CN109790578A - 使用纳米晶体管的核酸测序 - Google Patents
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Abstract
实施方案可包括测定核酸序列的方法。核酸可以是DNA。所述方法可包括通过聚合酶从第一核酸链和第二核酸链形成双链核酸分子。形成双链核酸分子可包括将第一化合物添加至第二核酸链。第一化合物可包括与第三核酸链连接的核苷酸。第三核酸链可以连接到部分。所述方法还可以包括使核苷酸从第三核酸链和所述部分脱离。所述方法可以进一步包括测量由所述部分导致的晶体管的电特征的变化。此外，所述方法可以包括基于测量的电特征的变化来识别核苷酸。
Description
背景
纳米晶体管，即尺寸在纳米级的晶体管，已被用作化学或生物传感器(S. Sorgenfrei等人，Nano Lett. 11(9):3739-3743 (2011)；R. Chen等人，PNAS 100(9):4984-4989(2003)；S. Peng等人，在第三届International Workshop on Structural HealthMonitoring的研讨会论文，可在ionicviper.org/system/files/Carbon%20Nanotube%20Sensor_resource.pdf获得)。纳米晶体管通常包括固态组件，并且在一些情况下，固态纳米晶体管包括两个电极之间的半导体材料。通过电极之间的半导体材料发送电流。通过纳米晶体管的电特征基于化合物的存在或与纳米晶体管接近而改变。与纳米晶体管上的纳米级组件相互作用的化合物通常改变这些纳米晶体管的电特征和操作，允许将纳米晶体管用作传感器。已经考虑将纳米晶体管用于核酸测序，例如，在单分子测序中(美国专利公开号2006/0246497 A1)。通过本文中描述的技术解决了对纳米晶体管测序的准确性，精确度，操作，效率，经济性和/或其他方面的改进。
概述
本技术的实施方案允许使用纳米晶体管分析核酸分子。当分子靠近或接触纳米晶体管时，纳米晶体管可以经历电特征(诸如电流频率或电流幅度)的变化。为了分析核酸分子，可以使用作为标记的部分，并将其连接到核苷酸或其他核酸分子前体。具有所述部分的核苷酸可以与核酸分子杂交，并且然后可以在纳米晶体管中测量电特征的变化。可以基于电特征的变化识别所述部分，并且然后也可以相应地识别与所述部分结合的核苷酸。因此，然后可以确定核酸分子的序列。
在一些实施方案中，为了帮助感测核苷酸，可以使用拴系化合物将聚合酶拴系到晶体管。核苷酸与包含所述部分的标记化合物连接。聚合酶使核苷酸与核酸分子杂交。核苷酸的杂交可以使核苷酸与标记化合物分离。在核苷酸与标记化合物分离后，标记化合物的一部分可以与拴系化合物的一部分结合。结果，可以使所述部分与纳米晶体管足够接近以被检测到。标记化合物的剩余物可以部分或完全与拴系化合物分离。然后，标记化合物可以再次与拴系化合物结合并重复该过程。晶体管中电特征的所得变化可有助于识别所述部分。在标记化合物与拴系化合物完全分离后，随后可以通过聚合酶将具有另一部分的另一核苷酸添加到待测序的核酸分子。本技术的实施方案可以允许通过电特征而不是光特征来分析核酸分子。此外，实施方案还可以避免在分析中洗涤循环的需要。
一些实施方案可包括测定核酸序列(例如DNA)的方法。所述方法可包括通过由拴系化合物连接到晶体管的核酸聚合酶延伸新生链。核酸聚合酶可以并入与包含部分(moiety)的标记化合物连接的核苷酸。核酸聚合酶还可以从新生链和所述部分切割核苷酸。所述方法可以进一步包括测量由所述部分导致的晶体管的电特征的变化。此外，所述方法可以包括基于测量的电特征的变化来识别核苷酸。
实施方案可包括核酸分子系统。所述系统可包括与拴系化合物连接的核酸聚合酶。聚合酶可以配置为延伸新生链。所述系统还可包括与标记化合物连接的核苷酸。标记化合物可包含部分(moiety)。所述系统还可以包括与电源电连通的晶体管。聚合物可以连接到晶体管。此外，所述系统可以包括仪表装置，所述仪表装置被配置为在通过核酸聚合酶从核苷酸切割标记化合物之后，测量来自所述部分的晶体管的电特征。
一些实施方案可包括测定多个核酸序列的方法。所述方法可以包括将模板亲本链固定到晶体管。所述方法包括通过核酸聚合酶延伸新生链。核酸聚合酶可以并入与包含部分(moiety)的标记化合物连接的核苷酸。聚合酶可以在新生链的延伸期间从标记化合物切割核苷酸。新生链与模板亲本链杂交。所述方法还包括测量由所述部分导致的晶体管的电特征的变化。此外，所述方法包括基于测量的电特征的变化识别核苷酸。
实施方案还可包括核酸分子分析系统。所述系统包括固定到晶体管的模板亲本链。所述系统还包括核酸聚合酶，所述核酸聚合酶被配置为延伸与模板亲本链杂交的新生链。所述系统还包括与标记化合物连接的核苷酸。标记化合物可包含部分(moiety)。此外，所述系统可以包括与晶体管电连通的电源。所述系统可以进一步包括仪表装置，所述仪表装置被配置为在核酸聚合酶从标记化合物切割核苷酸之后，测量来自所述部分的晶体管的电特征。
本发明提供了测定核酸序列的方法，所述方法包括通过由拴系化合物连接到晶体管的核酸聚合酶延伸新生链，其中所述核酸聚合酶并入与包含部分(moiety)的标记化合物连接的核苷酸，并且在新生链的延伸期间从标记化合物切割核苷酸，新生链与模板亲本链杂交；测量由所述部分导致的晶体管的电特征的变化；并基于测量的电特征的变化识别核苷酸。拴系化合物可以包含肽序列，并且可以包含可被固定到晶体管的聚合物。标记化合物可包含与所述部分连接的第一核酸链。所述方法可以进一步包括使第一核酸链的一部分与第二核酸链的一部分杂交，并任选地将第一核酸链的一部分与第二核酸链的一部分分开。电特征可以是电流，并且包括电流幅度或电流频率。
所述方法可以进一步包括使所述部分更靠近和远离晶体管移动，其中移动所述部分改变电特征。如果核苷酸是第一核苷酸并且所述部分是第一部分，标记化合物是第一标记化合物，并且电特征的变化是电特征的第一变化，则所述方法可以进一步包括通过核酸聚合酶进一步延伸新生链，其中核酸聚合酶并入与包含第二部分的第二标记化合物连接的第二核苷酸，在新生链的进一步延伸期间从第二标记化合物切割第二核苷酸，测量由第二部分导致的晶体管的电特征的第二变化，并基于测量的电特征的变化识别第二核苷酸。
第一部分可以与第二部分不同，并且由第一部分导致的晶体管的电特征的第二变化可以不同于由第二部分导致的晶体管的电特征的第一变化。第一标记化合物可包含第一核酸链，第二标记化合物包含第二核酸链，且第二核酸链包含与第一核酸链相同的序列。
如果核苷酸是第一核苷酸，则所述方法可以进一步包括识别第二核苷酸，其中模板亲本链包含第二核苷酸。在一个实施方案中，新方法可以进一步包括在所述部分振荡至晶体管和从晶体管振荡的同时，测量通过晶体管的电流的幅度和频率。
本发明还提供了测定核酸序列的方法，所述方法包括将模板亲本链固定到晶体管；通过核酸聚合酶延伸新生链，其中核酸聚合酶并入与包含部分(moiety)的标记化合物连接的核苷酸，并且在新生链的延伸期间从标记化合物切割核苷酸，新生链与模板亲本链杂交；测量由所述部分导致的晶体管的电特征的变化；并基于测量的电特征的变化识别核苷酸。
所述方法可以进一步包括将多个模板亲本链固定到晶体管，其中所述多个模板亲本链中的每个模板亲本链包含相同的序列，通过多个核酸聚合酶延伸多个新生链，其中所述多个核酸聚合酶并入多个核苷酸，其中所述多个核苷酸中的每个核苷酸与多个标记化合物中的一个标记化合物连接，并且所述多个标记化合物中的每个标记化合物包含多个部分中的一个部分，并且在多个新生链的延伸期间，从多个标记化合物切割多个核苷酸，所述多个新生链中的每个新生链与多个模板链中的一个模板亲本链杂交，其中测量晶体管的电特征的变化包括测量由所述多个部分导致的电特征的变化，并且基于测量的电特征的变化识别核苷酸包括基于测量的电特征的变化识别多个核苷酸。
将模板亲本链固定到晶体管可以包括使模板亲本链与晶体管接触。将模板亲本链固定到晶体管还可以包括将模板亲本链固定到颗粒，并且在新生链的延伸期间，使所述颗粒接触晶体管。所述颗粒可以是珠子，或可以通过拴系化合物固定到晶体管。
本发明还提供了用于执行上公开的根据本发明的方法的系统和仪器。
附图简述
图1显示了根据本技术的实施方案的纳米晶体管。
图2显示了根据本技术的实施方案，来自纳米晶体管的电特征的图。
图3显示了根据本技术的实施方案，在纳米晶体管的半导材料上具有化合物的纳米晶体管。
图4显示了根据本技术的实施方案，在化合物与纳米晶体管的半导材料接触之前和之后，来自纳米晶体管的电特征的图。
图5显示了根据本技术的实施方案的核酸分析系统。
图6显示了根据本技术的实施方案，具有与纳米晶体管接触的部分(moiety)的核酸分析系统。
图7显示了根据本技术的实施方案测定核酸序列的方法。
图8显示了根据本技术的实施方案，由不同部分导致的电流的变化。
图9显示了根据本技术的实施方案的核酸分析系统。
图10显示了根据本技术的实施方案，具有与纳米晶体管接触的多个部分(moieties)的核酸分析系统。
图11显示了根据本技术的实施方案的测定核酸序列的方法。
图12显示了根据本技术的实施方案的计算机系统。
图13显示了根据本技术的实施方案的测序系统。
图14显示了根据本技术的实施方案的计算机系统。
定义
“核酸”可以指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语可涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接键的核酸，其是合成的，天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合性质，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例可包括但不限于硫代磷酸酯，亚磷酰胺，甲基膦酸酯，手性-甲基膦酸酯，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNA)。
除非另有指明，否则具体的核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)，和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。术语核酸与基因，DNA，RNA，寡核苷酸和多核苷酸可互换地使用。
除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体以外，术语“核苷酸”还可以理解为指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，对于其中使用核苷酸的特定上下文(例如，与互补碱基杂交)而言，它们在功能上等同，除非上下文另有清楚地指出。
术语“振荡”可以指由布朗运动或其他力导致的物体在流体中的运动。物体可以在没有人或机器的主动干预的情况下振荡。在一些情况下，物体可能由于施加的电场或压力驱动流而振荡。
术语“接触”可以指使一个物体接近另一个物体，使得电子可以从一个物体穿过另一个物体。在亚原子水平上，两个物体可能永远不会彼此物理触碰，因为来自物体中的电子云的排斥力可以阻止物体更紧密接近。
在该技术术语用于化学中时，术语“部分”可包括官能团。此外，部分还可以指键合在一起的原子或原子团，其可以形成较大化合物的一部分。
术语“德拜长度”可以是化合物或化合物的一部分的电效应的量度。德拜长度可以是电荷可以分开的距离。较长的德拜长度可表示较强的电效应。
详述
常规测序方法包括使用荧光染料标记核苷酸。由于可用染料的限制和在不同染料之间进行区分的光学限制，需要定期洗掉染料，包括每次使用标记的核苷酸后。然后可以引入用于不同核苷酸的不同染料。洗掉染料可能降低测序效率。
固态晶体管为分析分子(包括核酸分子的测序)提供了有前景的系统。这些固态晶体管可以是纳米或小于0.1微米的尺度，其被称为纳米晶体管。作为实例，纳米晶体管可以包括碳纳米管晶体管，石墨烯晶体管，半导过渡金属二硫属元素化物2D晶体晶体管(例如，MoS2、MoSe2、WS2、WSe2、MoTe2、WTe2、TeS2、SnSe2、TeSe2)，或硅纳米线晶体管。一个或多个纳米晶体管可以位于基板上，其中每个纳米晶体管用于对核酸分子进行测序。
靠近纳米晶体管或与纳米晶体管接触的分子可以影响纳米晶体管的漏极电流或其他电特征。当分析核酸分子和其他分子时，通常使用水作为介质。水是极性溶剂，并且具有小于1 nm的德拜长度。因此，与其他介质相比，水可以减少分子对在给定距离处的纳米晶体管的影响。结果，任何待分析的分子可能必须非常紧密地靠近纳米晶体管。分子可以与纳米晶体管直接接触。在液体介质中，游离分子与静止的纳米晶体管紧密靠近或接触持续足够的时间以测量可察觉信号的可能性很低，使得识别甚至单个小分子具有挑战性。
较大的分子可以具有对纳米晶体管的不同影响，这取决于分子的哪个部分最接近纳米晶体管。纳米晶体管可用于识别分子的特定部分。为了对核酸分子进行测序，需要识别核酸分子中的几个核苷酸，而不仅仅是一个核苷酸。结果，相同核酸分子中的几个核苷酸，而不仅仅是一个核苷酸，必须紧密地靠近纳米晶体管，以便被纳米晶体管识别。因此，通过纳米晶体管识别相同核酸分子中的几个核苷酸比识别单个核苷酸或小分子具有甚至更低的可能性。此外，当核苷酸与核酸分子杂交时，标记可以与核苷酸分离，降低了标记可被纳米晶体管感测到的可能性。本文中描述的技术通过将核酸分子连接到固定到晶体管的拴系化合物，来增加分子与纳米晶体管接近的持续时间和可能性。
I. 用纳米晶体管测序
图1显示纳米晶体管100。纳米晶体管100包括源电极102和漏电极104。源电极102和漏电极104通过半导材料106连接。除非向栅电极108施加电压，否则半导材料106不允许电流在源电极102和漏电极104之间流动。电压可以由电压源109提供。半导材料可包括碳纳米管，石墨烯，半导过渡金属二硫属元素化物2D晶体(例如，MoS2、MoSe2、WS2、WSe2、MoTe2、WTe2、TeS2、SnSe2、TeSe2)，或硅纳米线。然后，由电源110提供的电流可以在源电极102和漏电极104之间流动。可以由仪表112测量通过半导材料的电特征，诸如电流或电压。电特征可以基于化合物在半导材料106附近的存在而改变。电特征数据由计算机系统114分析。
图2显示通过纳米晶体管100的电流的简化图示。电特征显示在y轴上，且时间显示在x轴上。因为没有化合物靠近半导材料106，电特征随时间保持恒定。
图3显示纳米晶体管100，其中化合物116位于半导材料106上。化合物116可以具有与半导材料106的尺寸在相同数量级的尺寸。化合物116可具有1nm，10nm，100nm或1μm的数量级的特征大小。化合物116可以是具有强静电场效应的化合物。由于这些或其他原因，化合物116可以影响源电极102和漏电极104之间的电特征。
图4显示通过纳米晶体管100的电流的简化图示，其中化合物116瞬时添加在半导材料106上。在此图示中，化合物116具有瞬时增加通过纳米晶体管100的电特征的作用。在一些实施方案中，化合物可以降低通过纳米晶体管100的电特征。
通过纳米晶体管100的电流或纳米晶体管100的其他电特征可依赖于化合物116的特性(identity)。不同的化合物可以对通过纳米晶体管100的电流或其他电特征具有不同的作用。此外，不同的化合物可以以不同的速度朝向或远离纳米晶体管100移动，其可以是作用于所述化合物的静电或流体或其他力的结果。实际上，化合物116不会瞬时出现在半导材料106上，并且因此，电特征不会如图4中所示的阶梯函数那样立即改变。
因为不同的化合物可以导致通过纳米晶体管100测量的不同电特征，所以可以使用纳米晶体管100来识别不同的化合物。特别地，纳米晶体管可用于测序核酸分子。核酸分子包括核苷酸的组合。如果每个核苷酸足够接近纳米晶体管持续足够的时间，并且可以将核苷酸对纳米晶体管的作用与邻近核苷酸的作用区分开，则可以使用纳米晶体管识别核酸分子的每个核苷酸。然后可以基于核苷酸的特性(identity)确定序列。如下所述，还可以从连接到核苷酸的标记化合物确定序列，其中不同类型的核苷酸(例如，C，T，A和G)具有不同的标记化合物，从而允许确定序列。
II. 使用拴系的聚合酶的核酸测序
为了增加核苷酸保持接近纳米晶体管的可能性和持续时间，可以将核酸聚合酶拴系到纳米晶体管。拴系允许核苷酸并入新生链中，同时足够接近纳米晶体管以影响通过纳米晶体管的电特征(如在图3和4中)。化合物可以将聚合酶拴系到纳米晶体管。
仅拴系聚合酶可能不允许核苷酸足够接近纳米晶体管以影响纳米晶体管的电特征。作为使核苷酸移动靠近纳米晶体管的替代，可以用聚合物标记核苷酸，其中聚合物连接到部分(moiety)。所述部分在足够接近处诱导纳米晶体管中的强场破坏。聚合物可包括单链核酸，其至少部分地与将聚合酶拴系至纳米晶体管的化合物杂交。以这种方式，在核苷酸的三磷酸酯水解后，聚合物和所述部分与核苷酸分离。聚合物可以与将聚合酶拴系至纳米晶体管的化合物结合。聚合物与化合物(即，拴系化合物)的结合使得所述部分更靠近纳米晶体管，从而影响纳米晶体管的电导。然后，可以测量电特征的变化。所述部分不仅可以影响通过纳米晶体管的电流幅度，而且由于所涉及的特定结合，也可以以特定频率振荡。通过纳米晶体管的电流的幅度和频率可以帮助识别核苷酸。
A. 具有拴系的聚合酶的系统
图5和6显示了根据本技术的实施方案的核酸分析系统500。如所示，系统500包括固定到拴系化合物504的核酸聚合酶502，其中拴系化合物504将核酸聚合酶502连接至晶体管506。核酸聚合酶502可以与拴系化合物504共价结合。晶体管506可以是纳米晶体管100或本文所述的任何晶体管。核酸聚合酶502配置为延伸新生链516。新生链516与模板亲本链514杂交。新生链516和模板亲本链514形成中间核酸分子512。拴系化合物504包括核酸链503(即，第一核酸链)和聚合物505。
在图5中，聚合物505被描绘为与晶体管506接触的拴系化合物504的一部分，并且核酸链503被描绘为拴系化合物504的一部分，其中水平线离开拴系化合物504的主线。聚合物505可包括聚乙二醇，肽或生物聚合物。聚合物505可以对性质类似的另一聚合物具有特异性亲和力。例如，聚合物505可以是对另一肽具有已知亲和力的短肽。肽可以具有特定序列并且可以用于与特定序列的寡核苷酸相互作用。核酸链503可以是寡核苷酸。
系统500可以包括核苷酸，诸如核苷酸520，其可以与模板亲本链514杂交并且可以并入新生链516中。核苷酸520连接到第一标记化合物518，其包含核酸链522 (即第二核酸链)和部分524。当在晶体管506的德拜长度内时，部分524可以具有强电场或者对晶体管506具有强场效应。例如，部分524可以是金属簇，卤素或氧化还原剂。金属簇可包括多金属有机金属化合物或金属纳米颗粒。部分524可以限于这些类别中的一个，可以排除这些类别中的任一个，或者可以是这些类别的组合。部分524或核酸链522中的至少一个可用于标记特定类型的核苷酸。例如，所述系统还可以包括与第二标记化合物526连接的核苷酸528，所述第二标记化合物526包含核酸链530和部分532，但核苷酸528和部分532分别不同于第一标记化合物518中的核苷酸520和部分524。可以使用不同的部分以帮助识别不同的核苷酸。在一些实施方案中，可以用相同的部分、但不同的核酸链标记不同的核苷酸。在这些实施方案中，不同的核酸链可以影响所述部分的振荡或运动，并且因此影响晶体管506中的电特征的变化。
第一标记化合物518中的核酸链522和第二标记化合物526中的核酸链530对于不同的核苷酸520和528可以是相同的，或者在一些情况下，对于不同的核苷酸520和528可以是不同的。不同的核酸链可以包括具有不同数量的错配的序列，其然后可以影响标记化合物与拴系化合物的结合。更大数量的错配可以增加所述部分的振荡。如果核酸链对于不同的核苷酸是不同的，则所述部分对于不同的核苷酸可以是相同或不同的。对于DNA的四种不同的核苷酸(A，T，C，G)，所述系统可包括具有四种不同部分(moieties)的四种不同化合物- 每种类型的核苷酸一种。所述系统可包括多种这些化合物，并且每种类型的化合物可以是多种这些化合物中的一种。在一些情况下，拴系化合物和标记化合物中的任一者或两者可以不包括核酸链，特别是在拴系化合物的一部分对标记化合物的一部分具有亲和力的情况下。例如，两种拴系化合物都可以具有对标记化合物上的肽具有亲和力的肽。
晶体管506可以与电源534电连通。拴系化合物504可以固定到晶体管506，并且拴系化合物504可以利用拴系化合物504的聚合物部分接触晶体管506。电源534可以是直流电源或交流电源。
此外，系统500可以包括仪表装置536，其配置为在核苷酸520与新生链514杂交后，测量来自部分524的506晶体管的电特征。第一标记化合物518脱离核苷酸520，并且核酸链522与核酸链503杂交。
图6显示了拴系化合物504已经与第一标记化合物518的一部分杂交后的系统500。核苷酸520已并入新生链516中，并且核苷酸520已与模板亲本链514杂交。核苷酸520中三磷酸酯的水解导致核苷酸520与第一标记化合物518分离。在分离核苷酸520后，核酸链522与拴系化合物504杂交，因为核酸链503和核酸链522可具有互补或基本上互补的序列。将拴系化合物504与第一标记化合物518的剩余物杂交可使部分524更靠近晶体管506。在一些情况下，部分524可以接触晶体管506。部分524可以不固定在一个位置。部分524可以朝向和远离晶体管506移动。换言之，部分524可以振荡。拴系化合物504可以与第一标记化合物518的剩余物部分或完全去杂交，并且在一些情况下可以与第一标记化合物518的剩余物再杂交。这种杂交和去杂交的过程也可以导致部分524振荡至晶体管506和从晶体管506振荡。最终，第一标记化合物518的剩余物可以完全去杂交，形成类似于图5的系统。新生链516可以接受另一核苷酸用于进一步延伸。例如，核苷酸528可以并入新生链516中。
核酸分子分析系统可包括多个晶体管。电源可以与所述多个晶体管电连通，其可以包括向每个晶体管发送电流。可以由单个仪表装置测量通过晶体管的电特征(诸如电流或电压)，所述单个仪表装置装配用于并联测量许多晶体管的电特征，或者可以由多个仪表装置测量通过晶体管的电特征，对每个晶体管使用相应的仪表装置。所述多个晶体管可以由数百万或数亿个晶体管构成。多个晶体管可以允许多路复用，这可以比传统系统和方法更有效且更准确。即使系统中包括数亿个纳米晶体管，半导体制造方法也可以使纳米晶体管成本低廉。
B. 使用拴系的聚合酶的方法
图7显示了根据本技术的实施方案分析核酸链的方法。核酸序列可以是部分或完整的DNA序列。系统500可以与方法700一起使用。
在方框702中，方法700包括通过核酸聚合酶延伸新生链，所述核酸聚合酶通过拴系化合物与晶体管连接。新生链可以与模板亲本链杂交。
方框702a包括将第一核苷酸并入新生链中，并且可以是延伸新生链的一部分。核苷酸可以是图5中的核苷酸520。
方框702b包括将第一核苷酸与模板亲本链杂交。方框702b可以是延伸新生链中的操作。第一核苷酸可以与包含部分(moiety)的第一标记化合物连接。标记化合物还可包含与部分(moiety)连接的第一核酸链。所述部分可以是本文所述的任何部分，包括部分524。第一标记化合物可包括图5中的第一标记化合物518。
核酸聚合酶可以通过化合物(诸如拴系化合物504)连接到晶体管。拴系化合物可包含第二核酸链。拴系化合物可包含聚合物。聚合物可以接触并固定到晶体管。聚合物可以是本文所述的任何聚合物。
在方框704中，可以从包含第一部分的第一标记化合物切割第一核苷酸。核酸聚合酶可以从第一标记化合物切割核苷酸，因为第一标记化合物可以与核苷酸的三磷酸酯基团连接。当三磷酸酯随着核苷酸被添加到新生链而被水解时，第一标记化合物可以与核苷酸分离。拴系化合物的第二核酸链的一部分或全部可以与第一标记化合物的第一核酸链结合或杂交。例如，如图6中所示，可以将核苷酸520添加到新生链516。拴系化合物504和第一标记化合物518的一部分可以结合在一起。这种结合可以允许部分524保持接触晶体管506或保持在晶体管506的德拜长度内，持续比没有这种结合更长的时间段。部分524可以移动更接近或远离纳米晶体管，这可能影响电特征。部分524可以移动与纳米晶体管接触或脱离接触。在一些情况下，所述部分可以在纳米晶体管附近振荡。
在方框706中，方法700还包括测量由所述部分导致的晶体管的电特征的第一变化。电特征可以是电流或电压。电特征可以包括电流或电压的幅度或频率中的至少一个。可以在所述部分在纳米晶体管附近振荡的同时测量频率。在一些情况下，振荡可能是电场或布朗运动中的至少一个的结果。振荡也可以是第一标记化合物中的核酸序列与拴系化合物的核酸序列的短暂杂交的结果，如图6中所示。杂交和去杂交可以是晶体管的电特征(包括晶体管电位)和/或流体的特征的结果。所测量的电特征的变化可以由以下导致：所述部分开始与晶体管的接触，接触晶体管，结束与晶体管的接触，或其任何组合。所测量的电特征的变化可以与所述部分和晶体管之间接触的量(例如，表面积)或强度相关。
在方框708中，方法700包括基于所测量的电特征的第一变化来识别核苷酸。计算机系统可用于分析电特征模式和识别核苷酸。
因为通过聚合酶并入新生链中的核苷酸与模板亲本链上的核苷酸互补，所以也可以识别模板亲本链上的互补核苷酸。例如，在图6中，可以识别核苷酸520，这也将导致识别模板亲本链514上的互补核苷酸。任一核苷酸可以是通过本文描述的方法确定的核酸序列的一部分。
第一标记化合物的第一核酸链可以与拴系化合物的第二核酸链分离。晶体管电位可以具有使两条杂交链解链的作用，这导致分离。然后，第一标记化合物可以从纳米晶体管移动或扩散到背景中，使得不再能够测量到所述部分对纳米晶体管的作用。换言之，所述部分可以移动离开纳米晶体管超过德拜长度。在第一标记化合物分离并移开后，拴系化合物的第二核酸链可以自由地与另一核酸链杂交。
在方框710中，通过核酸聚合酶进一步延伸新生链。核酸聚合酶将第二核苷酸并入新生链中。第二核苷酸可以与第二标记化合物连接，所述第二标记化合物可以包含与第二部分连接的第三核酸链。第二核苷酸可以与第一核苷酸不同。如上所讨论，包含不同部分和/或不同核酸链的不同标记化合物可用于方法中以帮助识别不同核苷酸。第二标记化合物的第三核酸链可包含与第一标记化合物的第一核酸链相同的序列。相同的序列可以允许与拴系化合物杂交。
在方框712中，可以从第二标记化合物切割第二核苷酸。在三磷酸酯水解后，核酸聚合酶可切割第二核苷酸。与之前的第一标记化合物一样，第二标记化合物然后可以自由移动以与拴系化合物杂交。然后，与拴系化合物杂交可以允许第二部分影响晶体管的电特征。
在方框714中，可以测量由第二部分导致的晶体管的电特征的第二变化。电特征的变化可以是本文所述的任何变化。
在方框716中，方法700可以包括基于测量的电特征的第二变化来识别第二核苷酸。由第二部分导致的电特征的第二变化可以不同于由第一部分导致的电特征的第一变化。计算机系统可用于识别核酸序列中的核苷酸。
第二核酸聚合酶可以通过固定到晶体管的第二化合物(例如，第二拴系化合物)连接到晶体管。第二拴系化合物可包含另一核酸链和第二聚合物。第二聚合物可以固定到晶体管。第二核酸聚合酶可以允许标记化合物的另外核苷酸进行杂交，这可以增加对电特征的影响。此外，多个核酸聚合酶(包括超过两个核酸聚合酶)可以通过多个拴系化合物连接到晶体管。
图8显示不同的部分如何可以导致电特征的不同变化的图示。可以用不同的部分标记不同的核苷酸。例如，A核苷酸可以总是与部分802结合，C核苷酸可以总是与部分804结合，G核苷酸可以总是与部分806结合，并且T核苷酸可以总是与部分808结合。每个部分可以对通过晶体管的电流或电压具有不同的影响。如图8中所示，电特征的差异可表现为幅度、频率和/或持续时间的差异。电特征可以是电流或电压。电特征的幅度、频率或持续时间的差异可以是标记化合物的核酸链的结果，其中不同核苷酸的序列的变化影响拴系化合物和标记化合物之间的结合强度。不同标记化合物和/或部分的电特征可以形成核苷酸的电指纹。计算机系统可以针对电特征的参考变化来分析电特征的变化，以便识别所述部分并因此识别核苷酸。电特征的参考变化可以凭经验确定，或者可以基于原子和分子性质计算。
C. 实施例
使用类似于系统500的核酸分析系统来测序核酸分子。不同类型的核苷酸用不同的部分标记。当在纳米晶体管附近时，不同的部分显示出不同的电流特征。结果，通过纳米晶体管中的电流模式识别核苷酸。
III. 纳米晶体管上的多个核酸
在一些实施方案中，可以将多个拷贝的核酸链或单链寡核苷酸连接(拴系)到纳米晶体管。多个拷贝的核酸链允许同时或几乎同时添加多个核苷酸，其中每个核苷酸可以用相同的部分标记。因此，所述部分对纳米晶体管的影响可以倍增和集中，从而允许纳米晶体管的电特征中的信号比仅使用单个部分的情况更强。
多个聚合酶可用于多个拷贝的核酸链中的每一个。使用连接到纳米晶体管的多个拷贝的核酸链，聚合酶可以不需要拴系至纳米晶体管。没有将聚合酶拴系至纳米晶体管的拴系化合物的情况下，具有所述部分的标记化合物不需要配置为与拴系化合物杂交。结果，核苷酸和部分(moieties)可以不与核酸链连接。
A. 具有拴系的核酸的系统
图9显示核酸分子分析系统900的实施方案。如技术人员可注意到的，系统900可以类似于先前描述的系统500。系统900可包括固定到纳米晶体管904的模板亲本链902。纳米晶体管904可以是纳米晶体管100或本文所述的任何晶体管。模板亲本链902可以直接接触纳米晶体管904，或者如图9中所示，模板亲本链902可以固定到颗粒906。颗粒906可以固定到纳米晶体管904。在一些实施方案中，颗粒906可以固定到聚合物，所述聚合物可以固定到纳米晶体管904。虽然图9显示多个模板亲本链902，但系统900可仅包括固定到纳米晶体管904的单个模板亲本链。
颗粒906可以是珠子或可以是球形的。颗粒906也可以被认为是拴系化合物。如果颗粒906不是球形的，则颗粒906可具有特征尺寸。在实施方案中，颗粒906可具有在10nm至15nm，15nm至20nm，20nm至30nm，30nm至40nm，40nm至50nm或50nm或更大的范围内的直径或特征尺寸。
模板亲本链902可包括第一模板亲本链908和第二模板亲本链910。模板亲本链可包括3、4、5或更多个模板亲本链。每个模板亲本链可包含相同的核苷酸序列。所述相同的核苷酸序列可以包括每个模板亲本链中的所有核苷酸，或者可以包括每个模板亲本链中的核苷酸的子集。
系统900还可以包括聚合酶912，其被配置为促进使用模板亲本链902延伸新生链916。在一些情况下，核酸聚合酶912可以用类似于本文所述的任何拴系化合物的化合物，拴系至纳米晶体管904或颗粒906。在一些情况下，核酸聚合酶912可以不拴系至纳米晶体管904，并且反而可以在含水介质中自由移动。在核酸聚合酶912拴系至纳米晶体管904或颗粒906的情况下，拴系化合物可包含与标记化合物的至少一部分结合或杂交的核酸链，类似于上文和图5和6中所述的实施方案。然而，不将核酸聚合酶拴系到纳米晶体管可以通过不需要用于核酸聚合酶的拴系化合物并且不设置标记化合物与拴系化合物结合来简化系统。
系统900可以进一步包括多个标记化合物。核苷酸920可以连接到包含部分922的标记化合物918。与图5和6一样，不同的部分可以与不同的核苷酸结合，并且每种类型的核苷酸可以连接相同的部分。例如，与核苷酸920不同的核苷酸926用包含部分924的化合物标记，其中部分924不同于部分922。标记化合物918可以是本文所述的任何标记化合物，并且核苷酸920可以是本文所述的任何核苷酸。与部分922相同的部分932显示为标记核苷酸934，其中核苷酸934是与核苷酸920相同的核苷酸。
此外，系统900可以包括与纳米晶体管904电连通的电源928。电源928可以是本文描述的任何电源。
系统900可以进一步包括仪表装置930，其被配置为在多个部分连接到新生链且然后与新生链分离后，测量来自所述多个部分的纳米晶体管904的电特征。仪表装置930可以是本文所述的任何仪表装置。
图10显示核苷酸920和核苷酸934与模板亲本链902杂交后的系统900。部分922和部分932与核苷酸分离并移动至紧密靠近或接触纳米晶体管904。然后，仪表装置930可以测量由所述部分导致的电特征的变化。然后，可以识别与多个核酸链杂交的核苷酸。
核酸分子分析系统可包括多个纳米晶体管。与系统500一样，系统900可包括与单个电源电连通的多个纳米晶体管。多个纳米晶体管可以允许多路复用。
B. 使用栓系的核酸的方法
如图11中所示，实施方案可包括测定核酸序列的方法1100。方法1100可以包括使用系统900。
在方框1102中，方法1100包括将模板亲本链固定到晶体管。在一些实施方案中，方法1100可以包括将多个模板亲本链固定到晶体管。所述多个模板亲本链中的每个模板亲本链可包含相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，可以将多个模板亲本链固定到颗粒，且然后可以将颗粒固定到纳米晶体管。颗粒可以是本文所述的任何颗粒。在其他实施方案中，模板亲本链可以接触晶体管。
在方框1104中，方法1100还可以包括通过核酸聚合酶延伸新生链。在具有多个模板亲本链的实施方案中，方法可包括通过多个核酸聚合酶延伸多个新生链。
在方框1104a中，方法1100可以包括核酸聚合酶，其并入与包含部分(moiety)的标记化合物连接的核苷酸。标记化合物可以是本文所述的任何标记化合物，并且所述部分可以是本文所述的任何部分。一些实施方案可包括多个核酸聚合酶，其并入与多个标记化合物连接的多个核苷酸，其中每个标记化合物包含部分(moiety)。所述多个核苷酸可以是相同的核苷酸。所述多个核苷酸中的每个核苷酸可以同时或几乎同时添加到多个新生链中的每个新生链。“几乎同时”可以是指，可以在将不同的核苷酸添加到多个新生链中的任何其他新生链之前，将每个核苷酸添加到多个新生链。
在方框1104b中，方法1100可以包括将核苷酸与模板亲本链杂交。方框1104b可以是延伸新生链中的操作。在一些实施方案中，方法可包括将多个核苷酸与多个模板亲本链杂交。
在方框1106中，在新生链的延伸期间，通过核酸聚合酶从标记化合物切割核苷酸。新生链与模板亲本链杂交。在一些实施方案中，通过多个核酸聚合酶从多个标记化合物切割多个核苷酸。在切割后，所述部分或多个部分可以朝向纳米晶体管移动。例如，如图10中所描绘，部分922和部分932可以同时与纳米晶体管904紧密接近。在一些情况下，部分922和部分932可以同时接触纳米晶体管904。在纳米晶体管附近的多个标记化合物(并且因此多个部分)可以增加所述部分接近纳米晶体管的可能性。多个标记化合物还可以增加对纳米晶体管的影响，因为多个部分可以将其对晶体管的场效应组合。
在方框1108中，方法1100可以包括测量由所述部分导致的纳米晶体管的电特征的变化。实施方案还可以包括测量由多个部分导致的电特征的变化。电特征可以是本文所述的任何电特征。
在方框1110中，方法1100可以进一步包括基于测量的电特征的变化来识别核苷酸。方法可以包括基于测量的电特征的变化来识别多个核苷酸。识别核苷酸或多个核苷酸可包括本文所述的任何识别操作。
可以通过多个核酸聚合酶并入多个第二核苷酸。多个第二核苷酸中的每个第二核苷酸可以连接到包含第二部分的第二标记化合物。在并入第二核苷酸后，可以通过多个核酸聚合酶从第二核苷酸切割多个第二标记化合物。然后，多个第二部分可以诱导晶体管的电特征的变化，这可以允许识别第二部分并因此识别第二核苷酸。以这种方式，可以确定新生链的核酸序列。因此，还可以确定与新生链互补的模板亲本链的核酸序列。
C. 使用拴系的核酸的实施例
使用类似于系统900的核酸分析系统来测序核酸分子。不同类型的核苷酸用不同的部分标记。当在纳米晶体管附近时，不同的部分显示出不同的电流特征。结果，通过纳米晶体管中的电流模式识别核苷酸。
IV. 计算机系统
本文提及的任何计算机系统可以利用任何合适数量的子系统。此类子系统的实例显示于图12中的计算机系统10中。在一些实施方案中，计算机系统包括单一计算机设备，其中子系统可以是计算机设备的组件。在其他实施方案中，计算机系统可以包括各自为子系统的多个计算机设备，以及内部组件。计算机系统可以包括台式计算机和便携式计算机、平板电脑、移动电话和其他移动装置。
图12中显示的子系统经系统总线75相互连接。显示了另外的子系统诸如打印机74、键盘78、存储装置79、监视器76 (其耦接到显示适配器82)和其他。耦接到I/O控制器71的外围设备和输入/输出(I/O)装置可以通过任何数量的本领域已知的工具(诸如输入/输出(I/O)端口77 (例如，USB, FireWire®, Thunderbolt))连接到计算机系统。例如，I/O端口77或外部接口81 (例如以太网、Wi-Fi等)可以用于将计算机系统10连接到广域网(诸如互联网)，鼠标输入装置或扫描仪。经系统总线75的相互连接允许中央处理器73与每一子系统通信并且控制来自系统存储器72或存储装置79 (例如，固定盘，诸如硬盘驱动器，或光盘)的指令的执行，以及在子系统之间信息的交换。系统存储器72和/或存储装置79可以体现为计算机可读介质。另一子系统是数据收集装置85，诸如相机，麦克风，加速度计等。任何本文提及的数据可以从一个组件输出至另一组件且可以输出给用户。
计算机系统可以包括多个相同的组件或子系统，例如通过外部接口81或通过内部接口连接在一起。在一些实施方案中，计算机系统、子系统或设备可以经网络通信。在此类情况下，可以认为一台计算机是客户端且另一计算机是服务器，其中每一个可以是相同计算机系统的部分。客户端和服务器可以各自包括多个系统、子系统或组件。
应该理解本发明的任何实施方案可以以控制逻辑的形式使用硬件(例如专用集成电路或现场可编程门阵列)和/或使用计算机软件用通常可编程处理器以模块或集成方式来实施。如本文所用，处理器包括相同集成芯片上的单核处理器、多核处理器，或单一电路板上或网络化的多个处理单元。基于本文提供的公开和教导，本领域普通技术人员将知晓和理解使用硬件，以及硬件和软件的组合实施本发明的实施方案的其他方式和/或方法。
本申请中所述的任何软件组件或函数可以作为软件代码实施，所述软件代码将由处理器使用任何合适的计算机语言诸如，例如Java、C、C++、C#、Objective-C、Swift或脚本语言，诸如Perl或Python，使用例如常规或面向对象的技术来执行。软件代码可以作为一系列指令或命令存储在计算机可读介质上用于存储和/或传输。合适的非暂时计算机可读介质可以包括随机访问存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、磁性介质诸如硬盘驱动器或软盘、或光学介质诸如压缩盘(CD)或DVD (数字多用盘)、闪存等。计算机可读介质可以是此类存储或传输装置的任何组合。
此类程序还可以使用载波信号来编码和传输，所述载波信号适配于经有线、光学和/或无限网络传输，符合多种协议，包括互联网。因此，根据本发明的实施方案的计算机可读介质可以使用用此类程序编码的数据信号来产生。用程序代码编码的计算机可读介质可以用兼容装置包装或者与其他装置分开提供(例如经互联网下载)。任何此类计算机可读介质可以驻存于单一计算机产品(例如硬盘驱动器、CD或整个计算机系统)之上或之内，并且可以存在于系统或网络内的不同计算机产品之上或之内。计算机系统可以包括用于给用户提供本文提及的任何结果的监视器、打印机或其他合适的显示器。
本文所述的任何方法可以总体地或部分地用包括一个或多个处理器的计算机系统来执行，所述处理器可以配置为执行所述步骤。因此，实施方案可以涉及配置为执行本文所述的任何方法的步骤的计算机系统，其潜在地具有执行各个步骤或步骤的各个组的不同组件。尽管作为经编号的步骤呈现，但本文方法的步骤可以同时或者以不同次序来执行。此外，这些步骤的部分可以与来自其他方法的其他步骤的部分一起使用。而且，步骤的全部或部分可以是任选的。此外，任何方法的任何步骤可以用模块、单元、电路或用于执行这些步骤的其他工具来执行。
图13显示示例性的测序系统。图13中描绘的系统包括：测序装置1302和智能模块1304，所述智能模块1304是计算机系统1306的部分。测序装置1302可以包括系统500或系统900。计算机系统1306可以包括计算机系统10的部分或全部。将数据集(电特征数据集)经网络连接或直接连接从测序装置1302传送至智能模块1304，或反之亦然。例如，可以处理数据集以识别核苷酸。识别步骤可以由存储在计算机系统1306的硬件上的软件实施。所述数据集可以通过在处理器上运行并且存储在智能模块的存储装置上的计算机代码进行处理，并且在处理后传送回分析模块的存储装置，其中改变的数据可以显示在显示装置上。在一些实施方案中，智能模块还可以在测序装置中实施。
图14显示计算机系统1400可以包括接收工具1410，其可以包括例如接收从测序装置获得的电特征数据。计算机系统1400还可以包括识别工具1420，其用于识别引起数据中的电特征的变化的部分(moiety)。计算机系统1400还可以包括识别工具1430，其用于识别与所述部分结合的核苷酸。计算机系统1400可以进一步包括识别工具1440，其用于识别使用识别工具1430识别的核苷酸的互补核苷酸。
具体实施方案的特定细节可以以任何合适方式组合，而不背离本发明的实施方案的精神和范围。然而，本发明的其他实施方案可以涉及关于每一单独方面、或这些单独方面的特定组合的特定实施方案。
已呈现本发明的实施例实施方案的以上描述用于说明和描述的目的。不期望其为穷尽的或将本发明限制至所述的确切形式，并且参考上述教导，许多修改和改变都是可能的。
在前面的描述中，出于解释的目的，已经阐述了许多细节以便提供对本技术的各个实施方案的理解。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，某些实施方案可以在没有这些细节中的一些或者具有附加细节的情况下实施。
已经描述了几个实施方案，本领域技术人员将认识到，可以使用各种修改，替代构造和等同方案，而不背离本发明的精神。此外，没有描述许多众所周知的过程和要素，以避免不必要地模糊本发明。此外，任何特定实施方案的细节可能并不总是存在于该实施方案的变式中，或者任何特定实施方案的细节可以添加到其他实施方案中。
在提供数值范围的情况下，应该理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值也被具体公开至下限单位的十分之一。涵盖在规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或从该范围排除，并且其中在较小范围内包括任一限值、不包括限值或包括两个限值的每一范围也涵盖在本发明中，服从于规定范围中任何具体排除的限值。在规定范围包括一个或两个限值的情况下，也包括排除那些包括的限值中的任一或两者的范围。
如在本文中和在所附权利要求中所使用的，单数形式“一”(“a”,“an”)和“所述”包括复数的指代物，除非上下文另有明确说明。因此，例如提及“一种方法”包括多种此类方法，并且提及“所述颗粒”包括对一个或多个颗粒及本领域技术人员已知的其等同物的提及等。现在已经为了清楚和理解的目的详细描述了本发明。然而，应当理解，在所附权利要求的范围内，可以实施某些改变和修改。
Claims (14)
1.测定核酸序列的方法，所述方法包括：
通过由拴系化合物连接到晶体管的核酸聚合酶延伸新生链，其中所述核酸聚合酶：
并入与包含部分的标记化合物连接的核苷酸，且
在新生链的延伸期间，从所述标记化合物切割核苷酸，所述新生链与模板亲本链杂交；
测量由所述部分导致的晶体管的电特征的变化；且
基于测量的电特征的变化识别核苷酸。
2.用于分析核酸分子的系统或仪器，所述系统或仪器包括：
与拴系化合物连接的核酸聚合酶，所述核酸聚合酶被配置为延伸新生链，
与包含部分的标记化合物连接的核苷酸，
与电源电连通的晶体管；
仪表装置，其被配置为在所述核酸聚合酶并入所述核苷酸后并且在所述核苷酸聚合酶从所述标记化合物切割所述核苷酸后，测量来自所述部分的晶体管的电特征，其中：
所述拴系化合物包含聚合物，且
所述聚合物固定到所述晶体管。
3.权利要求2的系统或仪器，其中所述拴系化合物包含与所述聚合物连接的核酸链。
4.权利要求2的系统或仪器，其中：
所述核苷酸是第一核苷酸，
所述部分是第一部分，且
所述标记化合物是第一标记化合物，
所述系统或仪器进一步包括：
与包含第二部分的第二标记化合物连接的第二核苷酸，其中：
所述第二核苷酸不同于第一核苷酸，且
所述第二部分不同于第一部分。
5.权利要求4的系统或仪器，其中：
所述第一标记化合物是多个第一标记化合物中的一个，且
所述第二标记化合物是多个第二标记化合物中的一个。
6.权利要求2的系统或仪器，其中：
所述系统包括多个晶体管，
所述电源与所述多个晶体管电连通。
7.权利要求2的系统或仪器，其中所述电特征是电流。
8.权利要求2的系统或仪器，其中所述部分包含金属。
9.测定核酸序列的方法，所述方法包括：
将模板亲本链固定到晶体管；
通过核酸聚合酶延伸新生链，其中所述核酸聚合酶：
并入与包含部分的标记化合物连接的核苷酸，且
在新生链的延伸期间，从所述标记化合物切割所述核苷酸，所述新生链与所述模板亲本链杂交；
测量由所述部分导致的晶体管的电特征的变化；且
基于测量的电特征的变化识别核苷酸。
10.用于分析核酸分子的系统或仪器，所述系统包括：
固定到晶体管的模板亲本链，
核酸聚合酶，其被配置为延伸与模板亲本链杂交的新生链，
与包含部分的标记化合物连接的核苷酸；
与晶体管电连通的电源；
仪表装置，其被配置为在所述核酸聚合酶并入所述核苷酸后并且在所述核苷酸聚合酶从所述标记化合物切割所述核苷酸后，测量来自所述部分的晶体管的电特征。
11.权利要求10的系统或仪器，还包括：
固定到晶体管的多个模板亲本链，
多个核酸聚合酶，其被配置为延伸与多个模板亲本链杂交的多个新生链，
与多个标记化合物连接的多个核苷酸，其中每个标记化合物包含多个部分中的一个部分。
12.权利要求10的系统或仪器，其中所述模板亲本链与所述晶体管接触。
13.权利要求10的系统或仪器，其中所述模板亲本链固定到颗粒，并且其中所述颗粒固定到所述晶体管。
14.权利要求10的系统或仪器，其中所述颗粒固定到聚合物，并且其中所述聚合物固定到所述晶体管。
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