CN109897806A - 一株促进作物耐盐碱生长的巨大芽孢杆菌及盐碱地专用微生物肥料和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株促进作物耐盐碱生长的巨大芽孢杆菌及盐碱地专用微生物肥料和应用，该菌株T4‑9属于Bacillus megaterium(菌种专利保藏编号CGMCC17334)，试验表明，菌株T4‑9微生物肥料施入不同程度的盐碱土壤后，能够提高作物耐盐胁迫能力，增加作物产量且可以降低土壤含盐量改善土壤的理化性质。菌株T4‑9微生物肥料在盐碱地上的应用可以缓解盐胁迫对作物的伤害，提高盐碱地作物的产量，为盐碱地的改良和农业利用提供可行方案。

Description

一株促进作物耐盐碱生长的巨大芽孢杆菌及盐碱地专用微生 物肥料和应用

技术领域

本发明属于农业集约化生产技术，具体涉及一株植物根际促生菌T4-9及其应用，在盐碱地施加具有促进玉米耐盐碱生长的植物根际促生菌T4-9的盐碱地专用微生物肥料，可以提高玉米的产量，降低盐碱地土壤含盐量，改良盐碱地土壤理化性质，实现了盐碱地的农业利用。

背景技术

土壤盐碱化是全球性环境问题，我国盐碱地总面积为9913万公顷，约占全世界盐碱地总面积的10％。其中滨海盐碱地分布广泛，涉及到我国11个省(区)市的海岸线，占我国盐碱地总面积的40％。土壤盐渍化问题普遍存在，并且呈现出日益严重的趋势，给农业生产带来了极大的障碍。我国粮食需求日益高涨，耕地资源紧张，解决盐碱地改良的问题对国家和人民的需求具有重要的意义。

植物根际促生菌(PGPR)是一类定殖于植物根际，并且在一定程度上促进植物生长和抵抗胁迫的一类有益菌。PGPR可以通过各种机制改善植物根际养分可利用性、产生挥发性气体、调节植物激素水平等促进植物生长，在抗生物胁迫时PGPR通过分泌次生代谢物质(如抗生素、聚酮类化合物、细菌素和水解酶等)拮抗病原菌，也可通过营养竞争抑制真菌孢子的萌发，抑制真菌的生长，有时PGPR帮助植物在抵抗生物胁迫时诱导植物产生自身系统抗性从而避免来自病原细菌、真菌、病毒和线虫等的侵害。PGPR在非生物胁迫条件下，能够通过调节乙烯合成速度对盐碱、干旱、水涝、温度及污染物等非生物胁迫做出反应。

微生物有机肥料能增加化肥的利用率，改良土壤性状，提高土壤肥力，促进植物对营养元素的吸收，增强作物抗逆性，调节植物生长，增加农产品质量和产量，降低农残，促进废弃物资源化利用，并且对生态环境友好，研发盐碱地专用功能性有机微生物肥料(增强作物耐盐胁迫，提高盐碱地作物产量)是一条可行的出路。

发明内容

本发明的目的在于提供一株植物根际促生菌T4-9，该菌株具有产氨、解无机磷、产嗜铁素、产IAA等促生能力。

本发明的另一目的在于针对农业生产中盐碱地作物产量低下，土地难以利用的实际问题，开发研制出盐碱地专用功能性微生物有机肥料，能够促进盐碱地作物正常生长，提高盐碱地上农作物的产量并在一定程度上改善盐碱地的土壤理化性质。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一株植物根际促生菌T4-9，该菌株属于Bacillus megaterium，为革兰氏染色阳性巨大芽孢杆菌，于2019年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号CGMCC17334。

采集地上植物生长良好但来源不同的盐碱土壤样品，浸提土壤悬液，在LB固体培养基上稀释涂布，分离纯化，筛选得到形态不一的芽孢杆菌。分别把不同的芽孢杆菌接种于水培玉米根际初步筛选寻找生长良好的处理，玉米水培时NaCl浓度为140mM，并且通过玉米和小麦的土培盆栽实验验证，土培玉米和小麦盆栽实验NaCl浓度为200mM，最后证明接种菌株T4-9于玉米，小麦根际时玉米和小麦的株高、地上部鲜重均显著高于不接种菌株T4-9的处理。

盐浓度为140mM水培玉米，在玉米生长两周后，在玉米根际接种T4-9发酵菌液，接菌浓度约为10⁷个/mL，三天后测定玉米叶片中与逆境胁迫相关物质的含量，与对照组相比，玉米叶片中可溶性糖总量(TSS)、过氧化物酶(POD)活性显著提高，丙二醛(MDA)和过氧化氢(H₂O₂)含量，过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著降低。

测定菌株T4-9的促生能力，发现该菌株具有产氨、解无机磷、产嗜铁素等能力，确定菌株T4-9为根际促生芽孢杆菌，利用绵羊血平板，测定菌株T4-9的溶血反应，试验表明菌株T4-9溶血反应呈阴性，可用于肥料的开发利用。

上述的植物根际促生菌T4-9在制备微生物肥料中的应用。所述的微生物肥料优选为具有提高植物耐盐碱胁迫能力的盐碱地专用微生物肥料。

一种具有提高植物耐盐碱胁迫能力的盐碱地专用微生物肥料，该微生物肥料中包含上述的植物根际促生菌T4-9。优选的，所述的植物根际促生菌T4-9在该微生物肥料中的含量不低于1×10⁸个孢子/g。进一步优选的，该微生物肥料中的养分含量≥5％、有机质含量≥ 45％。

更进一步优选的，该微生物肥料采用以下步骤制备：

(1)将上述的植物根际促生菌T4-9接种到改良的糖蜜培养基进行液体发酵，发酵条件为：pH 7.3～7.6，培养温度为34～36℃，发酵周期为45～50h；发酵中后期形成芽孢，发酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/mL；

(2)以腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥作为该微生物肥料的载体有机物料，将步骤 (1)制备的植物根际促生菌T4-9发酵液与腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥进行二次固体发酵，每吨固体有机物料中加入植物根际促生菌T4-9发酵液30L并混合均匀，中途进行翻堆，使其发酵温度低于50℃，发酵7天后结束，植物根际促生菌T4-9的活菌或芽孢量达到 1×10⁸个/g以上，获得二次固体发酵的牛粪猪粪秸秆混合堆肥微生物有机肥。

探究芽孢杆菌T4-9液体发酵的条件，经芽孢杆菌单因素和正交液体发酵试验得知所用的改良的糖蜜培养液配制方法为：按重量百分含量计，糖蜜5％、豆粕粉0.72％、氯化钠0.5％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钙0.1％、硫酸镁0.1％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锌0.05％、硫酸锰0.05％、水93.33％、pH值调节至7.5±0.1、121℃灭菌20min。

进一步优选的，芽孢杆菌液体发酵条件为：pH 7.3～7.6，培养温度为35℃，摇床转速为 180～200转/分钟，液体发酵周期为48小时，发酵中后期形成芽孢，发酵液中的活菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/mL。

该微生物肥料的载体有机物料购于市场的有机物料，为腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥，其中养分含量大于5％、有机质含量大于45％。

2018年6月下旬至10月初在山东滨州“渤海粮仓无棣示范样板项目区”选择三块盐碱程度高低不同的盐碱地进行小区试验，种植品种为恒源一号的玉米，分别施加不同肥料处理，期间的灌水和追肥统一管理，均与周围其他大田地块一致，三个月后对玉米进行取样测产同时取土样测定土壤理化性质，验证该微生物有机肥的肥效。

所述微生物有机肥料可专用于盐碱地玉米产量障碍及盐碱地改良。

本发明的有益效果：

本发明提供了一株能促进玉米耐盐碱生长的菌株，并探索其液体发酵最佳条件，将该菌液体发酵后的菌液与普通牛粪猪粪秸秆混合堆肥均匀混合后二次发酵制成微生物肥料，该微生物肥料具有以下优点：

1.本发明提供的微生物肥料专用于提高盐碱地玉米产量且在一定程度上改良土壤理化性质，不仅起到增产的作用还可以改良土壤；

2.本发明提供的微生物有机肥中的有效菌株来源自盐碱地，对盐碱环境有适应性，兼具产氨、解无机磷、产嗜铁素等能力，且溶血反应阴性，对人类不具有危害；

3.本发明提供的微生物有机肥前期液体发酵所需的培养液主要原料为糖蜜、豆粕粉，原料成本低廉，且提高了这些物料的利用效率。且在最佳发酵条件下，较短的发酵周期就可使菌液中有效菌数量或芽孢含量达到所需量；

4.本发明提供的微生物有机肥所用的载体有机物料为普通的牛粪猪粪秸秆混合堆肥，不需要特定的有机肥料承载，二次发酵之后即可正常使用，做载体的原料常见易得成本低。

附图说明

图1为140mMNaCl不同接菌处理对玉米株高的影响图

图2为140mM NaCl水培玉米(A)，小麦(B)图

其中，Mock control:0mM NaCl不接菌处理；Salt control：140mM NaCl不接菌处理；

T4-9：140mM NaCl接种T4-9处理

图3为200mM NaCl土培玉米(A)，小麦(B)图

其中，Mock control:0mM NaCl不接菌处理；Salt control：200mM NaCl不接菌处理；

T4-9：200mM NaCl接种T4-9处理

图4为140mM NaCl玉米叶片TSS、POD、MDA、SOD、CAT、H₂O₂含量图

图5为单因子发酵实验结果

图6为菌株T4-9最佳液体发酵条件下有效菌数量和芽孢量

图7为盐碱地田间小区玉米图

其中，T1:不施肥，T2:常规化肥，T3:普通有机肥，T4:T4-9有机肥

具体实施方式

1.土样采集和芽孢杆菌分离筛选

采集全国各地的盐碱土，并进行盆栽实验，在这些土壤上分别种植品种为京甜紫花糯的玉米，正常浇水，一个月后收获玉米植株。分别浸提根际土的土壤悬液，90℃水浴15min后在LB平板上稀释涂布，37℃培养过夜，分别对平板上的菌分离纯化，共筛选出芽孢杆菌 124株，甘油管保存于-80℃冰箱。

2.提高作物耐盐能力菌株筛选

将玉米种子表面消毒后于灭菌的培养皿中，培养皿底部放置无菌水润湿的灭菌滤纸，避光至于4℃冰箱春化3天；将发芽种子至于圆形塑料筐中，每个小筐上放置种子30粒，塑料筐至于1.6L小桶上，加水约1.4L至与种子接触，用黑色避光膜遮光，每日换水一次，4天后撤去遮光膜，之后每日早晚换水一次，一周后，换成含140mM NaCl的1/4MS营养液处理玉米，同时分别在玉米根际接种不同菌液，接种浓度为10⁷个/mL，每个菌株各设置3 个重复。7天后测定玉米的株高、地上部鲜重和根长等，初步筛选出几株效果较好的菌株 (见图1)。

之后用玉米和小麦土培试验验证，种子表面消毒之后于培养皿中避光春化，待种子发芽后，移入底部扎孔的700mL塑料杯中，每个塑料杯装土1kg，栽玉米种子3粒，小麦种子10粒，每个菌株设置12个重复，每隔一天浇去离子水50mL，10天后，每隔一天浇含 200mMNaCl的盐水50mL，并且每个塑料杯分别接菌10mL，第5天补接菌3mL，10天后测定玉米和小麦株高和干鲜重等指标。证明菌株T4-9为能显著提高玉米和小麦的株高和鲜重(见图2和图3)。经过16sRDNA分析，该菌株属于Bacillus megaterium，为革兰氏染色阳性巨大芽孢杆菌，于30～37℃LB固体培养基上12h即可呈乳白色光滑规则菌落，血琼脂平板上，少数菌株产生溶血环。于2019年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC17334。

3.玉米植株中与逆境胁迫相关物质含量的测定：

将玉米种子进行表面消毒处理，于4℃避光春化，发芽后至于小筐中，小筐放于小桶中，加水至接触到玉米种子为最佳，用黑色遮光膜对其进行避光处理，每日换水一次，3-4天后撤去遮光膜，之后每日早晚换水一次，一周后，换成含140mM NaCl的1/4MS营养液处理玉米，同时分别在玉米根际接种菌液，接种浓度为10⁷个/mL，设置3个重复。3天后测定玉米叶片中各项与盐胁迫相关物质的含量，可溶性总糖含量用蒽酮比色法测定，过氧化氢含量用二甲酚橙法测定，其余且用相应试剂盒测定。

⑴蒽酮比色法:

①准曲线的制作

取20mL刻度试管6支，从1～6分别编号，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0mL的100μg/mL蔗糖溶液，并用水补至2mL，各管中糖含量分别为0、20、40、60、 80、100μg，然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作对照，在630nm波长下测其吸光度，以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。

②可溶性糖的提取

称取已粉碎样品0.10～0.30g放入20mL刻度试管中，加入5～10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min(提取2次)，提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

③显色测定

吸取0.5mL样品液于20mL刻度试管中(3次重复)，加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入蒽酮乙酸乙酯试剂、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准线性方程求出糖的量(μg)，计算测试样品中的糖含量。

⑵二甲酚橙法：

①标准曲线的制作

取10mL离心管六支，分别加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL10μmol/L过氧化氢，加水至2mL，显色时，向各管加4mL工作试剂，30℃水浴显色30min，于560nm出测定吸光度值，绘制标准曲线。

②样品的提取

取植物组织样品0.5g，加2mL预冷丙酮研磨匀浆，10000r/min离心10min，上清液定容至3mL，即为过氧化氢提取液，取1mL加3mL萃取剂，混匀，再加5mL蒸馏水，混匀，5000r/min离心1min，上层水相即为样品提取液。

③显色测定

取2mL样品提取液，加入4mL工作试剂，按标准曲线方法同样处理后，于560nm处测定吸光度值，从标准曲线查得过氧化氢浓度。

结果表明，将菌株T4-9接种于盆栽小麦和玉米根际，能提高盐分胁迫下小麦及玉米的生长指标(株高、地上部鲜重)，且提高玉米叶片中可溶性糖总量(TSS)、过氧化物酶(POD)活性，降低玉米叶片中丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)的含量，降低过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性(见图4)。

4.菌株其他促生能力测定

⑴NH₃产生能力测定

将待测菌株接入盛有蛋白胨水(10g/L)培养液的试管中，28℃，170r min^-1振荡培养 72h，每个试管中加入1mL Nessler’s试剂(0.09mol/L碘化汞钾与2.5molL^-1氢氧化钾的混合液)，出现黄褐色沉淀的菌株为产氨阳性反应。

⑵嗜铁素产生能力的测定

将待测各菌株点接到LB固体培养基平板上，28℃培养24h，然后将CAS固体培养基(含CAS蓝色检测液，30.24g L^-1的PIPES，0.9％的琼脂糖)倾倒平铺于LB平板上，15- 30min后观察菌体周围是否出现淡黄或淡红色的晕圈，初步判定其产嗜铁素能力。另将供试菌株的培养液上清过膜除菌后，与CAS检测液等体积混合，充分反应，测OD₆₃₀，得吸光值 As，以双蒸水作为对照调零；以未接种的培养基与CAS检测液等体积混合，测OD₆₃₀，得吸光值Ar。As/Ar值代表样品中嗜铁素的相对含量，嗜铁素含量测定重复3次，As/Ar值越低，产嗜铁素能力越强。一般产铁载体能力较高的菌株，其As/Ar低于0.5。

⑶IAA产生能力测定

待测菌株在Landy培养基中(添加0.5gL^-1的L-色氨酸，约2.5mmolL^-1)25℃、140rmin^-1条件下振荡培养72h，取培养液1mL，12000×g离心5min，取500μL上清液加入等体积的Salkowski试剂(10.8molL^-1硫酸含4.5g三氯化铁)，室温暗处显色30min后，于 530nm处测光密度值，以空白培养基作对照，并以纯IAA对应的光密度作标准曲线，计算 IAA的产出量(mgL^-1)。

⑷解磷能力测定

待测各菌株在LB培养基中活化，取1mL培养液，6000r min^-1离心5min，弃上清，菌体用无菌水洗涤三次后重悬，将待测菌株接入磷酸盐液体养基(NBRIP)，不接菌为空白对照，28℃、170r min^-1条件下振荡培养7d，钼锑抗比色法定量测定溶磷含量及对应pH值。

结果见表1，菌株T4-9为植物根际促生菌，具有可以产氨、解无机磷、产嗜铁素、产IAA等促生能力。

表1为菌株T4-9产氨、解磷、产嗜铁素能力

5.菌株T4-9芽孢杆菌液体发酵条件探索

⑴单因子发酵实验

表2为芽孢杆菌液体发酵实验安排

表3为各物质的碳氮含量表

⑵正交发酵实验

表3为正交发酵实验条件

单因子发酵实验结果见图5，经过单因子发酵实验筛选出最佳液体发酵条件进行正交发酵实验，菌株T4-9最佳液体发酵条件下有效菌数量和芽孢量见图6，经过正交发酵实验设计出菌株T4-9的改良的糖蜜培养基配方及发酵条件。

改良的糖蜜培养基配制方法为：按重量百分含量计，糖蜜5％、豆粕粉0.72％、氯化钠 0.5％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钙0.1％、硫酸镁0.1％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锌0.05％、硫酸锰0.05％、水93.33％，pH值调节至7.5±0.1，121℃灭菌20min。

将植物根际促生菌T4-9接种到改良的糖蜜培养基进行液体发酵，发酵条件为：pH7.3～7.6，培养温度为35℃，摇床转速为180～200转/分钟，液体发酵周期为48小时，发酵中后期形成芽孢，发酵液中的活菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/mL。

6.微生物有机肥制备

有机物料购于江阴市联业生物科技有限公司，为腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥，其中养分含量大于5％、有机质含量大于45％。将液体发酵之后的T4-9菌液与有机物料均匀混合后进行二次固体发酵，每吨有机物料中加入T4-9菌液30L混合并搅拌均匀，中途进行翻堆，使其发酵温度低于50℃，发酵7天后结束，使活菌或芽孢量达到1×10⁸个/g以上，获得二次固体发酵的牛粪猪粪秸秆混合堆肥的微生物有机肥。

7.大田小区试验验证微生物有机肥的肥效

在渤海粮仓无棣示范样板项目区分别选取4区1号地块第2、3、4畦，第6区6号地块第5、6、7畦和30区4号地块第2、3、4畦，在每个地块上分别随机采取土壤样品，带回实验室测定土壤基本理化性质。

表4为各肥料的施肥量

小区试验分别设置3个重复，随机分布。

在每个小区施入肥料后进行旋耕，旋耕之后播种，隔一天浇水。在玉米大喇叭期施追肥一次。追肥时采样测量玉米的株高、茎粗及干鲜重等。三个月后对玉米进行采样测产(结果见表6)，并取土样测定土壤理化性质(结果见表7)。

表6为3‰(a)、4‰(b)、5‰(c)盐分地块田间小区试验玉米产量表

a

b

c

注：T1：不施肥，T2：常规化肥，T3：普通有机肥，T4：T4-9有机肥

表7为3‰(a)、4‰(b)、5‰(c)盐分地块田间小区试验地块土壤理化性质表

a

b

c

注：T1：不施肥，T2：常规化肥，T3：普通有机肥，T4：T4-9有机肥

“渤海粮仓无棣示范样板项目区”田间小区试验表明，菌株T4-9微生物肥料施入不同程度的盐碱土壤后，能够提高玉米耐盐胁迫能力，增加玉米产量且可以降低土壤含盐量改善土壤的理化性质(如表6和表7所示)。菌株T4-9微生物肥料在盐碱地上的应用可以缓解盐胁迫对玉米的伤害，提高盐碱地玉米的产量(见图7)，为盐碱地的改良和农业利用提供可行方案。

Claims (9)

1.一株植物根际促生菌T4-9，该菌株属于Bacillus megaterium，为革兰氏染色阳性巨大芽孢杆菌，于2019年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC17334。

2.权利要求1所述的植物根际促生菌T4-9在制备微生物肥料中的应用。

3.根据权利要求2中的应用，其特征在于所述的微生物肥料为具有提高植物耐盐碱胁迫能力的盐碱地专用微生物肥料。

4.一种具有提高植物耐盐碱胁迫能力的盐碱地专用微生物肥料，其特征在于该微生物肥料中包含权利要求1所述的植物根际促生菌T4-9。

5.根据权利要求4所述的微生物肥料，其特征在于所述的植物根际促生菌T4-9在该微生物肥料中的含量不低于1×10⁸个孢子/g。

6.根据权利要求4或5所述的微生物肥料，其特征在于该微生物肥料中的养分含量≥5％、有机质含量≥45％。

7.根据权利要求4或5所述的微生物肥料，其特征在于该微生物肥料采用以下步骤制备：

(1)将权利要求1所述的植物根际促生菌T4-9接种到改良的糖蜜培养基进行液体发酵，发酵条件为：pH7.3～7.6，培养温度为34～36℃，发酵周期为45～50h；发酵中后期形成芽孢，发酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/mL；

(2)以腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥作为该微生物肥料的载体有机物料，将步骤(1)制备的植物根际促生菌T4-9发酵液与腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥进行二次固体发酵，每吨固体有机物料中加入植物根际促生菌T4-9发酵液30L并混合均匀，中途进行翻堆，使其发酵温度低于50℃，发酵7天后结束，植物根际促生菌T4-9的活菌或芽孢量达到1×10⁸个/g，获得二次固体发酵的牛粪猪粪秸秆混合堆肥微生物有机肥。

8.根据权利要求7所述的微生物肥料，其特征在于，步骤(1)中所述的改良的糖蜜培养基配制方法为：按重量百分含量计，糖蜜5％、豆粕粉0.72％、氯化钠0.5％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钙0.1％、硫酸镁0.1％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锌0.05％、硫酸锰0.05％、水93.33％，pH值调节至7.5±0.1，121℃灭菌20min。

9.一种具有提高植物耐盐碱胁迫能力的盐碱地专用微生物肥料的制备方法，其特征在于包括以下步骤制备：

(1)将权利要求1所述的植物根际促生菌T4-9接种到改良的糖蜜培养基进行液体发酵，发酵条件为：pH7.3～7.6，培养温度为34～36℃，发酵周期为45～50h；发酵中后期形成芽孢，发酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/mL；

(2)以腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥作为该微生物肥料的载体有机物料，将步骤(1)制备的植物根际促生菌T4-9发酵液与腐熟后的牛粪猪粪秸秆混合堆肥进行二次固体发酵，每吨固体有机物料中加入植物根际促生菌T4-9发酵液30L并混合均匀，中途进行翻堆，使其发酵温度低于50℃，发酵7天后结束，植物根际促生菌T4-9的活菌或芽孢量达到1×10⁸个/g以上，获得二次固体发酵的牛粪猪粪秸秆混合堆肥微生物有机肥。