CN109837307B - 建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法 - Google Patents
建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109837307B CN109837307B CN201711192326.9A CN201711192326A CN109837307B CN 109837307 B CN109837307 B CN 109837307B CN 201711192326 A CN201711192326 A CN 201711192326A CN 109837307 B CN109837307 B CN 109837307B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chromosome
- embryonic stem
- chromosomes
- exogenous
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法。具体地，本发明通过显微注射的方法将插入mCherry报告基因的单条染色体注射到小鼠受精卵中，从而产生含有外源染色体的小鼠胚胎干细胞(ESCs)。通过单染色体显微注射方法来直接转移修饰过的染色体从而来介导染色体工程的方法是一种非常有效的技术，并且可以促进含外源染色体的细胞的获得和染色体操作。
Description
技术领域
本发明涉及遗传学领域，更具体地涉及一种建立含外源染色体的胚胎干细胞的新方法。
背景技术
按设计有计划削减、添加和代换同种或异种染色体的方法和技术称为染色体工程。作为细胞工程基础之一，染色体工程是现代实验生物学上极有价值的手段之一，广泛应用于生物学、医学及农业的各个领域，是基因定位和染色体转移等基础研究的有效手段。
微细胞介导的染色体转移技术(MMCT)是一项利用微细胞将外源染色体转入受体细胞的技术。该技术是在细胞融合的基础之上发展起来的，是细胞融合技术的进一步细化，为表观遗传学、基因组印记、哺乳动物人工染色体等方面的进一步研究提供了强有力的手段。事实上，对于兆碱基大小的DNA片段工程来说，基因插入，端粒相关的截断和微细胞介导的染色体转移(MMCT)等染色体操作是非常有用的操作。然而，这些技术既需要特定的带有染色体修饰的供体细胞株也需要供转移的受体细胞，随之而来的问题是无法控制染色体数目。
综上，本领域迫切需要研究新的建立含外源染色体的细胞的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种建立含外源染色体的胚胎干细胞的新方法
在本发明的第一方面，提供了一种体外建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法，所述的方法包括步骤：
(a)提供一供体细胞，将mCherry报告基因插入到所述供体细胞的各个染色体中，从而获得染色体中整合有mCherry报告基因的第一细胞系；
(b)分离所述第一细胞系的各个染色体，从而获得单独的染色体；
(c)将步骤(b)获得的单独的染色体注射到非人哺乳动物的受精卵中，从而获得包含外源染色体的受精卵；
(d)将步骤(c)获得的受精卵体外培育形成囊胚，检测所述囊胚的mCherry荧光表达情况，从而获得表达mCherry荧光的囊胚；和
(e)利用所述的表达mCherry荧光的囊胚，建立胚胎干细胞系，从而获得含外源染色体的胚胎干细胞。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的供体细胞和受精卵来源于不同种类的动物。
在另一优选例中，所述的供体细胞来源于人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的供体细胞为人H9细胞。
在另一优选例中，所述的外源染色体是选自下组的一条或多条染色体：1号染色体、人2号染色体、人3号染色体、人4号染色体、人5号染色体、人6号染色体、人7号染色体、人8号染色体、人9号染色体、人10号染色体、人11号染色体、人12号染色体、人13号染色体、人14号染色体、人15号染色体、人16号染色体、人17号染色体、人18号染色体、人19号染色体、人20号染色体、人21号染色体、人22号染色体、人X染色体、人Y染色体。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为啮齿动物，较佳地为小鼠。
在另一优选例中，所述的mCherry报告基因为CAG-mCherry基因。
在另一优选例中，在步骤(a)中，通过基因编辑技术将mCherry报告基因插入到所述供体细胞的各个染色体中。
在另一优选例中，所述的基因编辑技术包括piggyBac定点整合技术、CRISPR技术。
在另一优选例中，所述的mCherry报告基因随机插入或定点整合到所述供体细胞的各个染色体中。
在另一优选例中，在步骤(b)中，先将第一细胞系阻滞在M期，再分离所述第一细胞系的各个染色体，较佳地通过Democolcine将细胞系阻滞在M期。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的单独的染色体的完整度≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％，如99.9％，100％。
在另一优选例中，在步骤(e)中，获得的含外源染色体的胚胎干细胞的染色体的完整度≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％，如99.9％，100％。
在另一优选例中，在步骤(c)中，通过显微注射的方法将单独的染色体注射到受精卵中。
在另一优选例中，在步骤(c)中，每个受精卵注射一条单独的染色体。
在另一优选例中，在步骤(d)中，所述的表达mCherry荧光的囊胚中包含含有外源染色体的细胞。
在另一优选例中，在步骤(e)之后，所述方法还包括步骤：
(f)对获得的胚胎干细胞中含有的染色体的种类和完整程度进行鉴定，从而获得包含完整的特定外源染色体的胚胎干细胞。
在另一优选例中，在步骤(f)之后，所述方法还包括步骤：
(g)利用所述的含外源染色体的胚胎干细胞，制备含外源染色体的嵌合动物。
在另一优选例中，在步骤(g)中，检测所述嵌合动物的mCherry荧光表达情况，从而获得含外源染色体的嵌合动物。
在另一优选例中，所述嵌合动物的繁殖能力正常。
在另一优选例中，所述的胚胎干细胞中含有完整的单条外源染色体。
在另一优选例中，所述方法用于非人哺乳动物的染色体转移。
在另一优选例中，所述方法建立的含外源染色体的胚胎干细胞可以用于制备含外源染色体的嵌合动物。
在本发明的第二方面，提供了一种含外源染色体的胚胎干细胞，所述的细胞是用本发明第一方面所述的方法制备的。
在另一优选例中，所述的细胞为非人哺乳动物细胞。
在本发明的第三方面，提供了一种本发明第二方面所述细胞的用途，所述的细胞用于制备人源化抗体。
在另一优选例中，所述的细胞含有人14号染色体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示直接转移修饰过的染色体从而介导染色体工程。
图1A显示了直接转移修饰过的14号染色体从而介导染色体工程的示意图。
图1B显示了Zy+H9-14#细胞系的具有代表性的荧光图。
图1C显示了转移了修饰过的第14号染色体的Zy+H9-14#细胞系的具有代表性的PCR分析结果。
图1D显示了Zy+H9-14#细胞系的具有代表性的FISH图。其中，罗丹明(红)信号表明人Cot-1重复序列能染色标识出整条人源染色体。
图2显示通过DTMC介导的策略来获得人源化动物模型。
图2A显示了通过囊胚注射获得Zy+H9-14小鼠的示意图。
图2B显示了Zy+H9-14嵌合小鼠的具有代表性的荧光图。
图2C显示了Zy+H9-14嵌合小鼠的基因型鉴定图。
图3显示了建立含一条人染色体的小鼠胚胎干细胞系的PCR鉴定结果。其中，P表示阳性对照，N表示阴性对照，结果表明，#3细胞系含人5号染色体，#9细胞系含人8号染色体。
图4显示了Zy+H9-14#细胞的DNA-FISH结果。其中，红色荧光表示小鼠X染色体，绿色荧光表示人14号染色体，检测所用探针包括：人14号染色体探针(购自广州市外显子生物技术有限公司，货号FD-5114H)，小鼠X染色体探针(购自广州市外显子生物技术有限公司，FD-5023M)。
图5显示了Zy+H9-14#细胞的全基因组测序结果。
图6显示了构建含人染色体的小鼠胚胎干细胞系的示意图。
图7显示了建立含一条人染色体的小鼠胚胎干细胞系的PCR鉴定结果。其中，P表示阳性对照，N表示阴性对照，结果表明，Zy+H9-14细胞中包含一条14号人染色体。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法。具体地，本发明通过显微注射的方法将插入mCherry报告基因的单条染色体注射到小鼠受精卵中，从而产生含有外源染色体的小鼠胚胎干细胞(ESCs)。因此，通过单染色体显微注射方法来直接转移修饰过的染色体从而来介导染色体工程的方法是一种非常有效的技术，并且可以促进含外源染色体的细胞的获得和染色体操作。在此基础上，完成本发明。
本发明方法制备的胚胎干细胞含有完整的外源人染色体，完整度≥90％，所述的细胞可以用于科研或医药用途，如可以用于制备人源化的单克隆抗体。
本发明的主要优点包括：
(a)染色体的完整性。本发明方法可以得到含有额外人完整染色体的小鼠胚胎干细胞系，而传统的微核染色体转移技术(MMCT)技术得到的额外染色体往往是一个染色体片段(10％-90％)。
(b)染色体条数。本发明方法得到的是含额外单一条数染色体的小鼠胚胎干细胞，而MMCT方法得到的往往是多个染色体片段，不利于鉴定和应用。
(c)简单高效。本发明方法一次小鼠胚胎注射实验可以得到多个含不同外源染色体的小鼠胚胎干细胞系。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用材料和方法
实施例中所用小鼠购自斯莱克公司，人胚胎干细胞来源于ATCC细胞库。
动物伦理申明
小鼠的饲养和使用步骤都遵循中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所的医药研究动物伦理委员会的指南。
细胞饲养
人胚胎干细胞(H9-14#)所用的培养基成分为：TeSR(Stemcell technologies)基础培养基中添加1XTeSR配套添加物，100U/ml青霉素(Life Technologies)，100μg/mL链霉素(Life Technologies)。小鼠胚胎干细胞的培养用2i培养基，成分为杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco，11965-02)、15％胎牛血清(FBS)(Gibco)、1000U/ml小鼠Lif、2mM谷氨酰胺(Sigma)、1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)、0.1mM非必需氨基酸(Gibco)、1μM PD0325901和3μMCHIR99021。所有的细胞都在37℃、5％ CO2的环境下培养。
荧光原位杂交(FISH)
收集mESCs，孵育在0.075M KCl中，随后用3:1的甲醇：醋酸(V/V)在4℃对其进行固定，并且滴到载玻片上。载玻片在37℃老化过夜，然后室温下通过一系列乙醇梯度(70％、90％和100％乙醇各五分钟)进行脱水，接着75℃在70％甲酰胺/2XSSC中进行变性5分钟，然后在-20℃预冷的乙醇梯度中(100％、90％、70％)进行快速的复水。人源Cot-1探针(Invitrogen，15279-011)在75℃下水浴变性5分钟。载玻片放在湿盒中37℃杂交过夜，第二天42℃下用70％甲酰胺/2XSSC洗涤2个5分钟，后用2XSSC洗涤2个5分钟。最后，载玻片用10μl抗淬灭的DAPI染色并且封片。样品用Olympus BX53 fluorescent microscope或者NikonNiE-A1 plus fluorescent microscope.
有丝分裂染色体的分离
实验前细胞换新鲜培养基并且加入秋水仙素(75ng/ml)37℃孵育10-12小时，然后胰酶消化，1000rpm离心10分钟来收集细胞。用10ml GH缓冲液(100mM甘氨酸和1％乙烯乙二醇，并且用氢氧化钙调节pH值至8.4-8.6)重悬细胞，37℃水浴孵育，然后冰上5分钟。细胞中加入100μl的TritonX-100(终浓度至0.1％)，冰上孵育5分钟。用23-G针头吹吸细胞三次(并用显微镜检查细胞裂解和染色体释放情况)，1000rpm离心20分钟聚集细胞碎片，取上清放入新的管中，然后4℃ 2500rpm离心20分钟。用1ml HCZB重悬染色体，4℃ 2500rpm离心20分钟聚集染色体。最后用100μlHCZB重悬染色体。
受精卵注射和胚胎培养
为了染色体转移实验，首先激素超排C57BL/6雌鼠(三周大)或B6D2F1(C57BL/6XDBA2J)雌鼠(7-8周大)，然后分别与C57BL/6公鼠或者B6D2F1公鼠交配，然后从输卵管中收集受精卵。选取单条染色体，用FemtoJet微量注射仪(Eppendorf)的持续水流模式注入到可以明显看到原核的受精卵胞质中，注射的过程在含5μg/ml细胞松弛素(CB)的HEPES-CZB培养基中完成，注射完后的胚胎在37℃、5％ CO2的情况下在含氨基酸的KSOM培养基中养至囊胚来进行干细胞建系。
囊胚建系
囊胚的透明带用台式酸溶液(Sigma#T1788)去除。然后每个囊胚分别转移到预先铺了MEF的96孔板中的单个孔中，培养基成分为Knockout杜尔贝科改良伊格尔培养基(Gibco,KO DMEM)，加上20％KSR(Gibco)，2mM谷氨酰胺(Sigma)，1％青霉素/链霉素(ThermoFisher Scientific)，0.1mM非必需氨基酸(Gibco)，1000U/ml小鼠Lif，1μM PD0325901和3μM CHIR99021。5-7天后，胚胎生长物传代至24孔板的孔中来进行ES建系。
囊胚注射和胚胎移植
为了囊胚注射实验，从输卵管中收集受精卵，在37℃、5％ CO2的情况下在含氨基酸的KSOM培养基中培养至囊胚。人胚胎干细胞用胰酶消化，后用KSOM培养基重悬。用Piezo显微操作系统，在显微镜下在透明带和滋养外胚层上打孔，然后注射10-15个干细胞至囊胚靠近内细胞团的腔内。囊胚注射后，胚胎在37℃、5％ CO2的情况下再培养1-2小时。每只2.5dpc的假孕ICR母鼠的子宫中移植20-25枚注射过的囊胚。
基因型分析
用TIANamp genomic DNA Kit(Tiangen，DP304-03)从小鼠尾巴中抽提基因组DNA，用引物(见表1)进行PCR扩增。ExTaq在95℃、3分钟的条件下被激活，然后PCR的程序为95℃30s，60℃ 30s和72℃ 1分钟，这样反复30个循环后，最终72℃延伸5分钟。PCR产物进行胶回收纯化并且进行测序。
实施例1
含人染色体的小鼠胚胎干细胞系的构建
通过piggyBac定点整合技术将CAG-mCherry随机插入到人的H9细胞系中的各个人的染色体中，并通过流式分选技术，获得稳定的各个染色体有CAG-mCherry整合的细胞系。
随后，通过Democolcine将细胞系阻滞在M期，再将各个染色体单独分离，通过显微注射的方法，将单独的每条人染色体单独注射到小鼠受精卵中。如果该人染色体带有CAG-mCherry，有受精卵发育而来的囊胚细胞会表达mCherry荧光，因而可以实时追踪含有人染色体的细胞。通过这个途径，将含有荧光的小鼠囊胚建立胚胎干细胞系，之后进一步鉴定建立的小鼠胚胎干细胞系含有特定编号的人染色体。具体实验流程如图6所示。
结果如图3所示，通过这种方法，分别得到了含人5号，8号(图3)以及14号染色体(图7)的小鼠胚胎干细胞系。
针对含14号人染色体的小鼠胚胎干细胞(命名为Zy+H9-14或TcH14)，进行进一步的鉴定，包括PCR，DNA-FISH，全基因组测序和核型分析。
DNA-FISH的结果如图4所示，结果显示该细胞系含1条人的14号染色体。
全基因组测序结果如图5所示，结果显示了人14号染色体的所有片段都能检测到，证实了人14号染色体的完整性。
核型分析结果该细胞系含41条人的染色体，其中含1条人的染色体。
上述结果表明，构建的Zy+H9-14细胞株含有完整的人的14号染色体。
实施例2
直接转移修饰过的染色体从而来介导染色体工程
为了进一步研究实施例1中的直接转移修饰过的染色体(direct transfer ofthe modified chromosome，DTMC)策略是否能用于产生携带人染色体的小鼠胚胎干细胞，使用H9-14#细胞株，进行实验。H9-14#细胞是在人胚胎干细胞系(H9)的第14号染色体上，用PiggyBac(PB)系统插入了mCherry报告基因制备而成。
选取H9-14#细胞株中分离出来的单条染色体，用Piezo显微注射法注射到小鼠受精卵中(图1A)。注射后的受精卵培养至囊胚并建成胚胎干细胞系，根据mCherry荧光和人14号染色体的特定引物鉴定构建的细胞系。
结果如图1B和1C所示，获得了含人14号染色体的细胞株(命名为Zy+H9-14)。
通过原位杂交(FISH)的方法对含有人染色体的Zy+H9-14细胞株进行了二次鉴定，结果如图1D所示，再次确认获得的Zy+H9-14细胞株含有人14号染色体。
实施例3
通过DTMC介导的策略来获得人源化动物模型
为了研究这种直接转移修饰过的染色体(DTMC)策略是否能用于产生人源化小鼠，注射实施例2构建的Zy+H9-14细胞至小鼠囊胚中(图2A)。将注射后的胚胎移植入假孕母鼠体内后，通过DTMC介导的方法所获得基因编辑小鼠出生率正常，而且成功高效的获得了人源化小鼠(61.5％，13只中有8只阳性小鼠)(图2B和图2C)。在12.5天的胚胎和P3的新生小鼠的切片中可以发现有高嵌合率的mCherry表达(图2B)。特别地，当在P1新生小鼠的睾丸和附睾中能够检测到mCherry的表达(图2B)，这说明很有可能具备通过生殖系传递获得人源化小鼠的能力。
怀孕母鼠自然生产，获得了十只存活小鼠，通过观察荧光和基因型鉴定，发现其中有6只(60％)可作为人源化创建者小鼠(图2B和2C)。
综上所述，结果表明DTMC介导的方法在获得基因修饰小鼠方面是一种有效并且可靠的策略。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (19)
1.一种体外建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(a) 提供一供体细胞，将mCherry报告基因插入到所述供体细胞的各个染色体中，从而获得染色体中整合有mCherry报告基因的第一细胞系；
(b) 分离所述第一细胞系的各个染色体，从而获得单独的染色体；
(c) 将步骤(b)获得的单独的染色体注射到非人哺乳动物的受精卵中，从而获得包含外源染色体的受精卵；
(d) 将步骤(c)获得的受精卵体外培育形成囊胚，检测所述囊胚的mCherry荧光表达情况，从而获得表达mCherry荧光的囊胚；和
(e) 利用所述的表达mCherry荧光的囊胚，建立胚胎干细胞系，从而获得含外源染色体的胚胎干细胞；
所述的外源染色体是人14号染色体；
所述非人哺乳动物是小鼠；
所述的方法是非诊断和非治疗性的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的供体细胞和受精卵来源于不同种类的动物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的供体细胞来源于人或非人哺乳动物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的mCherry报告基因为CAG-mCherry基因。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，通过基因编辑技术将mCherry报告基因插入到所述供体细胞的各个染色体中。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，先将第一细胞系阻滞在M期，再分离所述第一细胞系的各个染色体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，通过Democolcine将细胞系阻滞在M期。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述的单独的染色体的完整度≥90%。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的单独的染色体的完整度≥95%。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的单独的染色体的完整度≥99%。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的单独的染色体的完整度为99.9%或100%。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，获得的含外源染色体的胚胎干细胞的染色体的完整度≥90%。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，获得的含外源染色体的胚胎干细胞的染色体的完整度≥95%。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，获得的含外源染色体的胚胎干细胞的染色体的完整度≥99%。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，获得的含外源染色体的胚胎干细胞的染色体的完整度为99.9%或100%。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，每个受精卵注射一条单独的染色体。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)之后，所述方法还包括步骤：
(f)对获得的胚胎干细胞中含有的染色体的种类和完整程度进行鉴定，从而获得包含完整的特定外源染色体的胚胎干细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：
(g) 利用所述的含外源染色体的胚胎干细胞，制备含外源染色体的嵌合动物。
19.一种细胞的用途，其特征在于，所述的细胞用于制备人源化抗体；
所述细胞是用权利要求1所述的方法制备的含外源染色体的胚胎干细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711192326.9A CN109837307B (zh) | 2017-11-24 | 2017-11-24 | 建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711192326.9A CN109837307B (zh) | 2017-11-24 | 2017-11-24 | 建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109837307A CN109837307A (zh) | 2019-06-04 |
| CN109837307B true CN109837307B (zh) | 2023-09-19 |
Family
ID=66876476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711192326.9A Active CN109837307B (zh) | 2017-11-24 | 2017-11-24 | 建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109837307B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3927832A4 (en) | 2019-02-18 | 2022-11-30 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMALS WITH A HUMANIZED IMMUNOGLOBULIN LOCUS |
| JP2023529846A (ja) | 2020-06-02 | 2023-07-12 | バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド | 共通軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を有する遺伝子改変非ヒト動物 |
| CN114107182A (zh) * | 2022-01-07 | 2022-03-01 | 徐维海 | 一种提高囊胚形成率的方法 |
| CN115161342B (zh) * | 2022-07-27 | 2024-04-30 | 内蒙古大学 | 一种具有新遗传性状的细胞系和动物的构建方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1628169A (zh) * | 2001-05-11 | 2005-06-15 | 麒麟麦酒株式会社 | 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体 |
| CN101333516A (zh) * | 1995-08-29 | 2008-12-31 | 麒麟医药株式会社 | 嵌合体动物及其制备方法 |
| CN102791857A (zh) * | 2010-01-06 | 2012-11-21 | 国立大学法人鸟取大学 | 小鼠人工染色体载体 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1536007B1 (en) * | 2002-09-03 | 2015-12-30 | Japan Science and Technology Agency | Artificial mammalian chromosome |
| CA2705841C (en) * | 2007-11-14 | 2015-01-27 | National University Corporation Tottori University | Mammalian artificial chromosome vector comprising human cytochrome p450 gene (cluster) and non-human mammalian animal retaining the same |
| HU230368B1 (hu) * | 2012-11-16 | 2016-03-29 | Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Kutatóközpont | Új módszer az emlős mesterséges kromoszóma több génnel való feltöltésére |
-
2017
- 2017-11-24 CN CN201711192326.9A patent/CN109837307B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101333516A (zh) * | 1995-08-29 | 2008-12-31 | 麒麟医药株式会社 | 嵌合体动物及其制备方法 |
| CN1628169A (zh) * | 2001-05-11 | 2005-06-15 | 麒麟麦酒株式会社 | 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体 |
| CN1789416A (zh) * | 2001-05-11 | 2006-06-21 | 麒麟麦酒株式会社 | 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体 |
| CN102791857A (zh) * | 2010-01-06 | 2012-11-21 | 国立大学法人鸟取大学 | 小鼠人工染色体载体 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| An Aneuploid Mouse Strain Carrying Human Chromosome 21 with Down Syndrome Phenotypes;Aideen O’Doherty et al.;《Science》;20050923;第309卷;第2033-2037页 * |
| 人类染色体病研究进展;陈海伟等;《赤峰学院学报（ 自然科学版）》;20120229;第28卷(第2期);第113-117页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109837307A (zh) | 2019-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cibelli et al. | Trasgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stem-like cells | |
| JP6905714B2 (ja) | 始原生殖細胞を機能的に成熟した卵母細胞へと分化させる培養方法 | |
| CN109837307B (zh) | 建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法 | |
| NZ230723A (en) | Pluripotential embryonic stem cells isolated from an embryonic disc, methods of producing transgenic cells and a chimeric foetus | |
| JP2012024088A (ja) | ラット胚性幹細胞 | |
| JP2020043864A (ja) | 幹細胞を用いた異種間胚胞キメラ動物の作製法 | |
| CN102762717A (zh) | 使用大鼠胚胎干细胞构建嵌合大鼠的方法 | |
| Gręda et al. | Mouse zygotes as recipients in embryo cloning | |
| CN118185862B (zh) | 一种小鼠四倍体器官的制备方法 | |
| US8119785B2 (en) | Nucleic acid sequences and homologous recombination vectors for distruption of a Fel D I gene | |
| JP6827250B2 (ja) | 多能性幹細胞再樹立法 | |
| WO2013159313A1 (zh) | 一种动物胚胎干细胞系及其制备方法和应用 | |
| US10626417B2 (en) | Method of genetically altering and producing allergy free cats | |
| Park et al. | Conservation of migration and differentiation circuits in primordial germ cells between avian species | |
| CN114369567A (zh) | 牛扩展多能性胚胎干细胞的建系方法及培养液 | |
| JP4502317B2 (ja) | 未分化細胞を選別する方法およびその利用 | |
| Kagami et al. | Strain preference in donor and recipient for production of W-bearing sperm in mixed-sex germline chimeric chickens | |
| WO2021200768A1 (ja) | ヒト染色体の分散方法、単離方法、およびその動物胚への移植方法 | |
| WO2019204530A1 (en) | Generation of human endodermal organs in pig model using lineage restricted endodermal precursors | |
| EP3120700A1 (en) | Microinjection into a cell's nucleus following somatic cell nuclear transfer | |
| WO2015152146A1 (ja) | １倍体胚性幹細胞の培養方法 | |
| Soszyńska et al. | Exposure of chimaeric embryos to exogenous FGF4 leads to the production of pure ESC-derived mice | |
| CN118147052A (zh) | 分离、培养鸡原始生殖干细胞并构建基因修饰鸡的方法 | |
| Doungkamchan | Gene Therapy for Male Infertility | |
| CN118389597A (zh) | 一种小鼠全能性干细胞的获得方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20200519 Address after: 200031 No. 320, Yueyang Road, Shanghai, Xuhui District Applicant after: Center for excellence and innovation of brain science and intelligent technology, Chinese Academy of Sciences Address before: 200031 Yueyang Road, Shanghai, No. 319, No. Applicant before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |