CN100430065C

CN100430065C - 滇重楼茎叶单体皂苷在制药中的应用

Info

Publication number: CN100430065C
Application number: CNB2006100109870A
Authority: CN
Inventors: 何明生; 陈昌祥; 王方方; 单芳
Original assignee: Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Current assignee: Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Priority date: 2006-06-27
Filing date: 2006-06-27
Publication date: 2008-11-05
Anticipated expiration: 2026-06-27
Also published as: CN1923212A

Abstract

本发明公开了滇重楼茎叶单体皂苷在制药领域中的新用途。本发明以滇重楼的茎叶为原料，充分利用植物资源，变废为宝，保护生态环境。深入的生物活性试验表明，滇重楼皂苷I～IV能抑制人白血病细胞株K562、HL60的增殖，其IC₅₀值均小于10ug/ml，具有较强的体外抗白血病活性。皂苷II体外可诱导K562、HL60细胞凋亡，随着作用时间的延长细胞凋亡率增高。皂苷II诱导K562、HL60细胞凋亡与Bcl-2/Bax比值下降有关，分析Bcl-2和Bax应是滇重楼茎叶皂苷II抗白血病的分子靶点，具有十分重要的意义，预示着良好的药用前景。

Description

滇重楼茎叶单体皂苷在制药中的应用

技术领域

本发明涉及滇重楼茎叶单体皂苷的用途，尤其涉及在制药领域中的用途。

背景技术

白血病(leukeamia)是发生于造血系统的恶性肿瘤。我国白血病发病率为2.76/10万，恶性肿瘤死亡率中，白血病居第6位(男性)和第8位(女性)，在儿童及35岁以下成人中高居第1位(叶任高，陆再英主编.内科学.第6版.北京：人民卫生出版社，2004年6月，625)。近年来对白血病的研究逐步深入，在白血病的治疗方面，由于有效联合化疗(chemotherapy)的应用和骨髓移植的进展，有不少患者已可长期无病生存。但白血病化疗药物毒副反应较大，而且患者最终产生耐药导致化疗失败。骨髓移植存在骨髓选择适合的供者困难和价格昂贵的问题，并且移植后相关死亡率相对较高。学者们不断探索治疗白血病的有效途径，如生物治疗、分子靶向治疗等，但传统的化疗仍被认为是最基本的治疗手段(何明生，陈明清，王熙才主编.现代肿瘤临床实用治疗学.云南科技出版社，2004年10月，179)。因此，寻找能消灭白血病克隆而对正常造血细胞损伤较小的药物，成为控制白血病较理想的方法和途径。

滇重楼(Paris Polyphylla Var.Yunnanensis L)是延龄草科(Trillaceae)重楼属植物，又名独角莲、七叶一枝花、三层草，《中华人民共和国药典》1995年版、2000年版和2005年版收载该药为云南重楼(滇重楼)或七叶一枝花的干燥根茎(国家药典委员会.中华人民共和国药曲(一部).北京：化学工业出版社，2005：214)为药用原料。

滇重楼根是多种中成药和配伍药的主要原料，民间采用量很大，从上世纪90年代中期以后，仅云南省的用量每年就达数百吨，全国需要量达到1000吨左右。而其生长速度极其缓慢，因此每年的消耗远远超出了野生重楼的生长量，使重楼资源日趋枯竭。滇重楼茎叶则生长迅速，每年其生长量相当于同年根生长量的7～8倍，至今尚未被开发利用。根据有关部门统计，以近年药用滇重楼根的量计算，每年就有至少3500吨滇重楼的茎叶被丢弃，造成资源的巨大浪费。所以，对重楼地上部分的研究，不仅是对资源的充分利用，也是对自然的保护。迄今为止，国内外均未利用地上部分药用，更无滇重楼茎叶中的单体皂苷用于抗白血病方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供滇重楼茎叶单体皂苷的新用途，即在制药中的新应用。

实际上，本发明涉及滇重楼茎叶单体皂苷在制备改善或治疗白血病的药物中的应用。

本发明涉及的滇重楼茎叶单体皂苷的制备方法包括下述步骤：

(1)以滇重楼地上部分的茎叶为原料，用有机溶剂提取获得提取物；

(2)提取物经皂苷树脂柱，70％洗脱部分为总皂苷；

(3)总皂苷经硅胶柱层析，洗脱得若干部分，合并相同部位，分别再经反相柱层析，洗脱获得相同皂苷后，分别再重结晶得到纯度为96％以上的滇重楼茎叶单体皂苷I、II、III、IV。

其中，步骤(1)所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、氯仿或乙酸乙酯中的一种。

本发明所述的滇重楼茎叶单体皂苷用在药物上时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1％～99％，优选为0.5％～90％的本发明的滇重楼茎叶单体皂苷，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

为了更好地理解本发明的实质，下面将用本发明所述的滇重楼茎叶单体皂苷的药物生物活性试验结果来说明它在医药领域中的应用。

一、材料和方法

1实验材料

1.1样品、细胞株与试剂

(1)样品：滇重楼皂苷I～IV，纯度为96％的生物活性提取物，其结构式为：

其中，

R 分子式分子量

滇重楼皂苷I glc.2 rha. C₄₄H₇₀O₁₆ 854

|4

ara.

滇重楼皂苷II glc.2 rha. C₅₁H₈₂O₂₀ 1014

|4

rha.4 rha

滇重楼皂苷III glc.2 rha. C₄₅H₇₂O₁₇ 884

|3

glc.

滇重楼皂苷IV glc.2 rha. C₃₉H₆₂O₁₂ 722

glc.py＝β-D-glucopyranosyl

rha.py＝α-L-rhamnopyranosy l

ara.fur＝α-L-arabinofuranosyl

上述滇重楼皂苷I～IV在甲醇溶液中均为无色针状结晶，熔点216℃～218℃，在中国科学院昆明植物研究所植化研究室分离提纯。

(2)细胞株：K562(人红细胞白血病细胞株)、HL60(人急性早幼粒细胞白血病细胞株)，均购自中国科学院上海细胞生物研究所。

(3)主要试剂：

A.RPMI-1640培养基(Gibco公司，批号：31800-022)；

B.小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：040623)；

C.Hoechst33258(sigma公司solarbio，B2883)；

D.碘化丙啶(PI，Sigma公司)；

E.RNA酶(RnaseA，华美生物工程公司)；

F.青霉素(中诺药业有限公司产品，批号：04101029)；

G.链霉素(山东瑞阳制药有限公司产品，批号：03120207)；

H.二甲基亚砜(DMSO，AMRESCO公司产品)；

I.膜连蛋白-V(Annexin-VFITC，购自IMMUNOTECH公司)；

J.鼠单抗Bcl-2(产品编号：MAB-0014)、免多抗Bax(产品编号：RAB-0092)、兔survivin多克隆抗体(产品编号：RAB-0536)，均购自福州迈新生物技术有限公司；抗Fas抗体为sigma公司产品；

K.Immuno-Bridge+试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)；

L.鬼臼乙叉甙(VP-16，上海医药工业研究院亚东药业公司浦东药厂生产，批号：028003)；

M.顺铂(DDP，云南个旧生物药业公司生产，批号：20020802)；

N.二甲基四氮唑蓝(MTT，AMRESCO生产，批号：0752B18)；

O.十二烷基硫酸钠(SDS，上海生物工程有限公司)。

1.2实验仪器设备

(1)CO2培养箱：日本SANYO公司，MCO-15AC型；

(2)医用净化工作台：苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-IFD型；

(3)低速自动平衡离心机：北京医用离心机厂，LD25-2型；

(4)倒置显微镜：日本OLYMPUS TOKYO公司，CK型；

(5)倒置相差显微镜：重庆光学仪器厂，AC220VIN；

(6)荧光显微镜：LEICA DMIRB型；

(7)过滤器：上海新亚净化器件厂；

(8)电热恒温干燥箱：上海跃进医疗器械厂，GZX-DH-300-S-II型；

(9)手提式高压消毒锅：上海华线医用核子仪器有限公司，YXQ.SG41.280型；

(10)流式细胞仪：美国BACKMAN-COULTER公司，EPICS XL型；

(11)电子天平：常熟市双杰测试仪器厂，JJ200型；

(12)酶标板自动读数仪：美国Bioteck公司，RIDMODEI-3550型；

(13)一次性96孔板：美国NUNC公司；

1.3试剂配置

1.3.1RPMI-1640完全培养液的配置

(1)将一袋RPMI-1640培养基溶于1L三蒸水中；

(2)加入2.2克碳酸氢钠，充分混匀；

(3)过滤器(滤膜为直径0.22μm+0.45μm)过滤；

(4)加10％小牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，调PH值为7.2，即为RPMI-1640完全培养液。

1.3.2PBS平衡盐溶液配置

(1)称取磷酸二氢钠2.96g、磷酸氢二钠29.01g、氯化钠9.0g；

(2)将之溶解于600ml双蒸水中，调PH值至7.2～7.4之间；

(3)最后用双蒸水定容至1L，即为浓度为0.1mmol/l的PBS溶液(使用时根据不同浓度的需要进行稀释)。

1.3.3固定液配置

取甲醇30ml、乙酸10ml(3∶1)，混匀避光保存备用。

2实验方法

2.1细胞培养

将K562、HL60细胞置于含有10％小牛血清的RPMI 1640完全培养液中，在37℃、5％CO²培养箱中常规培养。取对数生长期的细胞，用4g/L台盼蓝染色后计算细胞活率为＞98％，调整细胞密度为5×10⁴/ml备用。

2.2样品的配置

滇重楼茎叶皂苷，设5个浓度，先用DMSO溶解为10mg/ml，再用RPMI 1640培养液分别稀释，超声波混匀，备用。

2.3改良MTT法

(1)取备用的K562、HL60细胞悬液接种于96扎培养板，每孔90ul；

(2)加入不同浓度的受试样品，每孔10ul，使其终浓度分别为25、5、1、0.1、0.01ug/ml，每个浓度均设3个复孔；

(3)DDP、VP-16为阳性对照，等体积细胞悬液为阴性对照，1％DMSO为溶媒对照，等体积RPMI-1640培养液为空白对照；

(4)加药后细胞置37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时；

(5)每孔加MTT(5mg/ml)10ul，继续培养4小时；

(6)每孔加三联液[10％SDS+5％异丁醇+0.012mol/L HCL(W/V/V)]100ul静置12小时；

(7)设570nm为测定波长，630nm为参考波长，用酶标仪测定各孔的OD值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：

抑制率(％)＝[1-(给药孔OD值-空白孔OD值)/(阴性孔OD值-空白孔OD值)]×100％

采用LOGIT法计算半数抑制浓度IC₅₀。

2.4细胞形态学观察

取备用的K562、HL60细胞悬液入培养瓶内，加入稀释后的皂苷II(使其终浓度为5ug/ml)，置于37℃、5％CO²培养箱中常规培养24小时，然后：

A.离心收集皂苷II处理后的细胞样品于离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟；

B.离心去固定液，用0.01mmol/L的PBS溶液洗两遍，每次3分钟(洗涤期间手动晃动)；

C.最后一次离心后吸去大部分液体保留50ul液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀；

D.稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动；

E.均匀滴上0.5ml Hoechst33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干；

F.用0.01mmol/L PBS洗两遍，每次3分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干；

G.置于荧光显微镜下可检测到呈蓝色的细胞核(激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右)。

2.5流式细胞术检测DNA含量

A.细胞培养：同试验方法2.1所述。

B.样品制备：取对数生长期的K562、HL60细胞，调整细胞密度为2×10⁵/ml，随机分为3组，每组细胞悬液为10ml。第一组为样品组(加入皂苷II，使其终浓度为5ug/ml)，第二组为阳性对照组(加入VP-16，使其终浓度为5ug/ml)，第三组为阴性对照组(不加任何药品)。

C.三组分别处理24h、48h、72h后离心收集细胞；

D.0.01mmol/L PBS液洗涤两次，加入70％冷乙醇(无水乙醇+0.01mmol/L PBS液配制)制成单细胞悬液，4℃保存过夜；

E.离心(1000g×10min)，弃上清，PBS液洗涤1次，离心控尽残液；

F.加入Triton X-100及200ug/ml的RnaseA各200ul，置37℃30分钟；

G.加入100ug/ml的PI染料1ml，室温避光静置15分钟；

H.流式细胞仪上进行检测(激发波长488nm，发射波长670nm)，每份样品测定10000个细胞，随机软件检测DNA含量及计算相应的凋亡率。

2.6磷脂酰丝氨酸(PS)转位检测

A.细胞培养：同试验方法2.1所述。

B.样品制备：取对数生长期的K562细胞，调整细胞密度为2×10⁵/ml，随机分为3组，每组细胞悬液为10ml。第一组为样品组(加入皂苷II，使其终浓度为5ug/ml)，第二组为阳性对照组(加入VP-16，使其终浓度为5ug/ml)，第三组为阴性对照组(不加任何药品)；各组均处理24小时。

C.离心收集细胞，PBS液洗涤两次，低速离心弃上清；

D.将细胞重悬于Diluted binding buffer液，将细胞调至1×10⁶/ml；

E.取100ul细胞悬液加入至12×75mm试管中，加入5ul Annexin VFITC标记液和2.5ul PI，混匀；

F.将试管置于冰浴中避光孵育10分钟，加入10ul冷Diluted bindingbuffer，立即上流式细胞仪进行检测(激发波长488nm，发射波长670nm)，每份样品测定10000个细胞，随机软件分析结果。

2.7免疫组化染色

2.6.1Bcl-2表达的免疫组化检测

免疫组化染色操作按试剂盒说明书进行，具体步骤如下：

A.细胞培养：同试验方法2.1所述。

C.离心收集细胞，0.01mmol/L PBS洗3次，离心弃上清；

D.加4％多聚甲醛1～2ml混匀，室温固定15分钟；

E.离心弃上清，PBS洗5分钟×3次，离心弃上清；将细胞滴到玻片上，微晾干；

F.滴3％H₂O₂，室温避光30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性；

G.PBS洗3分钟×3次，稍晾干；

H.滴加5％羊血清封闭，37℃孵育30分钟，倾去，勿洗；

I.滴加工作液Bcl-2(一抗)，37℃孵育1小时，PBS冲洗2分钟×3次；

J.滴加试剂1，室温孵育20分钟，PBS冲洗2分钟×3次；

K.滴加试剂2，室温孵育20分钟，PBS冲洗2分钟×3次；

L.DAB溶液显色；

M.自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。

2.6.2Bax表达的免疫组化检测

A.细胞培养：同前；

C.离心收集细胞，0.01mmol/L PBS洗3次，离心弃上清；

D.加4％多聚甲醛1～2ml混匀，室温固定15分钟；

G.PBS洗3分钟×3次，稍晾干；

H.滴加5％羊血清封闭，37℃孵育30分钟，倾去，勿洗；

I.滴加工作液Bax(一抗)，37℃孵育1小时，PBS冲洗2分钟×3次；

J.滴加试剂1，室温孵育20分钟，PBS冲洗2分钟×3次；

K.滴加试剂2，室温孵育20分钟，PBS冲洗2分钟×3次；

L.DAB溶液显色；

M.自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。

2.6.3Fas表达的免疫组化检测

与上述方法类似，I步骤中一抗为Fas。以上3种组化均设以PBS取代一抗作阴性对照组。

2.8荧光免疫法流式细胞仪检测细胞凋亡蛋白

2.8.1Bcl-2蛋白检测

A.细胞培养同前；

B.样品制备：取对数生长期的HL60细胞，调整细胞密度为2×10⁵/ml，随机分为3组，每组细胞悬液为10ml。第一组为样品组(加入皂苷II，使其终浓度为5ug/ml)，第二组为阳性对照组(加入VP-16，使其终浓度为5ug/ml)，第三组为阴性对照组(不加任何药品)。

C.将细胞收集至10ml离心管中，300×g离心5min，弃上清；加入4mlPBS以300×g离心5min，弃上清，用PBS将细胞调至1×10⁶/ml。

D.分别于Bcl-2及同型对照管中加入100ul细胞悬液及100ulIntraPrep Reagent 1，混匀，于室温中孵育15min；

E.加入4mlPBS洗涤，300×g离心5min，弃上清；

F.每管各加入100ul IntraPrep Reagent 2，轻轻混匀，室温下孵育5min；

G.Bcl-2管中加20ul Bcl-2FITC，同型对照管中加入IgG₁-FITC 20ul，混匀，室温避光孵育15min；

H.加入4mlPBS，300×g离心5min，弃上清；加含有10g/L多聚甲醛PBS液0.5ml上机测定。

2.8.2Bax蛋白检测

A～F步骤与上述方法类似；

G.加入5.0ul Bax混匀，室温避光孵育30min；

H.加入4mlPBS，300×g离心5min，弃上清；

I.加入2.0ul羊抗鼠FITC2，避光孵育30min；

J.加入4mlPBS，300×g离心5min，弃上清，加0.5mlPBS混匀。

上机检测：以Flow-Chek校准光路及流路，用Flow-Set较准PMT电压，用同型对照调整阴性，流式细胞仪分别检测Bcl-2蛋白及Bax蛋白表达的百分率。

2.9统计学处理

采用SPSS10.0统计分析软件进行数据分析处理，实验结果以(均数+标准差)表示，各组间差异采用单因素方差分析，若整体有差异，则两两比较用LSD检验。两样本均数间的差异显著性用t检验。

二、实验结果

1.滇重楼皂苷I～IV对K562及HL-60细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为0.81±0.8、0.08±0.04、0.45±0.26、0.18±0.15ug/ml和2.13±1.03、0.05±0.03、0.01±0.006、0.09±0.01ug/ml，均小于10ug/ml，表现较好的剂量-效应依赖关系。

2.用5ug/ml皂苷II处理K562、HL60细胞24h时，细胞出现大小不等，形状不规整，胞核分裂固缩，染色质浓集等形态特征。

3.用皂苷II分别处理K562、HL60细胞24h、48h及72h时均出现亚二倍体峰，并随作用时间的延长而增加。K562细胞出现G₂/M期阻滞，HL60细胞出现S期阻滞。

4.用皂苷II处理K562细胞24h时，11.2％的细胞出现PS转位，阳性对照组仅3.55％。免疫组织化学染色表明处理组K562细胞低表达Bcl-2蛋白，Bax蛋白无明显变化，Bcl-2/Bax比值下降；Fas蛋白表达较对照组无明显上升。(5)皂苷II处理HL60细胞不同时间，荧光免疫法流式细胞仪检测发现Bcl-2蛋白下调(4.8％→1.6％)、Bax蛋白上调(12％→63.5％)，Bcl-2/Bax比值较前明显下降。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：

1.迄今为止，现有技术中尚无滇重楼茎叶单体皂苷作为有效成分在治疗白血病方面的报道，也没有该成分具有抗白血病活性的报道。从传统的中药及植物资源中寻找能有效治疗白血病的药物，是国内外新药研究中异常活跃的领域。本发明对所述的滇重楼茎叶单体皂苷作为制备和预防白血病的药物进行了深入研究，取得了令人鼓舞的药理试验结果。

2.滇重楼皂苷I～IV能抑制人白血病细胞株K562、HL60的增殖，其IC₅₀值均小于10ug/ml，具有较强的体外抗白血病活性。皂苷II体外可诱导K562、HL60细胞凋亡，随着作用时间的延长细胞凋亡率增高。皂苷II诱导K562、HL60细胞凋亡与Bcl-2/Bax比值下降有关，分析Bcl-2和Bax应是滇重楼茎叶皂苷II抗白血病的分子靶点，具有十分重要的意义，预示着良好的药用前景。

3.本发明充分利用现有的被白白丢弃的滇重楼的茎叶为原料，变废为宝，充分利用植物资源，成本低廉，制备工艺简单，并可制成口服剂型或注射剂型，为人类最终攻克白血病提供了一种经济实用的药物。

附图说明

图1为滇重楼茎叶皂苷对K562细胞的浓度-抑制率曲线图；

图2为滇重楼茎叶皂苷对HL60细胞的浓度-抑制率曲线图；

图3为倒置相差显微镜观察5ug/ml皂苷II对K562、HL60细胞作用24小时的影响(×200)，其中，A：HL60细胞对照组；B：HL60细胞处理组；C：K562细胞对照组；D：K562细胞处理组；

图4为荧光显微镜观察5ug/ml皂苷II对K562、HL60细胞作用24小时的影响(×400)，其中，A：K562细胞对照组；B：K562细胞处理组；C：HL60细胞对照组；D：HL60细胞处理组；

图5为K562细胞经5ug/ml皂苷II作用不同时间后细胞周期变化；

图6为5ug/ml皂苷II作用K562细胞不同时间诱导细胞凋亡；

图7为HL60细胞经5ug/ml皂苷II作用不同时间后细胞周期变化；

图8为5ug/ml皂苷II作用HL60细胞不同时间诱导细胞凋亡；

图9为K562细胞经5ug/ml皂苷作用24h后PS转位，其中，A：对照组；B：处理组；C：阳性对照组；

图10为免疫组化检测5ug/ml皂苷II作用K562细胞24h时Bcl-2的表达(×200)，其中，A：对照组；B：处理组；

图11为免疫组化检测5ug/ml皂苷II作用K562细胞24h时Bax的表达(×200)，其中，A：对照组；B：处理组；

图12为免疫组化检测5ug/ml皂苷II作用K562细胞48h时Fas的表达(×200)其中，A：对照组；B：处理组。

具体实施方式

通过下面给出的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明内容的限定。

实施例1

--滇重楼茎叶单体皂苷的制备

以滇重楼地上部分的茎叶为原料，粉碎，用乙醇提取；回收乙醇后的水溶物，上皂苷树脂柱分别用水，70％乙醇，95％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分回收乙醇为总皂苷；总皂苷经硅胶柱层析，用有机溶剂系统(8∶2v/v)洗脱得十部分，分别将第二，四，六九部分各自蒸除有机溶剂，获得四个馏分；各馏分再经反相柱层析，用有机溶剂系统(8∶2--9∶1v/v)洗脱得皂苷I、II、III、IV、个成分；分别重结晶，各自得到纯度为96％-99％的滇重楼茎叶单体皂苷I、II、III、IV。

实施例2

滇重楼茎叶皂苷对K562、HL60细胞增殖的影响

滇重楼茎叶皂苷I～IV能明显抑制K562、HL60细胞的增殖，其作用呈较好的剂量-效应关系。经计算，滇重楼茎叶皂苷I～IV对K562细胞的IC₅₀分别为0.81±0.8、0.08±0.04、0.45±0.26、0.18±0.15ug/ml，对HL60的IC₅₀分别为2.13±1.03、0.05±0.03、0.01±0.006、0.09±0.01ug/ml，均小于10ug/ml。结果见表1，其浓度-抑制率曲线见图1、图2。

实验重复3次。滇重楼茎叶皂苷I～IV抑制K562细胞增殖的作用见表1-4，VP-16(阳性对照组)抑制K562细胞增殖的作用见表5；滇重楼茎叶皂苷I～IV抑制HL60细胞增殖的作用见表6-9，DDP(阳性对照组)抑制K562细胞增殖的作用见表10。

表1.滇重楼茎叶皂苷I抑制K562细胞增殖的作用

注：与媒溶对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2.滇重楼茎叶皂苷II抑制K562细胞增殖的作用

注：与媒溶对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

表3滇重楼茎叶皂苷III抑制K562细胞增殖的作用

注：与媒溶对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表4滇重楼茎叶皂苷IV抑制K562细胞增殖的作用

注：与媒溶对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

表5VP-16对K562细胞增殖的抑制作用

表6滇重楼茎叶皂苷I抑制HL60细胞增殖的作用

注：与媒溶对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

表7滇重楼茎叶皂苷II抑制HL60细胞增殖的作用

注：与媒溶对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

表8滇重楼茎叶皂苷III抑制HL60细胞增殖的作用

注：与媒溶对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表9滇重楼茎叶皂苷IV抑制HL60细胞增殖的作用

注：与媒溶对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表10 DDP对HL60细胞增殖的抑制作用

实施例3

--细胞形态学观察

K562、HL60细胞分别经5ug/ml的皂苷II作用24小时后，在倒置相差显微镜下观察，发现细胞大小不一，形状不规整，胞核分裂固缩。经Hoechst33258染色后，在荧光显微镜下观察，发现细胞体积变小，核固缩，细胞核或细胞浆内可见致密的颗粒状强荧光，严重时细胞出泡形成凋亡小体。而正常细胞呈弥漫均匀荧光，且荧光较处理组弱(见图3，4)。

实施例4

--FCM分析凋亡细胞的结果

细胞凋亡后形成凋亡小体，导致细胞DNA丢失，5ug/ml皂苷II处理K562细胞24h、48h、72h后，在流式细胞仪检测的DNA含量图中，在G₁期前出现亚二倍体峰，细胞凋亡率分别为2.1％(24h)、5.1％(48h)、7.9％(72h)，呈一定的时效关系(见图3)。与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。我们还观察到药物作用后G₀/G₁期细胞略有上升，G₂/M期细胞明显下降，细胞阻滞在G₂/M期(见图5，6)。

5ug/ml皂苷II处理HL60细胞24h、48h、72h后，在流式细胞仪检测的DNA含量图中，G₁期前出现亚二倍体峰，细胞凋亡率分别为8.3％(24h)、15.6％(48h)、27.1％(72h)，呈一定的时效关系(见图5)。与对照组相比，差异有显著的统计学意义(P＜0.01)。本实验中还观察到药物作用24h后，S期细胞增多，G₂/M期细胞减少。作用48h～72h后，S期细胞减少，G₂/M期细胞逐渐增多。细胞阻滞在S期(见图7，8)。

实施例5

--FCM检测细胞PS转位结果

Annecin VFITC及PI双标记后，FCM检测发现5ug/ml皂苷II作用K562细胞24小时，11.2％的细胞出现V⁺PI^-(早期凋亡)，1.37％细胞出现V⁺PI⁺(晚期凋亡)。而阳性对照组分别为3.55％、0.78％(见图9)。

实施例6

--Bcl-2免疫组化染色结果

Bcl-2蛋白借其末端一个由19个氨基酸组成的疏水性羧基末端与膜相连，定位于细胞膜、内质网、线粒体膜及核膜上。5ug/ml皂苷II作用K562细胞24小时，用Bcl-2单抗进行免疫组化检测，结果显示空白对照组Bcl-2表达较高，细胞内呈强阳性反应，细胞呈深棕色。而实验组细胞颜色明显变浅，显示Bcl-2表达量明显减少(见图10)。

实施例7

--免疫组化染色结果

Bax蛋白主要定位于细胞质，K562细胞经皂苷II处理后，Bax蛋白染色强度未见明显增加(见图11)。

实施例8

--Fas免疫组化染色结果

Fas(Apo-1，CD95)受体是I型跨膜蛋白，是一类能够直接诱导细胞凋亡的细胞表面抗原。5ug/ml皂苷II作用K562细胞48小时，用Fas单抗进行免疫组化检测，发现处理后K562染色无明显增强(见图12)。

实施例9

--间接荧光法流式细胞仪检测Bcl-2蛋白及Bax蛋白表达

5ug/ml皂苷II处理HL60细胞24h、48h后Bcl-2蛋白及Bax蛋白表达情况见表11。

表11.滇重楼茎叶皂苷II诱导HL60细胞凋亡蛋白表达率

研究滇重楼茎叶皂苷单体I、II、III、IV体外抑制白血病细胞增殖，对其类型和浓度进行筛选，发现皂苷单体II活性较稳定、细胞毒作用较强。选取皂苷II进一步研究其诱导白血病细胞凋亡的作用，探讨其抗白血病作用的机制。为将滇重楼茎叶皂苷II开发成新的靶向治疗白血病的药物提供了可靠的实验依据和新思路。

试验数据表明，滇重楼茎叶皂苷II能降低Bcl-2蛋白表达水平，破坏Bcl-2和Bax之间的平衡，通滇重楼茎叶皂苷II对其他肿瘤细胞的增殖抑制作用提供了一定的理论基础，为将滇重楼茎叶皂苷II开发成新的靶向抗白血病药物提供了一定的理论依据。

Claims

1.滇重楼茎叶皂苷II在制备改善或治疗白血病的药物中的应用。