CN109946410A - 一种分析单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分析轻链含有一个N糖的单克隆抗体的电荷异质性方法。本发明通过选择合适的实验条件，使待分析的蛋白样品中的目的单克隆抗体、酸性异构体和碱性异构体等各组分实现有效分离，并能确定图谱中各组分的相对含量，方法的重复性好，具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种离子交换色谱检测方法，具体地说，涉及用于分析轻链含有一个N糖的单克隆抗体的电荷异质性的离子交换色谱检测方法。
背景技术
治疗性单克隆抗体药物作为一种靶向性生物治疗药物，至1986年获得FDA批准以来，经过30余年的市场考验，已成为目前全球药物研发的热点。截止到2013年2月，已有34个治疗性抗体获得美国FDA批准上市，用于各种疾病的治疗。其中IgG1型单克隆抗体是获批最多的治疗性单克隆抗体种类，其一般由两条轻重链组成，重链含有一个N糖基化位点，形成复杂的四聚体结构，总体分子量约150KD左右。
单克隆抗体分子一般呈现微观不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体。这些异构体可能来自抗体分子复杂的生物合成途径，如细胞系及培养工艺，也可能来自纯化、制剂等制造过程及贮存过程的任何阶段。其中由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，电荷异质性对单克隆抗体的稳定性及其生物学功能发挥具有重要的影响而成为关键质量属性(CQA)，并且电荷异质性可反映其生产工艺的稳定性，所以受到生物技术产业界及监管机构的密切关注。
目前，检测单克隆抗体电荷异质性的方法有等电聚焦电泳(IEF)、毛细管等点聚焦电泳(cIEF)、离子交换色谱(CEX)、疏水色谱等。等电聚焦电泳可快速检测抗体的等电点，普及性较广，但抗体在IEF图谱上是弥散条带，无法精确分析每个电荷变体。毛细管等点聚焦电泳可更精确的分离每个电荷变体，但与IEF原理一样，是根据抗体表面电荷分布的差异分离多种变体，且cIEF操作耗时，不易标准化。离子交换色谱是根据蛋白组分与色谱介质之间离子作用力大小差异进行分离，由于高分辨性能的离子交换色谱填料技术的发展，固定相与蛋白组分之间其他非特异性作用得到了较好的抑制，使电荷差异极小的电荷不均一性组分能获得较好的分离。
在电荷异质性的质控方法的研究进展中，对于IgG1型单克隆抗体的相关研究比较成熟，其电荷异构体一般分为酸性异构体和碱性异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关。而IgG1型单克隆抗体中有一类单克隆抗体，其轻链分子上含有一个N糖链，电荷异质性更为复杂，用传统的质控方法(例如使用磷酸钠和MES((N-吗啉)-乙磺酸作为阳离子交换缓冲液的离子交换色谱)无法实现有效的分离电荷异构体，因此有必要提供一种用于分析轻链含有一个N糖的单克隆抗体的电荷异质性的离子交换色谱检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的基于离子交换色谱技术的单克隆抗体电荷异质性的分析方法，适用于轻链含有一个N糖的单克隆抗体类药物的质控分析。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种分析单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法，检测条件包括：采用弱阳离子色谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中，所述的流动相A为缓冲液溶液，所述的流动相B为缓冲液-盐溶液，所述的缓冲液为HEPES。
根据本发明的优选实施例，所述的弱阳离子色谱柱为PropacWCX-10色谱柱。
根据本发明的优选实施例，所述的流动相A和所述的流动相B还包括变性剂。
根据本发明的优选实施例，所述的变性剂的浓度范围为0.5-2M。
根据本发明的优选实施例，所述的变性剂为尿素。
根据本发明的优选实施例，所述的流动相A和所述的流动相B的pH为6.5-8.0，优选为7.5-8.0。
根据本发明的优选实施例，所述的缓冲液的浓度范围为5-50mM。
根据本发明的优选实施例，所述的缓冲液的浓度范围为20mM。
根据本发明的优选实施例，所述的盐的浓度范围为0.2-2M。
根据本发明的优选实施例，所述的盐的浓度范围为0.5M。
根据本发明的优选实施例，所述的盐为NaCl。
根据本发明的优选实施例，所述的梯度洗脱的条件为0.0-5.0min，100％流动相A；5.0-20min，60-91％流动相A+9-40％流动相B；20.1-25.0min，100％流动相B；25.1-30.0min，100％流动相A，优选的，所述的梯度洗脱的条件为0.0-5.0min，100％流动相A；5.0-20min，80-91％流动相A+9-20％流动相B；20.1-25.0min，100％流动相B；25.1-30.0min，100％流动相A，更优选的，所述的梯度洗脱的条件0.0-5.0min，100％流动相A；5.0-20min，91％流动相A+9％流动相B；20.1-25.0min，100％流动相B；25.1-30.0min，100％流动相A。
根据本发明的优选实施例，所述的检测条件还包括：流速为0.5ml/min-1.5ml/min，优选为1.0ml/min；柱温为20℃-60℃，优选为34℃；检测波长为280nm。
根据本发明的优选实施例，所述的单克隆抗体为IgG1型单克隆抗体。
根据本发明的优选实施例，所述的IgG1型单克隆抗体的轻链上含有一个N糖链。
有益效果：
1、通过选择合适的实验条件，使待分析的蛋白样品中的目的单克隆抗体、酸性异构体和碱性异构体等各组分实现有效分离；
2、能确定图谱中各组分的相对含量；
3、方法的重复性好。
附图说明
注：所用附图的横坐标为时间单位(分)，纵坐标为UV，吸收强度单位AU。
图1显示了单克隆抗体原液SEC-HPLC纯度图谱。
图2显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM PB溶液，PH 7.5(A)；20mM PB-200mM NaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：20/20/60/100/100/20/20B％at0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图3显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM PB溶液，PH 7.5(A)；20mM PB-200mM NaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/70/100/100/0/0B％at0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图4显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM PB溶液，PH 7.5(A)；20mM PB-200mM NaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/50/100/100/0/0B％at0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图5显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM PB溶液，PH 7.5(A)；20mM PB-200mM NaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/35/100/100/0/0B％at0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图6显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM PB-1M尿素溶液，PH7.5(A)；20mM PB-1M尿素-200mM NaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/40/100/100/0/0B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图7显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM MES溶液，PH 6.5(A)；20mM MES-240mM NaCl溶液，PH 6.5(B)为流动相，梯度洗脱：20/20/60/100/100/20/20B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图8显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM MES-1M尿素溶液，PH6.5(A)；20mM MES-1M尿素-240mM NaCl溶液，PH 6.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/50/100/100/0/0B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图9显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM MES-1M尿素溶液，PH6.5(A)；20mM MES-1M尿素-240mM NaCl溶液，PH 6.5(B)为流动相，梯度洗脱：20/20/50/100/100/20/20B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图10显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM HEPES溶液，PH 7.5(A)；20mM HEPES-0.5MNaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：20/20/60/100/100/20/20B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图11显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM HEPES溶液，PH 7.5(A)；20mM HEPES-0.5MNaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/40/100/100/0/0B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图12显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM HEPES溶液，PH 7.5(A)；20mM HEPES-0.5MNaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/30/100/100/0/0B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图13显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM HEPES-0.5M尿素溶液，PH 7.5(A)；20mM HEPES-0.5M尿素-0.5MNaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/20/100/100/0/0B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图14显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM HEPES-1.0M尿素溶液，PH 7.5(A)；20mM HEPES-1.0M尿素-0.5MNaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/15/100/100/0/0B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图15显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM HEPES-2.0M尿素溶液，PH 7.5(A)；20mM HEPES-2.0M尿素-0.5MNaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/10/100/100/0/0B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图16显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM HEPES-2.0M尿素溶液，PH 7.5(A)；20mM HEPES-2.0M尿素-0.5MNaCl溶液，PH 7.5(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/9/100/100/0/0B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图17显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM HEPES-2.0M尿素溶液，PH 8.0(A)；20mM HEPES-2.0M尿素-0.5MNaCl溶液，PH 8.0(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/9/100/100/0/0B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的单克隆抗体弱阳离子交换色谱图。
图18显示了以PropacWCX-10弱阳离子交换柱为填充剂，20mM HEPES-2.0M尿素溶液，PH 8.0(A)；20mM HEPES-2.0M尿素-0.5MNaCl溶液，PH 8.0(B)为流动相，梯度洗脱：0/0/9/100/100/0/0B％at 0.0/5.0/20.0/20.1/25.0/25.1/30.0min，流速1.0ml/min，柱温34℃，样品池温度4℃，检测波长280nm条件下的连续三批单克隆抗体原液弱阳离子交换叠加色谱图。
具体实施方式
以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明。
实施例1
一、轻链含糖单克隆抗体的获得
为了示例性的目的，本研究选取IgG1型抗CD43单克隆抗体(按照中国专利ZL200680020846.5中公开的方法制备获得抗CD43单克隆抗体并在CHO细胞中进行生产)作为实验样品，经检定该抗体轻链含有一个N糖链。由于不同靶点的IgG1型单克隆抗体的序列除CDR区域外，存在高度的相似性，因此对于本研究的结果也同样适用。
复苏重组表达细胞株，接种至125ml摇瓶后放置于二氧化碳振荡培养箱中进行培养，培养条件37℃、110rpm、5％CO2，按照3天一次的传代周期进行细胞扩增，待细胞悬液达到接种数量后，将其接种至细胞罐生物反应器，接种密度为4×105细胞/ml，设定罐培养参数37℃、80rpm、50％DO、pH7.0～7.2，按照培养工艺分别在3、5、7、9、11、13天流加营养添加剂cell boost 7a和7b，维持葡萄糖浓度在2g/L以上，自罐接种开始，每日取样检测细胞状态和代谢水平，待培养时间达到14天或细胞活率低于70％时停止培养。将罐培养细胞悬液经深层过滤除去细胞及碎片，得到收获液进行纯化。
单克隆抗体纯化采用单克隆抗体纯化的平台工艺，细胞培养上清液经过ProteinA亲和层析捕获后，亲和主峰采用pH孵育的方式进行病毒灭活，然后经过一步阳离子交换层析及一步阴离子交换层析进一步去除工艺相关杂质，最后经超滤换液后得到单克隆抗体原液。
二、样品的纯度检测
将单克隆抗体原液进行SEC-HPLC分析，检测样品纯度，检测结果详见图1。
实施例2
一、实验条件
高效液相色谱仪器：Waters e2695系统；色谱柱：PropacWCX-10弱阳离子交换柱(4mm×250mm)；流动相：20mM PB溶液，PH 7.5(A)；20mM PB-200mM NaCl溶液，PH 7.5(B)，梯度洗脱(程序见表1)；流速1.0ml/min；样品池温度4℃；柱温34℃；UV检测器，检测波长280nm；进样量30μg。
表1梯度洗脱程序
二、数据分析
本实施例使用磷酸钠缓冲液系统为流动相对单克隆抗体原液进行分析，CEX-HPLC图谱如图2所示。结果发现目的单克隆抗体和电荷变体在色谱柱几乎没有保留，无法对其进行有效的质控分析。
实施例3
一、实验条件
高效液相色谱仪器：Waters e2695系统；色谱柱：PropacWCX-10弱阳离子交换柱(4mm×250mm)；流动相：20mM PB溶液，PH 7.5(A)；20mM PB-200mM NaCl溶液，PH 7.5(B)，梯度洗脱(程序分别见表2至表4)；流速1.0ml/min；样品池温度4℃；柱温34℃；UV检测器，检测波长280nm；进样量30μg。
表2梯度洗脱程序
表3梯度洗脱程序
表4梯度洗脱程序
二、数据分析
本实施例使用磷酸钠缓冲液系统为流动相对单克隆抗体原液进行分析，并且在梯度洗脱程序中依次降低流动相B的含量，CEX-HPLC图谱如图3至图5所示。结果发现目的单克隆抗体和电荷变体在色谱柱几乎没有保留，无法对其进行有效的质控分析。
以上结果说明使用磷酸钠缓冲液系统为流动相并优化梯度洗脱程序仍然无法明显改善目的单克隆抗体和电荷变体的分离效果。
实施例4
一、实验条件
高效液相色谱仪器：Waters e2695系统；色谱柱：PropacWCX-10弱阳离子交换柱(4mm×250mm)；流动相：20mM PB-1M尿素溶液，PH 7.5(A)；20mM PB-1M尿素-200mM NaCl溶液，PH 7.5(B)，梯度洗脱(程序见表5)；流速1.0ml/min；样品池温度4℃；柱温34℃；UV检测器，检测波长280nm；进样量30μg。
表5梯度洗脱程序
二、数据分析
本实施例使用磷酸钠缓冲液系统为流动相对单克隆抗体原液进行分析，并且在流动相中添加尿素，CEX-HPLC图谱如图6所示。结果发现目的单克隆抗体和电荷变体在色谱柱几乎没有保留，无法对其进行有效的质控分析。
以上结果说明使用磷酸钠缓冲液系统并加入尿素作为流动相仍然无法明显改善目的单克隆抗体和电荷变体的分离效果。
实施例5
一、实验条件
高效液相色谱仪器：Waters e2695系统；色谱柱：PropacWCX-10弱阳离子交换柱(4mm×250mm)；流动相：20mM MES溶液，PH 6.5(A)；20mM MES-240mM NaCl溶液，PH 6.5(B)，梯度洗脱(程序见表6)；流速1.0ml/min；样品池温度4℃；柱温34℃；UV检测器，检测波长280nm；进样量30μg。
表6梯度洗脱程序
二、数据分析
本实施例使用MES缓冲液系统为流动相对单克隆抗体原液进行分析，CEX-HPLC图谱如图7所示。结果发现与磷酸钠缓冲体系相比，使用MES缓冲液系统将导致分析物的洗脱时间更长，目的单克隆抗体和电荷变体能够实现分离。
以上结果说明使用MES缓冲液系统作为流动相能够在一定程度上改善目的单克隆抗体和电荷变体的分离效果。
实施例6
一、实验条件
高效液相色谱仪器：Waters e2695系统；色谱柱：PropacWCX-10弱阳离子交换柱(4mm×250mm)；流动相：20mM MES-1M尿素溶液，PH 6.5(A)；20mM MES-1M尿素-240mM NaCl溶液，PH 6.5(B)，梯度洗脱(程序分别见表7和表8)；流速1.0ml/min；样品池温度4℃；柱温34℃；UV检测器，检测波长280nm；进样量30μg。
表7梯度洗脱程序
表8梯度洗脱程序
二、数据分析
本实施例使用MES缓冲液系统为流动相对单克隆抗体原液进行分析，并且在流动相中添加尿素，CEX-HPLC图谱如图8和图9所示。结果发现使用表7中的梯度洗脱程序时，目的单克隆抗体和电荷变体的分离度不够，存在共流出，导致不能够准确定量或定量结果不重现，而通过采用表8中的梯度洗脱程序调整梯度，采用一个较缓的梯度，缩小梯度变化范围，目的单克隆抗体和电荷变体的分离度得到适当的增加。
以上结果说明使用MES缓冲液系统并且加入尿素作为流动相以及缩小梯度变化范围能够更好地改善目的单克隆抗体和电荷变体的分离效果。
实施例7
一、实验条件
高效液相色谱仪器：Waters e2695系统；色谱柱：PropacWCX-10弱阳离子交换柱(4mm×250mm)；流动相：20mM HEPES溶液，PH 7.5(A)；20mM HEPES-0.5MNaCl溶液，PH 7.5(B)，梯度洗脱(程序见表9)；流速1.0ml/min；样品池温度4℃；柱温34℃；UV检测器，检测波长280nm；进样量30μg。
表9梯度洗脱程序
二、数据分析
本实施例使用HEPES缓冲液系统为流动相对单克隆抗体原液进行分析，CEX-HPLC图谱如图10所示。结果发现目的单克隆抗体和电荷变体在色谱柱无保留，无法对其进行有效的质控分析。
实施例8
一、实验条件
高效液相色谱仪器：Waters e2695系统；色谱柱：PropacWCX-10弱阳离子交换柱(4mm×250mm)；流动相：20mM HEPES溶液，PH 7.5(A)；20mM HEPES-0.5MNaCl溶液，PH 7.5(B)，梯度洗脱(程序分别见表10和表11)；流速1.0ml/min；样品池温度4℃；柱温34℃；UV检测器，检测波长280nm；进样量30μg。
表10梯度洗脱程序
表11梯度洗脱程序
二、数据分析
本实施例使用HEPES缓冲液系统为流动相对单克隆抗体原液进行分析，并且优化洗脱程序采用较缓的梯度，缩小梯度变化范围，CEX-HPLC图谱如图11和图12所示。结果发现与磷酸钠缓冲液系统和MES缓冲液系统相比，使用HEPES缓冲液系统作为流动相时目的单克隆抗体和电荷变体的分离度得到适当的增加，能够实现有效的分离。
以上结果说明使用HEPES缓冲液系统为流动相并缩小梯度变化范围能够明显改善目的单克隆抗体和电荷变体的分离效果。
实施例9
一、实验条件
高效液相色谱仪器：Waters e2695系统；色谱柱：PropacWCX-10弱阳离子交换柱(4mm×250mm)；流速1.0ml/min，流动相及梯度洗脱程序分别见表12至表15；样品池温度4℃；柱温34℃；UV检测器，检测波长280nm；进样量30μg。
表12梯度洗脱程序
表13梯度洗脱程序
表14梯度洗脱程序
表15梯度洗脱程序
二、数据分析
本实施例使用HEPES缓冲液系统为流动相对单克隆抗体原液进行分析，并且在流动相中加入尿素以及优化洗脱程序采用较缓的梯度，缩小梯度变化范围，CEX-HPLC图谱如图13至图15所示。结果发现使用HEPES缓冲液系统并加入尿素作为流动相时目的单克隆抗体和电荷变体的分离度得到适当的增加，能够实现有效的分离，并且随着缓冲液中尿素浓度的增加，目的单克隆抗体和电荷变体的分离度明显增加。
进一步的，发现图15中色谱峰保留时间在12min-20min之间，而靠近22min处存在梯度峰，考虑到在实际质量控制中，由于流动相、温度、仪器等的影响色谱峰会有1-2min的偏差，导致梯度峰会影响供试品色谱峰的质控控制，因此对色谱峰保留时间进一步优化至图16所示。
以上结果说明使用HEPES缓冲液系统并且加入尿素作为流动相并缩小梯度变化范围能够明显改善目的单克隆抗体和电荷变体的分离效果。
实施例10
一、实验条件
高效液相色谱仪器：Waters e2695系统；色谱柱：PropacWCX-10弱阳离子交换柱(4mm×250mm)；流速1.0ml/min，流动相及梯度洗脱程序见表16；样品池温度4℃；柱温34℃；UV检测器，检测波长280nm；进样量30μg。
表16梯度洗脱程序
二、数据分析
本实施例使用HEPES缓冲液系统为流动相对单克隆抗体原液进行分析，并且在流动相中加入尿素以及调节缓冲液系统pH为8.0，CEX-HPLC图谱如图17所示。结果发现使用HEPES缓冲液系统并加入尿素作为流动相以及调节缓冲液系统pH为8.0时目的单克隆抗体和电荷变体同样能够实现有效的分离。
实施例11
一、实验条件
采用实施例10中的实验条件分析三批单克隆抗体原液。
二、数据分析
本实施例采用实施例10中的实验条件连续分析三批单克隆抗体原液，CEX-HPLC图谱如图18所示，单克隆抗体原液中各组分的百分含量结果如表17所示。
表17三批单克隆抗体各组分的百分含量
结果发现三批单克隆抗体原液分析均实现了目的单克隆抗体和电荷变体有效的分离，在CEX-HPLC图谱上共产生5个组分峰。以上结果说明本发明优化后的离子交换色谱检测方法比较稳定，利用该方法可检测出单克隆抗体各组分的百分含量，从而可以用于单克隆抗体产品生产中的质量检测及控制。
Claims (10)
1.一种分析单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法，其特征在于，检测条件包括：采用弱阳离子色谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中，所述的流动相A为缓冲液溶液，所述的流动相B为缓冲液-盐溶液，所述的缓冲液为HEPES。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的弱阳离子色谱柱为PropacWCX-10色谱柱。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相A和所述的流动相B还包括变性剂，优选的，所述的变性剂的浓度范围为0.5-2M。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的变性剂为尿素。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相A和所述的流动相B的pH为6.5-8.0，优选为7.5-8.0。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液的浓度范围为5-50mM，优选的，所述的缓冲液的浓度范围为20mM。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的盐的浓度范围为0.2-2M，优选的，所述的盐的浓度范围为0.5M，更优选的，所述的盐为NaCl。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脱的条件为0.0-5.0min，100％流动相A；5.0-20min，60-91％流动相A+9-40％流动相B；20.1-25.0min，100％流动相B；25.1-30.0min，100％流动相A，优选的，所述的梯度洗脱的条件为0.0-5.0min，100％流动相A；5.0-20min，80-91％流动相A+9-20％流动相B；20.1-25.0min，100％流动相B；25.1-30.0min，100％流动相A，更优选的，所述的梯度洗脱的条件0.0-5.0min，100％流动相A；5.0-20min，91％流动相A+9％流动相B；20.1-25.0min，100％流动相B；25.1-30.0min，100％流动相A。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测条件还包括：流速为0.5ml/min-1.5ml/min，优选为1.0ml/min；柱温为20℃-60℃，优选为34℃；检测波长为280nm。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单克隆抗体为IgG1型单克隆抗体，优选的，所述的IgG1型单克隆抗体的轻链上含有一个N糖链。
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