CN100366186C - 食品风味增强用原材料的制造方法 - Google Patents

Abstract

本说明书公开了一种半胱氨酸含量高的食品原材料制造方法，其特征是，γ-谷氨酰半胱氨酸在固体成分中所占的比例大于1%(重量)的酵母浸出物、酵母菌体等食品原材料，在无糖但有水存在下，在pH1～7，保持在50～120℃，或者，在pH3～9，15～70℃，使其与γ-谷氨酰基肽水解酶进行作用。另外，还公开了一种，在γ-谷氨酰基肽水解酶作用后，通过再添加还原糖，则可解决焦臭味浓等问题，制造出使饮食品中牛肉味及木鱼味等风味得到增强的食品风味增强用的原材料的制造方法。

Description

食品风味增强用原材料的制造方法

本发明申请是申请号为CN99812396.X(国际申请日为1999年11月25日)的进入国家阶段的PCT申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及以固体成分中以1％(重量％)以上的高含量含有γ-谷氨酰半胱氨酸(在本说明书中，除非另有说明，γ-谷氨酰半胱氨酸包含其氧化型的二硫化物)的酵母浸出物及酵母菌体等的食品原材料作为原料，将其在pH酸性乃至中性区域加热，或者，通过γ-谷氨酰肽水解酶作用于这些原料，可容易地制得半胱氨酸(在本说明书中，除非另有说明，半胱氨酸包含其氧化型二硫化物即胱氨酸)含量高的食品原材料的方法。

本发明还涉及以γ-谷氨酰半胱氨酸或以固体成分中以1％(重量％)以上的高含量含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母浸出物以及酵母菌体等的食品原材料作为原料，在pH酸性乃至中性区域将其加热，或者，通过γ-谷氨酰基肽水解酶作用于这些原料，然后，添加还原糖，由此可容易地制得食品的风味增强用原材料的方法，以及，通过加热用这些方法制得的食品的风味增强用原材料，可容易地制得食品的风味增强剂的方法。

本发明另外还涉及以高含量含有γ-谷氨酰半胱氨酸的用于食品用酵母菌体本身，进而，酵母浸出物本身，或者它们的制造方法。

背景技术

半胱氨酸，其目的是用于改善食品的风味等。关于半胱氨酸的制法，已知有蛋白分解法及半合成法等，而且目前主要采用的方法也正是蛋白分解法和半合成法。

把半胱氨酸用于上述目的时，迫切要求以高含量含有它的食品原材料，然而，以高含量含有半胱氨酸的食品原材料，早先几乎是不知道的。

例如，作为γ-谷氨酰半胱氨酸在酵母菌体内蓄积的例子，在基因工程学方面，使γ-谷氨酰半胱氨酸的合成酶过量表达，有的报告称，每单位菌体干重最高可蓄积2％的γ-谷氨酰半胱氨酸(大竹，バィサィェンスとィンダストリ-，50卷，10号，989～994页，1992年)。然而，该结果最终只能在基因工程学实验室酵母中作为模型，是以在自然界中通常不可能得到的形式制成的γ-谷氨酰半胱氨酸的高蓄积酵母。另外，在该报告中，用该酵母作为食品的原材料的想法并未记载。

另外，当把γ-谷氨酰半胱氨酸或含γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母浸出物等添加到食品中时，已知可使浓味增强。另外，γ-谷氨酰半胱氨酸或含γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母浸出物等与糖共存时，加热而得到的食品原材料，可有效增强食品的风味，例如，从特开平4-66069号公报、特开平4-91762号公报等早已知道这一点。

详细说明如下，按照前者(特开平4-66068号公报)，“为了得到更好的肉味调味料，进行悉心的研究结果发现，在含2～20％(重量)(固体物浓度)的谷胱甘肽、半胱氨酸或谷氨酰半胱氨酸等含硫化合物的酵母浸出物中，添加糖类，以及根据需要添加氨基酸类，通过在无脂肪存在下进行加热，将消除来自上述酵母的令人不愉快的臭味及不愉快的味道，可以得到质量好、稳定性优良的烧烤肉味的调味料”(参照该公报的“用于解决问题手段”)，基于这种发现，“往含一定量的谷胱甘肽、半胱氨酸，或者谷氨酰基半胱氨酸等含硫化合物(单位浸出物含2～20％重量)的酵母浸出物中，添加糖类，并且根据需要添加氨基酸，在无脂肪存在的情况下，于温度70～180℃，加热10～180分钟，而完成调味料的制造法”(该公报的“权利要求范围”)。

另外，按照后者的方法(特开平4-91762号公报)公开了，“已有的肉味调料有各种各样，然而，人们希望有着一种与天然的肉烧烤香味不同，而又具有与天然的烧烤肉香味很相似的质量的调味剂。”(该公报“发明拟解决的问题”)、“以解决这些缺点作为目的，对涉及各种氨基酸和糖类的加热焦化香味进行研究的结果发现，往γ-谷氨酰基半胱氨中添加糖类后，溶于水中，于温度70～180℃，加热10～180分钟，进行反应，制成原来没有的，具有良好烧烤肉香的味组合物，完成本发明。”(该公报的“用于解决问题的手段”)，“香味组合物的制造法，其特征是，往γ-谷氨酰半胱氨酸中添加糖类，于温度70～180℃，加热10～180分钟的制造方法”。

但是，用这些香味调味料，虽然肉香味增加，但与此同时，苔藓臭味增强，这些问题也被指出。

发明的公开

在上述原有技术的背景下，本发明的目的是提供一种半胱氨酸含量高的食品原材料。

在上述原有技术的背景下，本发明的另一个目的是提供一种消除上述强烈苔藓臭味等的上述问题的，在饮食品中使牛肉味及木鱼味等风味增强的食品风味增强用的原材料以及风味增强剂。

在上述原有技术的背景下，其次，本发明的再一个目的是提供一种以适当的高含量含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食用酵母菌体，乃至酵母浸出物作为上述食品原材料、食品风味增强用的原材料或风味增强剂的制造原料。

本发明人为了达到上述目的而悉心探讨的结果发现，γ-谷氨酰半胱氨酸，将其在pH1～7、50～120℃进行加热时，用3～300分钟分解成半胱氨酸和PCA(吡咯烷酮羧酸)，所以，可以整体高收率地得到半胱氨酸；另外，当采用γ-谷氨酰肽水解酶使γ-谷氨酰半胱氨酸水解时，由于γ-谷氨酰半胱氨酸分解成半胱氨酸和谷氨酸，所以，半胱氨酸作为整体可高收率地得到；其次，γ-谷氨酰半胱氨酸含量在1％(重量)以上的酵母菌体或酵母浸出物，在糖不存在的条件下，以含水状态进行同样加热，或者，使γ-谷氨酰肽水解酶作用于它，可以得到半胱氨酸含量高的酵母浸出物，基于这些发现，完成本发明的第一发明。

也就是说，本发明涉及一种半胱氨酸含量高的食品原材料的制造方法，以及作为该法原料的食品原材料的酵母浸出物或酵母菌体，其特征是，把γ-谷氨酰半胱氨酸在固体成分中所占的比例达到1％(重量)以上的食品原材料，在不存在糖而存在水的条件下，且在pH1～7下保持在50～120℃，或者，在pH3～9的条件下，于15～70℃的温度下使γ谷氨酰基肽水解酶作用于它。

本发明人为了达到上述目的而进一步悉心研究的结果发现，γ-谷氨酰半胱氨酸或γ-谷氨酰半胱氨酸在固体成分中所占的比例为1％(重量)以上的高含量的酵母菌体或酵母浸出物，在无还原糖存在下，在酸性乃至中性的pH区域，于50～120℃加热3～300分钟，或者，在pH3～9、15～70℃，在γ-谷氨酰基肽水解酶作用后，再添加还原糖，所得到的原材料可有效增强食品的风味；以及，当加热这些原材料时，制成优良的食品风味增强剂，基于这样的发现，完成本发明的第二发明。

也就是说，本发明涉及一种食品风味增强用的原材料的制造方法，其特征是，把γ-谷氨酰半胱氨酸，或γ-谷氨酰半胱氨酸在固体成分中所占的比例为1％(重量)以上的食品原材料，在无还原糖但有水存在下，在pH1～7，于50～120℃保持3～300分钟，或者，在pH3～9、15～70℃，与γ-谷氨酰肽水解酶作用后，添加占上述γ-谷氨酰半胱氨酸的比例达到1～10倍(摩尔)的还原糖；以及，涉及一种食品风味增强剂的制造方法，其特征是，把这样得到的食品风味增强用的原材料，在50～180℃保持10～300分钟。

本发明人为了达到上述目的而进一步悉心研究的结果发现，在作为食用酵母代表的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，制出单位干燥菌体超过1％的γ-谷氨酰半胱氨酸高含量的酵母，以该酵母菌体制造酵母浸出物的方法(在该浸出物中，含有高浓度的γ-谷氨酰半胱氨酸)，并且，通过加热处理该酵母浸出物，可以成功地得到半胱氨酸含量比加热前高的酵母浸出物，基于这一点完成本发明的第三发明。也就是说，本发明涉及的食用酵母菌体或酵母浸出物，其特征是，γ-谷氨酰半胱氨酸在固体成分中所占的比例达到在1％(重量)以上的高含量。

因此，上述本发明的第一、第二及第三发明，从早先的说明以及从上述说明可知，它们是由与单一的一般的发明概念相关连的一群发明所构成的。

下面详细地说明本发明。

首先，对上述第一发明进行说明。

在本发明的制造法中，作为原料的食品原材料，是γ-谷氨酰半胱氨酸占固体成分1％(重量)以上的高含量的食品原材料。γ-谷氨酰半胱氨酸的含量1％以下的食品原材料，所得到的风味差，工业上无法实用，是不理想的。

作为这样的食品原材料，例如，可以举出，γ-谷氨酰半胱氨酸在固体成分中占的比例1％(重量)以上的酵母菌体及酵母浸出物。因此，这种γ-谷氨酰半胱氨酸高含量的酵母菌体，例如，可以用下述实施例7中记载的方法，或者，将用突然变异法使γ-谷氨酰半胱氨酸达到高含量的酵母从自然界分离出来，或者通过变异处理得到。另外，酵母浸出物是从这种酵母菌体萃取出来，或通过自己消化，或在γ-谷氨酰半胱氨酸的含量达不到上述规定量的酵母浸出物中，通过补加γ-谷氨酰半胱氨酸来制造。

按照本发明，这样的食品原材料在水存在下，在酸性乃至中性区域，即在pH1～7，保持在50～120℃进行加热。水的存在量，从操作观点来决定，例如，对1份(重量)(换算成干重)食品原材料，可以用1～100份(重量)。当pH在上述范围外时，半胱氨酸的生成量变少，是不理想的。还有，pH的调节，当然可以用食品所允许的盐酸等酸以及氢氧化钠等碱来进行。加热温度，如过低，γ-谷氨酰半胱氨酸的分解反应进行缓慢，反之，如温度过高，已经生成后的半胱氨酸由于副反应而减少，是不理想的。当在上述条件下进行食品原材料的加热处理时，在3～300分钟，半胱氨酸大量生成，蓄积，从而得到半胱氨酸含量高的食品原材料。加热时间，如果过短，则反应未完成，反之，如果过长，同样是已经生成后的半胱氨酸由于副反应而减少，是不理想的。

γ-谷氨酰半胱氨酸分解反应，是在不添加糖，特别是不添加葡萄糖、果糖、木糖和麦芽糖等还原糖，在它们不存在的情况下进行是重要的。这就可以防止所生成的半胱氨酸与糖，特别是与这些还原糖反应产生焦臭及褐变反应。

另外，还可以举出用酶与γ-谷氨酰半胱氨酸作用生成半胱氨酸的方法。也就是说，把可以水解γ-谷氨酰半胱氨酸肽键的酶(γ-谷氨酰基肽水解酶)，在pH3～9、15～70℃作用于上述食品原材料。水的存在量，从操作观点来决定，例如，对每1份(重量)(换算成干重)的食品原材料，可达到1～100份(重量)。如pH和温度处于上述范围以外，γ-谷氨酰基肽水解酶的活性差，是不理想的。在上述条件下，当用酶处理食品原材料时，在1～300分钟之间，半胱氨酸大量生成、蓄积，得到半胱氨酸含量高的食品原材料。

γ-谷氨酰基肽水解酶存在多种，特别是，作为实施本发明有用的，可以举出γ-谷氨酰转移酶、γ-谷氨酰环化转移酶以及谷氨酰胺酶等。

这样制成的半胱氨酸含量高的食品原材料，以原有的液态，或加以浓缩制成糊状，或干燥成粉状，或其他的颗粒状等以便于流通。

下面对上述第二发明加以说明。

第一，对本发明的食品风味增强用的原材料的制造方法加以说明。例如，如上所述，在pH酸性乃至中性区域，把γ-谷氨酰半胱氨酸，或γ-谷氨酰半胱氨酸含量1％(重量)以上的酵母菌体或酵母浸出物，在不存在还原糖的条件下加热，或者，使γ-谷氨酰基肽水解酶作用于它们，继而加糖来制造。

在这样的制造法中，作为原料的食品原材料，与先前本发明第一发明的说明同样，是γ-谷氨酰半胱氨酸在固体成分中所占的比例1％(重量)以上的高含量的食品原材料。如γ-谷氨酰半胱氨酸的含量1％以下，则所得到的风味差，工业上不实用，是不理想的。

作为这样的原材料，例如，可以举出γ-谷氨酰半胱氨酸在固体成分中所占的比例1％(重量)以上的酵母菌体及酵母浸出物。因此，这种γ-谷氨酰半胱氨酸高含量的酵母菌体，例如，可以采用下面的实施例7中记载的基因工程学方法制得。另外，酵母浸出物，可以从这样的酵母菌体萃出或通过自己消化，或者，通过增补γ-谷氨酰半胱氨酸来配制。这也与本发明第一发明先前的说明同样。

按照本发明，首先，把γ-谷氨酰半胱氨酸高含量的上述食品原材料，在无还原糖存在而存在水的条件下，在酸性乃至中性区域，即在pH1～7，于50～120℃保持3～300分钟进行加热。这样的pH、温度及时间条件，其本身与本发明第一发明涉及的上述说明同样。

水的存在量，从操作观点来决定，例如，对γ-谷氨酰半胱氨酸，或其高含量的食品原材料，其1份量量(换算成干重)可以达到1～100份(重量)。

因此，本发明人另外还发现，把γ-谷氨酰半胱氨酸在pH1～7，于50～120℃，例如，加热3～300分钟时，由于γ-谷氨酰半胱氨酸分解成半胱氨酸和PCA(吡咯烷酮羧酸)，所以，半胱氨酸作为整体可以高收率得到，其次，把γ-谷氨酰半胱氨酸含量1％(重量％)以上的酵母菌体或酵母浸出物，在无还原糖存在下，在含水状态下同样加热时，可以得到半胱氨酸含量高的酵母浸出物，然而，本发明涉及的食用组合物的风味增强作用，可通过从γ-谷氨酰半胱氨酸这样生成的半胱氨酸来实现。

然而，pH在上述范围以外时，半胱氨酸的生成量减少，是不理想的。还有，pH的调节，不言而喻，要采用作为食品所允许的盐酸等酸以及氢氧化钠等碱来进行。这点与本发明的第一发明涉及的上述说明同样。

加热温度，当温度过低时，γ-谷氨酰半胱氨酸的分解反应进行缓慢，反之，当温度过高时，已经生成的半胱氨酸由于发生副反应而减少，是不理想的。加热时间，当过短时，反应未完成，反之，当过长时，已经生成的半胱氨酸同样由于发生副反应而减少，是不理想的。这也与本发明的第一发明涉及的上述说明同样。

按照本发明人的发现，如同前面说明的那样，当把γ-谷氨酰半胱氨酸在pH1～7的酸性乃至中性区域，于特定的温度下加热特定的时间时，γ-谷氨酰半胱氨酸分解成半胱氨酸和PCA(吡咯烷酮羧酸)，最终可高收率得到半胱氨酸，另外，γ-谷氨酰半胱氨酸的含量1％(重量％)以上的酵母菌体或酵母浸出物，在无还原糖存在下，在含水状态下同样进行加热时，可以得到半胱氨酸高含量的酵母浸出物。

γ-谷氨酰半胱氨酸的这种分解反应，例如，不添加葡萄糖、果糖、木糖和麦芽糖等还原糖，在它们不存在的条件下进行是重要的。这样可以防止所生成的半胱氨酸，与这些还原糖反应，发生焦臭及褐变反应。这点与本发明的第一发明涉及的上述说明同样。

另外，还可以举出，利用酶从γ-谷氨酰半胱氨酸生成半胱氨酸的方法。也就是说，把水解γ-谷氨酰基的肽键的酶(γ-谷氨酰基肽水解酶)，于pH3～9、15～70℃的条件下与γ-谷氨酰半胱氨酸或上述食品原材料作用1～300分钟。水的存在量，以操作观点来决定，例如，对食品原材料每1份(重量)(换算成干重)达到1～100(重量)。pH及温度，如在上述范围外，则γ-谷氨酰肽水解酶活性差，是不理想的。这点与本发明的第一发明涉及的上述说明相同。

γ-谷氨酰肽水解酶存在多种，然而，作为实施本发明特别有用的，可以举出γ-谷氨酰转移酶、γ-谷氨酰环化转移酶以及谷氨酰胺酶等。

这样制成的半胱氨酸高含量的加热处理生成物，往其中添加上述还原糖，其添加比例为上述γ-谷氨酰半胱氨酸的1～10倍(摩尔)，由此，可以得到本发明的食品风味增强用的原材料。

作为还原糖，可以举出葡萄糖、果糖、木糖和麦芽糖等，这些糖廉价易得，并且从可作为食品使用考虑是理想的。

还原糖的添加量，如上所述，对原料γ-谷氨酰半胱氨酸，或含其的酵母菌体，或者，酵母浸出物等天然食品原材料中，含有的γ-谷氨酰半胱氨酸1摩尔，可添加1～10摩尔。当添加量低于上述范围时，效果差，另一方面，添加量大时，甜味增强，是不理想的。这样制造的风味增强用的原材料，以其原来的液态，或浓缩成糊状，或干燥成粉末状，或制成其他的颗粒态等适于流通的状态。本发明的风味增强用原材料，当在以后的食品加工的场合使用时，在进行加工处理的加热工序，其中所含的半胱氨酸和还原糖反应，呈现风味增强的效果。

其次，对本发明的食品风味增强剂的制造方法加以说明。例如，把上述本发明的风味增强用的原材料，在适当的条件下，通过加热处理可以得到。

在进行加热处理时，为了得到风味增强效果，半胱氨酸浓度0.1％(重量)以上，理想的要根据需要浓缩达到0.6％(重量)以上，然后进行加热。加热条件要在50～180℃、10～300分钟的范围内不发生焦臭及褐变反应的范围内进行。这样的加热条件，例如，包括在50～60℃的低温及180～300分钟的长时间，以及在90～100℃(沸点前后)的高温和30～120分钟的短时间的加热条件。

例如，这样制成的本发明的食品风味增强剂，与先前的风味增强用的原材料同样，以原有的液态，或浓缩成糊状，或干燥成粉状及其他的颗粒状等适于流通的形态。

最后，对上述第三发明进行说明。

γ-谷氨酰基半脱氨酸高含量的本发明食用酵母(菌体)，按下法制成。也就是说，首先，把谷胱甘肽合成酶基因GSH2破坏，制成没有谷胱甘肽合成酶功能的酵母，然后，用普通方法进行培养。

因此，以往的报告(Chris M.Grant，Molccular Biology of theCell，8卷，1699～1707，9月，1997年)认为，GSH2基因不是生育所必须的基因。对不是生育必须的基因的破坏，是人们已知的即使1个基因的自然突然变异也容易产生的现象，所以，本发明后面的实施例7可以说是自然状态下产生的结果之一例。

另外，在本发明中，从制成的酵母制造实际的酵母浸出物，可以明确表明其是γ-谷氨酰半胱氨酸，乃至半脱氨酸高含量的食品原材料。

附图的简单说明

图1表示在pH3，还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的分解所生成的半胱氨酸量随时间的变化(检查例1)。

图2表示在pH5，还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的分解所生成的半胱氨酸量随时间的变化(检查例1)。

图3表示在pH7，还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的分解所生成的半胱氨酸随时间的变化(检查例1)。

图4表示在pH5，用谷氨酰胺酶的还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的分解生成的半胱氨酸量对谷氨酰胺酶量的依赖性(检查例2)。

图5表示在pH7，用谷氨酰胺酶的还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的分解生成的半胱氨酸量对谷氨酰胺酶量的依赖性(检查例2)。

图6表示在pH9，用谷氨酰胺酶的还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的分解生成的半胱氨酸量对谷氨酰胺酶量的依赖性(检查例2)。

图7表示H4ΔGSH2菌株体中的含硫化合物量(实施例7)。

图8表示H4ΔGSH2酵母浸出物中含硫化合物量的变化(实施例7)。

实施本发明的最佳方案

下面通过检查例及实施例更详细地说明本发明。

首先举出本发明第一发明的检查例及实施例。

检查例1(采用加热，从γ-谷氨酰半胱氨酸生成半胱氨酸)

对pH不同的(即pH3、5及7的)还原型γ-谷氨酰半胱氨酸1mmol浓度的水溶液，在98℃加热时生成的半胱氨酸量随时间的变化进行调查。结果示于下列图1～3。图中，PCA表示吡咯烷酮羧酸，γ-Glu-Cys表示还原型γ-谷氨酰半胱氨酸，而Total Cysteine表示半胱氨酸。

由图1～3可知，加热，可从γ-谷氨酰半胱氨酸高收率地得到半胱氨酸。

检查例2(用酶，从γ-谷氨酰半胱氨酸生成半胱氨酸)

往pH不同的(即pH5、7及9的)还原型γ-谷氨酰半胱氨酸1mmol浓度的水溶液中，添加各种浓度的“谷氨酰胺酶大和”(大和化成社制造的谷氨酰胺酶，比活性为3.0mM/min/mg)，对37℃反应10分钟时生成的半胱氨酸量进行调查(γ-谷氨酰半胱氨酸的水解酶量依赖性)。结果示于下列图4～6中。图中，γ-Glu-Cys表示还原型γ-谷氨酰半胱氨酸，而Total Cysteine表示半胱氨酸。

从图4～6可知，用谷氨酰胺酶水解γ-谷氨酰半胱氨酸，可同时等摩尔得到半胱氨酸(高收率)。

实施例1

往含4.5％γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母浸出物粉中加水，用盐酸调节pH到5，制成浓度2％的水溶液，将其于98℃加热180分钟后，冷冻干燥，得到含2.0％半胱氨酸的酵母浸出物粉。

因此，该酵母浸出物粉用于调味制造时，可以得到具有良好的烧烤肉香味的调味料。

实施例2

往含4.5％γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母浸出物粉中加水，用1N NaOH调节pH至7，制成浓度2％的水溶液。往该溶液添加谷氨酰胺酶(与在检查例2中使用的相同)，使浓度达到1mg/ml，于37℃孵化10分钟后，冷冻干燥，得到含2.5％半胱氨酸的酵母浸出物粉。

因此，把该酵母浸出物粉用于调味料制造时，结果可以得到与实施例1同样的具有良好的烧烤肉香味的调味料。

下面，举出本发明第二发明的实施例及检查例。

实施例3(γ-谷氨酰半胱氨酸)

用1N NaOH把pH调到5的γ-谷氨酰半胱氨酸4％的水溶液，于98℃加热3小时。加热后，添加葡萄糖，使对溶液达到4％(每1摩尔γ-谷氨酰半胱氨酸，相当于1.4摩尔)(风味增强用的原材料)。将其于60℃加热180分钟后，冷冻干燥(风味增强剂)。

用这样得到的冷冻干燥物(本发明的食品风味增强剂)，在从市场购得的牛肉清汤羹汁体系进行官能评价。添加本冷冻干燥物，使对市场购得的牛肉清汤羹汁固体成分达到0.05％，与未添加的进行对照，用15名品尝员，对各评价项目，用选择比较理想的或比较强的样品的方法进行评价。

结果示于下列表1。表中的人数是作为选择味道比较理想的或比较浓的样品的品尝员人数。

第1表：评价结果

0.05％添加	本发明	对照
			肉味浓肉味较浓风味整体浓风味整体理想综合评价	15人14人13人12人13人	0人1人2人3人2人

实施例4(γ谷氨酰半胱氨酸)

往用1N NaOH调节pH至7的γ-谷氨酰半胱氨酸的4％水溶液中添加谷氨酰胺酶，使达到1mg/ml，于37℃孵化2小时。反应后，添加葡萄糖，使对溶液达到4％(每1摩尔γ-谷氨酰半胱氨酸，相当于1.4摩尔)(风味增强用的原材料)。将其于60℃加热180分钟后，进行冷冻干燥(风味增强剂)。

用这样得到的冷冻干燥物(本发明的食品风味增强剂)，在市场购得的牛肉清汤羹汁体系内进行官能评价。添加本冷冻干燥物，使在市场购得的牛肉清汤羹汁固体成分中达到0.05％，与未添加的进行对照，用15名品尝员，对各评价项目，用选择比较好的或比较强的样品方法进行评价。

结果示于下表2。表中的人数是作为选择味道比较理想的或比较浓的样品的品尝员人数。

第2表

0.05％添加	本发明	对照
			肉味浓肉味理想风味整体浓风味整体理想综合评价	15人15人12人14人13人	0人0人3人1人2人

实施例5(酵母浸出物)

把含4.5％γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母浸出物，用1N NaOH调节pH至5的20％水溶液(在该水溶液中，γ-谷氨酰半胱氨酸浓度为0.9％)，于98℃加热3小时。加热后，添加葡萄糖，使对溶液达到1.8％(对γ-谷氨酰半脱氨酸1摩尔，相当于2.8摩尔)(风味增强用原材料)。将其与实施例3同样进行加热，浓缩后，进行喷雾干燥(风味增强剂)。

用本干燥物(本发明的食品风味增强剂)，在(a)市场购得的牛肉清汤羹汁、(b)咖喱、(c)清汤汁的各种体系中，进行官能评价。结果示于下表3。还有，本干燥物，对固体成分按表中所示的量进行添加，与未添加的进行对照，用15名品尝员，与实施例3同样进行评价。

第3表：评价结果

(a)牛肉清汤羹汁

0.05％添加	本发明	对照
			肉味浓肉味理想风味整体浓风味整体理想综合评价	14人13人12人13人13人	1人2人3人2人2人

(b)咖喱

0.1％添加	本发明	对照
			肉味浓肉味理想风味整体浓风味整体理想综合评价	13人12人13人12人13人	2人3人2人3人2人

(c)清汤汁

0.1％添加	本发明	对照
			佐料风味浓佐料风味理想风味整体浓风味整体理想综合评价	1514141314	01121

实施例6(酵母浸出物)

往含4.5％的γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母浸出物经1N NaOH调节pH至7的20％水溶液(该水溶液中的γ-谷氨酰半胱氨酸的浓度，0.9％)中，添加谷氨酰胺酶，使达到1mg/ml，于37℃孵化2小时。反应后，添加葡萄糖，使对溶液达到1.8％(对γ-谷氨酰半胱氨酸1摩尔，相当于2.8摩尔)(风味增强用的原材料)。将其与实施例3同样操作，加热，浓缩后，进行喷雾(风味增强剂)。

用本干燥物(本发明的食品风味增强剂)在(a)市场购得的牛肉清汤羹汁、(b)加喱及(c)清汤汁的各种体系中进行官能评价。结果示于下表4。还有，本干燥物按表中所示的量对固体成分添加，与未添加的进行对照，用15名品尝员，与实施例3同样进行评价。

第4表：评价结果

(a)牛肉清汤羹汁

0.05％添加	本发明	对照
			肉味浓肉味理想风味整体浓风味整体理想综合评价	12人14人12人14人14人	3人1人3人1人1人

(b)咖喱

0.1％添加	本发明	对照
			肉味浓肉味理想风味整体浓风味整体理想综合评价	12人13人12人12人13人	3人2人3人3人2人

(c)清汤汁

0.1％添加	本发明	对照
			佐料风味浓佐料风味理想风味整体浓风味整体理想综合评价	15人15人14人15人15人	0人0人1人0人0人

检查例3

往4％的γ-谷氨酰半胱氨酸溶液添加4％葡萄糖，调节至pH5后，于98℃加热3小时，立即冷冻干燥。

采用这样得到的冷冻干燥物试样(比较试样)及上述实施例3制造的本发明风味增强剂(冷冻干燥物＝本发明试样)，往市场购得的牛肉清汤羹汁试样添加，对市场购得的牛肉清汤羹汁的固体成分达到0.05％，用15名品尝员进行比较评价，按表下的评价标准评分，取其平均值。

第5表：评价结果

0.05％添加	比较试料	本发明试料
			苔藓臭味浓肉味浓风味整体浓风味整体理想	4.64.34.44.2	4.24.64.84.6

  评价标准

  评价等级：    5：非常浓，或理想

            4：浓，或理想

            3：稍浓，或稍理想

            2：稍弱，或稍不理想

            1：弱，或不理想

最后，举出本发明第三发明的实施例。

实施例7

(a)下面对单位干燥菌体(重量)含γ-谷氨酰半胱氨酸1％以上的食用酵母的育种加以说明。

在酶母的细胞内代谢时，γ-谷氨酰半胱氨酸是作为谷胱甘肽(GSH)生成的第一步中间代谢产物存在的。将γ-谷氨酰半胱氨酸转变成谷胱甘肽的酶是谷胱甘肽合酶。这里，通过使谷胱甘肽合酶失去遗传基因(下面称GSH2)的功能企图使γ-谷氨酰半胱胺酸蓄积在食用酵母细胞内。

(1)作为使GSH2失去遗传基因功能的方法，可采用一段遗传基因破坏法(one-step-gene-disruption法)。为此，首先要进行必要的GSH2遗传基因破坏盒(cassette)的制造。

详述如下，把市场购得的食用酵母(麦面酵母)啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)用通常的方法形成孢子，使所得到的孢子发芽，用PCR法，从所得株的1株(这里称作H4株)的GSH2遗传基因的上游区域至GSH2遗传基因的末端区域进行扩增。条件如下表6所示。

第6表

酵母染色体基因10X PCR缓冲剂10mM dNTPs10pmol/μl GAL11F(引物)		1μl10μl10μl1μl
			序列：5′-TATGAAGACTGTACAGTCTCC-3′(下示序列编号1的序列)
10pmol/μl GSH2R3(引物)		1μl
			序列：5′-CCGGGGAGCTCAGCTAAATGGTGTACTTCGCTAC-3′(下示序列编号2的序列)
毫当量水Taq聚合酶	76μl1μl
		合计	100μl

备考：在94℃、1分钟-94℃、30秒-60℃、40秒-74℃、1分30秒反复30次循环。

把这样放大的遗传基因片断(GSH2)，用通常的方法，使连接在质体pGEM-T Easy(Promega社制造)上，进行克隆(下面称作GSH2/pGEM)。

同样操作，作为在一段基因破坏法(one-step-gene-disruption法)中所用的选择遗传基因标记，也可以用RCR法使URA3基因放大。条件如下表7所示。

第7表

10ng/μlpYES2(Invitrogen社)10X PCR缓冲剂10mM dNTPs10pmol/μl URA3F2(引物)	1μl10μl10μl1μl
		序列：5′-ATTAACCCGGGTTGATTCGGTAATCTCCG-3′(下示序列编号3的序列)
10pmol/μl URA3R2(引物)	1μl
		序列：5′-ATTAACCCGGGGTTTTTTAGTTTTGCTGGC-3′(下示序列编号4的序列)
毫当量水Taq聚合酶	78μl1μl
		合计	100μl

备考：在94℃、1分钟-94℃、30秒-52℃、30秒-74℃、40秒反复30次循环。

接着，用控制酶MunI切断GSH2/pGEM，用通常的方法使基因末端变平滑。在该切断末端，用控制酶SmaI使基因末端变平滑的URA3基因，用通常的方法，进行再吸入使其导入(下面称作URA3-GSH2/pGEM)

以URA3-GSH2/pGEM作为模型，采用GSH2两端加以标记的遗传基因引物(上述GAL 11F、GSH2R)进行PCR，制造GSH2基因破坏盒。PCR的条件示于下列表8中。

第8表

10ng/μl URA3-GSH2/pGEM10X PCR 缓冲剂10mM dNTPs1pmol/μl GAL11F(引物)	1μl10μl10μl1μl
		序列：上面记载的(下示序列编号1的序列)
10pmol/μl GSH2R(引物)	1μl
		序列：5′-AGCTAAATGGTGTACTTCGCTAC-3′(下示序列编号5的序列)
毫当量水Taq聚合酶	76μl1μl
		合计	100μl

备注：在94℃、1分钟-94℃、30秒-56℃、30秒-74℃、1分钟反复30次循环。

(2)采用以上的方法制造的GSH2遗传基因破坏盒(下面称作URA3-GSH2)，进行食用酵母H4株的GSH2遗传基因的破坏。

首先，在3ml YPD培养基中，把H4株于30℃振荡培养24小时，进行前培养。把该培养菌体液1ml移至50ml YDP培养基中，培养达到对数增殖期后，在1M山梨糖醇中成悬浮状态，与URA3-GSH2混合，用通常的方法，进行电浊孔法处理，把GSH2基因放入破坏盒，得到变化的H4株(下面称作H4ΔGSH2)。

(b)含单位干燥菌体重1％以上的γ-谷氨酰半胱氨酸的食用酵母的培养，按下法进行。

把H4ΔGSH2株，用含1mM谷氨甘肽的3ml合成的基干培养基，于30℃振荡培养24小时，进行前培养。把该培养菌体液1ml移至含5mM半胱氨酸50ml的合成的基干培养基中，进行48小时培养，取得菌体。用蒸镏水洗涤该菌体3次后，将其于70℃进行萃取处理10分钟，萃出细胞内容物。

将其进行离心处理，测定得到的上清液(酵母浸出物萃取液)中的γ-谷氨酰半胱氨酸含量。结果得到的单位干酵母菌体中的γ-谷氨酰半胱氨酸含量示于图7。还有，干燥菌体重量，把一定培养基中所含的酵母菌体放在滤纸上，于105℃加热4小时后，测定所具有的菌体重量。

另外，把上述酵母浸出物萃取液用通常的方法进行冷冻干燥，制成粉末后，取该粉末20.2mg溶于1ml水中，溶液的pH达到5。将其一部分于98℃加热3小时，测定加热前后酵母萃取物(酵母浸出物)中的γ-谷氨酰半胱氨酸及半胱氨酸的含量。结果示于图8。

在上述图7及图8中，Total Cysteine表示半胱氨酸，γ-Glu-Cys表示还原型γ-谷氨酰半胱氨酸，而GSH表示谷胱甘肽。

还有，用本发明的制造方法得到的γ-谷氨酰半胱氨酸高含量的酵母菌体及酵母浸出物，不仅可以用作本发明涉及的食品原材料、食品风味增强用的原材料或食品风味增强剂的制造原料，而且，在其他的用途中，γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸不能不说是一种优良的原料。

工业上利用的可能性

按照本发明，可以容易地得到一种对食品风味改善等有用的半胱氨酸含量高的酵母浸出物等半胱氨酸含量高的天然食品原材料。

按照本发明，另外，可容易地得到一种焦臭味浓等问题得到解决的，在饮食品中，牛肉味及木鱼味等风味得到增强的食品风味增强用的原材料及风味增强剂。

按照本发明涉及的方法，可容易地制得γ-谷氨酰半胱氨酸高含量的酵母菌体。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>食品的风味增强用原材料的制造方法

<130>DF26PCT/B508

<150>JP 10-335385

<151>1998-11-26

<150>JP 10-336386

<151〉1998-11-26

<150>JP 11-194172

<151>1999-07-08

<150>JP 11-194209

<151>1999-07-08

<160>5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>1

tatgaagact gtaccgtctc c    21

<210>2

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<4002

ccggggagct cagctaaatg gtgtacttcg ctac    34

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>3

attaacccgg gttgattcgg taatctccg          29

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>4

attaacccgg ggttttttag ttttgctggc         30

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>5

agctaaatgg tgtacttcgc tac                23

Claims (6)

1.一种半胱氨酸含量高的食品原材料的制造方法，其特征是，在水存在下，在pH3～9、15～70℃时，使γ-谷氨酰肽水解酶作用于用固体成分中所占比例表示含有1重量％以上γ-谷氨酰半胱氨酸的食品原材料。

2.权利要求1中记载的半胱氨酸含量高的食品原材料的制造方法，其特征是，γ-谷氨酰肽水解酶是γ-谷氨酰转移酶、γ-谷氨酰环化转移酶或谷氨酰胺酶。

3.权利要求1或2中记载的半胱氨酸含量高的食品原材料的制造方法，其特征是，原料的食品原材料为酵母浸出物或酵母菌体。

4.一种食品风味增强用的原材料的制造方法，其特征是，使γ-谷氨酰肽水解酶，在水的存在下，于pH3～9、15～70℃下对γ-谷氨酰半胱氨酸或者用固体成分中所占比例表示含有γ-谷氨酰半胱氨酸1重量％以上的食品原材料作用1～300分钟后，以相对于上述γ-谷氨酰半胱氨酸的摩尔比为1～10的量添加还原糖。

5.权利要求4中记载的食品风味增强用的原材料的制造方法，其特征是，γ-谷氨酰肽水解酶为γ-谷氨酰转移酶、γ-谷氨酰环化转移酶或谷氨酰胺酶。

6.一种食品风味增强剂的制造方法，其特征是，将权利要求4或5中记载的食品风味增强用的原材料，在50～180℃保持10～300分钟。

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