CN109832085A - 双孢虫草及其人工栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一种虫草新记录种——双孢虫草[Ophiocordyceps bispora(Stifler)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel‑Jones&Spatafora]，和一种人工培养双孢虫草子实体的方法。该方法以云南土白蚁（Odontotermesyunnanensis）为培养基载体、以双孢虫草无性型为菌种，其主要操作步骤如下：A、菌种活化；B、液体摇瓶种子培养；C、虫草子实体培养。人工培养的双孢虫草子实体呈棒状，乳白色或棕色，成熟后变黑灰色，其长度与大小同野生双孢虫草类似。本发明为首创，利用该方法可以稳定、连续、批量地培养双孢虫草子实体，为双孢虫草的食用和药用研究奠定基础。

Description

双孢虫草及其人工栽培方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种虫生真菌——双孢虫草的无性型菌种和一种人工栽培双孢虫草子实体的方法。

背景技术

双孢虫草（Ophiocordyceps bispora）分布地点仅见于非洲坦桑尼亚Tanzania和肯尼亚Kenya接近内罗比Nairobi的半干旱草原，以及云南省哀牢山地区，属于亚洲新纪录种。双孢虫草隶属于真菌门、子囊菌纲、线虫草科、线虫草属。双孢虫草的寄主为等翅目的白蚁，本课题组经过多次分离纯化得到其无性型菌种。经文献调研，国内外还没有此种真菌栽培的报道与专利。双孢虫草野生资源稀少，实现其人工栽培是开发利用该种虫草资源需要解决的重要问题。

中医认为，白蚁性平，味咸，具有特殊的药用价值。明代李时珍的《本草纲目》中，就有用白蚁治病的记载。近年来人们发现，白蚁含有丰富的蛋白质、氨基酸、脱氧核糖核酸及其他药用成分。据测定，白蚁的氨基酸含量比名贵滋补品燕窝高出11.1%，还富含微量元素铁和维生素A、维生素B₂。白蚁体内存在的抗病物质甾体（主要有胆甾醇及其衍生物、谷甾醇、豆甾醇等），对癌细胞有一定的抑制作用。

本发明将双孢虫草的无性型菌种接种至云南土白蚁（Odontotermes yunnanensis），再添加其它营养液进行培养，通过对温度、湿度、光照、通风等的严格控制，营造出优于野生环境的营养条件和环境条件，最终使得双孢虫草菌菌丝分化、子实体形成，经过干燥、粉碎后，可用于开发增强免疫力和缓解体力疲劳的保健食品或者药。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种适于人工培养、产量高、有效成分含量高的虫草菌种。

本发明的目的之二在于提供一种适于规模化生产上述虫草菌的培育方法。

菌种及特性：

本发明提供的双孢虫草属于亚洲新记录种，其无性型菌株已于2017年8月10日保藏于云南大学中草药生物资源研究所真菌培养物保藏中心，保藏号为YFCC 170801。该菌株在PDA培养基上25℃培养21天，菌落直径14-16mm，白色，绒毛状，圆形，边缘整齐，常形成簇状子实体（孢梗束）；背面不产色素。菌丝透明，分隔，光滑，菌丝宽3.3-8.1μm。产孢细胞瓶梗状，分为A型瓶梗和B型瓶梗。A型瓶梗较长，通常发生于菌丝顶端，单生，锥形或圆柱形，15.1-26.8μm长，基部宽2.3-5.1 µm，向上逐渐变细，顶端宽0.9-2.1 µm，产生单个孢子。B型瓶梗通常发生于气生菌丝，单生或轮生，长9.7-14.7μm，基部膨大，椭圆形或球形，宽2.1-4.8μm，向上突然变细形成细长瓶颈，瓶颈长1.99-5.33μm，宽0.8-1.5μm。瓶梗常常再育形成牙形的许多小瓶颈。分生孢子单孢，光滑，近球形或椭圆形，3.8-6.4×3.4-5.2μm。

栽培方法：

将双孢虫草无性型菌种接种于改良的PDA固体培养基，进行菌种活化。然后将活化的菌种接种在液体培养基上进行种子液的配制。取一罐头瓶，加入110-130g 云南土白蚁和40-60mL营养液，湿热灭菌并冷却后，按5-10%的接种量接种菌种液，在适宜条件下进行子实体培养。子实体培养初期于温度23-27℃、湿度30-75%下避光进行，待10-20天长出大量菌丝体后转至人工气候箱培养。接下来是子实体形成阶段，分低温培养、变温培养、恒温培养三步。首先，低温培养5-10天，温度应控制在17-22℃，湿度40-60%，光照强度为10-50Lx。接着变温培养5-10天，保持湿度不变（50-70%），在温度20-25℃，光照强度100-200Lx下培养16h；然后调节温度为10-15℃，避光培养8h。最后，恒温培养15-20天，培养条件为温度22-27℃，湿度75-100%，光照300-700 Lx。培养成熟的子实体与野生采集样本类似，棒状，黑灰色，有明显的子囊壳结构，且富含野生双孢虫草所具有的各种营养成分。

具体实施方式

以下实施例可以对本发明作进一步说明：

1. 固体培养基配制：取没有发芽、变青的马铃薯，洗净去皮，称取200g，切成1厘米左右见方的小块。将切好的马铃薯小块放入约1000mL水中，煮沸后用温火保持30分钟。结束后用纱布过滤，得到滤液为马铃薯汁，将滤液补足至1000mL。然后加入葡萄糖20g，蛋白胨5g，琼脂20g，搅拌均匀后分别倒入试管，在121℃灭菌30分钟，取出后倾斜放置，待冷却凝固后可用于转种。

2. 液体培养基配制：取没有发芽、变青的马铃薯，洗净去皮，称取200g，切成1厘米左右见方的小块。将切好的马铃薯小块放入约1000mL水中，煮沸后用温火保持30分钟。结束后用纱布过滤，得到滤液为马铃薯汁，将滤液补足至1000mL后分装成500mL/瓶（三角瓶为1000mL规格）。每瓶加入葡萄糖10g，玉米粉10g，黄豆粉5g，魔芋粉5g，蛋白胨5g，酵母浸粉3g，硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾0.5g，搅拌均匀，塞上棉塞，在121℃灭菌30分钟后自然冷却、备用。

3. 固体培养制种：取双孢虫草无性型菌种，无菌条件下接入步骤1制作的固体斜面培养基，25℃避光培养。菌丝覆盖表面约70%时，可将菌丝接入液体培养基制种。制种过程如下：从斜面培养基上取1小块（大小约3-5mm×3-5mm）菌丝放入装有液体培养基的三角瓶内，在100rpm、25℃下培养约5天，待菌球长至适宜大小，即可用于接种。

4. 白蚁培养基配制：在一罐头瓶中加入120g云南土白蚁和50mL营养液，121℃下灭菌30分钟。营养液的配方为：葡萄糖20g，玉米粉20g，黄豆粉10g，魔芋粉10g，硫酸镁2.0g，磷酸二氢钾1.0g，维生素B1 5mg，水1000mL，调节pH8。

5. 接种：灭菌后的白蚁培养基冷却后，按8%的接种量接种菌种液。

6. 将接种后的罐头瓶置于适宜条件下进行子实体培养。子实体培养初期于温度25℃、湿度60%下避光进行，待20天长出大量菌丝体后转至人工气候箱培养。接下来是子实体形成阶段，分低温培养、温差培养、恒温培养三步。低温培养10天，温度应控制在18℃，湿度50%，光照强度为50Lx；接着进行。变温培养5天，保持湿度不变（70%），温度25℃，光照强度300Lx下培养16h，然后调节温度为15℃，避光培养8h；最后，恒温培养20天，培养条件改为温度27℃，湿度90%，光照500 Lx。

7. 采收成熟的双孢虫草。将罐头瓶中的双孢虫草用机械力打碎后收集、干燥后密封，用于进一步深加工。每瓶可收获鲜双孢虫草135-145g，干燥后每瓶干品重量约40-50g。

8. 人工培养的双孢虫草有效成分分析

经检测，上述干燥、粉碎的双孢虫草中，每1g含虫草多糖、虫草酸、胸苷、2`-脱氧腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤分别为63.48mg、114.33mg、51.47μg、785.96μg、819.28μg、344.57μg，明显优于野生双孢虫草和野生冬虫夏草（见表1）。

按照上述方法进行多批次栽培，结果稳定。

表1 人工培养的双孢虫草有效成分分析（n=3）

物种

虫草多糖mg/g

虫草酸mg/g

胸苷μg/g

2`-脱氧腺苷μg/g

尿嘧啶μg/g

腺嘌呤μg/g

人工培养的双孢虫草

63.48±3.06

114.33±11.61

51.47±2.62

785.96±54.74

819.28±82.94

344.57±29.48

野生双孢虫草

16.11±4.54

68.90±3.29

0

376.69±8.48

115.24±18.98

251.24±5.33

野生冬虫夏草

44.79±4.58

89.20±0.63

28.57±1.53

24.33±0.96

75.43±4.17

46.80±1.14

Claims (5)

1.一种虫生真菌，为双孢虫草[Ophiocordyceps bispora (Stifler) G.H.Sung,J.M.Sung, Hywel-Jones & Spatafora]无性型，菌种保藏号YFCC 170801。

2.一种双孢虫草菌的人工栽培方法，其特征在于：

a、用权利要求1所述的菌株接种于改良的PDA固体培养基，进行菌种活化；

b、将活化的菌种接种在液体培养基上进行种子液的配制；

c、在一罐头瓶中加入110-130g 云南土白蚁（Odontotermesyunnanensis）和40-60mL营养液，湿热灭菌并冷却后，按5-10%（w/w）的接种量加入菌种液，在适宜条件下进行子实体培养(子实体培养初期于温度23-27℃、湿度30-75%下避光进行；子实体形成阶段，首先，低温培养5-10天，温度应控制在17-22℃，湿度40-60%，光照强度为10-50Lx。接着变温温差培养5-10天，保持湿度不变（50-70%），每天在温度20-25℃，光照强度100-200Lx下培养16h；然后调节温度为10-15℃，避光培养8h；最后，恒温培养15-20天，培养条件改为温度22-27℃，湿度75-100%，光照300-700Lx)。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于a所述改良PDA固体培养基原料配比为：马铃薯汁1000mL，葡萄糖5-25g，蛋白胨5-15g，琼脂15-20g。

这里的马铃薯汁由下述步骤获得：将切成小块的去皮马铃薯放入水中，马铃薯与水的重量比为1:5-1:6，煮沸后温火保持25-40min，滤去渣，滤液即为马铃薯汁，以下马铃薯汁与此相同。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于b所述液体培养基原料配比为：马铃薯汁1000mL，葡萄糖5-25g，玉米粉5-25g，黄豆粉5-15g，魔芋粉5-15g，蛋白胨5-15g，酵母浸粉5-10g，硫酸镁1.0-3.5g，磷酸二氢钾1.0-2.0g。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于c所述营养液的配方为：葡萄糖5-25g，玉米粉5-25g，黄豆粉5-15g，魔芋粉5-15g，硫酸镁1.0-3.5g，磷酸二氢钾1.0-3.0g，维生素B1 5-10mg，水1000mL，调节pH6-9。