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CN109929039A - 基于cd276抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用 - Google Patents

基于cd276抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用 Download PDF

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CN109929039A
CN109929039A CN201910243041.6A CN201910243041A CN109929039A CN 109929039 A CN109929039 A CN 109929039A CN 201910243041 A CN201910243041 A CN 201910243041A CN 109929039 A CN109929039 A CN 109929039A
Authority
CN
China
Prior art keywords
car
gly
ser
leu
ala
Prior art date
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Pending
Application number
CN201910243041.6A
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English (en)
Inventor
李峰
张毅
盛誉乔
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First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CD276抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体为CD276‑28z‑CAR嵌合抗原受体、CD276‑BBz‑CAR或CD276‑28BBz‑CAR嵌合抗原受体，所述CD276‑28z‑CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD276‑BBz‑CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CD276‑28BBz‑CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明构建的嵌合抗原受体采用亲和力较强的scFv序列构建，由此产生的CAR‑T细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。

Description

基于CD276抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CD276抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)是一种人工合成的结构。利用转基因技术，将CAR序列转导入T细胞中，能够产生识别特异靶点、杀伤肿瘤细胞的CAR-T细胞，CAR-T细胞展示出良好的抗肿瘤活性。
CAR主要由3部分构成：胞外识别区、信号转导区和胞内信号区。其中，胞外识别区决定了CAR-T细胞杀伤的特异性，往往由scFv序列构成，scFv序列的特异性和亲和性决定了CAR-T细胞治疗的安全性和有效性。选择亲和力较强的特异scFv有助于提高CAR-T细胞治疗效果。胞内共刺激信号分子(CD28和/或41BB)对维持CAR-T细胞杀伤活性至关重要。
CD276是在肿瘤中广泛表达的膜抗原，是较好的CAR-T细胞治疗靶点。但是，目前针对该靶点的治疗研究较少，特别是不清楚采取何种scFv能够取得最佳治疗效果。
发明内容
本发明主要提供了一种基于CD276抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用，构建的嵌合抗原受体采用亲和力较强的scFv序列构建，由此产生的CAR-T细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。其技术方案如下：
一种基于CD276抗体的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为CD276-28z-CAR嵌合抗原受体、CD276-BBz-CAR或CD276-28BBz-CAR嵌合抗原受体，所述CD276-28z-CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD276-BBz-CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CD276-28BBz-CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述CD276-28z-CAR嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、CD276单链抗体、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜区与胞内区、人CD3z分子胞内区串联构成；
其中，所述人CD8a分子信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CD276单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，人CD28分子跨膜区与胞内区的氨基酸序列如SEQID NO.6所示，人CD3z分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，所述CD276-BBz-CAR嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、CD276单链抗体、人CD8a分子柔性片段与跨膜区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区串联构成；
其中，人CD8a分子信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CD276单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，跨膜区和人41BB分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，人CD3z分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，所述CD276-28BBz-CAR嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、CD276单链抗体、人CD8a分子柔性片段与跨膜区、人CD28和41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区串联构成；
其中，人CD8a分子信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CD276单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，跨膜区和CD28及41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，人CD3z分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
一种慢病毒表达载体，所述载体载有上述嵌合抗原受体。
优选的，所述嵌合抗原受体为在pCDH-EF1-MSC质粒中表达，形成pCDH-EF1-CAR-CD276-28z、pCDH-EF1-CAR-CD276-BBz或pCDH-EF1-CAR-CD276-28BBz质粒。
一种慢病毒，所述慢病毒为将上述慢病毒表达载体与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染靶细胞得到。
一种CAR-T细胞的构建方法，包括：
(1)CAR序列合成：构建CD276-28z-CAR嵌合抗原受体、CD276-BBz-CAR或CD276-28BBz-CAR嵌合抗原受体；
(2)表达载体构建：将嵌合抗原受体在pCDH-EF1-MSC质粒中表达，形成pCDH-EF1-CAR-CD276-28z、pCDH-EF1-CAR-CD276-BBz或pCDH-EF1-CAR-CD276-28BBz质粒；
(3)慢病毒包装：将步骤(2)的质粒与包装质粒混合，包装形成慢病毒；
(4)T细胞纯化与感染：纯化T细胞，用慢病毒转染T细胞，获得CAR-T细胞；
(5)T细胞CAR表达效率检测：检测T细胞表面CAR表达情况；
(6)CAR-T细胞体外扩增：对CAR-T细胞扩增。
上述嵌合抗原受体可应用于识别特异靶点CD276的CAR-T细胞的制备中。
采用上述方案，本发明具有以下优点：
抗原表达强度和识别抗体亲和力等因素影响了CAR-T细胞治疗效果。本发明以肿瘤广泛高表达的CD276为靶点进行CAR-T细胞治疗，结果显示该抗原是较好的肿瘤治疗靶点。同时，本发明采用了亲和力增强的抗CD276scFv作为CAR-T细胞识别区，可以更加有效地捕获相应抗原阳性肿瘤细胞，有助于免疫细胞治疗效果改善。通过添加胞内刺激信号(CD28或41BB)，能够改善T细胞功能。此类转基因修饰的CAR-T细胞具备更强、更持久的杀伤能力，有望提高肿瘤治疗效果。
附图说明
图1为实施例1中CD276-28z-CAR结构示意图；
图2为CD276-BBz-CAR结构示意图；
图3为CD276-28BBz-CAR结构示意图；
图4为流式细胞术检测T细胞表达CAR表达情况图；
图5为CAR-T细胞增殖情况图；
图6为CD276的表达情况图；
图7为CAR-T细胞特异杀伤肿瘤细胞结果图；
图8为CAR-T细胞分泌细胞因子能力图；
图9为对比例1中CD276-28z-CAR结构示意图；
图10为实施例1与对比例1中的结构传递T细胞活化信号情况对比图；
图11为实施例1与对比例1中CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤活性对比图。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。
实施例1
一、CAR结构
1.CD276-28z-CAR结构
如图1所示，CAR基本结构包括：人CD8a分子信号肽(Leadingsignal)、CD276单链抗体(scFv)、人CD8a分子柔性片段(CD8Hinge)、人CD28分子跨膜区与胞内区(CD28)，人CD3z分子胞内区(CD3z)。所述CD276-28z-CAR结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，信号肽(SP)序列的氨基酸序列为：
MALPVTALLLPLALLLHAARPGS(SEQ ID NO.4)。
亲和力增强型CD276单链抗体(CD276-scFv)序列：
QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLEWIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFGQGTKLELKR(SEQ ID NO.5)。
柔性片段与跨膜区(TM)和CD28胞内区(CD28)序列：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO.6)。
人CD3z分子胞内区(CD3z)序列：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.7)。
2.CD276-BBz-CAR结构
如图2所示，其由人CD8a分子信号肽(Leadingsignal)、CD276单链抗体(scFv)、人CD8a分子柔性片段与跨膜区(CD8HingeTM)、人41BB分子胞内区(41BB)，人CD3z分子胞内区(CD3z)串联构成，CD276-BBz-CAR结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，信号肽(Leadingsignal)序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPGS(SEQ ID NO.4)。
亲和力增强型CD276单链抗体(scFv)序列：
QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLEWIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFGQGTKLELKR(SEQ ID NO.5)。
柔性片段与跨膜区(TM)和41BB胞内区(41BB)序列：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.8)。
人CD3z分子胞内区(CD3z)序列：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.7)。
3.CD276-28BBz-CAR结构
如图3所示，CAR基本结构包括：人CD8a分子信号肽(Leadingsignal)、CD276单链抗体(scFv)、人CD8a分子柔性片段与跨膜区(CD8HingeTM)、人CD28和41BB分子胞内区(CD28-41BB)，人CD3z分子胞内区(CD3z)。CD276-28BBz-CAR结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，
信号肽(Leadingsignal)序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPGS(SEQ ID NO.4)。
亲和力增强型CD276单链抗体(scFv)序列：
QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLEWIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFGQGTKLELKR(SEQ ID NO.5)。
柔性片段与跨膜区(TM)和CD28及41BB胞内区(CD28-41BB)序列：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.9)。
人CD3z分子胞内区(CD3z)序列：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.7)。
二、CAR序列合成及载体构建
CAR编码序列由上海生工公司合成，获得CD276-28z-CAR结构的DNA序列(SEQ IDNO.12)、CD276-BBz-CAR结构的DNA序列(SEQ ID NO.13)或CD276-28BBz-CAR结构的DNA序列(SEQ ID NO.14)，通过酶切连接插入到pCDH-EF1-MSC质粒中，构建慢病毒表达质粒pCDH-EF1-CAR-CD276-28z，pCDH-EF1-CAR-CD276-BBz或pCDH-EF1-CAR-CD276-28BBz。
三、慢病毒包装
包装细胞293T铺板24小时后，将pCDH-EF1-CAR-CD276-28z，pCDH-EF1-CAR-CD276-BBz或pCDH-EF1-CAR-CD276-28BBz表达质粒与包装质粒(psPAX2与pMD2.G)混合，利用磷酸钙转染试剂进行293T细胞转染。转染48小时后，收集上清，准备用于T细胞感染。
四、T细胞纯化与感染
人外周血经密度梯度离心后，分离外周血单个核细胞。利用德国美天旎公司的T细胞分离试剂盒获得纯化的CD3+T细胞，再按照1个细胞加入1个磁珠的比例，加入适量CD3/CD28磁珠活化2天。2天后，加入病毒上清与polybrene(6μg/mL)孵育过夜。次日，离心清洗T细胞3次后，加入含200UIL-2与5％胎牛血清的RPMI-1640培养基扩增T细胞。
五、T细胞CAR表达效率
T细胞感染3天后，利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测。结果如图4所示。图4显示CAR表达阳性率到达约80％，证明CAR表达质粒构建及病毒包装成功。
六、CAR-T细胞体外扩增
计数1×106个T细胞进行感染，并在感染后每2天计数细胞，检测CAR-T细胞增殖情况。如图5所示，CAR-T细胞均能够高效增殖(14天内扩增约10倍)，与正常T细胞(UTD)相比，3种CAR-T细胞的增殖没有明显差别。
七、靶抗原检测
为了验证CAR-T细胞杀伤效果，我们首先检测了肿瘤细胞上的CD276表达情况。如图6所示，肿瘤细胞TE-1和KYSE150上高表达CD276，而利用基因敲除技术制备的细胞(KYSE150-CD276KO)则不表达CD276。
八、CAR-T细胞能够杀伤CD276阳性肿瘤细胞
T细胞感染14天后，计数T细胞与靶细胞，然后按照效靶比(效应细胞:靶细胞，E:T)1:1，1:5，1:10的比例，将T细胞(效应细胞)与CD276阳性靶细胞(TE-1和KYSE150)或CD276阴性靶细胞(KYSE150-CD276KO)共孵育16小时。共孵育结束后，利用小动物成像系统分析CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性(图7)。结果显示，CAR-T细胞能够高效杀伤CD276阳性细胞，而对CD276阴性细胞的影响很小，说明CAR-T细胞具有抗原依赖的杀伤活性。
九、CAR-T细胞分泌细胞因子的研究
为了进一步验证CD276特异CAR-T细胞的杀伤能力，我们分析了抗原活化的CAR-T细胞分泌细胞因子的能力。将T细胞(UTD，CD276-28z，CD276-BBz或CD276-28BBz)按照E:T＝1:1的比例与靶细胞孵育24小时后，利用ELISA检测上清中干扰素(IFN)和白介素-2(IL-2)浓度。如图8所示，CAR-T细胞与抗原阳性肿瘤细胞接触后能够大量分泌细胞因子，而与抗原阴性细胞孵育后未明显上调细胞分子表面，说明CAR-T细胞在特异抗原刺激后才能有效活化。
对比例1
构建huCD276-CAR结构，该结构与实施例1的区别在于，采用人源化CD276单链抗体为靶点，其余片段序列相同，其huCD276-CAR结构示意图如图9所示。huCD276-CAR结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中人源化CD276单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
结果分析
将实施例1中构建的高亲和力CD276-28z-CAR(CD276-CAR)和对比例1中构建的人源化(huCD276-CAR)CAR转导入Jurkat-NFAT_luc2细胞中，然后与抗原阳性或阴性细胞共孵育24小时。通过检测荧光强度可以确定CAR信号转导强度。结果显示CD276-28z-CAR能够更好地传递T细胞活化信号(图10)，提示实施例1结构能够更强得激活T细胞。
将实施例1中构建的高亲和力CD276-28z-CAR(CD276-CAR)和对比例1中构建的人源化(huCD276)抗体CAR-T细胞分别与靶细胞孵育24小时后，检测靶细胞的活性。结果显示，高亲和力CAR-T细胞CD276-28z-CAR具有更好的肿瘤细胞杀伤活性(图11)，提示实施例1结构能够有效提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 基于CD276抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp
85 90 95
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Thr Thr Ala Thr Trp Phe
115 120 125
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr
165 170 175
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser
195 200 205
Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
305 310 315 320
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
325 330 335
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
340 345 350
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
355 360 365
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro
420 425 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
435 440 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450 455 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465 470 475 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 2
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr
165 170 175
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser
195 200 205
Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly
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Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln
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Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
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Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
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Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys
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Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
340 345 350
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
355 360 365
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
370 375 380
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
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Ala Leu Pro Pro Arg
485
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<211> 532
<212> PRT
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<400> 3
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65 70 75 80
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100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Thr Thr Ala Thr Trp Phe
115 120 125
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr
165 170 175
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser
195 200 205
Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
305 310 315 320
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
325 330 335
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
340 345 350
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
355 360 365
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
370 375 380
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
385 390 395 400
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
405 410 415
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
420 425 430
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
435 440 445
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
450 455 460
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
465 470 475 480
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
485 490 495
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
500 505 510
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
515 520 525
Leu Pro Pro Arg
530
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser
20
<210> 5
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Thr Ala Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser
165 170 175
Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro
180 185 190
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly
210 215 220
His Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
225 230 235 240
Arg
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val
35 40 45
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
50 55 60
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
65 70 75 80
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
85 90 95
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
100 105 110
Ser
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
65 70 75 80
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
85 90 95
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
100 105
<210> 9
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val
35 40 45
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
50 55 60
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
65 70 75 80
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
85 90 95
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
100 105 110
Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
115 120 125
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
130 135 140
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
145 150 155
<210> 10
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
35 40 45
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala
65 70 75 80
Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
85 90 95
Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr
115 120 125
Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
145 150 155 160
Thr Lys Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala
165 170 175
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val
180 185 190
Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
195 200 205
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg
210 215 220
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
225 230 235 240
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn
245 250 255
Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val
305 310 315 320
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
325 330 335
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
340 345 350
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
355 360 365
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
370 375 380
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
385 390 395 400
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
405 410 415
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
420 425 430
Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
435 440 445
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
450 455 460
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
465 470 475 480
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
<210> 11
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
180 185 190
Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 12
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg ccactggccc tgctgctgca tgccgctaga 60
cctggcagcc aggtgcagct ggtgcagtca ggagctgaag tggtgaaacc tggcgcctct 120
gtgaagctga gttgtaagac atctggctat acattcacta attatgatat taattgggtg 180
agacagagac ctggacaggg actggagtgg attggctgga tctttccagg agacggctct 240
acacagtata atgaaaagtt caagggcaaa gctacactga caaccgacac cagcaccagc 300
accgcctaca tggagctgtc cagcctgagg tccgaggata ccgccgtgta cttctgcgct 360
aggcagacca ccgccacctg gttcgcctac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 420
agcggcggcg gcggaagcgg cggcggcggc agcggcggcg ggggctccga gatcgtgatg 480
acccagtccc ccgccaccct gagcgtgagc cctggcgaga gggtgaccct gagctgcaga 540
gcatctcaga gcatctccga ctacctgtac tggtaccagc agaagagcca cgaaagcccc 600
agactgctga tcaagtacgc cagccagagc atcagcggca tccctgccag gttctccggc 660
agcggctctg gcagcgagtt caccctgacc attaatagcg tggaaccaga agatgttgga 720
gtgtattatt gtcagaatgg acactctttt ccactgacat ttggacaggg cacaaaactg 780
gagctgaaaa gaaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 960
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1080
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1140
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260
gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1470
<210> 13
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg ccactggccc tgctgctgca tgccgctaga 60
cctggcagcc aggtgcagct ggtgcagtca ggagctgaag tggtgaaacc tggcgcctct 120
gtgaagctga gttgtaagac atctggctat acattcacta attatgatat taattgggtg 180
agacagagac ctggacaggg actggagtgg attggctgga tctttccagg agacggctct 240
acacagtata atgaaaagtt caagggcaaa gctacactga caaccgacac cagcaccagc 300
accgcctaca tggagctgtc cagcctgagg tccgaggata ccgccgtgta cttctgcgct 360
aggcagacca ccgccacctg gttcgcctac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 420
agcggcggcg gcggaagcgg cggcggcggc agcggcggcg ggggctccga gatcgtgatg 480
acccagtccc ccgccaccct gagcgtgagc cctggcgaga gggtgaccct gagctgcaga 540
gcatctcaga gcatctccga ctacctgtac tggtaccagc agaagagcca cgaaagcccc 600
agactgctga tcaagtacgc cagccagagc atcagcggca tccctgccag gttctccggc 660
agcggctctg gcagcgagtt caccctgacc attaatagcg tggaaccaga agatgttgga 720
gtgtattatt gtcagaatgg acactctttt ccactgacat ttggacaggg cacaaaactg 780
gagctgaaaa gaaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 1020
ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1080
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 1140
gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1200
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1260
ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1440
gccctgcccc ctcgc 1455
<210> 14
<211> 1596
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg ccactggccc tgctgctgca tgccgctaga 60
cctggcagcc aggtgcagct ggtgcagtca ggagctgaag tggtgaaacc tggcgcctct 120
gtgaagctga gttgtaagac atctggctat acattcacta attatgatat taattgggtg 180
agacagagac ctggacaggg actggagtgg attggctgga tctttccagg agacggctct 240
acacagtata atgaaaagtt caagggcaaa gctacactga caaccgacac cagcaccagc 300
accgcctaca tggagctgtc cagcctgagg tccgaggata ccgccgtgta cttctgcgct 360
aggcagacca ccgccacctg gttcgcctac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 420
agcggcggcg gcggaagcgg cggcggcggc agcggcggcg ggggctccga gatcgtgatg 480
acccagtccc ccgccaccct gagcgtgagc cctggcgaga gggtgaccct gagctgcaga 540
gcatctcaga gcatctccga ctacctgtac tggtaccagc agaagagcca cgaaagcccc 600
agactgctga tcaagtacgc cagccagagc atcagcggca tccctgccag gttctccggc 660
agcggctctg gcagcgagtt caccctgacc attaatagcg tggaaccaga agatgttgga 720
gtgtattatt gtcagaatgg acactctttt ccactgacat ttggacaggg cacaaaactg 780
gagctgaaaa gaaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 960
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1080
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caaacggggc 1140
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1200
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1260
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1320
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1380
gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1440
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1500
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1560
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1596

Claims (9)

1.一种基于CD276抗体的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体为CD276-28z-CAR嵌合抗原受体、CD276-BBz-CAR或CD276-28BBz-CAR嵌合抗原受体，所述CD276-28z-CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD276-BBz-CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CD276-28BBz-CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD276-28z-CAR嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、CD276单链抗体、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜区与胞内区、人CD3z分子胞内区串联构成；
其中，所述人CD8a分子信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CD276单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，人CD28分子跨膜区与胞内区的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示，人CD3z分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD276-BBz-CAR嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、CD276单链抗体、人CD8a分子柔性片段与跨膜区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区串联构成；
其中，人CD8a分子信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CD276单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，跨膜区和人41BB分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，人CD3z分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD276-28BBz-CAR嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、CD276单链抗体、人CD8a分子柔性片段与跨膜区、人CD28和41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区串联构成；
其中，人CD8a分子信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CD276单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，跨膜区和CD28及41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，人CD3z分子胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.一种慢病毒表达载体，其特征在于：所述载体载有权利要求1所述的嵌合抗原受体。
6.根据权利要求5所述的慢病毒表达载体，其特征在于：所述嵌合抗原受体为在pCDH-EF1-MSC质粒中表达，形成pCDH-EF1-CAR-CD276-28z、pCDH-EF1-CAR-CD276-BBz或pCDH-EF1-CAR-CD276-28BBz质粒。
7.一种慢病毒，其特征在于：所述慢病毒为将权利要求5或6中的慢病毒表达载体与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染靶细胞得到。
8.一种CAR-T细胞的构建方法，其特征在于：包括：
(1)CAR序列合成：构建CD276-28z-CAR嵌合抗原受体、CD276-BBz-CAR或CD276-28BBz-CAR嵌合抗原受体；
(2)表达载体构建：将嵌合抗原受体在pCDH-EF1-MSC质粒中表达，形成pCDH-EF1-CAR-CD276-28z、pCDH-EF1-CAR-CD276-BBz或pCDH-EF1-CAR-CD276-28BBz质粒；
(3)慢病毒包装：将步骤(2)的质粒与包装质粒混合，包装形成慢病毒；
(4)T细胞纯化与感染：纯化T细胞，用慢病毒转染T细胞，获得CAR-T细胞；
(5)T细胞CAR表达效率检测：检测T细胞表面CAR表达情况；
(6)CAR-T细胞体外扩增：对CAR-T细胞扩增。
9.权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体在制备识别特异靶点CD276的CAR-T细胞中的应用。
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