CN100390281C - 制备具有生理活性的il-18多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备具有生理活性多肽的方法,包括将前体多肽与活化酶接触,或共表达该多肽与活化蛋白酶。
Description
发明背景
本发明涉及制备具有生理活性的IL-18多肽的方法,更具体的是涉及制备活性人IL-18的方法。
IL-18,也被认为是干扰素-γ-诱导因子,是最近发现的新的细胞因子。活性IL-18包含有157个氨基酸残基。其具有潜在的生物学活性,包括通过T细胞和脾细胞诱导干扰素-γ-产物,增强NK细胞杀死活性,促进原初(naive)CD4+T细胞分化成Th1细胞。此外,人IL-18增大GM-CSF的产生和降低IL-10的产生。IL-18已经显示出比IL-12有更高的干扰素-γ-诱导能力,通过不同的受体发出信号和利用不同的信号传导途径。
IL-18,编码的核苷酸序列,和纯化蛋白质的某些物理化学的化学性质是已知的(Ushio,S.,et al.,1996,J.Immunology,156,4274-4279;Dinarello,C.A.,et al.1998,J.Leukocyte Biology,1998.63,658-664)。
Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kayaku Kenkyujo′s("Hayashibara″),U.S.5,192,324,相应于EP 0692536,于1996年1月17日出版,公开了一种小鼠蛋白,该蛋白通过免疫活性细胞诱导IFN-γ的产生,该蛋白被进一步的鉴定具有某些物理化学性质和已经定义的部分氨基酸序列特征。还公开了具有157个氨基酸序列的蛋白,及其两个片断,编码该蛋白的DNA(471bp),杂交瘤,蛋白纯化的方法,以及检测该蛋白的方法。
Hayashibara′s U.S.6,214,584,相应于EP 0712931,于1996年5月22日出版,公开了157个氨基酸的人蛋白及其同系物,编码该蛋白的DNA,转化体,制备该蛋白的方法,针对该蛋白的单克隆抗体,杂交瘤,蛋白纯化的方法,检测该蛋白的方法,处理和/或抑制恶性肿瘤的方法,病毒病,细菌感染疾病,和免疫疾病。
Incyte Pharmaceuticals,Inc.′s,WO 97/24441,出版于1997年7月10日,公开了193个氨基酸的蛋白质,相应于IL-18前体和编码DNA。
人类细胞中,由基因表达形成的多肽可能由胞内酶部分消化并接受糖链。能满意地地与药物结合的多肽可能是有与在人类细胞中相同加工的那些。已知大多数细胞因子通常以不具有生物学活性的细胞前体的形式产生,然后由胞内酶进行加工将其转化成活性多肽。
IL-18多肽通常以193个氨基酸的前体的形式存在于人类细胞中,并且没有生物学活性。前体IL-18也就是ProIL-18。一种由IL-18前体制备活性IL-18的方法由Hayashibara′s U.S.5,879,942所传授,相应于EP0819757,出版于1998年1月21日。所述专利公开了可将IL-18前体转化成活性IL18的酶或蛋白。
由IL-18前体制备活性IL18的另一种方法是由Hayashibara′s U.S.5,891,663所传授的,相应于EP0821005,出版于1998年1月28日。该专利公开了将IL-18前体与白介素-1β-转化酶(″ICE″)接触。该专利与参考文献在此引入作为参考。
作为细胞程序死亡和炎症介质的ICE在文中已得以广泛研究。还知道ICE可将白介素-1和白介素-18的前体加工成活性形式(Thornberry,NA,etal.,1992,Nature 356,768-774;Ghayur,T et al.,1997,Nature386,619-623)。
发明概述
本发明提供用活化酶体外激活人IL-18前体(也称Pro-IL-18)的方法,包括将人前体IL-18与活化酶例如caspase 4或caspase 5接触。更特别的是,本发明提供通过caspase 4和caspase 5作用IL-18前体以切割特定位点产生活性多肽的方法,所述活性多肽可在免疫活性细胞中诱导IFN-γ产生。
本发明进一步提供体内激活人IL-18前体的方法,包括蛋白与活化酶的共表达。更特别的是,本发明提供利用蛋白酶体内激活IL-18的方法,所述蛋白酶诸如caspase 4,也称为ICERELII,caspase 5,也称ICERELIII,和遍在蛋白(ubiquitin)-特异性蛋白酶,其可作用于IL-18多肽前体以将其转化成可诱导IFN-γ产生的活性多肽。
附图简述
图1显示人前体IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图2显示编码全长人IL-18的核酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3显示活性人IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
图4显示6-his标记的N-末端截短的caspase 4的氨基酸序列(SEQ IDNO:4)。
图5显示编码氨基酸序列的核酸序列,所述氨基酸序列为6-his标记的N-末端截短的caspase 4的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
图6显示6-his标记的N-末端截短的caspase5的氨基酸序列(SEQ IDNO:6)。
图7显示编码氨基酸序列的核酸序列,所述氨基酸序列为6-his标记的N-末端截短的caspase 5的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
图8显示双顺反子表达盒(bicistronic expression cassette)的概图,用于大肠杆菌中Pro-IL-18和截短的caspase 4共表达的pET28-ProIL-18/Casp 4内包含所述双顺反子表达盒。
图9显示pET28内Pro-IL-18/Caspase 4表达盒的序列(SEQ ID NO:8)。
图10显示Pro-IL-18/Caspase 4表达盒的annotated序列,编号方式与pET28a载体内的位点相应。
图11显示Pro-IL-18/Caspase4的诱导。
图12显示双顺反子表达盒的概图,用于大肠杆菌中ProIL-18和Caspase 5共表达的pET28-ProIL-18/截短的Caspase-5内包含所述双顺反子表达盒。
图13显示pET28内Pro-IL-18/Caspase 5表达盒的序列(SEQ ID NO:9)。
图14显示Pro-IL-18/截短的Caspase 5表达盒的annotated序列表,详述调控序列的特征和Pro-IL-18与截短的Caspase 5的翻译,编号方式与pET28a载体内的位点相对应。
图15显示Pro-IL-18/Caspase 5的诱导。
图16显示Ub-IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。
图17显示编码Ub-IL-18氨基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO:11)。
图18显示pET28载体内Ub-IL-18/Ubp-1表达盒的核酸序列(SEQ ID NO:12)。
图19显示pET28载体内Ub-IL-18/Ubp-1的annotated序列,编号方式与pET28载体内的位点相对应。
图20显示通过Ubp-1的Ub-IL-18表达和加工。
图21显示利用KG-1(人骨髓单核细胞系)细胞的IL-18活性鉴定并且监测IFN-γ的产生(如所示的IL-18以各种方式表达)。
图22显示利用纯化的人PBMCs进行的IL-18活性鉴定并且监测IFN-γ的产生(如所示IL-18以各种方式表达)。
发明详述
Caspase 4和5是胱氨酸蛋白酶家族的成员,包括白介素-1β转化酶(ICE),其优先切割包含蛋白酶激活基元的底物,所述基元包括氨基酸序列XEYD,其中X选自由W,L,F,Y,I,V,D,或E组成的氨基酸组,E是谷氨酸,Y选自由H,I,A,T,S,P或E组成的氨基酸组;D是天冬氨酸(Munday,N.A.,et al.,1995,J.Biol.Chemistry,270,15870-15876;Talanian,R.V.et al,1997,J.Biol.Chemistry 272,9677-82;Thonzberry,N.A.et al.1997 J.Biol.Chemistry 272,17907-11)。caspase-5的底物识别被认为基本上是与ICE和caspase-4相同的而与caspase的其它成员不同。(Talanian,R.V.et al,1997,J.Biol.Chemistry 272,9677-82;Thomberry,N.A.et al.1997J.Biol.Chemistry 272,17907-11)。Caspase4在EP-B-0754234中公开。Caspase 5在U.S.5,552,536和U.S.5,760,180中公开。
遍在蛋白-特异性蛋白酶属于不依赖ATP型酶家族,可精确地从与其融合的蛋白质N末端切割进化上保守的76氨基酸遍在蛋白多肽。这些蛋白酶特异地切割肽键,该肽键在遍在蛋白蛋白质羧基-末端氨基酸残基和结合遍在蛋白的任何非-遍在蛋白蛋白质的氨基基团间。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的遍在蛋白-特异性蛋白酶,Ubp1,Ubp-2,和Ubp-3,例如,是已知的并且可被重组表达以催化去除遍在蛋白的反应,该反应在体内和体外靶向遍在蛋白融合蛋白(Baker,RT et al.,1992,J.Biol.Chem.267:23364-23375;Baker,RT et al.,1994J.Biol.Chem.269:25381-25386)。除了以脯氨酸起点的外,酿酒酵母遍在蛋白-特异性蛋白酶的特异性容许精确地自任何肽去除遍在蛋白。其它种类的遍在蛋白-特异性蛋白酶诸如小鼠Unp和其人同系物的Unph,甚至能在脯氨酸前进行有效的切割(GilchristCA et al.1997,J.Biol.Chem.272:32280-32285。因此,在体外结合或与遍在蛋白特异性蛋白酶共表达时,通过去除精确融合的遍在蛋白肽事实上可生成任何所需的N-末端。遍在蛋白特异性蛋白酶在U.S.5,212,058;U.S.5,683,904;U.S.5,391,490;和U.S.5,494,818中公开。
任何天然的或人工制备的caspase 4,caspase 5,或遍在蛋白蛋白酶只要其产生活性多肽就可用于本发明中,所述活性多肽可独立于其结构,来源和起源在免疫活性细胞中诱导IFN-γ产生。
人类细胞中,基因表达形成的多肽可通过胞内酶加工。胞内酶将前体蛋白,诸如ProIL-18切割成它们的活性形式。能令人满意地结合药物的多肽应该受到与人类细胞中所进行的多肽的加工相似的加工。多肽通常以前体的形式存在于人类细胞中并且没有生物学活性。已知大多数细胞因子包括IL-18多肽通常生成的是没有生物学活性的前体,接着通过胞内酶加工转化成活性多肽。
本发明所指的IL-18前体存在于,例如,可固有地产生该多肽的细胞,哺乳动物宿主细胞,和细菌系统中,诸如大肠杆菌,通过导入DNA进行转化,例如具有SEQ ID NO:2核苷酸序列的DNA,所述序列包含编码所述多肽的区。使用所述哺乳动物的和细菌宿主细胞,前体IL-18可与蛋白酶共表达产生活性IL-18。
体外切割
本发明提供前体多肽诸如IL-18前体的体外活化的方法,包括将前体多肽与活化酶接触。
在优选的实施方案中,本发明提供人IL-18前体的体外活化的方法,包括将前体人IL-18与caspase 4或caspase 5接触。
在优选的实施方案中,通过活化酶切割而体外激活IL-18前体,所述活化酶可识别包括氨基酸序列XEYD的特异性蛋白酶激活基元,其中X选自由W,L,F,Y,I,V,D,或E组成的氨基酸组,y选自由H,I,A,T,S,P或E组成的氨基酸组。
在进一步优选的实施方案中,通过caspase 4或ca spase 5切割SEQ IDNO:1中天冬氨酸36和酪氨酸37间的肽键而体外激活IL-18前体,以产生在免疫活性细胞中可诱导IFN-γ生成的活性多肽。
一般,caspase 4或caspase 5可从能固有地产生它的细胞和应用重组DNA技术得到的转化体中得到。所述细胞的实施例是自哺乳动物和人类细胞确定的那些,例如上皮细胞,内皮细胞,间质细胞,软骨细胞,单核细胞,粒细胞,淋巴细胞及它们所确立的细胞系。转化体的实施例包括通过将编码caspase 5的DNA导入微生物和动物细胞而得到的转化微生物和动物细胞。通过在本领域所用的常规培养基中培养这些转化体来制备Caspase 4或caspase 5,或者在完整培养基(intact cultures)形式中或者是在从培养基分离后用超声处理它们,或者是将转化体浸在低渗溶剂中,将所得到的细胞碎片或包含细胞上清和细胞碎片的混合物应用到下面本领域纯化酶所用的常规技术中,盐析,透析,过滤,浓缩,分离沉降(separatorysedimentation),离子交换层析,凝胶过滤层析,吸附层析,等电层析,疏水层析(hydrophobic chromatography),亲合层析,反相层析(reverse-phase chromatography),亲和层析凝胶电泳和电聚焦(affinitychromatography gel electrophoresis and electrofocusing)。两种或更多种的这些纯化方法可结合使用。编码caspase 4(图5)(SEQ ID NO:5)和caspase 5(图7)(SEQ ID NO:7)的DNA和产生caspase 4与caspase5的转化体在本领域是已知的。例如,如(Munday NA et al.,1996,J.Biol.Chem 26:15870-76.)所述,通过表达没有pro区的N-末端截短的肽在大肠杆菌中产生活性形式的所述酶。
固有地产生前体多肽的细胞,例如,Pro-IL-18,或能被转化产生该前体的那些,在营养培养基中培养。优选的培养基包括本领域所熟知的培养基,例如Luria Bertani培养基或用于培养大肠杆菌的丰富培养基,包括胰蛋白胨和酵母提取物。
利用上述方法得到的Caspase 4或caspase 5,在破碎自培养基分离的或未分离的增生细胞后,允许在所得的培养基中共存,或将其加入到所得混合物中或细胞碎片。所需caspase 4或caspase 5的数量低于该前体的等摩尔数。caspase 4或caspase 5在允许caspase 4或caspase 5作用于该前体的温度与pH值下与前体接触。通常,在温度约为4-40℃和pH值约为6-9下caspase 4或caspase 5允许与前体反应至所需量的活性多肽从物质(material)前体形成。优选的温度约为25℃,优选的pH值约为7.2,因此,可得到含活性多肽的反应混合物。
根据作用每分钟每微克caspase 4或caspase-5产生加工多肽的微克数,caspase 4或caspase 5的活性通过活性单位得以鉴定和表达。
体内共表达
本发明进一步提供了体内活化前体多肽的方法,例如IL-18前体,包括与活化的蛋白酶共表达该蛋白质。更具体的是,本发明提供了体内活化IL-18的方法,包括多肽例如IL-18与蛋白酶诸如caspase 4,caspase 5,和遍在蛋白的双顺反子共表达,caspase 4,也称ICERELII,caspase 5,也称ICEREIII。
在优选的实施方案中,人caspase 4,也称ICERELII,与人Pro-IL-18双顺反子共表达以允许体内进行ProIL-18加工成活性IL-18。
在另一优选的实施方案中,截短的人caspase 4(SEQ ID NO.4),与人Pro-IL-18双顺反子共表达以允许体内进行ProIL-18(SEQ ID NO:1)加工成活性IL-18(SEQ ID NO:3)。
在另一优选的实施方案中,人caspase 5,也称ICERELIII,与人Pro-IL-18双顺反子共表达以允许体内进行ProIL-18加工成活性IL-18(SEQ ID NO:3)。
在另一优选的实施方案中,遍在蛋白蛋白酶1(Ubp-1)与遍在蛋白-IL-18(Ubp-IL-18)双顺反子共表达以允许体内进行UB-IL-18加工成活性IL-18。
在另一优选的实施方案中,遍在蛋白蛋白酶1(Ubp-1)与遍在蛋白-IL-18(Ubp-IL-18)双顺反子共表达以允许体内进行UB-IL-18(SEQ ID NO:9)加工成活性IL-18(SEQ ID NO:3)。
在最优选的实施方案中,截短的人caspase 5(SEQ ID NO:5),与人Pro-IL-18双顺反子共表达以允许体内进行ProIL-18(SEQ ID NO:1)加工成活性IL-18(SEQ ID NO:3)。
将编码caspase 4或caspase 5的DNA和编码所述多肽前体的DNA均导入合适的微生物和动物细胞以进行转化。在这种情况下,DNA表达所形成的caspase 4或caspase 5,作用于相同转化体中DNA表达形成的多肽前体,以形成活性多肽(图11和15)。优选的宿主细胞是表皮-,间质-,成神经细胞-,造血-细胞系,衍生于人,猴,小鼠和仓鼠以及常用作宿主的例如3T3细胞,包括3T3-Swiss albino细胞(ATCC CCL 92),C1271细胞(ATCC CRL1616),CHO细胞包括CHOK1细胞(ATCC CCL 61),CV-1细胞(ATCC CCL 70),COS细胞包括COS-1细胞(ATCC CCL 1650),HeLa细胞(ATCC CCL 2),MOP细胞包括MOP-8细胞(ATCCCRL 1709)和它们的突变体。最优选的宿主细胞是大肠杆菌。最优选的方法是用氯化铷(rubidium chloride)的化学转化,将编码caspase 4或5的DNA与编码所述多肽前体的DNA导入大肠杆菌,这是本领域所熟知的。将编码caspase 4或5的DNA与编码所述多肽前体的DNA导入哺乳动物宿主细胞包括常规的DEAE-葡聚糖方法,磷酸钙方法,电穿孔,脂转染,微注射,病毒感染方法,使用逆转录病毒,腺病毒,疱疹病毒,牛痘病毒。这种情况下,按照下面标准技术使用载体例如pCD,pcDL-SR α,pKY4,pCDM8,pCEV4,pME18S和pSV2-gpt,所述载体包括合适的启动子,增强子,复制起点,终止点,剪接序列,聚腺苷酸化序列和/或选择标记,描述于Ausubel FM et al.,1994Current Protocols inMolecular Biology,New York:Greene Publishing Assoc.和WileyInterscience中。通过免疫检测观察到产生活性多肽的克隆,由在营养培养基培养后从转化体选择所需克隆进行筛选。用本领域常规营养培养基培养克隆转化体得到含活性多肽的培养物。对于固有产生所述多肽前体的细胞和其它转化产生所述多肽的细胞,它们在活化酶下可产生所述前体,活化所述多肽,所述活化酶例如caspase 4,caspase 5,和遍在蛋白。应用哺乳动物宿主细胞的重组DNA技术在Glutzman,Cell,23:175(1981)Mullingan,PNAS 78:2072(1981)中详细公开。应用细菌宿主细胞的重组DNA技术在蛋白质表达:A Practical Approach,S.J.Higgins和B.D.Hames eds.1999,New York,Oxford University Press中公开。
在所得反应混合物和培养物包含活性IL-18多肽,可完整地用作IFN-γ诱导物时,在优选的实施方案中,用超声,细胞裂解酶和/或表面活性剂破碎培养物中的细胞,接着通过过滤,离心等,从所得的细胞和细胞碎片中分离所述多肽,下面标准工业方法描述于(Protein Purification:Principles and Practice,Cantor,C.R.ed.1993,New York,Spinger-Verlag)。通过本领域用于纯化生物学活性物质的常规纯化方法,所述分离于细胞和细胞碎片的多肽得以提纯,例如,盐析,透析,过滤,浓缩,分离沉降,离子交换层析,凝胶过滤层析,吸附层析,等电层析,疏水层析,反相层析,亲合层析,凝胶电泳和电聚焦亲和层析。如果必要,两种或更多种的这些纯化方法可结合使用。所得纯化的多肽可被浓缩并冷冻干燥成液体或固体产物以满足最终的用途。
本发明双顺反子表达盒是多用途载体,事实上可用于体内的加工任何多肽,所述多肽包含合适的caspase 4/caspase 5或遍在蛋白酶(ubiquitinase)的切割识别位点,如先前描述(Tobias,J.W.et al.,Journal of Biological Chemistry,1991.266(18):p.12021.12028;Talanian,R.V.et al.,Journalof biological Chemistry,1997.272(15):p.9677-9682)。双顺反子表达提供有利于其它共表达策略的优点,由于两基因结合在相同的转录单元,确保两基因随时间(over time)的一致表达(consistent expression)。这可与双质粒系统相比较,长时间时双质粒其中之一可能丢失,或单质粒双启动子系统,其中表达可由于一个实验到另一个实验的每个启动子而变化。尤其是,本文所述的双顺反子表达系统理想地适合于体内活化酶,细胞因子,生长因子以及其它蛋白水解的可激活的蛋白,由此能自在单步(single step)中由细胞大规模地生产所述蛋白,不需要单独的体外激活步骤。
活化蛋白酶,caspase 4(Ala105到Asn377)或caspase 5(Ile146到Asn418),紧接Pro-IL-18序列之后被亚克隆为N-末端6-His融合,以产生两基因的转录融合。T7终止子位于caspase-4序列的下游用于双顺反子转录单元的翻译终止。包括缺陷型Shine Dalgarno序列的小基因间隔区被加入以仅允许自caspase-4序列起始的最低的翻译(图10和14)。其它调控区包括25碱基对lac操纵子序列,所述操纵子序列紧接17碱基对启动子的下游,其通过lac阻遏物结合,所述lac阻遏物由位于该质粒的lac-I基因的拷贝编码,由此在没有T7RNA聚合酶时抑制基本转录。然后将指定为ProIL18/Casp4和ProIL18/Casp5所得质粒分别转染至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,该菌株包含T7聚合酶基因的诱导染色体拷贝。
双顺反子盒的翻译受T7启动子的指导,其受噬菌体T7RNA聚合酶蛋白的控制,被自T7RNA聚合酶基因的溶源性拷贝所编码。该T7RNA聚合酶染色体拷贝自身是在lacUV5启动子的控制之下,通过添加异丙基-1-thio-b-D-galactopyranoside诱导。诱导导致Pro-IL18和组氨酸-caspase-4或组氨酸-caspase-5协同转录和翻译。初期(Nascently)翻译的caspase-4或caspase-5自动加工成活性种类,其启动蛋白水解活化pro-IL-18。翻译的前体IL-18以及翻译后活化的IL-18主要是大肠杆菌内可溶性的。通过常规层析方法诱导后,包含N-末端酪氨酸的成熟活性IL-18从细胞溶解产物直接纯化。在37℃4小时或29℃18小时用caspase-4切割成熟IL-18得以完成(图11),29℃18小时用caspase-5切割成熟IL-18得以完成(图15)。
在最优选的实施方案中,本发明使用截短的(truncated)caspase 4,如图4(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)所示,或截短的caspase 5,如图5(SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)所示。caspase 4和caspase 5的截短公开于Munday,N.A.,et al.,1995,J.Biol;Chemistry,270,15870-15876中。
本发明进一步提供了产生活性多肽的方法,是通过遍在蛋白-特异性蛋白酶与N-末端遍在蛋白IL-18融合体(前体)共表达实现的,所述融合体是通过遍在蛋白c-末端水解酶的活性而转化成活性IL-18。包含真正的(authentic)N-末端酪氨酸的76个氨基酸遍在蛋白蛋白质,与人IL-18成熟N-末端融合并且和遍在蛋白-特异性蛋白酶在大肠杆菌中共表达,例如如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。在真核细胞中发现遍在蛋白高度保守的76-残基蛋白,其功能是标记蛋白质的降解(Baker,R.T.,CurrentOpinion in Biotechnology,1996.7(5):p.541-6)。通过遍在蛋白-特异性蛋白酶的作用,遍在蛋白被特异地自蛋白质上切割,所述遍在蛋白-特异性蛋白酶在真核细胞中内源性的表达,而在细菌中没有。大肠杆菌中遍在蛋白融合蛋白质与遍在蛋白-特异性蛋白酶的共表达还导致有效地去除遍在蛋白(Baker,R.T.et al.,Journal of Biological Chemistry,1992.267(32):p.23364-75)(图20)。此外,大多数去除遍在蛋白的酶能在除了脯氨酸外的任何氨基酸前切割。因此,尽管在PI′位点存在大量的芳香族酪氨酸残基,自成熟IL-18的遍在蛋白的切割是可能的。
遍在蛋白-IL-18(Ub-IL-18)和遍在蛋白蛋白酶-1(Ubp-1)(Tobias,J.W.etal.,Jour77al of Biological Chemistry,1991.266(18):p.12021.12028)的共表达通过在诱导型T7启动子控制下两基因的双顺反子表达得以实现。成熟IL-18表达为N-末端与进化上保守的76氨基酸遍在蛋白肽的融合体。pET28a载体内T7RNA聚合酶启动子控制下将Ub-IL-18cDNA亚克隆。随后,编码全长遍在蛋白-特异性蛋白酶的cDNA被亚克隆T7终止子序列前的下游(图19)。由于Ub-IL-18和遍在蛋白特异性蛋白酶cDNA被翻译成单mRNA转录物,从中Ub-IL-18和遍在蛋白-特异性蛋白酶cDNA′s被分别转录。
如上所述,本发明方法获得的活性人IL-18多肽,具有诱导IFN-γ产物作为有用的生物学活性物质生成的活性,刺激自KG-1(人骨髓单核细胞系)细胞产生IFNg并纯化人PBMCs(图22)。
所有的出版物和专利在此引入作为参考,下面的实施例进-步解释但并不限制本发明:
实施例
实施例1-前体IL-18(pro-IL-18)的制备
在大肠杆菌中人前体IL-18被表达为N-末端6-组氨酸标记的融合体。表达质粒ProEx-hIL1 8,衍生于包含Trc启动子和IacIq的载体pPROEX-1(生命技术)用于异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。为了构建重组表达载体,含完整caspase 5前体基因的DNA片断自cDNA克隆进行PCR扩增,5′以Nde I和3′以Bam HI限制性核酸内切酶位点加尾。pPROEX-中在两限制位点间扩增产物进行亚克隆,由此产生与载体中6-组氨酸编码序列的框内N-末端融合(inframe N-terminal fusion)。
在37℃用I PTG诱导5小时后,所得质粒在DH10B宿主细胞中表达。自诱导培养物离心后得到的细胞沉淀中收获重组蛋白。
实施例2-pro-IL-18的纯化
将如实施例1中所述表达pro-IL-18的1.5kg大肠杆菌细胞悬浮于3.6L裂解缓冲液C(50mM Ttis HCl,10mM BME,0.5M NaCI,5%甘油,1ug/ml胃蛋白酶抑制剂A,1ug/ml leupepsin,0.4mM AEBSF)中,通过Microfluidics在12,000psi,28,000xg离心,两步法(two passes)裂解,并收集到3.7L上清,将用含5mM咪唑(BufferD)缓冲液C预平衡过的600ml NiNTA琼脂糖加入到上清中并温育浆液一小时以捕获pro-IL-18。浆液在低速度(3,000r pm)下离心,倾析上清,将浆液上柱,用缓冲液D冲洗该柱,并且用300mM咪唑缓冲液C洗脱出pro-IL-18。在缓冲液E(25mM HEPES,10mM BME,pH 8.0)中透析汇集液(pool),并应用到用相同缓冲液平衡过的DEAE ToyoPearl 650M柱上,用0-0.5M NaCl线性梯度缓冲液E洗脱柱,汇集液包含650mg>90%纯pro-IL-18。
实施例3-Caspase 4的制备
在大肠杆菌中人前体caspase-4也被表达为N-末端6-组氨酸标记的融合体。表达质粒,pET16b-caspase 4,衍生于包含噬菌体T7启动子的载体pET16b(Novagen)。重组载体通过PCR扩增caspase-4活性域(氨基酸I1e146至Asn418)而构建,所述域在N-末端结合有6-组氨酸编码序列,并且以NcoI和Xho I限制性内切酶位点加尾。所得PCR产物接着在此两限制位点间进行亚克隆产生N-末端6-组氨酸Caspase 4融合载体。
在lacUV5启动子控制下,将所得质粒转化到溶源性BL21 DE3大肠杆菌菌株,该大肠杆菌菌株包含T7RNA聚合酶的染色体拷贝,用1mM IPTG诱导后能诱导表达caspase 4。从细胞沉淀中纯化活性蛋白,所述沉淀在37℃诱导3小时后分离。
实施例4-Caspase 4的纯化
在裂解大肠杆菌细胞时,如实施例2所述该大肠杆菌细胞表达N-末端6-组氨酸标记的人caspase 4,在裂解物上清中可检测caspase 4活性。在自上清的NiNTA琼脂糖珠粒(bead)捕获蛋白质时,均可回收p10和p20。这表明在细胞培养期间通过p10和p20结合点自动切割活化caspase 4蛋白酶域,其维持非共价异二聚体。利用该信息,6-组氨酸标记p20/p10异二聚体可被纯化。整个方法在4℃实施以避免任何进一步的分子断裂。
约400g湿大肠杆菌细胞沉淀悬浮于含25mM HEPES,0.1%CHAPS,500mM NaCl,10mM β巯基乙醇(BME),pH 7.4,和10%甘油(BufferA)的1.6L裂解缓冲液中,并用两步法经Microfluidics 12,000psi裂解,裂解物与30,000xg离心一小时,回收得到1.7L裂解物上清。将用含5mM咪唑裂解缓冲液预先平衡的150ml NiNTA琼脂糖加入到该裂解物上清中,用2NNaOH将悬浮液调节到pH 8.0,caspase 4分批吸附(batch-absorbed)一小时。将NiNTA琼脂糖填充到柱中,用5mM和25mM咪唑的缓冲液A依次冲洗以去除杂质,并用300mM咪唑缓冲液A洗脱caspase5。蛋白质对BufferB(25mM HEPES,0.1%CHAPS,10%甘油,10mM BME,pH 8.0)透析,并应用到用相同缓冲液预先平衡过的DEAE ToyoPearl 650M上。用100mM NaCl的相同缓冲液洗脱出Caspase 4。使用荧光肽底物,LEED-AMC,显示高度特异性的caspase 4成分被汇集。
实施例5-体外活化和制备多肽
如实施例2所述纯化的Pro-IL-18使用Caspase 4以1∶500w/w的比例在室温温育3小时。根据SDS-PAGE分析Prodomain的切割反应完成>90%。反应混合物中加入140ml NiNTA琼脂糖的Buffer D,温育1小时,倒到烧结玻璃板漏斗(sintered glass funnel)以回收未结合的主要包含成熟IL-18的物质。少量剩余的pro-IL-18,prodomain,caspase 4和其它杂质结合到NINTA琼脂糖上。未结合溶液被调整到25mM DTT,温育1小时以完成还原反应,通过加入2M磷酸调整溶液pH值至6.0,用YM10膜浓缩至86ml。将浓缩的样品应用到预先用含0.1M NaCl的10mM NaPhosphate pH 6.0平衡过的Superdex 75柱上,汇集的级分包含560毫克成熟IL-18。
实施例6-体内活化和制备多肽
通过同时表达人前体IL-18和caspase-4也可完成体内活化IL-18。Pro-IL-18与人caspase-4在表达质粒pET28-Pro-IL-18/Casp4内双顺反子地自单转录物大肠杆菌共表达(图5和6)。为了自Pro-IL-18序列最佳翻译启动,在T7启动子控制下将人pro-IL-18基因亚克隆入pET28a(Novagen),所述启动子包括有效的Shine-Dalgarno序列(图8)。紧接在包括缺陷型Shine-Dalgarno序列的Pro-IL-18序列之后,将caspase 4基因(Ile146至Asn418)亚克隆,以允许自caspase 4序列的最低翻译启动。包括T7终止子序列用于双顺反子转录单元之后翻译终止。然后将所得的构建体转染至BL21(DE3)宿主,该宿主包含T7聚合酶基因的可诱导染色体拷贝。所述宿主中该构建体用1mM IPTG的诱导导致pro-IL-18和pro-caspase 4的协同(coordinate)转录和翻译。初期翻译的pro-caspase 4被自动加工成活性种类,其启动蛋白水解活化pro-IL-18。图8显示在1mM IPTG诱导(0-18小时)后,于29℃活化18小时的IL-18的时程(time course)。
实施例7-体内活化caspase4
caspase 4的体内活化在(Munday,N.A.,et al.,1995,J.Biol.Chemistry,270,15870-15876)中描述。大肠杆菌中缺少proregion通过切割成能装配成活性酶异二聚体的P10和P20亚基,始于Ala59截短形式的caspase-4的表达导致自活化(self-activation)。caspase-4活化的延迟被翻译成Pro-IL-18切割和活化为成熟IL-18的延迟(图9)。在其切割成成熟IL-18之前能积累更高稳定的Pro-IL-18,成熟IL-18在细胞中稳定性较低。
实施例8-与Caspase4共表达的人IL-18的纯化
如实施例6所述,将表达IL-18的66g大肠杆菌细胞悬浮于含1mM EDTA和10mM DTT的130ml0.1M HEPES pH 7.5中(除了最后步骤没有SH,整个方法在4℃进行,并且存在10mM DTT),使用Microfluidics通过两步法于15,000psi裂解。裂解物(230ml)于34,000xg离心30分钟。用25mMHEPES pH 7.0将上清(200ml)稀释至1L,并流经串联的两柱ToyoPearl SP650M和ToyoPearl DEAE 650M,源于大肠杆菌细胞的许多杂质结合到柱上。流通(flow-through)物质用25mM bistris propane调整到pH 9.5,稀释至2L,应用到用25mM bistris propane HCl pH 9.5平衡过的Source 15Q柱上。用线性梯度0-0.5M NaCl的相同缓冲液洗脱该柱。使用Vydac C4RP-HPLC鉴定包含IL-18的级分并汇集(250ml)。使用YM10膜将汇集液浓缩成50m l并应用到Supe rdex 75柱上,该柱用包含1mM EDTA和0.15M NaCI的10mM NaPO4pH 6.0预先平衡(体内使用没有DTT)。
实施例9-截短型caspase 5的制备
人截短型caspase5也在大肠杆菌中被表达为N-末端6-组氨酸标记的融合体。表达质粒,pET16b-截短型caspase 5,衍生于包含噬菌体T7启动子的载体pET16b(Novagen)。重组载体通过PCR扩增截短型caspase 5活性域(氨基酸Ile146至Asn418)来构建,所述域在N-末端结合有6-组氨酸编码序列并且以Nco I和Xho I限制性内切酶位点加尾。所得PCR产物接着在两限制位点间进行亚克隆产生N-末端结合有6-组氨酸截短型Caspase 5的融合载体。
将所得质粒转化到溶源性BL21DE 3大肠杆菌菌株,该大肠杆菌菌株包含T7 RNA聚合酶的染色体拷贝,在lacUV5启动子控制下,用1mM IPTG诱导后能诱导表达截短型caspase 5。从细胞沉淀中纯化活性蛋白,所述沉淀在37℃诱导3小时后分离。
实施例10-截短型caspase 5的纯化
在裂解大肠杆菌细胞时,如实施例9所述该大肠杆菌细胞表达N-末端6-组氨酸标记的人截短型caspase 5,在裂解物上清中可检测到截短型caspase 5活性。在自上清的NiNTA琼脂糖珠粒捕获蛋白质时,均可回收p10和p20。这表明在细胞培养期间通过p10和p20结合点自动切割活化截短型caspase 5,截短型caspase 5维持可溶非共价异二聚体。利用该信息,6-组氨酸标记的p20/p10异二聚体可被纯化。整个方法在4℃实施以避免任何进一步的分子断裂。
约400g湿大肠杆菌细胞沉淀悬浮于含25mM HEPES,0.1%CHAPS,500mM NaCl,10mM β巯基乙醇(BME)pH 7.4,和10%甘油(Buffer A)的1.6L裂解缓冲液中,并用两步法经Microfluidics 12,000psi裂解,裂解物30,000xg离心一小时,回收得到1.7L裂解物上清。将用含5mM咪唑裂解缓冲液预先平衡的150ml NiNTA琼脂糖加入到该裂解物上清中,用2NNaOH将悬浮液调节到pH 8.0,caspase 5分批吸收一小时。将NiNTA琼脂糖填充到柱中,用5mM和25mM咪唑缓冲液A依次冲洗以去除杂质,并用300mM咪唑缓冲液A洗脱caspase 5。蛋白质对Buffer B(25mM HEPES,0.1%CHAPS,10%glycerol,10mM BME,pH 8.0)透析,再应用到用相同缓冲液预先平衡过的DEAE ToyoPearl 650M上。用100mM NaCl的相同缓冲液洗脱出截短型caspase 5。使用荧光肽底物,显示高度特异性的截短型caspase5级分,LEED-AMC,被汇集。
实施例11-体外活化和制备多肽
如实施例1和2所述纯化制备的Pro-IL-18使用截短型caspase 5以1∶500w/w的比例在室温温育3小时。根据SDS-PAGE分析,prodomain的切割反应完成>90%。反应混合物中加入140ml NiNTA琼脂糖的BufferD,温育1小时,倒到烧结玻璃漏斗(sintered glass funnel)以回收主要包含成熟IL-18的未结合物质。少量剩余的pro-IL-18,prodomain,截短的caspase 5和其它杂质结合到NINTA琼脂糖上。未结合溶液被调整到25mMDTT,温育1小时以完成还原反应,通过加入2M磷酸调整溶液pH值至6.0,用YM10膜浓缩至86ml。将浓缩的样品应用到预先用含0.1M NaCl的10mMNaPhosphate pH 6.0平衡过的Superdex 75柱上,汇集级分包含560毫克成熟IL-18。
实施例12-体内活化和制备多肽
通过同时表达人前体IL-18和截短型caspase 5也可完成体内活化IL-18。Pro-IL-18与人截短型caspase 5在表达质粒pET28-Pro-IL-18/Casp5内双顺反子地自单转录物大肠杆菌共表达(图9)。自Pro-IL-18序列的最佳翻译启动,在T7启动子控制下将人pro-IL-18基因亚克隆入pET28a(Novagen),所述启动子包括有效的Shine-Dalgarno序列(图10)。在包括缺陷型Shine-Dalgarno序列的Pro-IL-18序列之后,将截短型caspase 5基因(Ile146至Asn418)直接亚克隆,以允许自截短型caspase 5序列的最低翻译启动。包括T7终止子序列在双顺反子转录单元之后用于翻译终止。然后将所得的构建体转染至BL21(DE3)宿主,该宿主包含T7聚合酶基因的可诱导染色体拷贝。所述宿主中该构建体用1mM IPTG的诱导导致pro-IL-18和pro-caspase 5的协同转录和翻译。初期翻译pro-caspase 5被自动加工成活性种类,启动蛋白水解活化pro-IL-18。
实施例13-与截短型caspase 5共表达的人IL-18纯化
如实施例12所述,将表达IL-18的66g大肠杆菌细胞悬浮于含1mMEDTA和10mM DTT的130ml 0.1M HEPES pH 7.5中(除了最后步骤没有SH,整个方法在4℃进行,并且存在10mM DTT),使用Microfluidics通过两步法于15,000psi裂解。裂解物(230ml)于34,000xg离心30分钟。用25mM HEPES pH 7.0将上清(200ml)稀释至1L,并流经串联的两柱ToyoPearlSP 650M和ToyoPearl DEAE 650M,源于大肠杆菌细胞的许多杂质结合到柱上。流通物质用25mM bistris propane调整到pH 9.5,稀释至2L,应用到用25mM bistris propane HCl pH 9.5平衡过的Source 15Q柱上。用线性梯度0-0.5M NaCl的相同缓冲液洗脱该柱。使用Vydac C4 RP-HPLC鉴定包含IL-18的成分并将其汇集(250ml)。使用YM10膜将沉积物浓缩成50ml并应用到Superdex 75上,该柱用包含1mM EDTA和0.15M NaCI的10mM NaPO4pH 6.0预先平衡(体内使用没有DTT)。
实施例14-遍在蛋白/Pro-IL-18/Ubpl的制备
76个氨基酸遍在蛋白编码序列与成熟人IL-18的起点经平端连接框内融合,成熟IL-18的第一个酪氨酸密码子直接在遍在蛋白的甘氨酸76密码子后。接着在T7启动子控制下将基因融合体亚克隆至pET载体,用于自遍在蛋白-IL-18基因序列最佳转录启动,所述启动子包括有效的Shine-Dalgarno序列。接着在包括缺陷型Shine-Dalgarno序列的IL-18后,全长Ubp-1基因直接被亚克隆以用于最低Ubp-1翻译。图11描述了pET28内UbIL-18/Ubp-1表达盒序列。图13描述了pET28内UbIL-18/Ubp-1的annotated序列。编号与pET28内位点对应。
实施例15-IL-18的体内活化和制备
接着将实施例14的构建体转染至BL21(DE3)宿主。用1mM IPTG的诱导导致pro-IL-18和pro-caspase 4的协同转录和翻译。Ubp-1的酶反应导致有效地将Ub-IL-18加工成成熟活性IL-18,接着用常规方法IL-18可被直接从大肠杆菌裂解物中纯化。图16解释了用1mM IPTG的诱导后IL-18表达和于30℃和37℃加工的时程。上部的箭头表示泳道1中未加工UB-IL-18的部分,底部的箭头表示泳道3中加工过的UB-IL-18的部分(采用抗-IL-18抗血清进行Western blot检测)。
实施例16-与遍在蛋白共表达的人IL-18的纯化
如实施例15所述,将表达IL-18的66g大肠杆菌细胞悬浮于含1mMEDTA和10mM DTT的130ml 0.1M HEPES pH 7.5中(除了最后步骤没有SH,整个方法在4℃进行,并且存在10mM DTT),使用Microfluidics通过两步法于15,000psi裂解。裂解物(230ml)于34,000xg离心30分钟。用25mM HEPES pH 7.0将上清(200ml)稀释至1L,并流经串联的两柱ToyoPearlSP 650M和ToyoPearl DEAE 650M,源于大肠杆菌细胞的许多杂质结合到柱上。流通物质用25mM bistris propane调整到pH 9.5,稀释至2L,应用到用25mM bistris propane HCl pH 9.5平衡过的Source 15Q柱上。用线性梯度0-0.5M NaCl的相同缓冲液洗脱该柱。使用Vydac C4 RP-HPLC鉴定包含IL-18的级分并汇集(250ml)。使用YM10膜将沉积物浓缩成50ml并应用到Superdex 75上,该柱用包含1mM EDTA和0.15M NaCI的10mMNaPO4pH 6.0预先平衡(体内使用没有DTT)。
虽然本文描述了目前认为是本发明优选的实施方案,它应被理解为其中可以进行各种改变,所附权利要求中意欲覆盖的所有如此改变落在本发明的真实精神和范围之内。
序列表
<110>史密丝克莱恩比彻姆公司(SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION)
<120>制备具有生理活性的IL-18多肽的方法
<130>P51137
<140>待指定
<141>Herewith
<150>60/211,832
<151>2000-06-15
<150>60/224,128
<151>2000-08-10
<150>60/264,923
<151>2001-01-30
<160>12
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>193
<212>PRT
<213>人(Homo sapien)
<400>1
Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met
1 5 10 15
Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn
20 25 30
Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Ly s Leu Ser Val Ile
35 40 45
Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro
50 55 60
Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg
65 70 75 80
Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met
85 90 95
Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys
100 105 110
Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile
115 120 125
Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly
130 135 140
His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe
145 150 155 160
Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys
165 170 175
Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu
180 185 190
Asp
<210>2
<211>582
<212>DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>2
atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60
aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120
cttgagagca aactatcggt cattcgtaat ttaaatgacc aggtcctatt tatcgaccaa 180
gggaatcgtc cactattcga ggacatgaca gacagtgact gccgagacaa tgcgccgcga 240
accattttca ttatatctat gtacaaggat tctcagccgc gcggaatggc cgtaactatt 300
tctgtcaaat gtgaaaagat atccacgctg tcgtgtgaga acaagattat tagtttcaaa 360
gagatgaatc cgccggataa tatcaaggac acgaagtctg atatcatatt tttccagcgc 420
agcgtgccgg ggcacgataa caagatgcaa tttgaatcat ccagctatga agggtacttt 480
cttgcatgcg agaaggaacg cgatctcttt aaacttattt taaagaaaga ggacgagcta 540
ggcgatcgca gcattatgtt cactgtccaa aatgaagact ag 582
<210>3
<211>157
<212>PRT
<213>人(Homo sapien)
<400>3
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210>4
<211>282
<212>PRT
<213>人(Homo sapien)
<400>4
Met Gly His His His His His His Gly Ala Leu Lys Leu Cys Pro His
1 5 10 15
Glu Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro
20 25 30
Ile Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn
35 40 45
Thr Glu Phe Asp His Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile
50 55 60
Thr Gly Met Lys Glu Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val
65 70 75 80
Glu Glu Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe
85 90 95
Ala Thr Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu
100 105 110
Met Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu
115 120 125
Lys Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn
130 135 140
Asn Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val
145 150 155 160
Gln Ala Cys Arg Gly Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser
165 170 175
Pro Thr Ser Leu Glu Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu
180 185 190
Glu Asp Ala Val Tyr Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe
195 200 205
Cys Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly
210 215 220
Ser Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp
225 230 235 240
Cys Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu
245 250 255
Thr Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met
260 265 270
Thr Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn
275 280
<210>5
<211>849
<212>DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>5
atgggccatc atcatcatca tcatggcgcc ctcaagcttt gtcctcatga agaattcctg 60
agactatgta aagaaagagc tgaagagatc tatccaataa aggagagaaa caaccgcaca 120
cgcctggctc tcatcatatg caatacagag tttgaccatc tgcctccgag gaatggagct 180
gactttgaca tcacagggat gaaggagcta cttgagggtc tggactatag tgtagatgta 240
gaagagaatc tgacagccag ggatatggag tcagcgctga gggcatttgc taccagacca 300
gagcacaagt cctctgacag cacattcttg gtactcatgt ctcatggcat cctggaggga 360
atctgcggaa ctgtgcatga tgagaaaaaa ccagatgtgc tgctttatga caccatcttc 420
cagatattca acaaccgcaa ctgcctcagt ctgaaggaca aacccaaggt catcattgtc 480
caggcctgca gaggtgcaaa ccgtggggaa ctgtgggtca gagactctcc agcatccttg 540
gaagtggcct cttcacagtc atctgagaac ctggaggaag atgctgttta caagacccac 600
gtggagaagg acttcattgc tttctgctct tcaacgccac acaacgtgtc ctggagagac 660
agcacaatgg gctctatctt catcacacaa ctcatcacat gcttccagaa atattcttgg 720
tgctgccacc tagaggaagt atttcggaag gtacagcaat catttgaaac tccaagggcc 780
aaagctcaaa tgcccaccat agaacgactg tccatgacaa gatatttcta cctctttcct 840
ggcaattga 849
<210>6
<211>282
<212>PRT
<213>人(Homo sapien)
<400>6
Met Gly His His His His His His Gly Ile Leu Lys Leu Cys Pro Arg
1 5 10 15
Glu Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Lys Asn His Asp Glu Ile Tyr Pro
20 25 30
Ile Lys Lys Arg Glu Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn
35 40 45
Thr Lys Phe Asp His Leu Pro Ala Arg Asn Gly Ala His Tyr Asp Ile
50 55 60
Val Gly Met Lys Arg Leu Leu Gln Gly Leu Gly Tyr Thr Val Val Asp
65 70 75 80
Glu Lys Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Val Leu Arg Ala Phe
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu
100 105 110
Met Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Ala His Lys Lys
115 120 125
Lys Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn
130 135 140
Asn Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val
145 150 155 160
Gln Ala Cys Arg Gly Glu Lys His Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser
165 170 175
Pro Ala Ser Leu Ala Val Ile Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu
180 185 190
Ala Asp Ser Val Cys Lys Ile His Glu Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe
195 200 205
Cys Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Arg Thr Arg Gly
210 215 220
Ser Ile Phe Ile Thr Glu Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Cys
225 230 235 240
Cys Cys His Leu Met Glu Ile Phe Arg Lys Val Gln Lys Ser Phe Glu
245 250 255
Val Pro Gln Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Ala Thr Leu
260 265 270
Thr Arg Asp Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn
275 280
<210>7
<211>849
<212>DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>7
atgggccatc atcatcatca tcatggcata ctcaaacttt gtcctcgtga agaattcctg 60
agactgtgta aaaaaaatca tgatgagatc tatccaataa aaaagagaga ggaccgcaga 120
cgcctggctc tcatcatatg caatacaaag tttgatcacc tgcctgcaag gaatggggct 180
cactatgaca tcgtggggat gaaaaggctg cttcaaggcc tgggctacac tgtggttgac 240
gaaaagaatc tcacagccag ggatatggag tcagtgctga gggcatttgc tgccagacca 300
gagcacaagt cctctgacag cacgttcttg gtactcatgt ctcatggcat cctagaggga 360
atctgcggaa ctgcgcataa aaagaaaaaa ccggatgtgc tgctttatga caccatcttc 420
cagatattca acaaccgcaa ctgcctcagt ctaaaggaca aacccaaggt catcattgtc 480
caggcctgca gaggtgaaaa acatggggaa ctctgggtca gagactctcc agcatccttg 540
gcagtcatct cttcacagtc atctgagaac ctggaggcag attctgtttg caagatccac 600
gaggagaagg acttcattgc tttctgttct tcaacaccac ataacgtgtc ctggagagac 660
cgcacaaggg gctccatctt cattacggaa ctcatcacat gcttccagaa atattcttgc 720
tgctgccacc taatggaaat atttcggaag gtacagaaat catttgaagt tccacaggct 780
aaagcccaga tgcccaccat agaacgagca accttgacaa gagatttcta cctctttcct 840
ggcaattga 849
<210>8
<211>1743
<212>DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>8
agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60
ttcccctcta gaccacacct taaggaggat ataacatatg gctgctgaac cagtagaaga 120
caattgcatc aactttgtgg caatgaaatt tattgacaat acgctttact ttatagctga 180
agatgatgaa aacctggaat cagattactt tggcaagctt gagagcaaac tatcggtcat 240
tcgtaattta aatgaccagg tcctatttat cgaccaaggg aatcgtccac tattcgagga 300
catgacagac agtgactgcc gagacaatgc gccgcgaacc attttcatta tatctatgta 360
caaggattct cagccgcgcg gaatggccgt aactatttct gtcaaatgtg aaaagatatc 420
cacgctgtcg tgtgagaaca agattattag tttcaaagag atgaatccgc cggataatat 480
caaggacacg aagtctgata tcatattttt ccagcgcagc gtgccggggc acgataacaa 540
gatgcaattt gaatcatcca gctatgaagg gtactttctt gcatgcgaga aggaacgcga 600
tctctttaaa cttattttaa agaaagagga cgagctaggc gatcgcagca ttatgttcac 660
tgtccaaaat gaagactagt ggaggatata ataccaggaa taaataaaat ccatgggcca 720
tcatcatcat catcatggcg ccctcaagct ttgtcctcat gaagaattcc tgagactatg 780
taaagaaaga gctgaagaga tctatccaat aaaggagaga aacaaccgca cacgcctggc 840
tctcatcata tgcaatacag agtttgacca tctgcctccg aggaatggag ctgactttga 900
catcacaggg atgaaggagc tacttgaggg tctggactat agtgtagatg tagaagagaa 960
tctgacagcc agggatatgg agtcagcgct gagggcattt gctaccagac cagagcacaa 1020
gtcctctgac agcacattct tggtactcat gtctcatggc atcctggagg gaatctgcgg 1080
aactgtgcat gatgagaaaa aaccagatgt gctgctttat gacaccatct tccagatatt 1140
caacaaccgc aactgcctca gtctgaagga caaacccaag gtcatcattg tccaggcctg 1200
cagaggtgca aaccgtgggg aactgtgggt cagagactct ccagcatcct tggaagtggc 1260
ctcttcacag tcatctgaga acctggagga agatgctgtt tacaagaccc acgtggagaa 1320
ggacttcatt gctttctgct cttcaacgcc acacaacgtg tcctggagag acagcacaat 1380
gggctctatc ttcatcacac aactcatcac atgcttccag aaatattctt ggtgctgcca 1440
cctagaggaa gtatttcgga aggtacagca atcatttgaa actccaaggg ccaaagctca 1500
aatgcccacc atagaacgac tgtccatgac aagatatttc tacctctttc ctggcaattg 1560
aaaatggatc cgaattcgag ctccgtcgac aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac 1620
caccaccact gagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc 1680
accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt 1740
ttg 1743
<210>9
<211>1464
<212>DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>9
atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60
aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120
cttgagagca aactatcggt cattcgtaat ttaaatgacc aggtcctatt tatcgaccaa 180
gggaatcgtc cactattcga ggacatgaca gacagtgact gccgagacaa tgcgccgcga 240
accattttca ttatatctat gtacaaggat tctcagccgc gcggaatggc cgtaactatt 300
tctgtcaaat gtgaaaagat atccacgctg tcgtgtgaga acaagattat tagtttcaaa 360
gagatgaatc cgccggataa tatcaaggac acgaagtctg atatcatatt tttccagcgc 420
agcgtgccgg ggcacgataa caagatgcaa tttgaatcat ccagctatga agggtacttt 480
cttgcatgcg agaaggaacg cgatctcttt aaacttattt taaagaaaga ggacgagcta 540
ggcgatcgca gcattatgtt cactgtccaa aatgaagact agtggaggat ataataccag 600
gaataaataa aatccatggg ccatcatcat catcatcatg gcatactcaa actttgtcct 660
cgtgaagaat tcctgagact gtgtaaaaaa aatcatgatg agatctatcc aataaaaaag 720
agagaggacc gcagacgcct ggctctcatc atatgcaata caaagtttga tcacctgcct 780
gcaaggaatg gggctcacta tgacatcgtg gggatgaaaa ggctgcttca aggcctgggc 840
tacactgtgg ttgacgaaaa gaatctcaca gccagggata tggagtcagt gctgagggca 900
tttgctgcca gaccagagca caagtcctct gacagcacgt tcttggtact catgtctcat 960
ggcatcctag agggaatctg cggaactgcg cataaaaaga aaaaaccgga tgtgctgctt 1020
tatgacacca tcttccagat attcaacaac cgcaactgcc tcagtctaaa ggacaaaccc 1080
aaggtcatca ttgtccaggc ctgcagaggt gaaaaacatg gggaactctg ggtcagagac 1140
tctccagcat ccttggcagt catctcttca cagtcatctg agaacctgga ggcagattct 1200
gtttgcaaga tccacgagga gaaggacttc attgctttct gttcttcaac accacataac 1260
gtgtcctgga gagaccgcac aaggggctcc atcttcatta cggaactcat cacatgcttc 1320
cagaaatatt cttgctgctg ccacctaatg gaaatatttc ggaaggtaca gaaatcattt 1380
gaagttccac aggctaaagc ccagatgccc accatagaac gagcaacctt gacaagagat 1440
ttctacctct ttcctggcaa ttga 1464
<210>10
<211>233
<212>PRT
<213>人(Homo sapien)
<400>10
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Tyr Phe Gly Lys
65 70 75 80
Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu
85 90 95
Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser
100 105 110
Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr
115 120 125
Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys
130 135 140
Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys
145 150 155 160
Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile
165 170 175
Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu
180 185 190
Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp
195 200 205
Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser
210 215 220
Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
225 230
<210>11
<211>702
<212>DNA
<213>人(Homo sapi en)
<400>11
atgcagatct tcgtcaagac gttaaccggt aaaaccataa ctctagaagt tgaatcttcc 60
gataccatcg acaacgttaa gtcgaaaatt caagacaagg aaggcattcc acctgatcaa 120
caaagattga tctttgccgg taagcagctc gaagacggta gaacgctgtc tgattacaac 180
attcagaagg agtcgacctt acatcttgtc ttaagactaa gaggagggta ctttggcaag 240
cttgagagca aactatcggt cattcgtaat ttaaatgacc aggtcctatt tatcgaccaa 300
gggaatcgtc cactattcga ggacatgaca gacagtgact gccgagacaa tgcgccgcga 360
accattttca ttatatctat gtacaaggat tctcagccgc gcggaatggc cgtaactatt 420
tctgtcaaat gtgaaaagat atccacgctg tcgtgtgaga acaagattat tagtttcaaa 480
gagatgaatc cgccggataa tatcaaggac acgaagtctg atatcatatt tttccagcgc 540
agcgtgccgg ggcacgataa caagatgcaa tttgaatcat ccagctatga agggtacttt 600
cttgcatgcg agaaggaacg cgatctcttt aaacttattt taaagaaaga ggacgagcta 660
ggcgatcgca gcattatgtt cactgtccaa aatgaagact ag 702
<210>12
<211>3419
<212>DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>12
agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 600
ttcccctcta gaccacacct taaggaggat ataacatatg cagatcttcg tcaagacgtt 120
aaccggtaaa accataactc tagaagttga atcttccgat accatcgaca acgttaagtc 180
gaaaattcaa gacaaggaag gcattccacc tgatcaacaa agattgatct ttgccggtaa 240
gcagctcgag gacggtagaa cgctgtctga ttacaacatt cagaaggagt cgaccttaca 300
tcttgtctta agactaagag gagggtactt tggcaagctt gagagcaaac tatcggtcat 360
tcgtaattta aatgaccagg tcctatttat cgaccaaggg aatcgtccac tattcgagga 420
catgacagac agtgactgcc gagacaatgc gccgcgaacc attttcatta tatctatgta 480
caaggattct cagccgcgcg gaatggccgt aactatttct gtcaaatgtg aaaagatatc 540
cacgctgtcg tgtgagaaca agattattag tttcaaagag atgaatccgc cggataatat 600
caaggacacg aagtctgata tcatattttt ccagcgcagc gtgccggggc acgataacaa 660
gatgcaattt gaatcatcca gctatgaagg gtactttctt gcatgcgaga aggaacgcga 720
tctctttaaa cttattttaa agaaagagga cgagctaggc gatcgcagca ttatgttcac 780
tgtccaaaat gaagactagt ggaggatata ataccaggaa taaataaaat ccatgggcca 840
tcatcatcat catcatggca tggatgaaag caagataaac agtttattac aatttttatt 900
tggttcccga caggattttt tgagaaattt taaaacttgg agtaacaaca ataacaatct 960
atcgatttat ttattaattt ttggcatagt agtatttttt tataaaaaac cagaccatct 1020
aaactacatt gttgagagcg ttagtgaaat gacaacaaac ttcagaaata ataatagcct 1080
tagccgttgg ttgcccagaa gtaagtttac ccacttagac gaagagatct tgaaaagagg 1140
tggtttcatt gctggtttag ttaatgatgg taacacttgt tttatgaact ctgttttgca 1200
atcattggca tcatccagag aattaatgga gttcttggac aataatgtca taaggaccta 1260
tgaggagata gaacaaaatg aacacaatga agaaggaaac gggcaagaat ctgctcaaga 1320
tgaagccact cataagaaaa acactcgtaa gggtggcaaa gtttatggta agcataagaa 1380
gaaattgaat aggaagtcaa gttcgaaaga agacgaagaa aagagccagg agccagatat 1440
cactttcagt gtcgccttaa gggatctact ttctgcctta aatgcgaagt attatcggga 1500
taaaccctat ttcaaaacca atagtttatt gaaagcaatg tccaaatctc caagaaaaaa 1560
tattcttctt ggctacgacc aagaggacgc gcaagaattc ttccagaaca tactagccga 1620
gttggaaagt aacgttaaat cattgaatac tgaaaaacta gataccactc cagttgcgaa 1680
atcagaatta cccgatgatg ctttagtagg tcaacttaac cttggtgaag ttggcactgt 1740
ttacattcca actgaacaga ttgatcctaa ctctatacta catgacaagt ccattcaaaa 1800
tttcacacct ttcaaactaa tgactccttt agatggtatc acggcagaaa gaattggttg 1860
tttacagtgt ggtgagaacg gtggcataag atattccgta ttttcgggat taagcttaaa 1920
tttaccgaac gagaatattg gttccacttt aaaattatct cagttattga gcgactggag 1980
taaacctgaa atcatcgaag tcgtagaatg taaccgttgt gccctcacag cagcgcactc 2040
tcatttattt ggtcagttga aagaatttga aaaaaaacct gagggttcga tcccagaaaa 2100
gccaattaac gctgtaaaag atagggtcca tcaaatcgaa gaagttcttg ccaaaccagt 2160
tattgacgat gaagattata agaagttgca tacagcaaat atggtacgta aatgctctaa 2220
atctaagcag attttaatat caagacctcc accattatta tccattcata tcaacagatc 2280
cgtatttgat ccaagaacgt acatgattag aaaaaataac tcgaaagtat tgtttaagtc 2340
aacgttgaat cttgcccctt ggtgttgtga tattaatgaa atcaatttgg atgctcgttt 2400
gccaatgtca aaaaaggaaa aagctgcgca acaagattca agtgaagatg aaaacattgg 2460
cggtgaatac tatacgaaat tacatgaacg cttcgagcag gaatttgaag acagcgagga 2520
agaaaaagaa tacgatgacg cagaggggaa ctatgcgtct cattacaatc ataccaagga 2580
tatcagtaac tatgatcccc taaacggtga agtcgatggc gtgacatccg atgatgaaga 2640
tgagtacatt gaagaaaccg atgctttagg gaatacaatc aaaaaaagga tcatagaaca 2700
ttctgatgtt gaaaacgaga atgtaaaaga taatgaagaa ctgcaagaaa tcgacaatgt 2760
gagccttgac gaaccaaaga tcaatgttga agatcaacta gaaacatcat ctgatgagga 2820
agatgttata ccagctccac ctatcaatta tgctaggtca ttttccacag ttccagccac 2880
tccattgaca tattcattgc gctctgtcat tgttcactac ggtacccata attatggtca 2940
ttacattgca tttagaaaat acaggggttg ttggtggaga atatctgatg agactgtgta 3000
cgttgtggac gaagctgaag tcctttcaac acccggtgta tttatgttat tttacgaata 3060
tgactttgat gaagaaactg ggaagatgaa ggatgatttg gaagctattc agagtaataa 3120
tgaagaagat gatgaaaaag agcaggagca aaaaggagtc caggagccaa aggaaagcca 3180
agagcaagga gaaggtgaag agcaagagga aggtcaagag cagatgaagt tcgagagaac 3240
agaagaccat agagatattt ctggtaaaga tgtaaactaa gctcgagcac caccaccacc 3300
accactgaga tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg 3360
ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttg 3419
Claims (8)
1.一种自前体IL-18多肽制备活性IL-18多肽的方法,包括:
(i)将caspase 5与前体IL-18多肽接触;和
(ii)纯化该活性IL-18多肽。
2.权利要求1的方法,其中前体IL-18多肽是人IL-18多肽。
3.一种制备活性人IL-18多肽的方法,包括:
(i)将caspase 5与人前体IL-18多肽接触以将所述前体多肽转化成活性人IL-18多肽,所述前体IL-18多肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分,所述部分保留了SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第36位天冬氨酸残基和第37位酪氨酸残基作为N-末端序列;和
(ii)纯化该活性人IL-18多肽。
4.权利要求3的方法,其中活性人IL-18多肽是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。
5.一种自前体IL-18多肽制备活性IL-18多肽的方法,包括:
(i)通过双顺反子使caspase 5与前体IL-18多肽共表达,和
(ii)纯化该活性IL-18多肽。
6.权利要求5的方法,其中前体IL-18多肽是人前体IL-18多肽。
7.权利要求6的方法,其中活性人IL-18多肽是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。
8.一种自人前体IL-18多肽制备活性人IL-18多肽的方法,包括:
(i)通过双顺反子使caspase 5与人前体IL-18多肽共表达,所述caspase 5具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列;和
(ii)纯化该活性IL-18多肽。
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