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CN109900819A - 一种uplc/ms-ms联用检测人血清中替诺福韦的方法 - Google Patents

一种uplc/ms-ms联用检测人血清中替诺福韦的方法 Download PDF

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CN109900819A
CN109900819A CN201910131960.4A CN201910131960A CN109900819A CN 109900819 A CN109900819 A CN 109900819A CN 201910131960 A CN201910131960 A CN 201910131960A CN 109900819 A CN109900819 A CN 109900819A
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CN
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tenofovir
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human serum
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uplc
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CN201910131960.4A
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English (en)
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高倩倩
潘诗苑
王华娟
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Nanjing Haina Pharmaceutical Co Ltd
Nanjing Yinuo Pharmaceutical Technology Co Ltd
Nanjing Haina Pharmaceutical Polytron Technologies Inc
Original Assignee
Nanjing Haina Pharmaceutical Co Ltd
Nanjing Yinuo Pharmaceutical Technology Co Ltd
Nanjing Haina Pharmaceutical Polytron Technologies Inc
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Publication date
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Abstract

本发明属于生物分析领域,具体涉及一种液质联用定量检测人血清中替诺福韦浓度的方法。本发明以氘代替诺福韦为内标物,采用Inertsil C8‑3柱以乙腈和甲酸水溶液为混合流动相进行梯度洗脱,氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应,测定血清中替诺福韦浓度的重现性、准确度均较好。本发明方法可用于评价替诺福韦各剂型的生物等效性。

Description

一种UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法
技术领域
本发明属于生物分析领域,具体涉及一种液质联用定量检测人血清中替诺福韦浓度的方法。
背景技术
富马酸替诺福韦二吡呋酯是一种单磷酸腺苷的无环核苷磷酸二酯类似物。富马酸替诺福韦二吡呋酯首先在胃中通过酯水解为替诺福韦,然后通过细胞酶的磷酸化形成替诺福韦二磷酸盐,一个专性链的终端。替诺福韦二磷酸盐通过与自然底物脱氧腺苷5'-三磷酸盐相竞争,然后插入病毒DNA,使DNA链终止,从而抑制HIV-1逆转录酶和HBV逆转录酶的活性。富马酸替诺福韦二吡呋酯是美国吉尔德(Gilead)公司开发上市的一种核苷酸类抗病毒药。2001年经美国FDA批准用于治疗人免疫缺陷病毒(HIV)的感染。2008年4月和8月,欧盟和美国FDA根据大量的临床试验结果,又分别批准其用于治疗乙型肝炎(乙肝),并被专家和媒体誉为最好的抗乙肝药物之一。富马酸替诺福韦二吡呋酯是经美国FDA和欧盟EDMA批准既可用于HIV感染又可用于HBV感染的少数药物之一。市场上以富马酸替诺福韦二吡呋酯片剂为主,Gilead公司在美国上市了本品的颗粒剂型,主要用于儿童或对片剂吞咽困难的患者。
文爱东于2007年建立了蛋白沉淀液质联用方法检测人血浆中的替诺福韦,方法使用非氘代马来酸恩替卡韦做内标无法控制化合物与内标的基质效应相同,可能使样品检测结果与真实值有差距,且样品用量100μL,仪器进样量20μL用量较多不适于大批量分析样品,容易产生残留,无法保证检测样品浓度的准确性。
姜莉苑于2013年建立了蛋白沉淀液质联用方法检测人血浆中替诺福韦含量,其血浆样品用量为0.3mL沉淀剂用量为0.9mL前处理样本体积较多不利于大批量处理,且实验中有水浴等操作步骤,过于繁琐,增长样品处理时间影响实验效率。
宫旭于2013年建立了蛋白沉淀液质联用方法用于检测血浆中的替诺福韦,该方法未用氘代内标且取样量大,样品绝对回收率为50%左右,基质效应为53%左右均较低对于数量较大的样品检测而言,该方法验证结果不够理想。
鉴于上述的缺陷,为满足临床大批量样品分析评价药物生物等效性的需求,需开发更简单、可靠、高通量的样品预处理方法以及方法验证结果理想的血清药物浓度检测的方法,用于替诺福韦的测定。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上,提供一种重现性好、灵敏度高、分析速度快基质效应影响小,提取回收率较高的检测人血清中替诺福韦浓度的方法。
本发明的技术方案如下:
一种UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,包括以下步骤:(1)人血清样品前处理;(2)液相色谱-质谱联用检测;(3)人血清中替诺福韦浓度的测定;其液相色谱条件包括:采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱,所述流动相A为乙腈,所述流动相B为甲酸水溶液;所述梯度洗脱过程如下:在0-3.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比为5:95;在3.5-3.8分钟内,流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至95:5;在3.8-4.8分钟内,流动相A和流动相B的体积比为95:5;在4.8-5.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至5:95;在5.1-6.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比为5:95。具体的梯度洗脱过程如下:
为了改善色谱分离选择性,可以考虑调节流动相的极性。在一种优选方案中,流动相B为0.5~1.5%甲酸水溶液;在不影响本发明效果的情况下,优选为0.8%甲酸水溶液。
本发明采用UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦时,采用GL Science Inc,Inertsil C8-3作为色谱柱。进一步优选采用长度为150mm,直径为4.6mm,填料粒径为3.0μm的Inertsil C8-3作为色谱柱。
在色谱法中,色谱柱的选择十分重要,对色谱柱的要求:柱效高、选择性好,分析速度快等。本发明采用乙腈和甲酸水溶液作为流动相,以Inertsil C8-3作为色谱柱,在其他条件的配合下,内源性物质不干扰样品的测定,且重现性好、灵敏度高、分析速度快基质效应影响小。
在采用内标法时,内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去,和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征;在色谱分析条件下,内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦时,采用替诺福韦-d7作为内标,以氘代替诺福韦做内标物,氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应,测定血清中替诺福韦浓度的重现性、准确度均较好。
在步骤(1)中,本发明对人血清样品采用蛋白沉淀法进行前处理,采用甲醇作为沉淀剂。采用蛋白沉淀法进行前处理人血清样品,可以避免繁琐耗时的液液萃取过程,同时获得令人惊讶的高回收率。采用本发明的检测方法,替诺福韦总体提取回收率为85.99%,内标的提取回收率为90.18%。
本发明的检测方法还包括配制内标溶液:称取替诺福韦-d7对照品,经质量校正系数校正后,以乙腈与水的体积比为5:95的混合溶液分别配制浓度为1.00mg/ml替诺福韦-d7储备液和200ng/mL的替诺福韦-d7工作液。
在一种优选方案中,在步骤(1)中,人血清样品前处理包括:人血清样品加入内标和沉淀剂,涡旋及离心后取上清液,与复溶液混合,即得待测样品;复溶液为乙腈和水的混合溶液,乙腈和水的体积比为5:95。
在一种更优选方案中,在步骤(1)中,人血清样品前处理包括:取60μL人血清样品,加入60μL内标工作液和480μL甲醇,涡旋及离心后取上清液经氮气流吹干后加入100μL复溶液混合后,即得待测样品。
在一种特别优选方案中,涡旋及离心后取200μL上清液经氮吹装置吹干后加入100μL复溶液混合后,即得待测样品。
本发明对人血清样品采用蛋白沉淀法进行前处理,其中涡旋及离心的条件为:涡旋5min,在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min。
本发明在色谱检测时,将待测样品置于自动进样器,进行LC-MS/MS分析,进样体积为5μL,进样器温度5℃。
本发明的检测方法,步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括:
本发明详细的色谱条件为:采用Inertsil C8-3作为色谱柱,按照上述提到的洗脱过程进行梯度洗脱,柱温30~45℃,优选35℃;流速0.5~1.5mL/min,优选0.8mL/min;进样量5μL。
本发明的质谱条件包括:采用电喷雾离子源,正离子多反应监测扫描,喷雾电压3300V,离子源温度600℃;替诺福韦,[M+H]+,m/z 288.1→176.2,DP值100V,CE值34V,替诺福韦-d7,[M+H]+,m/z 295.1→183.2,DP值100V,CE值37V。
本发明的检测方法,步骤(3)人血清中替诺福韦浓度的测定步骤包括:将待测血清按步骤(1)样品前处理方法制备,按步骤(2)液相色谱-质谱联用检测,记录替诺福韦对应的峰面积,将替诺福韦和内标的峰面积比值以权重系数w=1/x2进行线性回归,方程表达式,y=ax+b,计算得到所述待测血清中替诺福韦的浓度。
本发明的检测方法能够用于临床药代动力学样本监测。临床药物代谢动力学参数的计算的步骤包括:用DAS3.2.8计算药动学参数。用非房室模型(Non-compartmentalanalysis,NCA)分析,计算各受试者的药代动力学参数,包括:Cmax、Tmax、t1/2、AUC0-t,同时计算各参数的均数和标准差。
采用本发明的技术方案,优势如下:
(1)本发明以氘代替诺福韦做内标物,氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应,测定血清中替诺福韦浓度的重现性、准确度均较好。
(2)本方法使用样本量仅为60μL,所用样本量较少适用于大批量血清样品检测。本发明的检测方法线性范围为2.00~800ng/mL,该线性范围较宽,适于分析不同规格给药后的血清样品,应用范围较广。
(3)本发明的方法进行了包括特异性、准确度、精密度、基质效应、提取回收率、稳定性的全部方法验证,能用于评价替诺福韦各剂型在人体内的生物等效性。
附图说明
图1是替诺福韦子离子扫描图;
图2是替诺福韦-d7子离子扫描图;
图3是LC-MS/MS法测定血清中替诺福韦的特异性色谱图;
(1~6)6批不同个体空白血清色谱图;其中,左边的是替诺福韦通道色谱图,右边是替诺福韦-d7通道色谱图;
图4是混合空白血清色谱图;
其中,左边的是替诺福韦通道色谱图,右边是替诺福韦-d7通道色谱图;
图5是定量下限样品色谱图;
其中,左边的是替诺福韦通道色谱图,右边是替诺福韦-d7通道色谱图;
图6是健康受试者服用富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒后收集的血清样品色谱图;
其中,左边的是替诺福韦通道色谱图,右边是替诺福韦-d7通道色谱图;
图7是24名受试者给予受试/参比制剂富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒后血清中替诺福韦的平均血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的检测方法作进一步的说明,但这些实施例不对本发明构成任何限制。
材料与方法
1.仪器与试剂
高相液相色谱(Shimadzu LC-30AD系列);质谱(API 5500,Applied Biosystems/Sciex);纯水仪(MilliDirectQ,Millipore);微量天平(XP6,METTLER TOLEDO);离心机(HeraeusMuitifuge X1R,ThermoFisher);振荡器(LPD2500,LE PARD);氮吹仪(OrganomationMicrovap 11803;NG150-1A,莱普特科学仪器有限公司)。
乙腈(Merck,HPLC级别),水(超纯水,实验室自制),甲酸(Aladdin,HPLC级别),异丙醇(安徽时联特种溶剂股份有限公司,HPLC级别),甲醇(Merck,HPLC级别)。空白的血清来源于健康受试者。替诺福韦(USP,纯度100%),替诺福韦-d7(TLC,纯度96.1%)
2.液质条件
液相条件:色谱柱:GL Science Inc,InertsilC8-3,4.60×150mm,3μm;柱温:35℃;进样器温度:5℃;流动相A为乙腈;流动相B为0.8%甲酸水溶液;梯度洗脱过程如下:在0-3.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比为5:95;在3.5-3.8分钟内,流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至95:5;在3.8-4.8分钟内,流动相A和流动相B的体积比为95:5;在4.8-5.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至5:95;在5.1-6.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比为5:95;流速0.8mL/min;洗针方式:Rinse Port Only自动进样器洗针液:超纯水(弱洗);清洗体积:500μL。
质谱条件:离子检测方式:多反应监测(MRM);离子化方式:气动辅助电喷雾离子化(ESI);离子极性:正离子(Positive);检测对象:替诺福韦,[M+H]+,m/z 288.1→176.2;内标:替诺福韦-d7,[M+H]+,m/z 295.1→183.2;质谱参数:IonSpray Voltage:3300V;CUR:50psi;CAD:8psi;TEM:600℃。
3.标准品溶液的配制
替诺福韦工作溶液的配制:精密称取两份替诺福韦对照品适量,经质量校正系数校正后,用乙腈:水(5:95)溶解后,得到两份终浓度均为1.00mg/mL的替诺福韦储备液,储备液保存于-20℃冰箱。经储备液检查合格后,精密量取一份替诺福韦储备液用乙腈:水(5:95)稀释,配制一系列浓度为16,000,12,800,8,000,4,000,2,000,400,80.0,40.0ng/mL的替诺福韦标准曲线样品工作溶液,精密量取另一份替诺福韦储备液用乙腈:水(5:95)稀释。配制浓度为12,000,800,120,40.0ng/mL的QC工作溶液。
替诺福韦-d7工作溶液的配制:精密称取替诺福韦-d7对照品适量,经质量校正系数校正后,用乙腈:水(5:95)溶解,得到最终浓度为1.00mg/mL的替诺福韦-d7储备液,储备液保存于-20℃冰箱。精密量取一定量的替诺福韦-d7用乙腈:水(5:95)稀释,配制成浓度为200ng/mL的内标工作液。
4.标准曲线样品及质控样品的配制
对于每个浓度水平的标准曲线样品和质控样品,其配制过程举例如下:在190μL的空白血清中加入10.0μL相应的工作溶液,混合均匀。配制体积可据实际情况适当调整,配成含替诺福韦浓度分别为2.00,4.00,20.0,100,200,400,640,800ng/mL的标准曲线样品和浓度分别为2.00ng/mL(LLOQ QC)、6.00ng/mL(LQC)、40.0ng/mL(MQC)、600ng/mL(HQC)的质控样品。
5.样品前处理
向1.0mL 96孔板中加入60μL的样品(待测样品,标准曲线样品、质控样品);对于双空白样品和空白样品,加入60μL的空白基质。在双空白样品中加入60μL溶剂乙腈:水(5:95),除双空白样品在外,在所有孔中加入60μL的内标工作液,后加入480μL沉淀剂甲醇。将96孔板以2000rpm/min涡旋震荡10min。将96孔板在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min。取200μL上清液加入到干净的96孔板中,经氮气流吹干后加入100μL复溶液乙腈:水(5:95)混匀置于进样室或者相同温度冰箱中待测。
6.方法学考察内容
根据2015年新版《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行方法学验证,以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证包括以下内容:特异性、标准曲线、精密度和准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。
7.生物等效性研究
选取24名健康受试者,受试者服药前0h及服药后、10min、20min、30min、45min、1h、1h15min、1h30min、1h45min、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h;静脉采血4mL置于5mL无抗凝负压采血管中。2-8℃冰箱静置30min以上,待血液凝集后离心(2~8℃,4000r/min,10min),分离出上层血清。分别取两个冻存管分装上清液。其中量取约0.75ml~1.5mL血清至冻存管a用于检测,剩余的血清装入另一冻存管b作为备份样本。分装完成后转入超低温冰箱(≤-60℃)冷冻保存。
结果与讨论
1.专属性
本试验所采用的色谱条件下,替诺福韦的保留时间为3.03min左右,内标(替诺福韦-d7)的保留时间为3.00min左右,如图5所示,其中,左边的是替诺福韦通道色谱图,右边是替诺福韦-d7通道色谱图;分别取6种不同来源的空白血清各60μL,除不加内标外,按样品预处理操作,获得空白血清样品色谱图,如图3-1~图3-6所示,其中,左边的是替诺福韦通道色谱图,右边是替诺福韦-d7通道色谱图;定量下限样品色谱图见图5;取健康受试者服用富马酸替诺福韦二吡呋酯后收集的血清样品,按样品预处理操作,得健康受试者血清样品色谱图,如图6所示,其中,左边的是替诺福韦通道色谱图,右边是替诺福韦-d7通道色谱图。
2.准确度、精密度试验
配制含替诺福韦浓度分别为2.00、6.00、40.0、600ng/mL的质控样品,每个浓度各配制6份样品,并配制两条标准曲线(由两套标准曲线样品回归得到),计算替诺福韦的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f,记作f,以f代入当天的标准曲线求得实测浓度及实测浓度平均值和准确度,计算批内和批间精密度,结果见表1。
结果表明:除最低定量限(LLOQ)外,替诺福韦的批内和批间质控样品的精密度RSD均小于15%,批内准确度RE有三分之二以上不超过±15%,且每个浓度水平二分之一以上数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±15%。最低定量限替诺福韦样品的批内和批间质控样品的精密度RSD均小于20%,批内准确度RE有三分之二以上不超过±20%,且每个浓度水平二分之一以上数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±20%,综上,精密度及准确度均符合要求。
表1批内、批间样品检测的精密度和准确度
注:斜体、加粗表示准确度不符合接受标准。
3.基质效应考察
基质样品配制:取6份不同来源个体的空白血清,每个不同来源的空白血清制备九个重复的双空白样品,按样品预处理操作,得到空白基质提取液,提取之后加入一定的分析物和内标,以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平,三个重复)。
溶液样品的配制:以纯水代替空白血清进行前处理步骤,后将工作溶液进行稀释配制成相应浓度使加入200μL空白基质提取液或200μL纯水提取液后浓度与低、中、高浓度质控样品前处理后进样浓度一致,且每一浓度3个重复样本。
结果显示,替诺福韦基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为0.98~1.01,偏差小于1.6%,血清基质不影响替诺福韦准确定量。基质效应数据结果见表2。
表2基质效应(计算方式:基质效应因子:对照溶液峰面积比/样品峰面积比)
4.提取回收率考察
基质样品配制:取6份不同来源个体的空白血清,每个不同来源的空白血清制备九个重复的双空白样品,按样品预处理操作,得到空白血清提取液,提取之后加入一定的分析物和内标,以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平,三个重复)。
质控样品配制:取低、中、高三种浓度的质控样品按照样品处理方法处理,每一浓度水平配制6份。
通过质控样品与基质样品待测物峰面积比值评价待测物的回收率;通过质控样品与基质样品内标物峰面积响应的比较评价内标物的回收率。
回收率的接受标准为:每个浓度水平和所有浓度水平的回收率的精密度应在15%之内。替诺福韦提取回收率(以峰面积比值计算)为85.99%,其中低、中、高三个浓度提取回收率分别为87.77%,85.30%,84.90%。结果见表3。
表3待测物提取回收率
5.稳定性考察
进样器稳定性:考察精密度、准确度的分析批首次进样分析后,放置于自动进样器(5℃)91.1h后,再次进样分析,记录色谱图。结果见表4,替诺福韦血清样品在室温下放置24h,血清样品处理后的进样溶液在进样器中放置91.1h稳定性良好,符合生物样品分析的要求。
室温稳定性:将配置好的低、中、高三个浓度水平的质控样品,含替诺福韦浓度分别为6.00,40.0,600ng/mL,每个浓度水平的样品混合均匀后,于室温放置24h后,进行LC-MS/MS分析,记录色谱图。结果如表5所示。
冻融稳定性:新鲜配制含替诺福韦浓度分别为6.00ng/mL,600ng/mL的样品,分别放入-20℃及-80℃冰箱中进行4次冻融循环。接受标准为:稳定性样品的平均测定值与其理论值的%RE不应超过±l5.0%,各浓度水平下稳定性样品测定值的%RSD应≤15.0%。结果见表6及表7。
长期稳定性:新鲜配制含替诺福韦浓度分别为6.00ng/mL,600ng/mL的样品,分别放入-20℃及-80℃冰箱中冻存45天后检测。接受标准为:稳定性样品的平均测定值与其理论值的%RE不应超过±l5.0%,各浓度水平下稳定性样品测定值的%RSD应≤15.0%。结果见表8及表9。
表4制备后样品的稳定性
表5样品离心分离前基质中待测物稳定性
表6样品-20℃条件下,反复冻融4次待测物稳定性
表7样品-80℃条件下,反复冻融4次待测物稳定性
表8样品-20℃条件下,放置45天待测物长期稳定性
表9样品-80℃条件下,放置45天待测物长期稳定性
6.人体生物等效性研究
24名健康受试者按试验方案分别给予富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒(受试制剂A,含替诺福韦300mg)和富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒(参比制剂R,含替诺福韦300mg)后,用LC-MS/MS法测定血清中替诺福韦的浓度,如图7所示。24名健康受试者按试验方案给予受试富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒和参比富马酸替诺福韦二吡呋酯颗粒后,计算的替诺福韦的达峰浓度Cmax,达峰时间Tmax,AUC0-t。受试制剂和参比制剂中替诺福韦的AUC0-t、AUC0-∞及Cmax经对数转换后进行方差分析,结果表明:Cmax、AUC0-t、AUC0-∞比值的90%置信区间在80%~125%范围内。Tmax经非参检验(配对Wilcoxon法),不同制剂间无显著性差异(P>0.05)。综上所述,该结果符合《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》中的生物等效性评价要求,认定两制剂具有人体生物等效性。
本发明的检测方法建立了人血清中替诺福韦的HPLC-MS/MS测定方法,专属性良好,血清中内源性物质不干扰样品的测定,替诺福韦标准曲线线性范围为2.00ng/mL~800ng/mL,线性关系良好:高浓度(600ng/mL)、中浓度(40.0ng/mL)、低浓度(6.00ng/mL)、定量下限(2.00ng/mL)四个浓度水平的质控样品检测结果的批内和批间精密度均小于15.0%;定量下限的质控样品检测结果的批内和批间精密度均小于20.0%。替诺福韦总基质效应因子为0.98~1.01,偏差小于1.6%,血清基质不影响替诺福韦准确定量。替诺福韦总体提取回收率为85.99%,内标的提取回收率为90.18%。替诺福韦血清于室温放置22.5h后稳定性良好;替诺福韦血清样品处理后在5℃自动进样器中放置91.1小时稳定性良好,符合生物样品分析要求。
综上所述,本发明方法所建立的HPLC-MS/MS法测定人体血清中替诺福韦浓度的方法符合2015版药典《生物样品定量分析方法验证指导原则》中的相关要求,可用于临床试验的血清样品分析检测。

Claims (10)

1.一种UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)人血清样品前处理;(2)液相色谱-质谱联用检测;(3)人血清中替诺福韦浓度的测定;其液相色谱条件包括:采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱,所述流动相A为乙腈,所述流动相B为甲酸水溶液;所述梯度洗脱过程如下:在0-3.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比为5:95;在3.5-3.8分钟内,流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至95:5;在3.8-4.8分钟内,流动相A和流动相B的体积比为95:5;在4.8-5.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至5:95;在5.1-6.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比为5:95。
2.根据权利要求1所述的UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,其特征在于,色谱条件包括:采用Inertsil C8-3作为色谱柱;优选该色谱柱的长度为150mm,直径为4.6mm,填料粒径为3.0μm;柱温30~45℃,优选35℃;流速0.5~1.5mL/min,优选0.8mL/min;所述流动相B为0.5~1.5%甲酸水溶液;优选为0.8%甲酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,其特征在于,在步骤(1)中,人血清样品通过蛋白沉淀法进行前处理;采用替诺福韦-d7作为内标,采用甲醇作为沉淀剂。
4.根据权利要求3所述的UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,其特征在于,包括配制内标溶液:称取替诺福韦-d7对照品,以乙腈与水的体积比为5:95的混合溶液分别配制浓度为1.00mg/ml替诺福韦-d7储备液和200ng/mL的替诺福韦-d7工作液。
5.根据权利要求4所述的UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,其特征在于,在步骤(1)中,人血清样品前处理包括:人血清样品加入内标和沉淀剂,涡旋及离心后取上清液,与复溶液混合,即得待测样品;所述复溶液为乙腈和水的混合溶液,乙腈和水的体积比为5:95。
6.根据权利要求5所述的UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,其特征在于,在步骤(1)中,人血清样品前处理包括:取60μL人血清样品,加入60μL内标工作液和480μL甲醇,涡旋及离心后取上清液经氮气流吹干后加入100μL复溶液混合后,即得待测样品。
7.根据权利要求5或6所述的UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,其特征在于,所述涡旋及离心的条件为:涡旋5min,在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min。
8.根据权利要求1、2或7所述的UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,其特征在于,将待测样品置于自动进样器,进行LC-MS/MS分析,进样体积为5μL,进样器温度为5℃。
9.根据权利要求1所述的UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,其特征在于,质谱条件包括:采用电喷雾离子源,正离子多反应监测扫描,喷雾电压3300V,离子源温度600℃;替诺福韦,[M+H]+,m/z 288.1→176.2,DP值100V,CE值34V,替诺福韦-d7,[M+H]+,m/z295.1→183.2,DP值100V,CE值37V。
10.根据权利要求1所述的UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法,其特征在于,该方法可用于临床药代动力学样本监测。
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