发明的优点是丰富了枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂的种类，使得枯草芽孢杆菌在工业中特别是环境污染治理的堆肥方面得到更为广泛的应用成为一种可能。

Description

一种生物乳化剂和它的生产方法

技术领域

本发明涉及枯草芽孢杆菌产生的一种新的生物乳化剂和对该生物乳化剂合适的提取方法。

背景技术

生物表面活性剂因其具有无毒害或低毒害性以及可生物降解性而逐渐被人们重视，并正在工业应用中逐步取代“传统表面活性剂”。然而，生物表面活性剂成本昂贵性和在工业应用中种类的有限性等问题成为它在工业中广泛被采用的瓶颈。在固体垃圾堆肥领域，生物表面活性剂可以改善堆肥微环境，从而促进微生物对有机垃圾的分解，提高堆肥中垃圾的处理效率。垃圾堆肥是一个复杂的反应体系，多种生物表面活性剂共同作用于堆肥系统中将更有利于改善堆肥微环境。但是，如果将多种能够产生生物表面活性剂的微生物同时接种于堆肥环境中，微生物之间可能因为相互的拮抗作用而不能同时很好地生长并同时产生多种生物表面活性剂。因此，有效地使尽可能少的微生物种类在同一堆肥环境体系中产生多种生物表面活性剂成为解决这一问题的一个出路。最为理想的状态就是一种微生物能够产生多种不同类型的、功能各异的生物表面活性剂。

生物乳化剂是一种大分子的生物表面活性剂。以往的文献资料中提到的枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂主要为3种脂肽类物质，即surfactins，iturins和fengycins。这3种脂肽类生物表面活性剂都属于小分子量的生物表面活性剂。生物修复包括将环境污染中的有机污染物进行自然降解。然而，当有机污染物难溶于水时，生物乳化剂或表面活性剂的加入将增加它们在水溶液中的溶解度，促进这些有机物与微生物的接触和结合。有研究表明，当大分子量的生物乳化剂参与时，将有效地促进微生物对疏水性有机物的降解。虽然枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂如surfactins等同样具有一定的乳化性能，但是，由于成本的昂贵性使得它很难在工业上得到广泛的应用。如果枯草芽孢杆菌能够产生一种新的生物乳化剂，那么，产物种类丰富的这种微生物在工业中被广泛的应用将变得更为可能。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供枯草芽孢杆菌产生的一种乳化性能高且稳定的生物乳化剂和它的生产方法。

本发明中产生的生物乳化剂的组成和特性如下：

一种生物乳化剂，由枯草芽孢杆菌产生，组成成分质量百分含量分别为：蛋白质45.6±0.3％，醣类8.9±0.3％，其他成分为44.9～46.1％，不含脂类物质，所述生物乳化剂临界胶束浓度为2.67～2.96g/L，此时它将蒸馏水的表面张力值从78mN/m下降到45.7～47.3mN/m，所述生物乳化剂乳化系数E₂₄保持在60％～70％之间，该乳化系数E24是指容器中乳化层高度除以液体总高度再乘以100％所得到的值。

制备上述生物乳化剂可以通过以下技术方案实现：

1.将枯草芽孢杆菌于30～37℃下活化24h后，接种于富集培养液中，在温度30～37℃，转速200～250rpm条件下培养24h，将富集后的菌种按体积分数2～5％接种于好氧发酵培养液中进行发酵培养，培养温度30～37℃，转速150～200rpm，通气速率1.0～1.2vvm，通入的空气过0.45μm滤膜进行过滤除菌，发明中通过测定发酵液表面张力值的变化确定生物乳化剂的产生以及好氧发酵培养时间；

2.取上述好氧发酵培养后的发酵液高速离心除菌，离心力范围11000～12000×g，时间15～20min，然后用酸沉降的方法将该生物乳化剂沉淀下来，具体为用HCl溶液调节上清液pH1.5～2.0，然后在0～4℃静置过夜后高速离心，离心力为10000～12000×g，时间15～20min，弃去上清液，用蒸馏水溶解离心管中的物质并用NaOH溶液调节pH7.0～8.0，然后将该溶液冷冻干燥得到冻干的生物乳化剂的粗提物；

3.取上述冻干的生物乳化剂的粗提物用氯仿/甲醇混合溶液萃取的方法将枯草芽孢杆菌产生的脂肽类生物表面活性剂溶解，过0.45μm滤膜，滤膜上留下的物质风干即得到本发明生物乳化剂。

所述步骤1中富集培养基成分为：NaCl 4.0～5.0g，蛋白胨4.0～5.0g，牛肉粉2.5～3.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2；好氧发酵培养液组成为：葡萄糖40～45g，NH₄NO₃ 6.8～7.3g，K₂HPO₄·3H₂O 13.8～14.3g，NaH₂PO₄·H₂O 1.95～2.05g，MgSO₄·7H₂O 0.5～0.6g，MnSO₄·H₂O 0.036～0.04g，酵母膏 0.5～0.6g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2；好氧发酵培养时间最好为24h；所述步骤3中氯仿/甲醇混合溶液中氯仿和甲醇的体积比为2∶1～65∶15。

本发明的优点：

本发明使枯草芽孢杆菌产生了一种新的生物乳化剂，它是一种大分子的生物表面活性剂，丰富了枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂的种类，使得枯草芽孢杆菌在工业中特别是环境污染的治理方面得到更为广泛的应用成为一种可能。在环境污染治理中的固体垃圾的堆肥方面，生物表面活性剂的加入将有利于改善堆肥微环境，促进微生物与有机物的接触密度和强度，提高微生物降解有机物的速度和彻底性。不同生物表面活性剂在堆肥系统中起到的作用各有千秋。有研究发现，将多种生物表面活性剂同时加入堆肥系统中时，将显著提高微生物对有机物的降解速率。但是，各种微生物在同一体系中生存和繁殖时可能会因为彼此之间的拮抗作用而对工业处理效果产生负面影响。因此，如果能够让尽可能少种类的微生物产生足够多种类的生物表面活性剂，就会减少和避免这种拮抗作用带来的负面影响。以往的文献资料中提到的枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂主要为3种脂肽类物质，即surfactins，iturins和fengycins。本发明发现枯草芽孢杆菌在适当情况下可以产生一种新的生物乳化剂，增加了它产生的生物表面活性剂的种类，使得枯草芽孢杆菌在工业中特别是环境污染治理的堆肥方面得到更为广泛的应用成为一种可能。

另外，该发明产生的生物乳化剂具有乳化性能高且稳定的特点。在中性附近、常温条件下，该生物乳化剂对芳香烃、饱和烷烃和油脂类物质均具有良好的乳化性能。乳化指数E₂₄保持在60～70％之间；疏水性有机物全部被乳化掉，被乳化的疏水性有机物的体积与该有机物总体积的比值(参数A)始终保持在100％；乳化层中疏水性有机物的含量也很高，体积分数参数B保持在70％以上。

附图说明

图1：实施例1中发酵液表面张力值随时间的变化情况；

图2：实施例1中发酵液pH、菌体吸光度和接收液菌体吸光度随时间的变化情况；

图3：实施例1中生物乳化剂的临界胶束浓度；

图4：实施例2中生物乳化剂的临界胶束浓度。

具体实施方式

实施例1：制备本发明生物乳化剂

本发明中用到的菌种为枯草芽孢杆菌(编号CCTCC Bacillus subtilis AB93108)，该菌种购自中国典型培养物保藏中心，并每1～2月在斜面培养基上接种一次，菌种在4℃条件下保藏。取冷藏的菌种于30℃下活化24h，然后在无菌操作台中用接种环从斜面培养基中挑取一环菌种接种于种子培养液中，种子培养液事先于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min。将接种后的种子培养液放在恒温培养箱中于30℃，200rpm条件下培养。种子培养液的组成为：NaCl 5.0g，蛋白胨5.0g，牛肉粉3.0g，蒸馏水1000mL，并用1M NaOH调节pH7.0。

将培养24h的种子培养液按体积分数2％的接种量接种于发酵培养液中。发酵液组成为：葡萄糖40g，NH₄NO₃ 6.8g，K₂HPO₄·3H₂O 13.8g，NaH₂PO₄·H₂O 1.95g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄·H₂O 0.036g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000mL，并用1M NaOH调节pH7.0。发酵培养液事先也于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min。每个500mL的锥形瓶装250mL接种后的发酵培养液，放置在恒温培养箱中，于温度30℃，转速200rpm，通气速率1.0vvm的条件下进行培养，通入的空气过0.45μm的滤膜进行灭菌，发酵过程中产生的泡沫通过出气管道流入500mL接收瓶中，接收瓶中事先装有10mL用1N HCl调节pH2.0的蒸馏水。

每12h取发酵液20mL，于5600×g下离心15min，用自动界面张力仪测定上清液的表面张力值(如图1)。发酵液培养24h时表面张力由最初的61.3mN/m下降到39.2mN/m，发酵液的表面张力值达到最低，意味着此时发酵液中生物乳化剂的产量最大。离心后残留于离心管中的菌体用无菌水溶解，用紫外分光光度计在600nm波长下测定菌体吸光度(如图2)。根据在一定条件下菌体浓度与菌体吸光度成线性关系，可以发现发酵液培养24h时枯草芽孢杆菌达到对数生长期后期，此时菌体浓度最大。结合图1和图2我们可以得出该种生物乳化剂的产生是生长相关型的，接收瓶中的菌体生长情况可通过取5.0mL菌液用上述测定发酵液菌体吸光度同样的方法得到(如图2)，菌体浓度随着流入接收瓶中的泡沫的量增多而增加，直接取30mL发酵液测定其pH(如图2)，整个过程发酵液pH维持在6.39～7.0的范围内，可以发现枯草芽孢杆菌在该种发酵培养液中的最佳生长环境为中性微偏酸性，发酵液培养24h菌体浓度达到最大时对应的pH为6.83。

取上述培养24h的发酵液于12000×g下离心15min，除去发酵液中的菌体，然后用6N HCl调节上清液pH2.0后，将其放在4℃条件下静置过夜，静置液再于12000×g下离心15min，弃去上清液，离心管中的残留物用蒸馏水清洗，并用1M NaOH调节pH7.0，冷冻干燥；取冻干后的酸沉降物0.15g溶解于40mL氯仿/甲醇(V∶V＝65∶15)混合溶液中，超声波振荡20min，过0.45μm滤膜，弃去上层有机相，这样将枯草芽孢杆菌可能产生的脂肽类生物表面活性剂(包括surfactins，iturins和fengycins等)除去，滤膜上的残留物继续按上述方法萃取，重复3次，最终滤膜上的残留物在自然条件下风干，干燥后得到的发明生物乳化剂为褐色颗粒状物质。

实施例2：制备本发明生物乳化剂

如实施例1，取4℃条件下冷藏的菌种于37℃下活化24h，然后在无菌操作台中用接种环从斜面培养基中挑取一环菌种接种于种子培养液中，种子培养液事先于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min，将接种后的种子培养液放在恒温培养箱中于37℃，250rpm条件下培养。种子培养液的组成为：NaCl4.0g，蛋白胨4.0g，牛肉粉2.5g，蒸馏水1000mL，并用1MNaOH调节pH7.2。

将培养24h的种子培养液按体积分数5％的接种量接种于发酵培养液中。发酵液组成为：葡萄糖45g，NH₄NO₃ 7.3g，K₂HPO₄·3H₂O 14.3g，NaH₂PO₄·H₂O 2.05g，MgSO₄·7H₂O 0.6g，MnSO₄·H₂O 0.04g，酵母膏0.6g，蒸馏水1000mL，并用1M NaOH调节pH7.2。发酵培养液事先也于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min。每个500mL的锥形瓶装250mL接种后的发酵培养液，放置在恒温培养箱中，于温度37℃，转速150rpm，通气速率1.2vvm的条件下进行培养，通入的空气过0.45μm的滤膜进行灭菌。发酵过程中产生的泡沫通过出气管道流入500mL接收瓶中，接收瓶中事先装有10mL用1N HCl调节pH1.5的蒸馏水。

每12h取发酵液20mL，于5600×g下离心15min，用自动界面张力仪测定上清液的表面张力值，与实施例1类似，发酵液培养24h时表面张力同样值达到最低，由最初的61.3mN/m下降到39.5mN/m，意味着此时发酵液中生物表面活性剂的产量最大。离心后残留于离心管中的菌体用无菌水稀释，用紫外分光光度计在600nm波长下测定菌体吸光度，同样地发现发酵液培养24h时枯草芽孢杆菌达到对数生长期后期，此时菌体浓度最大。这里再次证明该种生物表面活性剂的产生是生长相关型的。直接取30mL发酵液测定其pH，可以发现枯草芽孢杆菌在该种发酵培养液中的最佳生长环境与实施例1类似，为中性微偏酸性，发酵液培养24h菌体浓度达到最大时对应的pH为6.81。

取培养24h的发酵液于11000×g下离心20min，除去发酵液中的菌体。然后用6N HCl调节上清液pH1.5后，将其放在0℃条件下静置过夜。静置液再于10000×g下离心20min，弃去上清液，离心管中的残留物用蒸馏水清洗，并用1M NaOH调节pH8.0，冷冻干燥。取冻干后的酸沉降物0.15g溶解于40mL氯仿/甲醇(V∶V＝2∶1)混合溶液中，超声波振荡20min，过0.45μm滤膜，弃去上层有机相，这样将枯草芽孢杆菌可能产生的脂肽类生物表面活性剂(包括surfactins，iturins和fengycins等)除去。滤膜上的残留物继续按上述方法萃取，重复3次。最终滤膜上的残留物在自然条件下风干。干燥后即可得到褐色颗粒状的发明生物乳化剂。

实施例3：

实施例1和2中所制备的生物乳化剂的组成和性质：

1)脂类(lipids)含量

称取0.2g生物乳化剂，用6.0mL氯仿/甲醇(V:V＝2:1)混合溶液溶解提取脂类物质，然后于7332×g下离心10min，收集上清液，离心管中的残留物继续按上述方法提取，重复3次。将收集的有机萃取相于46℃下真空旋转蒸发，称重。测得生物乳化剂中的脂类含量为0。

2)蛋白质含量

生物乳化剂中蛋白质的含量采用考马斯亮蓝法测定，采用牛血清蛋白作为标准样，光的吸收波长选定为595nm。实验中测定该生物乳化剂中蛋白质的质量百分含量为45.6±0.3％。

3)醣类含量

生物乳化剂中醣类含量通过苯酚-硫酸法测得，采用葡萄糖作为标准样，光的吸收波长选定为490nm。实验中测定该生物乳化剂中醣类质量百分含量为8.9±0.3％。

4)临界胶束浓度及表面张力值

如图3，4所示，该生物乳化剂临界胶束浓度(critical micelle concentration)为2.67～2.96g/L，此时它将蒸馏水的表面张力值从78mN/m下降到45.7～47.3mN/m。

5)乳化性能

以蒸馏水作为溶剂配制213mg/L(相当于0.07CMC)的生物乳化剂溶液，取2.0mL该溶液分别和2.0mL疏水性有机物(包括苯、二甲苯、汽油、柴油、正壬烷、正戊烷等)同时加入容积为7.0mL的带橡皮塞的玻璃瓶中，剧烈振荡3min，然后在室内温度下静置24h后测定它的各项乳化指数。用乳化层高度除以液体总高度，再乘以100％，即可得到该生物乳化剂的乳化系数E₂₄，参数A体现的是疏水性有机物被乳化的百分含量，参数B体现的是乳化层中疏水性有机物所占的体积分数，具体结果见表1。

表1  生物乳化剂的乳化性能

注：表中修正系数(如-1.25、-4.2、+1.3、+5.0等)为实施例2相对于实施例1的变化

从表1、图4中我们可以发现，在中性范围附近、常温条件下，该生物乳化剂对芳香烃、饱和烷烃和油脂类物质均具有良好的乳化性能，乳化系数E₂₄保持在60％～70％之间。同时，疏水性有机物全部被乳化掉，参数A始终保持在100％，乳化层中疏水性有机物的含量也很高(参数B)，体积分数保持在70％以上。

Claims (7)

1.一种生物乳化剂，其特征在于该生物乳化剂由枯草芽孢杆菌产生，其包括的组成成分质量百分含量分别为：蛋白质45.6±0.3％、醣类8.9±0.3％、其他成分为44.9～46.1％，所述生物乳化剂中不含脂类物质，所述生物乳化剂临界胶束浓度为2.67～2.96g/L，它将蒸馏水的表面张力值从78mN/m下降到45.7～47.3mN/m，所述生物乳化剂乳化系数E₂₄保持在60％～70％之间；该乳化系数E₂₄是指在乳化试验后，容器中乳化层高度除以液体总高度再乘以100％所得到的值。

2.一种生产权利要求1所述生物乳化剂的方法，其特征在于包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌于接种于富集培养液中，然后将富集后的菌种接种于好氧发酵培养液中进行发酵培养，通过测定好氧发酵培养液表面张力值的变化确定生物乳化剂的产生以及好氧发酵培养时间，取好氧发酵培养液高速离心除去菌体，然后用酸沉降的方法将该生物乳化剂沉淀下来，并通过高速离心的方法收集，将收集的生物乳化剂的粗提物通过氯仿/甲醇混合溶液萃取的方法将枯草芽孢杆菌产生的脂肽类生物表面活性剂除去，即可得到本发明生物乳化剂。

3.根据权利要求2所述的生产生物乳化剂的方法，其特征在于包括以下具体步骤：

A.将枯草芽孢杆菌于30～37℃下活化24h后，接种于富集培养液中，在温度30～37℃，转速200～250rpm条件下培养24h，将富集后的菌种按体积分数2～5％接种于好氧发酵培养液中进行发酵培养，培养条件为：温度30～37℃，转速150～200rpm，通气速率1.0～1.2vvm，通入的空气过0.45μm滤膜进行过滤除菌，发明中通过测定好氧发酵培养液表面张力值的变化确定生物乳化剂的产生以及好氧发酵培养时间；

B.取上述好氧发酵培养后的发酵液高速离心除去菌体，离心力为11000～12000×g，时间15～20min，然后用酸沉降的方法将该生物乳化剂沉淀下来，具体为用HCl溶液调节上清液pH1.5～2.0，然后在0～4℃静置过夜后高速离心，离心力为10000～12000×g，时间15～20min，弃去上清液，用蒸馏水溶解离心管中的物质并用NaOH溶液调节pH7.0～8.0，然后将该溶液冷冻干燥得到冻干的生物乳化剂的粗提物；

C.取上述冻干的生物乳化剂的粗提物用氯仿/甲醇混合溶液萃取的方法将枯草芽孢杆菌产生的脂肽类生物表面活性剂溶解，过0.45μm滤膜，将滤膜上留下的物质风干即得到本发明生物乳化剂。

4.根据权利要求2或3所述的生产生物乳化剂的方法，其特征在于所述富集培养液成分为：NaCl 4.0～5.0g，蛋白胨4.0～5.0g，牛肉粉2.5～3.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。

5.根据权利要求2或3所述的生产生物乳化剂的方法，其特征在于所述好氧发酵培养液组成为：葡萄糖40～45g，NH₄NO₃ 6.8～7.3g，K₂HPO₄·3H₂O 13.8～14.3g，NaH₂PO₄·H₂O 1.95～2.05g，MgSO₄·7H₂O 0.5～0.6g，MnSO₄·H₂O 0.036～0.04g，酵母膏0.5～0.6g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。

6.根据权利要求2或3所述的生产生物乳化剂的方法，其特征在于所述好氧发酵培养时间为24h。

7.根据权利要求2或3所述的生产生物乳化剂的方法，其特征在于所述氯仿和甲醇的体积比为2∶1～65∶15。

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