CN109749945B - 一株丝孢毕赤氏酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一株丝孢毕赤氏酵母及其应用。所述丝孢毕赤氏酵母的保藏编号为CCTCC NO：M 2018666。本发明还公开了能够使茶叶增香的制剂，该制剂含有所述丝孢毕赤氏酵母和酶助剂。本发明还公开了所述丝孢毕赤氏酵母或制剂在茶制品增香中的应用。此外，本发明公开了一种制备茶制品的方法，该方法包括：将所述丝孢毕赤氏酵母接种至茶叶提取液中进行培养。通过利用本发明的丝孢毕赤氏酵母，本发明能够在保持茶制品原有茶香的基础上有效使茶制品增香。

Description

一株丝孢毕赤氏酵母及其应用

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，具体地，涉及一株丝孢毕赤氏酵母(Hyphopichiasp.)及其应用。

背景技术

茶是全世界消费最多的饮料之一，中国是茶叶的故乡，是最早发现茶并利用茶的国家，而且一直以来都是茶叶产出大国，每年生产的茶叶约占世界总量的四分之一。茶能消食去腻、降火明目、宁心除烦、清暑解毒、生津止渴。茶中含有的茶多酚，具有很强的抗氧化性和生理活性，是人体自由基的清除剂，可以阻断亚硝酸胺等多种致癌物质在体内合成。它还能吸收放射性物质达到防辐射的效果(陈睿.(2004).茶叶功能性成分的化学组成及应用.安徽农业科学32(5),1031-1033.)。茶诸多的功效使得茶渐渐成为人们生活中不能缺少的伴侣，饮茶的境界也进一步升华，茶品质已经成为消费者最为关注的方面，进而形成了茶文化。人们对茶叶的品质好坏，在没有科学仪器和方法鉴定的时候，可以通过色、香、味、形四个方面的来评价，因此，茶香又是影响茶品质与特性的重要因素之一(Yang,Z.,Baldermann,S.,and Watanabe,N.(2013).Recent studies of the volatile compoundsin tea.Food Research International 53,585-599.)。

茶叶中的香味物质大致可分为两大类：芳香性与尝起来有味的物质(Ho,C.-T.,Zheng,X.,and Li,S.(2015).Tea aroma formation.Food Science and Human Wellness4,9-27.)。按其化学结构特点可以分为四类：①脂肪类衍生物；②萜烯类衍生物；③芳香族衍生物；④含氮、氧杂环类化合物(姚珊珊,2005)。目前，在茶叶加工过程中已报到的有600多种挥发性化合物，这些化合物可归为11个类群(TeiYamanishi,A.K.(1999).Progress oftea aroma chemistry.Flavor Chemistry,135-145.)。这些化合物主要通过四个途径产生：类胡萝卜素为前体、脂质为前体、糖苷前体及美拉的反应途径。其中脂肪酸过氧化及降解生成6个碳的醇、醛类香气化合物，糖苷在其水解酶作用下水解出单萜烯醇和脂肪醇配基，这些配基是构成茶叶香气品质的物质基础。在茶树生长与茶叶加工过程所形成的香气物质一部分呈游离态的芳香性挥发物，绝大部分是以键合态的香气前体形式存在，键合态香气前体多以糖苷类为主，其糖基部分主要是β-葡萄糖、β-樱草糖和β-巢菜糖，所以糖基部分释放对茶香有重要的影响。针对这一方面提出了酶作用的研究思路，利用酶作用具有反应条件温和、专一性强、效率高等特点，使糖苷酶的应用于茶叶加工为提高茶叶品质和天然茶香精等茶行业的健康，发展奠定了良好而坚实的基础。

国外对于茶学的研究集中在茶对人体健康的影响(Dai,F.et.al.,2017；Peluso,I.et.al.,2017；Afzal,M.et.al.,2015)，国内对茶学相关方面的研究较多主要有组学技术对茶学研究的作用、茶叶中茶多酚氧化产物、茶叶中的功能性成分、茶叶中的香气物质的分析等的研究(胡秋辉等，2000；苏小琴等，2017；应乐等，2010；杨贤强等，2005)。在茶叶深加工过程中芳香物质易出现香气混杂、损耗及变化而导致香气低沉恶化；还有滋味淡薄、汤色褐变等现象(陈荣荣,王根女,张献忠,吴燕,符渊淼,&陈雄.(2014).糖苷酶在茶叶增香及香气形成中的应用研究进展.香料香精化妆品(5),48-52)。鉴于这些问题，近年来利用糖苷酶在茶叶香气形成和增香方面的研究逐渐成为茶学研究热点。但是对于利用微生物进行茶叶提取物发酵产香及成品茶发酵产香都无相关研究。CN108432906A公开了一种利用微生物菌种发酵制作果酒香茶叶的方法，但是，其需要配合乳酸菌10-20份、果酒孢菌10-30份、酵母菌50-70份、消化酶5-10份，菌种要求复杂，而且主要是为了赋予茶制品酒香。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一株丝孢毕赤氏酵母及其应用。

本发明的发明人在研究中得到一株丝孢毕赤氏酵母，其能够实现茶叶后发酵增香的目的，因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一株丝孢毕赤氏酵母，该丝孢毕赤氏酵母的保藏编号为CCTCC NO：M 2018666。

第二方面，本发明提供了一种能够使茶叶增香的制剂，该制剂含有第一方面所述的丝孢毕赤氏酵母和酶助剂。

第三方面，本发明提供了第一方面所述的丝孢毕赤氏酵母或第二方面所述的制剂在茶制品增香中的应用。

第四方面，本发明提供了一种制备茶制品的方法，该方法包括：将第一方面所述的丝孢毕赤氏酵母接种至茶叶提取液中进行培养。

通过利用本发明的丝孢毕赤氏酵母，本发明能够在保持茶制品原有茶香的基础上有效使茶制品增香。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明的丝孢毕赤氏酵母(Hyphopichia sp.)，于2018年10月12被保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072)(保藏单位的缩写为CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018666。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明菌株的分子鉴定系统进化树状图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明中，使用的术语“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位(U)，本发明中酶单位的定义是：在pH 5和45℃的条件下，每分钟水解或裂解糖苷键产生1μmol对应的还原糖的酶量为一个酶活力单位，即1U＝1μmol/min；“酶的比活力”代表每单位质量蛋白质的催化能力，能够反应酶活性大小，其值越大，表明酶活性越高，比活力的计算公式为：比活力(U/mg)＝总酶活力单位数/mg总蛋白。

本发明提供的丝孢毕赤氏酵母的保藏编号为CCTCC NO：M 2018666(本文简称FLei-01)。

本发明还提供了一种能够使茶叶增香的制剂，其特征在于，该制剂含有如上所述的丝孢毕赤氏酵母和酶助剂。

所述丝孢毕赤氏酵母与所述酶助剂可以以混合的方式存在于制剂中，也可以各自独立保存，为了进一步优化增香效果，优选地，所述丝孢毕赤氏酵母和所述酶助剂独立保存。

本发明中，对所述制剂的剂型没有特别的要求，可以以常规的形态存在，例如粉剂、悬浮液等形式。

本发明的制剂中，对所述丝孢毕赤氏酵母与所述酶制剂的比值没有特别的要求，优选情况下，相对于每克的以细胞干重计的丝孢毕赤氏酵母，所述酶助剂的用量为800-1800U。

本发明的制剂中，所述酶助剂可以为常规的各种能够水解糖苷键的酶，优选地，所述酶助剂为纤维素酶和/或果胶酶。进一步优选情况下，所述酶助剂为酶活力之间的比值是1-4:1(如1:1、2:1、3:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、4:1或上述数值之间的任意值)的纤维素酶和果胶酶。

本发明还提供了如上所述的丝孢毕赤氏酵母或制剂在茶制品发酵产香中的应用。

此外，本发明还提供了一种制备茶制品的方法，其特征在于，该方法包括：将如上所述的丝孢毕赤氏酵母接种至茶叶提取液中进行培养。

根据本发明，所述茶叶提取液可以为各种方式获得的茶水，例如，开水泡制、煮沸等，优选情况下，所述茶叶提取液为茶叶的沸水煮提液和/或茶叶的酶处理液。

其中，所述茶叶的沸水煮提液一般通过将茶叶加水煮沸后弃茶叶残渣而获得的清液。相对于每克以干基计的茶叶，水的用量可以为5-10ml。煮沸的温度可以为80-90℃。煮沸的时间可以为1-5min。煮沸后经过滤即可得茶叶的沸水煮提液。

其中，所述茶叶的酶处理液指茶叶经糖苷酶处理后弃茶叶残渣而获得的清液。例如，所述茶叶的酶处理液的制备方法可以包括：将茶叶与水混合，再引入酶助剂进行酶处理。所述酶助剂可以为各种常见的糖苷酶，优选为纤维素酶和/或果胶酶，具体如前所述，在此不再赘述。相对于每克以干基计的茶叶，所述酶助剂的用量可以为80-180U(如80U、100U、120U、140U、160U、170U、172U、175U、178U、180U或上述数值之间的任意值)，水的用量可以为15-20g。混合可以在常规的条件下进行，但优选情况下，所述混合在超声条件下进行。超声的频率可以为25-40kHz。混合的温度可以为40-60℃。混合的时间可以为40-50min。酶处理的温度可以为40-60℃。酶处理的时间可以为60-80min。酶处理后经过滤即可得茶叶的酶处理液。

根据本发明，对所述丝孢毕赤氏酵母的接种量没有特别的要求，优选地，相对于每升的茶叶提取液，所述丝孢毕赤氏酵母以细胞干重计的用量为50-100mg。

根据本发明，所述培养的条件可以为常规的真菌培养条件，例如，培养的温度可以为28-32℃。为了进一步促进增香，培养的时间可以为4-10天(1天＝24h)。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，生茶、红茶和白茶均购自云南木朽生香茶叶有限公司；菌株分离自大曲酒曲。

实施例1

本实施例用来说明本发明的菌株FLei-01的分类学地位。

(1)菌株培养培养基：商品化马丁氏培养基；

(2)基因组提取试剂：SDS，Tris碱，EDTA；

(3)PCR扩增所需试剂及引物：TaqDNA聚合酶，dNTP，GoldView核酸染料；

(4)DNA Marker；

(5)ITS扩增引物：

ITS1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’

ITS4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’

(6)基因提取及扩增实验方法及步骤：

基因组提取；收集菌体；清水冲洗3次；滤纸充分吸干菌体残余水分；将吸干的菌体装入研钵中，向其中加入适量的6％SET溶液和石英砂充分研磨，尽量研磨充分；吸取研磨后的液体，加入2ml离心管内，75℃水浴30min，迅速冰冻5min，然后再75℃水浴3min，冰冻5min，冻融可重复两次；将冻融后的样品5000r/min离心1min，取上清液到新离心管，再向离心管中加入1/2体积冰冷的3MNaoAC/醋酸钾，迅速摇匀，静置5min；12000rpm离心10min；取上清液加入另一无菌离心管中，加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，震荡3-5min后12000rpm离心10min；取上层溶液加入等体积冰冷的异丙醇，冰浴10min，12000rpm离心10min，得到的沉淀用70％的乙醇和无水乙醇各洗一次，晾干后用适量的溴化乙锭(EB)溶解。最后再加0.5μgRNAase置于37℃下20min；ITS扩增；PCR扩增程序：95℃预变性4min，在94℃下1min，56℃40s，72℃1min，循环35次，72℃延伸7min。

(7)系统发育树的建树进化树是通过比较分子序列的同源性而构建的。将所得的序列利用Blast软件在GenBank等数据库中进行相似性搜索，选用同源性比较高的典型菌株的ITS序列作为参比对象，采用邻接法(Neighbor-joining)用MAGE7软件构进化树。

(8)鉴定结果：

从构建的树状图(见图1)中可以看出，本发明菌株界于毕赤酵母(Hyphopichia)和丝状酵母属(Candida)之间。其与伯顿丝孢毕赤氏酵母(Hyphopichiaburtonii)的相似性最高，但两者之间的最高相似度仅达到96.8％(差异性为3.2％)，显示该菌株是毕赤酵母属的一个新种。

实施例2

本实施例用来说明本发明的菌株FLei-01能够使茶水发酵产香。

(1)按照表1的方式对茶叶进行沸水煮提，沸水煮提后的茶叶水提取液平均装入150ml的三角瓶中，茶水每个瓶中装入40ml。灭菌。5％(V/V)接种FLei-01菌株种子液(种子液采用查氏培养基培养，FLei-01以细胞干重计的浓度为2g/L)；每种茶水做一个空白对照(不接菌种)和接种一个样品。

(2)接种后在30℃、180r/min下培养8天，每天观察与闻其气味，发现茶水颜色变深，并散发出浓厚香气，对其进行感官品质评分(评分标准如下表2所示)，由30名成年消费者进行评价，结果取平均值且如下表3所示。

(3)处理：将发酵液先用滤纸过滤，滤液用0.22μm无菌过滤膜过滤至试剂瓶中，进行气相色谱分析，其方法为：电离方式：EI+；离子化电压：70eV；扫描范围：35-450amu；离子源温度：230℃；传输线温度：260℃；谱图检索：WILEY、NIST08谱库进行检索；所使用的色谱柱为DB-5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；Clarus 600/Clarus 600T GC/MS联用仪(美国Perkin Elmer公司)；结果如表4所示。

表1

茶类	茶叶量/g	水量	沸煮时间/min	沸煮温度/℃	煮后湿重/g
						生茶(A)	30	200ml	2min	85	106.0
红茶(B)	30	200ml	2min30s	85	105.6
						白茶(C)	30	240ml	4min30s	85	105.4

表2

表3

表4

从表3和表4的结果可以看出，经本发明的丝孢毕赤氏酵母处理后，茶水香气浓厚，挥发性香气成分(如苯乙二醇和植物醇)含量较高，而且无有毒物质产生，安全性好。

实施例3

(1)将茶叶研磨碎，过100目筛取筛下物，称取10g磨碎的样品，茶水重量比1:18，温度50℃超声45min(超声频率为32kHz)，再添加纤维素酶(活力为135U/mg，购自云南与诺生物工程有限责任公司)10mg，果胶酶(活力为400U/g，购自云南与诺生物工程有限责任公司)1g。温度50℃，时间70min进行提取，过0.22微米的无菌过滤膜，得茶叶提取液。

(2)按照5％(V/V)接种FLei-01菌株种子液(FLei-01以细胞干重计的浓度为1g/L)，每种茶叶提取液做一个空白对照(不接菌种)和接种一个样品。

(3)接种后在30℃、180r/min下培养，每天观察与闻其气味，发现经10天培养，茶水颜色变深，并散发浓厚香气，对其进行感官品质评分(评分标准如表2所示)，由30名成年消费者进行评价，结果取平均值且如下表5所示。

(4)将发酵液先用滤纸过滤，滤液用0.22μm无菌过滤膜过滤至试剂瓶中，进行气相色谱分析(方法同上)，结果如表6所示。

表5

表6

从表5和表6的结果可以看出，经本发明的丝孢毕赤氏酵母处理后，茶水香气浓厚，挥发性香气成分(如苯乙二醇和植物醇)含量较高，而且无有毒物质产生，安全性好。进一步地，酶与超声辅助的温水法提取增香效果明显更好于实施例1的沸水提取。

对比例1

按照实施例1的方式处理茶叶，不同的是，将FLei-01替换为其他工业丝孢毕赤氏酵母(米曲霉(Aspergillus oryzae)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，编号为CICC 2014)，感官评价结果见表7所示。

对比例2

按照实施例1的方式处理茶叶，不同的是，将FLei-01替换为其他工业丝孢毕赤氏酵母(伯顿丝孢毕赤氏酵母(Hyphopichiaburtonii)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，编号为CICC 33291)，感官评价结果见表7所示。

表7

虽未全部示出，但进一步的实验表明，无论是借助沸水煮提，还是借助酶与超声辅助温水水提，其它丝状真菌(如米曲霉、黑曲霉、木霉)并不能使茶水或茶叶提取液增香。多数酵母(如酿酒酵母、汉逊酵母、假丝酵母、啤酒酵母、卡尔斯伯酵母、伯顿毕赤酵母、产朊假丝酵母)等均不能在所得茶水或茶叶提取液中生长繁殖，部分酵母能够在茶水中生长，但是，并不能使茶水或茶叶提取液增香。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 冯磊

<120> 一株丝孢毕赤氏酵母及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (11)

1.一株丝孢毕赤氏酵母（Hyphopichia sp.），其特征在于，该丝孢毕赤氏酵母的保藏编号为CCTCC NO：M 2018666。

2.一种能够使茶叶发酵产香的制剂，其特征在于，该制剂含有权利要求1所述的丝孢毕赤氏酵母和酶助剂，其中，所述酶助剂为能够水解糖苷键的酶。

3.根据权利要求2所述的制剂，其中，所述丝孢毕赤氏酵母和所述酶制剂独立保存。

4.根据权利要求2或3所述的制剂，其中，相对于每克的以细胞干重计的丝孢毕赤氏酵母，所述酶助剂的用量为800-1800U。

5.根据权利要求2或3所述的制剂，其中，所述酶助剂为纤维素酶和/或果胶酶。

6.根据权利要求2或3所述的制剂，其中，所述酶助剂为酶活力之间的比值是1-4:1的纤维素酶和果胶酶。

7.权利要求1所述的丝孢毕赤氏酵母或权利要求2-5中任意一项所述的制剂在茶制品发酵产香中的应用。

8.一种制备茶制品的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的丝孢毕赤氏酵母接种至茶叶提取液中进行培养，其中，所述茶叶提取液为茶叶的沸水煮提液和/或茶叶的酶处理液。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述茶叶的酶处理液的制备方法包括：将茶叶与水混合，再引入酶助剂进行酶处理，其中，所述酶助剂为能够水解糖苷键的酶。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述酶助剂为纤维素酶和/或果胶酶。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，相对于每升的茶叶提取液，所述丝孢毕赤氏酵母以细胞干重计的用量为50-100mg。

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