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CN109952319B - 对gp100具有特异性的TCR-抗CD3 scFv融合蛋白的定量用药方案 - Google Patents

对gp100具有特异性的TCR-抗CD3 scFv融合蛋白的定量用药方案 Download PDF

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Abstract

本发明涉及癌症的治疗，特别涉及gp100阳性癌症的治疗。特别地，本发明涉及一种T细胞重定向双特异性治疗剂的用量方案，所述双特异性治疗剂包含与YLEPGPVTA‑HLA‑A2复合物结合的靶向部分，所述靶向部分与结合CD3的T细胞重定向部分融合。

Description

对gp100具有特异性的TCR-抗CD3 scFv融合蛋白的定量用药 方案
技术领域
本发明涉及癌症的治疗，特别涉及gp100阳性癌症的治疗。特别地，本发明涉及一种T细胞重定向双特异性治疗剂的用量方案，所述双特异性治疗剂包含结合YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的靶向部分，所述靶向部分与结合CD3的T细胞重定向部分融合。
背景技术
人糖蛋白100(gp100)是黑色素瘤相关抗原组中的一种，身体可以对黑色素瘤相关抗原产生自然免疫应答。该蛋白质是有661个氨基酸的黑素体膜相关糖蛋白，其在正常黑色素细胞中表达并且在大多数黑色素瘤癌细胞中广泛过表达。例如，一项研究(Trefzer etal.,(2006)Melanoma Res.16(2):137-45)发现来自28名黑色素瘤患者的192个黑色素瘤转移瘤中有82％表达gp100。一些研究报道了gp100在黑色素瘤组织中的表达水平较高(Hofbauer et al.,(2004)J Immunother.27(1):73-78,Barrow et al.,(2006)ClinCancer Res.12:764-71)。虽然大多数gp100阳性癌症是黑色素瘤，但该文献中也包含许多根据例如通过免疫组织化学用名为HMB-45的抗体检测到的表达gp100的其他癌症形式的报告，例如透明细胞肉瘤和各种脑癌亚型，HMB-45为广泛使用的gp100特异性诊断抗体(Huanget al.,(2015)Int J Clin Exp Pathol.8(2):2171-5,Ozuguz et al.,(2014)IndianDermatol Online J 5(4):488-90,Taddei et al.,Appl Immunohistochem Mol Morphol(2001)9(1):35-41)。该蛋白的确切功能尚未知晓，但似乎与黑素体成熟有关(Hoashi etal.,2005；Kawakami and Rosenberg,1997)。gp100抗原已经并将继续成为许多基于免疫疗法的黑色素瘤临床试验的目标。
早期的gp100靶向免疫疗法涉及使用表达整个gp100蛋白质或其一部分的肽或病毒的疫苗接种策略(在(Lens(2008)Expert Opin Biol Ther.8(3):315-323.)有综述)。这些试验获得有限的成功，被认为是产生的免疫应答不足而不是对靶标有效性的反映的结果。因此，使用gp100作为黑色素瘤靶标的原则仍然是黑色素瘤特异性免疫疗法的有效方法。
包含与结合CD3的T细胞重定向部分融合的基于T细胞受体的gp100特异性靶向部分的新型双特异性治疗剂的开发提供了新的治疗选择(Liddy et al.,(2012).Nat Med.8:980-987)。这种治疗剂的作用机制与之前的其他免疫疗法治疗剂显著不同，并导致非gp100特异性T细胞快速有效地重定向以便杀死体外gp100阳性细胞；因此，对期望改善患者和因对gp100阳性正常组织(例如皮肤黑色素细胞)的活性而产生的中靶脱肿瘤毒性(on-target,off-tumour toxicities)的临床疗效结果存在合理的理由。
肽YLEPGPVTA(SEQ ID No:1)与gp100中编号为280-288的氨基酸残基对应。YLEPGPVTA(SEQ ID No:1)肽由gp100+/HLA-A*02+癌细胞上的I类HLA分子呈递(Salgalleret al.,(1996)Cancer Res 56:4749-4757)。WO2011/001152描述了结合了YLEPGPVTA肽的TCR以肽-HLA-A*02复合物呈递。该TCR相对于天然gp100TCRα和/或β可变结构域是突变的，从而改善了对复合物的结合亲和力和/或结合半衰期，并且可以与治疗剂(共价地或以其它方式)缔合。一种这样的治疗剂是抗CD3抗体，或所述抗CD3抗体的功能片段或变体，例如单链可变区片段(scFv)。抗CD3抗体或片段可以与TCRα或β链的C-或N-末端共价连接。此类TCR已用于治疗患者黑色素瘤(临床试验标识符NCT01211262)。
IMCgp100是一种T细胞重定向双特异性治疗剂，其包含与YLEPGPVTA肽-HLA-A*02复合物结合的亲和力增强的可溶性TCR，该亲和力增强的可溶性TCR与抗CD3 scFv融合。已显示IMCgp100通过与gp100阳性靶细胞结合并经募集肿瘤特异性细胞和非肿瘤特异性T细胞来诱导杀伤而在体外起作用。一旦与gp100阳性靶细胞表面上的肽-HLA-A*02复合物结合，IMCgp100使靶细胞与T细胞通过分子的抗CD3 scFv部分的相互作用而交联。通过双特异性治疗剂使两种细胞交联导致免疫突触的形成、T细胞的活化以及针对gp100阳性靶细胞的T细胞应答的重定向。IMCgp100可以使CD4+和CD8+T细胞活化；然而，IMCgp100的主要功能是诱导CD8+T细胞应答。CD8+T细胞，也称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，在自然免疫系统抗癌方面发挥着重要作用。CTL是溶细胞的并且通过凋亡途径起诱导肿瘤细胞裂解功能。
如上所述，gp100在包括黑色素细胞在内的正常健康细胞中表达，这在临床环境中引发了中靶脱肿瘤反应性的可能性。已知gp100在黑色素细胞中的表达水平低于肿瘤中的表达水平。在IMCgp100的临床前测试期间，证实了IMCgp100能够针对正常黑色素细胞使T细胞活性重定向，但是效力低于肿瘤细胞，在此背景下的效力与靶细胞表面上展示的表位数量成正比(Liddy et al.,(2012).Nat Med.8:980-987)。虽然这些数据表明中靶肿瘤(on-tumour)和脱肿瘤(off-tumour)反应性之间存在潜在的治疗窗口，但IMCgp100治疗不能排除中靶脱肿瘤反应性。预期临床试验期间对皮肤黑色素细胞的任何反应性会表现为与皮肤有关的毒性(例如皮疹、白癜风)以及细胞因子和趋化因子局部释放作用，这可通过氢化可的松治疗来控制。在IMCgp100的体外临床前测试期间未发现其他安全性问题，包括没有脱靶交叉反应性的证据。IMCgp100基于该数据而被批准用于临床测试。如本领域技术人员所理解，合适的治疗剂量水平不能先验预测并且取决于药物作用机制和靶抗原表达谱。因此，虽然已知已经在临床中评价许多gp100特异性疫苗和自体T细胞疗法有中靶脱肿瘤毒性，但是仍然不能先验预测T细胞重定向治疗剂的合适治疗剂量。这是因为，虽然疫苗和自体T细胞疗法导致仅一小部分的患者T细胞能够识别gp100阳性细胞，但是T细胞重定向治疗剂理论上可以为患者的每个CD3阳性T细胞提供识别gp100阳性细胞并与其反应的能力。
已在I期试验(临床试验标识符NCT01211262)中对IMCgp100在晚期黑色素瘤患者中的安全性和耐受性进行了研究。已经展示了该研究的中期结果(Middleton et al.,(2015)Cancer Res 2015；75(15Suppl):Abstract nr CT106)。确定，无论患者体重如何，对于每周给药，最大耐受剂量为600ng/kg，每剂量转化为50μg的II期推荐剂量(RP2D)。在剂量递增的研究部分期间，观察到作为主要的剂量限制性毒性的重度(3/4级)低血压。随后患者组接受每周RP2D定量用药，并报告有更多的重度低血压发作。其他常见的不良反应包括皮疹、瘙痒、发热和水肿。不良反应通常在第一或第二药物剂量后不久表现出来。每周额外IMCgp100剂量超过剂量2导致较少的不良反应并且这些反应严重性总体上有所改善。为了增加早期剂量期间的耐受性，每周第一IMCgp100剂量按常规做法减少20％至40μg，然后在随后的几周内按RP2D定量用药。然而，重度低血压病例继续出现。gp100在皮肤黑色素细胞中的表达使体内最大器官中的抗原阳性细胞大量下沉。IMCgp100对gp100阳性细胞的有效靶向导致重定向T细胞对gp100阳性皮肤黑色素细胞的活性。这在患者中表现为皮肤相关毒性。对患者血清和活组织检查样品的分析表明，细胞因子和趋化因子在皮肤和肿瘤内局部释放导致大量T细胞在极短的时间间隔内从外周循环贩运进组织中；与这种快速T细胞迁移相关的实质性液体转变导致了低血压。
发明内容
在第一方面，本发明提供T细胞重定向双特异性治疗剂，包含(i)靶向部分，其结合YLEPGPVTA-HLA-A2复合物；(ii)结合CD3的T细胞重定向部分，其与所述靶向部分融合，所述T细胞重定向双特异性治疗剂用于治疗患者gp100阳性癌症的方法中，所述方法包括对所述患者进行双特异性治疗剂给药，其中按每5至10天各剂量来给药，至少第一和第二剂量低于40μg且第二剂量高于第一剂量。
本发明人惊奇地发现了一种患者内剂量递增方案，该方案使采用T细胞重定向介导的作用机制以双特异性治疗剂治疗的gp100阳性肿瘤的耐受性得以改善。本发明提供了一种用量递增方案，其中不希望的副作用，例如重度低血压显著降低。该用量方案可用于降低患者的中靶脱肿瘤毒性的严重性，从而减少患者在治疗的最初几周内对住院和/或接受重症监护的需要。另一个令人惊讶的好处是，通过使用定量用药方案改善对中靶脱肿瘤T细胞活性的影响，患者随后可以安全地耐受比现有的50μg R2P2更高的总治疗剂量水平，这预计可以导致临床疗效提高。不希望受理论束缚，发明人假设低血压的剂量限制性毒性为与患者疾病负担和患者肿瘤内gp100表达水平有关的双特异性治疗剂的C max暴露水平、皮肤区室内大量gp100阳性黑色素细胞的存在、和患者肿瘤中gp100表达的程度所迫。发明人认为，定量用药方案可以足以使得表达高水平gp100的正常皮肤黑色素细胞被破坏，随后允许更安全地进行较高治疗剂量给药，这导致剩余gp100阳性肿瘤细胞的靶向改善，从而改善临床疗效。
发明人观察到，在对IMCgp100总体暴露较高下，相比肿瘤或疾病负担较小的患者，肿瘤直径较大或总体疾病负担较高的患者经历客观的肿瘤应答。基于该数据，发明人假设，通过使用本发明的定量用药方案在减轻先前剂量限制性毒性后数周内增加药物暴露可导致肿瘤反应增强。
在本发明中，双特异性治疗剂可以根据如下来给药：
(a)至少一次第一剂量，所述第一剂量范围为10μg至30μg；
(b)至少一次第二剂量，所述第二剂量范围为20μg至40μg，其中所述第二剂量或每次第二剂量高于所述第一剂量；然后
(c)至少一次至少50μg的剂量。
在本发明中，各剂量可以表示为治疗剂的规定重量，而无论患者体重如何，或该量是否与通过常规用于计算给患者的适当用量的其它方法之一计算出的要给药的治疗剂的量(例如，每Kg体重、体表面积或瘦肌肉质量等的治疗剂的重量)相同。优选的是，按每周的间隔，例如在治疗方案的第1、8、15、22天等进行规定重量的治疗剂给药，但定量用药间隔可以更长或更短。定量用药间隔可取决于T细胞重定向双特异性治疗剂的抗原结合特征及其消除半衰期。因此，各剂量可以按每6至9天或每6至8天来给药。优选地，各剂量按每7天来给药。各剂量可以以不同间隔分开。可替换地，各剂量可以以相同的间隔分开。
第一剂量可以为10μg至30μg。第一剂量可以为13μg至27μg，15μg至25μg或18μg至22μg。剂量可以是15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、21μg、22μg、23μg、24μg或25μg。一种优选的第一剂量为20μg，其可以在每周的基础上给药。可替换地，可以按一次第一剂量给药。可替换地，可以按一次以上第一剂量，优选2至5次第一剂量，更优选两次第一剂量来给药。优选的是，如果按两次或更多次第一剂量来给药，该两次或更多次第一剂量是相同的。但是，该两次或更多次第一剂量可以不同。
第二剂量可以为20μg至40μg，并且可以高于第一剂量。第二剂量可以比第一剂量高1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg或10μg。第二剂量可以为23μg-37μg、25μg-35μg或28μg-32μg。随后的剂量可以是25μg、26μg、27μg、28μg、29μg、30μg、31μg、32μg、33μg、34μg或35μg。一种优选的第二剂量为30μg，其可以在每周的基础上给药。可以按一次第二剂量来给药。可替换地，可以按一次以上第二剂量，优选2至5次第二剂量，更优选两次第二剂量来给药。优选的是，如果按两次或更多次第二剂量来给药，该两次或更多次第二剂量是相同的。但是，该两次或更多次第二剂量可以不同。
第二剂量后的剂量可以为至少50μg。该第二剂量后的剂量可以为50μg-300μg、50μg-250μg、50μg-200μg、50μg-150μg、50μg-100μg、50μg-90μg、50μg-80μg、50μg-70μg或50μg-60μg。该剂量可以为至少50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg或250μg。第二剂量后的一个优选的剂量是50μg。另一个是60μg，并且再一个为70μg。随后可以使用相同的剂量。可替换地，该剂量可以是递增的。例如，该剂量可以高5μg、10μg、15μg、20μg、30μg、40μg或50μg。
第一剂量可为20μg，第二剂量可以是30μg，和/或第二剂量后的剂量可为50μg或更大。
可用于本发明的T细胞重定向双特异性治疗剂包含(i)靶向部分，其结合YLEPGPVTA-HLA-A2复合物；(ii)结合CD3的T细胞重定向部分，其与所述靶向部分融合。
所述靶向部分可以是T细胞受体(TCR)。使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法描述TCR，并链接到TCR序列的IMGT公共数据库。由IMGT命名法定义的独特序列是众所周知的，并且对TCR领域技术人员来说是易得到的。例如，它们可以在“T cell ReceptorFactsbook”,(2001)LeFranc and LeFranc,Academic Press,ISBN 0-12-441352-8；Lefranc,(2011),Cold Spring Harb Protoc 2011(6):595-603；Lefranc,(2001),CurrProtoc Immunol Appendix 1:Appendix 1O；Lefranc,(2003),Leukemia 17(1):260-266以及IMGT网站(www.IMGT.org)上找到。
本领域技术人员已知的任何形式的TCR可以可用于本发明。例如，TCR可以是αβ异二聚体，或者它们可以是单链形式(例如WO9918129中描述的那些)。单链TCR包括以下类型的αβTCR多肽：Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ或Vα-Cα-L-Vβ-Cβ，任选地为反方向，其中Vα和Vβ分别是TCRα和TCRβ可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和TCRβ恒定区，L是接头序列。TCR优选为可溶形式(即不具有跨膜或细胞质结构域)。为了稳定性，这种可溶性TCR优选在各个恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，例如，如WO03/020763中所述。优选的这类TCR包括具有TRAC1恒定结构域序列和TRBC1或TRBC2恒定结构域序列的那些TCR，除了其中TRAC1的Thr 48和TRBC1或TRBC2的Ser 57被半胱氨酸残基所取代，所述半胱氨酸在TRAC1恒定结构域序列与TCR的TRBC1或TRBC2恒定结构域序列之间形成二硫键。它可能含有全长的α链和β链。
α和/或β链恒定结构域相对于天然/自然存在的TRAC/TRBC序列可以是截短的。此外，TRAC/TRBC可能包含修饰。例如，α链细胞外序列可包括相对于天然/自然存在的TRAC的修饰，籍此TRAC的氨基酸T48(参考IMGT编号)被C48替换。同样地，β链胞外序列可包括相对于天然/自然存在的TRBC1或TRBC2的修饰，籍此TRBC1或TRBC2的S57(参考IMGT编号)被C57替换。相对于天然α和β链胞外序列的这些半胱氨酸取代使非天然链间二硫键能够形成，所述非天然链间二硫键使重折叠的可溶性TCR(即，通过重折叠胞外α和β链形成的TCR)稳定(WO 03/020763)。这种非天然二硫键有助于在噬菌体上展示正确折叠的TCR((Li et al.,Nat Biotechnol 2005Mar；23(3):349-54)。此外，使用稳定的二硫键连接的可溶性TCR能够更方便地评估结合亲和力和结合半衰期。WO 03/020763中描述了形成非天然二硫键的可替换位置。
可以将用于本发明的TCR工程化以包括突变。产生突变的高亲和力TCR变体的方法(例如噬菌体展示和定点诱变)是本领域技术人员已知的(例如参见WO 04/044004和Li etal.,Nat Biotechnol 2005Mar；23(3):349-54)。
可用于本发明的TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期至少是胞外α链序列为SEQ ID No:2和胞外β链序列为SEQ ID No:3的TCR的两倍。可用于本发明的TCR与复合物的KD可以为≤8μM、≤5μM、≤1μM、≤0.1μM、≤0.01μM、≤0.001μM或≤0.0001μM和/或与复合物的结合半衰期(T1/2)可以为≥1.5s、≥3s、≥10s、≥20s、≥40s、≥60s、≥600s或≥6000s。优选的KD和/或结合半衰期(T1/2)分别为约10pM至100pM和约6小时至48小时。特别优选的KD和/或结合半衰期(T1/2)为约24pM和约24小时。
结合亲和力(与平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)可以通过任何适当的方法来确定。应当理解，将TCR的亲和力加倍会导致KD减半。根据ln2除以解离速率(koff)来计算T1/2。因此，T1/2的加倍导致k off减半。通常对可溶形式的TCR测量TCR KD和koff值，所述可溶形式的TCR即被截短以除去疏水性跨膜结构域残基的TCR形式。因此，应该理解，如果可溶形式的TCR符合该可溶形式的TCR与YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期的要求，那么该给定的TCR也符合该要求。优选地，使用相同的测定方案，对给定TCR的结合亲和力或结合半衰期测量数次，例如3次或更多次，并取结果的平均值。在优选的实施方式中，使用WO2011/001152的实施例3的表面等离子体共振(BIAcore)方法进行这些测量。通过该方法测量的胞外α链序列为SEQ ID No:2和胞外β链序列为SEQ ID No:3的参照物gp100TCR的KD为约19μM，并且koff为约1s-1(即T1/2为约0.7s)。
可用于本发明的TCR可以与抗CD3抗体或所述抗CD3抗体的功能片段或变体缔结，并且可以如WO2011/001152中所述。适用于本文所述组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括但不限于微抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、dsFv和scFv片段、NanobodiesTM(Ablynx(比利时)出售的这些构建体包含来源自骆驼科动物(例如骆驼或美洲驼))的合成的单一免疫球蛋白重链可变结构域)、和Domain Antibodies(Domantis(比利时)，包含亲和力成熟的单个免疫球蛋白重链可变结构域或免疫球蛋白轻链可变结构域)。
可用于本发明的TCR-抗CD3融合体包括：选自由以下组成的组中的TCRα链氨基酸序列：
(i)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是S；
(ii)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是A；
(iii)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是G；
(iv)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是S，并且基于SEQ ID No:2的编号，截短α链的C末端所包含的F196至S203的8个氨基酸；
(v)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是A，并且基于SEQ ID No:2的编号，截短α链的C末端所包含的F196至S203的8个氨基酸；
(vi)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是G，并且基于SEQ ID No:2的编号，截短α链的C末端所包含的F196至S203的8个氨基酸；和
选自由以下组成的组中的TCRβ链-抗CD3氨基酸序列：
(vii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为D和I；
(viii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为A和I；
(ix)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为A和Q；
(x)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为D和I，第108至131位氨基酸被RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG(SEQ ID No:6)取代，第254至258位氨基酸被GGEGGGSEGGGS(SEQ ID No:7)取代；
(xi)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为D和I，第257位氨基酸为S，第258位氨基酸为G；
(xii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为D和I，第256位氨基酸为S，第258位氨基酸为G；
(xiii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为D和I，第255位氨基酸为S，第258位氨基酸为G；
(xiv)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸是A和Q，并且其中第257位氨基酸是S，第258位氨基酸是G；
(xv)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸是A和Q，并且其中第256位氨基酸是S，第258位氨基酸是G；
(xvi)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸是A和Q，并且其中第255位氨基酸是S，第258位氨基酸是G；
(xvii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为A和I，并且其中第257位氨基酸是S，第258位氨基酸是G；
(xviii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为A和I，并且其中第256位氨基酸是S，第258位氨基酸是G；
(xix)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为A和I，并且其中第255位氨基酸是S，第258位氨基酸是G；
这种TCR-抗CD3融合体的实例是如下的TCR，其中：
α链氨基酸序列是(i)，β链-抗CD3氨基酸序列是(vii)；
α链氨基酸序列是(i)，β链-抗CD3氨基酸序列是(x)；
α链氨基酸序列是(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列是(ix)；
α链氨基酸序列是(v)，β链-抗CD3氨基酸序列是(viii)；
α链氨基酸序列是(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列是(vii)；
α链氨基酸序列是(i)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xi)；
α链氨基酸序列是(i)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xii)；
α链氨基酸序列是(i)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xiii)；
α链氨基酸序列是(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xiv)；
α链氨基酸序列为(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列为(xv)；
α链氨基酸序列为(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列为(xvi)；
α链氨基酸序列是(v)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xvii)；
α链氨基酸序列是(v)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xviii)；
α链氨基酸序列是(v)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xix)；
α链氨基酸序列为(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列为(xi)；
α链氨基酸序列是(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xii)；和
α链氨基酸序列是(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xiii)。
优选的TCR-抗CD3融合体分别具有SEQ ID NO:4和5的α和β链。优选的TCR-抗CD3融合体具有(v)的α链氨基酸序列和(viii)的β链-抗CD3氨基酸序列。
可替换地，靶向部分可以是抗体。如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，无论该分子是天然的还是部分或完全合成产生的。术语“抗体”包括抗体片段、衍生物、抗体的功能等同物和同源物、人源化抗体，包括含有免疫球蛋白结合域的任何多肽(无论是天然的还是完全或部分合成的)、以及具有作为抗体结合域的或与抗体结合域同源的结合域的任何多肽或蛋白质。因此，包括与另一多肽融合的包含免疫球蛋白结合域的嵌合分子或等同物。EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合抗体的克隆和表达。人源化抗体可以是具有非人(例如鼠)抗体可变区和人抗体恒定区的经修饰抗体。例如专利号我5225539的美国专利中描述了制备人源化抗体的方法。抗体的实例是免疫球蛋白同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其同种型亚类；包含抗原结合域的片段，例如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双抗体。抗体可以是多克隆的或单克隆的。单克隆抗体在本文中可称为“mAb”。
可以采用抗体(例如单克隆抗体)，并使用重组DNA技术来产生保留原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子。这种技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA引入不同的免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区中(参见例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400)。杂交瘤(或产生抗体的其他细胞)可以经历遗传突变或其他变化，这些变化可以改变或不改变所产生的抗体的结合特异性。
已经表明，完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward,E.S.et al.,Nature.1989Oct 12；341(6242):544-6)；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，即包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域缔结的肽接头来连接以形成抗原结合位点(Bird et al.,Science.1988Oct21；242(4877):423-6；Huston et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1988Aug；85(16):5879-83)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双抗体”，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Hollinger et al.,Proc Natl Acad SciU S A.1993Jul 15；90(14):6444-8)。双抗体是多肽的多聚体，每个多肽包括含有免疫球蛋白轻链结合区的第一结构域和含有免疫球蛋白重链结合区的第二结构域，这两个结构域连接(例如通过肽接头)但不能彼此缔合形成抗原结合位点：抗原结合位点通过多聚体内的一条多肽的第一结构域与多聚体内的另一条多肽的第二结构域缔合而形成(WO94/13804)。在要使用双特异性抗体的情况下，常规的双特异性抗体可以通过多种方式制备(例如以化学方法制备或由杂交的杂交瘤制备)(Hollinger&Winter,Curr Opin Biotechnol.1993Aug；4(4):446-9)，或可以是上述任何双特异性抗体片段。可以优选使用scFv二聚体或双抗体而不是完整抗体。可以不用Fc区而仅使用可变结构域来构建双抗体和scFv，潜在地降低了抗独特型反应的作用。其他形式的双特异性抗体包括Traunecker et al.,EMBO J.1991Dec；10(12):3655-9中描述的单链“Janusins”。与双特异性完整抗体相反，双特异性双抗体也可以是有用的，因为它们可以轻易构建并在大肠杆菌中表达。使用来自文库的噬菌体展示(WO94/13804)可以轻易地选择具有适当结合特异性的双抗体(和许多其他多肽，例如抗体片段)。如果双抗体的一个臂保持恒定，例如具有针对抗原X的特异性，则可以使另一个臂变化并选择具有适当特异性的抗体来制备文库。“抗原结合域”是抗体的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原很大的情况下，抗体可以仅与抗原的特定部分(该部分称为表位)结合。抗原结合域可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗原结合域可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
结合部分可以是被设计为特异性结合肽-MHC复合物的TCR样分子。特别优选的是TCR模拟抗体，例如WO2007143104以及Sergeeva et al.,Blood.2011Apr 21；117(16):4262-72和/或Dahan and Reiter.Expert Rev Mol Med.2012Feb 24；14:e6中描述的那些。
基于工程化蛋白支架的结合部分也包括在本发明内。蛋白支架衍生自已经过修饰以提供目标靶分子的结合位点的稳定可溶的天然蛋白质结构。工程化蛋白支架的实例包括但不限于：基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域的亲和体，所述Z结构域在其两个α-螺旋上提供结合界面(Nygren,FEBS J.2008Jun；275(11):2668-76)；衍生自脂质运载蛋白的anticalin，anticalin在β-桶状折叠的开放末端掺入小配体结合位点(Skerra,FEBS J.2008Jun；275(11):2677-83)；纳米抗体和DARPins。工程化蛋白支架通常靶向结合与抗体相同的抗原性蛋白质，并且是潜在的治疗剂。它们可以充当抑制剂或拮抗剂，或作为递送载体以使分子(例如毒素)靶向体内特定组织(Gebauer and Skerra,Curr Opin Chem Biol.2009Jun；13(3):245-55)。短肽也可用于结合靶蛋白。Phylomers是源自细菌基因组的天然结构肽。这类肽代表多种蛋白质结构折叠并且可用于抑制/破坏体内蛋白质-蛋白质相互作用(Watt,NatBiotechnol.2006Feb；24(2):177-83)。
如上文关于TCR的描述，结合CD3的T细胞重定向部分可以是抗CD3抗体、或所述抗CD3抗体的功能片段或变体，并且可以如WO2011/001152中所述。
在本发明的一种实施方式中，该方法包括在第1周中将剂量不超过20μg，在第2周中将剂量不超过30μg，并且在第3周和随后几周将剂量为至少50μg的T细胞重定向双特异性治疗剂给药至患者，其中，所述双特异性治疗剂的TCR部分与T细胞重定向抗CD3抗体或其片段缔合，并且其对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期至少是胞外α链序列为SEQ ID No:2和胞外β链序列为SEQ ID No:3的TCR的两倍。
优选通过静脉内输注进行T细胞重定向双特异性治疗剂给药。可替换的给药途径包括其他肠胃外途径，例如皮下或肌内输注、肠内(包括口服或直肠)、吸入或鼻内途径。
用于本发明的双特异性治疗剂可以作为单一疗法给药。可替换地，它可以与一种或多种抗癌疗法，优选免疫调节疗法组合给药。使用组合疗法进行另外的免疫活化的可能性增加了中靶脱肿瘤毒性的风险。这些疗法包括：
·化疗剂，如达卡巴嗪和替莫唑胺，
·免疫治疗剂，如白细胞介素-2(IL-2)和干扰素(IFN)
·检查点抑制剂，例如靶向PD-1或PD-L1的药剂，例如派姆单抗、纳武单抗、阿替利组单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和度伐鲁单抗(durvalumab)，以及靶向CTLA-4的药剂，例如易普利姆玛(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)，
·BRAF抑制剂，如维莫非尼(vemurafenib)和达拉非尼(dabrafenib)，
·MEK抑制剂，如曲美替尼(trametinib)，
·TGF-β抑制剂，如galunisertib，
·MET激酶抑制剂，如美雷替尼(merestinib)。
优选的组合疗法使用度伐鲁单抗、曲美木单抗、galunisertib和美雷替尼与如上所述的T细胞重定向双特异性治疗剂的组合。在使用美雷替尼(参见WO2010011538)或类似的酰氨基苯氧基吲唑(WO2010011538中描述的)与双特异性治疗剂组合使用的情况下，美雷替尼的剂量可以为每天一次40mg至120mg，优选每天一次80mg至120mg。
可以以第一和后续剂量进行双特异性治疗剂单独给药，然后添加另外的治疗剂，或反之亦然。在本发明实施方式中，在T细胞重定向双特异性治疗剂和另一癌症疗法组合给药的情况下，可以在第1周和第2周单独进行T细胞重定向双特异性治疗剂给药，并且在第3周和随后的几周中添加另一种疗法。
组合疗法可能导致包括细胞因子和趋化因子分泌和淋巴细胞贩运的免疫活化增加，从而有增加副作用如重度低血压的风险。因此，可以在组合定量用药之前首先给出作为单一药剂的T细胞重定向双特异性治疗剂的剂量。在优选的实施方式中，在第1周按不超过20μg的剂量来给药，在第2周按不超过30μg的剂量来给药，并且在第3周和随后的数周按至少50μg的剂量来给药。可以从第3周开始按一种或多种另外的免疫调节疗法的定量用药来给药。
本发明涉及gp100阳性癌症的治疗。一种这样的癌症是黑色素瘤。恶性黑色素瘤仍然是全球公共卫生中的主要问题。据估计，2016年在美国将有近76,000例新诊断的黑色素瘤，预计将有近10,000人死于黑色素瘤(美国癌症协会统计，2016年)。此外，黑色素瘤的诊断率继续以显著速度上升；根据“2015年监测、流行病学和最终结果数据”，过去十年平均发病率每年上升1.4％，而黑色素瘤现在是美国第五大常见癌症诊断结果。虽然手术切除后早期疾病患者的预后良好，但随着疾病进展，中位生存率迅速下降，远端转移性疾病患者下降至不到一年(Garbe et al.,Oncologist 2011；16:5-24)。黑色素瘤的发病率上升加上标准化疗的不良结果和来自基于免疫的疗法的早期信号引向对用以增强抗肿瘤免疫应答的新方法和组合的密集研究。
根据本发明的待治疗的黑色素瘤可以是皮肤黑色素瘤或葡萄膜黑色素瘤(也称为眼黑色素瘤)。可替换地，该黑色素瘤可以是恶性雀斑样痣性黑色素瘤、浅表性扩散黑色素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉样黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素型黑色素瘤、软组织黑色素瘤、小痣样细胞的小细胞黑色素瘤和spitz样黑色素瘤。
待治疗的黑色素瘤通常是晚期疾病(进展期疾病)，通常以转移性病变为特征。例如，III期和/或IV期(Balch et al.,J Clin Oncol 2009；27:6199-206)。
葡萄膜黑色素瘤(UM)是一种罕见的黑色素瘤，在生物学上与皮肤黑色素瘤不同。UM是一种极其恶性的赘生物，影响眼睛血管层(虹膜、睫状体和脉络膜)。尽管UM发病率很低(约占黑色素瘤病例的3％，全球每年约4,000例)，(Papastefanou et al.,(2011)J SkinCancer；2011:573974)。UM中的抑制环境和检查点抑制缺乏活性表明，在该疾病背景中，使具有肿瘤特异性中心的活化的T细胞变动可能具有抗肿瘤活性。
如上所述，文献中报道了gp100阳性的其他非黑色素瘤癌症，例如透明细胞肉瘤和神经系统癌症(例如一些神经胶质瘤)。本发明可用于治疗这些癌症。
在另一方面，本发明提供了治疗患者gp100阳性癌症的方法，所述方法包括对所述患者进行T细胞重定向双特异性治疗剂给药，其中各剂量按每5-10天来给药，所述第一和第二剂量至少低于40μg且第二剂量高于第一剂量。
在另一方面，本发明提供T细胞重定向双特异性治疗剂，其包含(i)靶向部分，其结合YLEPGPVTA-HLA-A2复合物；(ii)结合CD3的T细胞重定向部分，其与所述靶向部分融合，所述T细胞重定向双特异性治疗剂用于治疗患者gp100阳性癌症的方法中，所述方法包括以下顺序步骤：
(a)对患者进行每周剂量为10μg至30μg的双特异性治疗剂给药；
(b)(i)如果患者经历1级或更低的治疗相关性低血压，则将患者的给药剂量增加至每周20μg至40μg双特异性治疗剂剂量，或
(b)(ii)如果患者经历2级或更高的治疗相关性低血压，继续对患者进行每周剂量为10μg至30μg的双特异性治疗剂给药，直至患者经历1级或更低的治疗相关低血压，然后将患者的给药剂量增加至每周20μg至40μg双特异性治疗剂剂量；和
(c)(i)如果患者经历1级或更低的治疗相关性低血压，则将给予患者的给药剂量增加至每周至少50μg双特异性治疗剂剂量，或
(c)(ii)如果患者经历2级或更高的治疗相关性低血压，继续对患者进行每周剂量为20μg至40μg的双特异性治疗剂给药，直至患者经历1级或更低的治疗相关低血压，然后将患者的给药剂量增加至每周至少50μg的双特异性治疗剂剂量。
在这方面，该方法还可以在步骤(b)和(c)之间包括以下步骤：
(d)(i)如果患者经历1级或更低的治疗相关性低血压，则将患者的给药剂量增加至每周30μg至45μg双特异性治疗剂剂量，或
(d)(ii)如果患者经历2级或更高的治疗相关性低血压，继续对患者进行每周剂量为20μg至40μg的双特异性治疗剂给药，直至患者经历1级或更低的治疗相关低血压，然后将患者的给药剂量增加至每周30μg至45μg双特异性治疗剂剂量。
低血压的等级可由医生评估。
针对其他方面中的每个方面，对本发明的每个方面的优选特征在细节上作必要修改。应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。本发明特别涵盖了涉及T细胞重定向双特异性治疗剂和治疗gp100阳性癌症的方法的实施方式的所有组合，并且公开于此，正如每个和各种组合被单独和明确地公开。本文提及的已发表的文献在法律允许的最大范围内并入。本申请中任何文献的引用或标识并不承认该文献可用作本发明的现有技术。
附图说明
在此参考附图，其中：
图1示出了参照物gp100TCR的α链胞外域的氨基酸序列(SEQ ID No:2)；
图2示出了参照物gp100TCR的β链胞外域的氨基酸序列(SEQ ID No:3)；
图3示出了gp100特异性TCRα链的氨基酸序列(SEQ ID No:4)；
图4示出了在gp100特异性TCRβ链的N末端处通过接头(即GGGGS(下划线))融合的抗CD3 scFv抗体片段(粗体)的氨基酸序列(SEQ ID No:5)；
图5示出了包括重度和/或严重低血压在内的毒性相对于IMCgp100剂量的次数的出现；
图6示出了IMCgp100的第一剂量后淋巴细胞从外周进行贩运；
图7示出了在存在或不存在抗CTLA-4的情况下在IMCgp100下的T细胞增殖；
图8示出了在存在或不存在抗PD-L1的情况下在IMCgp100下的T细胞增殖；
图9示出了在存在或不存在抗CTLA-4的情况下在IMCgp100下的细胞因子IFNγ、TNFα和IL-2的分泌；和
图10示出了在存在或不存在抗CTLA-4的情况下在IMCgp100下的细胞因子IFNγ的分泌。
具体实施方式
实施例
实施例1-改善药物相关重度低血压并允许提高剂量上限的IMCgp100的用量方案的鉴定
IMCgp100是T细胞重定向双特异性试剂，其包含与YLEPGPVTA肽-HLA-A*02复合物结合的亲和力增强的可溶性TCR，该亲和力增强的可溶性TCR与抗CD3 scFv融合。
[IMCgp100的α链和β链分别为SEQ ID NO:4和5]在人类首次(FIH)开放标签剂量发现研究中对IMCgp100进行了研究，以评估IMCgp100对恶性黑色素瘤晚期患者的安全性和耐受性(临床试验标识符：NCT01211262)。该研究旨在确定IMCgp100在2次重复定量用药方案中的最大耐受剂量(MTD)或II期推荐剂量(RP2D)：(Arm 1)每周定量用药(RP2D-QW)和(Arm2)每天定量用药×4天(RP2D-QD)。
IV期或不可切除的III期恶性黑色素瘤患者参与该研究。所有患者均为HLA-A*02阳性，年龄超过18岁并且进行了分类，根据RECIST 1.1标准，这些患者具有可测疾病，并且预期寿命超过3个月并且东部肿瘤协作组(ECOG)表现状态为1或以下。没有限制先前疗法次数。充分评估患者的血液、肾脏、肝脏和心脏功能。研究特别排除了有脑转移症状的患者。总共有84名患者接受了治疗。
使用受控输注泵通过静脉内输注进行IMCgp100给药。除了在定量用药开始前28天内进行的HLA分型、MRI扫描、眼科、听力学和超声心动图评估以外,在开始IMCgp100定量用药之前不超过14天进行筛选程序和确定合格性测试。所有患者获得知情同意书。在筛选时、在输注前第1天，在输注开始后4、10和24小时以及在第2天、第8天和第30天获得用于血液学、生物化学和药代动力学(PK)分析的血液样品。
每周定量用药：剂量递增结果
遵循标准的3+3I期剂量递增方案以确定最大耐受剂量(MTD)。简而言之，IMCgp100的剂量在3(+3)患者组中递增，直至满足MTD标准，或直至达到目标限制剂量。剂量递增以三倍增量进行，根据安全性和PK曲线或者如果报告剂量限制性毒性(DLT)，则转变为改良的斐波纳契设计(modified Fibonacci design)。MTD被定义为这样的最高剂量水平：在该水平下参与的患者中超过33％经历DLT。在治疗后的8天窗口期内观察DLT，并根据NCI通用不良反应术语标准(CTCAE)4.0版进行评估。由于药物的预期药理作用，排除将短暂的3级或4级淋巴细胞减少和非危及生命的皮肤皮疹作为剂量限制标准。
在剂量递增期间，31名患者在8次剂量组中进行治疗，并接受5ng/kg至900ng/kg的药物。在4名患者中，在剂量以405ng/kg(n＝六个中有一个)、600ng/kg(n＝六个中有一个)和900ng/kg(n＝六个中有两个)递增期间观察到3级或4级低血压的剂量限制性毒性(DLT)。4个3级或4级低血压的DLT病例中有3个在IMCgp100的第一剂量给药后约12至18小时时发生反应；在接受伴随的抗高血压治疗的患者中，在第二剂量为405ng/kg时发生1次DLT低血压反应。在这4个病例中采用IV输液(生理盐水和胶体输注)处理低血压；没有患者需要血压的药理学(肌力)支持，所有患者均以IV皮质类固醇激素疗法进行治疗。所有3或4级低血压病例均在2天内通过液体疗法和IV皮质类固醇疗法来消退。
表1-每周剂量递增下的剂量限制性毒性(DLT)的总结
根据这些数据，宣布对于每周定量用药，MTD为600ng/kg。
每周给药：RP2D-QW组结果
每周剂量递增组的PK和安全性数据的综述表明，IMCgp100的毒性较严重和药物暴露较高与给药的绝对剂量较高相关。基于这些数据和在600ng/kg的MTD下给药的绝对剂量范围(N＝5pts，范围为34μg至66μg QW，中位剂量为54μg)，首先确定每周定量用药方案的2期推荐剂量(指定RP2D-QW)为在每周基础上按50μg的平稳剂量给药。
在此期间，另外三名患者出现了涉及2级或更高级的低血压的不良反应。仅限于在前两次剂量(例如周期1第1天(C1D1)和周期1第8天(C1D8))中观察到这些反应(图5)。在避免重度低血压反应的尝试中，IMCgp100的第一剂量随后被降低至40μg；然而，在C1D1和/或C1D8定量用药后，观察到另外两名患者有低血压(3/4级)；在第三剂量后有一名患者也经历了2级低血压。随后的剂量后未报告严重低血压病例。应该注意的是，发明人观察到低血压的频率和严重程度与患者肿瘤内gp100表达水平之间的联系，葡萄膜黑色素瘤患者的gp100表达水平特别高，并且因此毒性风险更高。
由于肿瘤内gp100表达水平高而处于高毒性风险中的另外7名患者(6名葡萄膜黑色素瘤和1名皮肤黑色素瘤)参与了每周剂量扩大期，接受20μg的第一剂量(C1D1)，然后接受30μg的第二剂量(C1D8)，最后变为50μg平稳剂量作为第三剂量以及后续剂量。令人惊讶的是，尽管这7名患者经历gp100表达介导的毒性的风险较高，但没有报道这些患者有重度(3/4级)低血压。
下表2总结了研究中使用的三种用量方案、每种方案治疗的患者的数量和报告的低血压不良反应的数量。
表2-每周用量方案和低血压反应的总结
这些数据证明了在治疗gp100阳性癌症患者时改善药物相关的重度低血压的两步患者内剂量递增方案的惊人益处。
低血压是由淋巴细胞贩运和细胞因子释放引起的对按每周RP2D定量用药的患者亚组的血液进行分析，显示在进行了IMCgp100给药后淋巴细胞贩运显著。在输注后约12至24小时，淋巴细胞水平显著下降，在第8天恢复至基线水平。在重度和/或严重低血压的情况下，这种效应更为意义深远(图6)。细胞因子分析显示一种或多种炎性细胞因子水平适度。观察到外周增加最大的是组织化学引诱物趋化因子的水平，其与外周循环淋巴细胞的瞬时下降相似，通常在定量用药后48小时消退并在第8天达到给药前水平。
进一步测试患者内的用量方案
在上述I期研究中，来自治疗的患者的肿瘤应答数据的回顾性综述通常注意到，接受了较高的绝对剂量(约65μg-85μg)的患者获得了客观应答。因此，假设，在C1D1使用20μg且在C1D8使用30μg可以使得在周期1第15天(C1D15)及后续剂量允许更高的绝对剂量(即高于50μg)并且可以改善功效。
为了测试这一点，在针对晚期葡萄膜黑色素瘤患者的正在进行的I期多中心开放标签研究中，进一步研究IMCgp100(临床试验标识符：NCT02570308)。该研究的第一部分遵循标准的3+3剂量递增设计。第一组患者接受IMCgp100，通过静脉内输注在C1D1按固定剂量20μg并且在C1D8按固定剂量30μg来给药，然后从C1D15起按60μg定量用药。初步数据表明，没有报告该组患者有重度低血压相关反应(n＝3)。另外的患者组将在C1D15接受较高剂量(例如，70μg、80μg或更高)。
实施例2-IMCgp100与其他免疫调节药物组合给药引起重度低血压风险增加的证据
在存在或不存在抗PD-L1/PD-1和CTLA-4的检查点抑制剂抗体的情况下，体外研究IMCgp100介导的免疫活化。
IMCgp100与抗-CTLA-4组合增加T细胞应答效力
在该实验中，使用T细胞增殖作为效力读数。在存在或不存在40ug/ml抗CTLA-4(克隆L3D10；Biolegend)的情况下，使用浓度为80pM的IMCgp100。使用10nM或100nM gp100肽脉冲的HLA-A*02阳性单核细胞作为靶抗原呈递细胞，并以10,000个细胞/孔铺板。用CellTracker Violet标记效应CD3+T细胞。5天后，使用基于FACS的Intellicyt测定法测量T细胞增殖。
图7中呈现的结果显示，与单独的IMCgp100相比，IMCgp100与抗CTLA-4组合导致T细胞应答改善(在较低的肽浓度下)，表明与IMCgp100单一疗法相比，用这种组合治疗患者可能具有更高水平的效力和gp100特异性中靶脱肿瘤毒性。
IMCgp100与抗PD-L1组合增加T细胞杀伤效力
在该实验中，使用T细胞杀伤作为效力的读数。在存在或不存在10μg/ml抗PD-L1(克隆29E.2A3；BioLegend)的情况下，使用浓度为80pM和100pM的IMCgp100。使用HLA-A*02阳性Mel624细胞作为靶抗原呈递细胞。使用CD8+T细胞作为效应细胞，效靶比为5:1。使用Incucyte ZOOM测定在3天内测量T细胞杀伤。监测靶细胞中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7活化作为细胞凋亡的量度(每2小时成像)。
图8中呈现的结果显示，与单独的IMCgp100相比，IMCgp100与抗PD-L1组合导致T细胞杀伤增强，表明与IMCgp100单一疗法相比，用这种组合治疗患者可能具有更高水平的效力和gp100特异性中靶脱肿瘤毒性。
IMCgp100与抗CTLA-4或抗PD-L1组合增加促炎细胞因子的产生
在该实验中，使用来自Meso Scale Discovery的V-PLEX人促炎组1测定试剂盒来评估细胞因子分泌。
对于IMCgp100与抗CTLA-4和抗PD-L1的组合，分别在从增殖测定和杀伤测定起24小时时取上清液样品。
在图9所示的数据表明与单独的IMCgp100相比，在IMCgp100和抗CTLA-4存在下，IFNγ、TNFα和IL-2的分泌增强。
图10中所示的数据表明与单独的IMCgp100相比，在IMCgp100和抗PD-L1存在下，IFNγ的分泌增强。
这些数据表明与IMCgp100单一疗法相比，IMCgp100组合疗法增加免疫活化，因此对于接受组合疗法的患者，由于靶向gp100阳性黑色素细胞的中靶脱肿瘤而导致重度低血压的风险可能增加。

Claims (15)

1.一种T细胞重定向双特异性治疗剂的组合在制备用于治疗患者中gp100阳性癌症的药物中的用途，其中所述组合包含至少一个第一T细胞重定向双特异性治疗剂、至少一个第二T细胞重定向双特异性治疗剂和至少一个第三T细胞重定向双特异性治疗剂，其中所述第一、第二和第三T细胞重定向双特异性治疗剂均包含：(i)与YLEPGPVTA-HLA-A2复合物结合的T细胞受体(TCR)；(ii)抗CD3抗体，其与所述复合物融合，并且其中所述第一、第二和第三T细胞重定向双特异性治疗剂中的每一者包括相同的TCRα链氨基酸序列和相同的TCRβ链-抗CD3氨基酸序列，其中所述TCRα链氨基酸序列选自由以下组成的组：
(i)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是S；
(ii)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是A；
(iii)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是G；
(iv)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是S，并且基于SEQ ID No:2的编号，截短α链的C末端的F196至S203这8个氨基酸；
(v)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是A，并且基于SEQ ID No:2的编号，截短α链的C末端的F196至S203这8个氨基酸；和
(vi)SEQ ID No:2的TCRα链序列，其中第1至109个氨基酸被SEQ ID No:4的序列替换，其中第1位氨基酸是G，并且基于SEQ ID No:2的编号，截短α链的C末端的F196至S203这8个氨基酸；
并且所述TCRβ链-抗CD3氨基酸序列选自由以下组成的组：
(vii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为D和I；
(viii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为A和I；
(ix)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为A和Q；
(x)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为D和I，第108至131位氨基酸被RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG(SEQ ID No:6)取代，并且第254至258位氨基酸被GGEGGGSEGGGS(SEQ ID No:7)取代；
(xi)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为D和I，第257位氨基酸为S，并且第258位氨基酸为G；
(xii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为D和I，第256位氨基酸为S，并且第258位氨基酸为G；
(xiii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为D和I，第255位氨基酸为S，并且第258位氨基酸为G；
(xiv)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸是A和Q，并且其中第257位氨基酸是S，并且第258位氨基酸是G；
(xv)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸是A和Q，并且其中第256位氨基酸是S，并且第258位氨基酸是G；
(xvi)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸是A和Q，并且其中第255位氨基酸是S，并且第258位氨基酸是G；
(xvii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为A和I，并且其中第257位氨基酸是S，并且第258位氨基酸是G；
(xviii)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为A和I，并且其中第256位氨基酸是S，并且第258位氨基酸是G；和
(xix)SEQ ID No:5的TCRβ链-抗CD3序列，其中第1和第2位氨基酸分别为A和I，并且其中第255位氨基酸是S，并且第258位氨基酸是G；
并且其中：
(a)所述至少一个第一T细胞重定向双特异性治疗剂被用于施用范围为10μg至30μg的T细胞重定向双特异性治疗剂；
(b)所述至少一个第二T细胞重定向双特异性治疗剂被用于施用范围为20μg至40μg的T细胞重定向双特异性治疗剂，其中所述第二T细胞重定向双特异性治疗剂或每个第二T细胞重定向双特异性治疗剂被用于施用比所述第一T细胞重定向双特异性治疗剂更高的剂量；和
(c)所述至少一个第三T细胞重定向双特异性治疗剂被用于施用至少50μg的T细胞重定向双特异性治疗剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，各T细胞重定向双特异性治疗剂被用于每7天施用。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述至少一个第一T细胞重定向双特异性治疗剂被用于施用20μg的T细胞重定向双特异性治疗剂，并且所述至少一个第二T细胞重定向双特异性治疗剂被用于施用30μg的T细胞重定向双特异性治疗剂。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述至少一个第一T细胞重定向双特异性治疗剂被用于施用20μg的T细胞重定向双特异性治疗剂，所述至少一个第二T细胞重定向双特异性治疗剂被用于施用30μg的T细胞重定向双特异性治疗剂，和/或所述至少一个第三T细胞重定向双特异性治疗剂被用于施用至少50μg的T细胞重定向双特异性治疗剂。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述至少一个第三T细胞重定向双特异性治疗剂被用于施用至少60μg的T细胞重定向双特异性治疗剂。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述T细胞重定向双特异性治疗剂的组合包含两个第二T细胞重定向双特异性治疗剂。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是胞外α链序列为SEQ ID No:2和胞外β链序列为SEQ ID No:3的TCR的结合亲和力和/或结合半衰期的至少两倍。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
α链氨基酸序列是(i)，β链-抗CD3氨基酸序列是(vii)；
α链氨基酸序列是(i)，β链-抗CD3氨基酸序列是(x)；
α链氨基酸序列是(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列是(ix)；
α链氨基酸序列是(v)，β链-抗CD3氨基酸序列是(viii)；
α链氨基酸序列是(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列是(vii)；
α链氨基酸序列是(i)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xi)；
α链氨基酸序列是(i)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xii)；
α链氨基酸序列是(i)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xiii)；
α链氨基酸序列是(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xiv)；
α链氨基酸序列为(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列为(xv)；
α链氨基酸序列为(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列为(xvi)；
α链氨基酸序列是(v)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xvii)；
α链氨基酸序列是(v)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xviii)；
α链氨基酸序列是(v)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xix)；
α链氨基酸序列为(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列为(xi)；
α链氨基酸序列是(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xii)；和
α链氨基酸序列是(vi)，β链-抗CD3氨基酸序列是(xiii)。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(v)，且所述β链-抗CD3氨基酸序列是(viii)。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物与一种或多种抗癌疗法组合给药。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述抗癌疗法是度伐鲁单抗、曲美木单抗、galunisertib或美雷替尼。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述抗癌疗法是美雷替尼，并且美雷替尼的剂量为每天一次40mg至120mg。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述美雷替尼的剂量为每天一次80mg至120mg。
14.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述gp100阳性癌症是黑色素瘤。
15.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述gp100阳性癌症是葡萄膜黑色素瘤。
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